專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種流感a型h3n2病毒血凝素蛋白親和肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種流感病毒血凝素蛋白親和肽，特別是一種流感A型H3N2病毒血凝素蛋白親和肽。
背景技術(shù)：
：A(甲)型流感正在嚴(yán)重影響公共健康，A型流感病毒抗原性易發(fā)生變異，多次引起世界性大流行。1918年的HlNl型西班牙流感，1957年的H2N2亞洲流感，1968年的香港H3N2流感，已奪取世界幾千萬(wàn)人的生命(Dasetal.，NatStructMolBiol.2010,17:530)。另外，目前仍在出現(xiàn)的H5N1病毒(禽流感病毒)，雖未在人與人之間有效的傳播，但在人類(lèi)中表現(xiàn)出高致病性。自2009年4月，一種新的HlNl流感(豬流感)已蔓延全球，至2010年8月6日，該流感病毒已致至少18449人死亡(http://www.who.int/csr/don/2010_08_06/en/index.html)。這種病毒來(lái)自于北美和歐亞豬毒株的重組，豬流感的Hl亞型的血凝素(HA)蛋白顯著不同于最近季節(jié)性的流感A型病毒的Hl亞型的HA。所以，大多數(shù)人缺少對(duì)這種病毒的免疫保護(hù)，因此導(dǎo)致流感大流行。疫苗接種是預(yù)防流感病毒傳染的理想方法?？共《舅幬镆惨驯挥糜陬A(yù)防和治療季節(jié)性流感。但因?yàn)樽銐?、快速地生產(chǎn)一種有效的疫苗是很困難的(Couzin-Fnmkel，Science2009，324，705)，因此在快速傳播流行的起初，抗病毒藥物顯得特別重要。流感A型病毒膜包括3種蛋白，血凝素(HA)，神經(jīng)氨酸酶(NA)以及質(zhì)子通道(M》。在病毒感染的起初階段，HA負(fù)責(zé)唾液酸受體親，病毒吸收進(jìn)入內(nèi)涵體(endosome)之后，通過(guò)其構(gòu)象的變化誘使病毒與細(xì)胞的融合。M2運(yùn)輸質(zhì)子進(jìn)入內(nèi)涵體中正在感染的病毒，在酸性條件下，基質(zhì)蛋白Ml從基因轉(zhuǎn)錄酶復(fù)合體中分離出，以便于膜融合之后，未被包裹的復(fù)合體被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核。在感染的末期，NA從病毒和細(xì)胞復(fù)合糖裂解唾液酸，以確保來(lái)自被感染細(xì)胞的、新的病毒釋放。M2蛋白和NA已作為藥靶用于抗A型流感，以M2蛋白為靶點(diǎn)的藥物包括金剛胺及其衍生物，以NA為靶點(diǎn)的NA抑制劑，包括zanamivir和oseltamivir，然而，許多流感A型毒株已經(jīng)對(duì)金剛胺或oseltamivir表現(xiàn)出抗性(http://www.who.int/csr/disease/influenza/hlnl_table/en/index.html)。因此，針對(duì)新的藥靶研發(fā)新的抗病毒藥物則顯得特別重要。HA蛋白抗病毒藥物潛在的藥靶，因?yàn)槠湓诓《靖腥镜淖畛蹼A段的作用受體親和與病毒與細(xì)胞膜的融合(Rupert，etal.，PNAS,2008，105，17736)。同時(shí)，抑制病毒進(jìn)入細(xì)胞是最有前景的策略，HA識(shí)別宿主細(xì)胞表面的唾液酸受體，這是病毒感染過(guò)程的第一步(Wiley，etal,Annu.Rev.Biochem.1987,56，365)，因此，HA抑制劑對(duì)于抗流感具有潛在的應(yīng)用開(kāi)發(fā)前景。目前，許多研究報(bào)道含唾液酸的聚合物可以有效的抑制流感病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞。肽可有效地抑制HA與唾液酸糖蛋白的相互作用(Matsubara，etal.,JMed.Chem.2010，53:4441)。因此，設(shè)計(jì)有效的肽抑制劑則顯得尤為重要。
發(fā)明內(nèi)容有鑒于此，為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種流感A型H3N2病毒血凝素蛋白親和肽，可進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為抗流感A型H3N2病毒藥物。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的它的氨基酸序列為氨基端-LWICRTMVQPKPAQP-羧基端。本發(fā)明的一種流感A型H3N2病毒血凝素蛋白親和肽，選取一組經(jīng)過(guò)噬菌體肽庫(kù)展示技術(shù)獲得的、含有15個(gè)氨基酸殘基的肽樣本，經(jīng)過(guò)肽定量構(gòu)效關(guān)系建模技術(shù)設(shè)計(jì)具有高親和力的流感A型H3N2病毒HA蛋白親和肽，經(jīng)過(guò)表面等離子體共振技術(shù)檢測(cè)肽與HA的親和力，依此方法找到了本發(fā)明所述的氨基酸序列，即氨基端-LWICRTMVQPKPAQP-羧基端。本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)、目標(biāo)和特征在某種程度上將在隨后的說(shuō)明書(shū)中進(jìn)行闡述，并且在某種程度上，基于對(duì)下文的考察研究對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是顯而易見(jiàn)的，或者可以從本發(fā)明的實(shí)踐中得到教導(dǎo)。本發(fā)明的目標(biāo)和其他優(yōu)點(diǎn)可以通過(guò)下面的說(shuō)明書(shū)，權(quán)利要求書(shū)來(lái)實(shí)現(xiàn)和獲得。合成本發(fā)明所述的氨基酸序列方法均是現(xiàn)有的成熟技術(shù)，它是按照如下方法制成的采用標(biāo)準(zhǔn)Fmoc方案，起始選用0.0125mmol，PSC樹(shù)脂(ABI公司生產(chǎn)，批號(hào)A5F013),按照權(quán)利要求1所述的序列特征，使肽鏈從C端逐個(gè)向N端延伸，各氨基酸的用量為O.lmmol，各種氨基酸保護(hù)基團(tuán)是各氨基酸的alplia氨基Pmoc保護(hù)，其余側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)，Arg(Mtr)，Tyr(tBu),Thr(tBu)，Asp(OtBu)，對(duì)于生物素基和十八?；鶊F(tuán)的修飾，F(xiàn)moc-Lys(biotin)-OH和十八酸分別連接到肽的C末端和N末端。每步縮合都加入HoBT/Dcc活化保護(hù)氨基酸的羧基。每步縮合用含有20%六氫吡啶的NMP溶液去除Fmoc保護(hù)基，肽側(cè)鏈合成后，按照ABI公司推薦的步驟，將含樹(shù)脂的肽鏈加入處于冰浴條件下的混合反應(yīng)液中，反應(yīng)液的成分結(jié)晶苯酸0.75g，酒石酸乙二胺(EDT)0.25ml，苯硫基甲烷0.5ml，去離子水0.5ml，三氟乙酸10ml。在室溫條件下持續(xù)攪拌，反應(yīng)時(shí)間為4.5小時(shí)，把肽鏈從樹(shù)枝上裂解下來(lái)，同時(shí)去除多種保護(hù)基團(tuán)。將混合液經(jīng)4G的玻璃濾器過(guò)濾，以濾掉切下的樹(shù)脂和保護(hù)集團(tuán)，并用三氟乙酸沖洗反應(yīng)瓶和濾器，將濾液在常溫下低壓蒸發(fā)至l_2ml，加乙醚50ml，使多肽沉淀后，經(jīng)6G濾器過(guò)濾后，冷凍干燥，所得便是肽產(chǎn)品。以上過(guò)程都是在ABI-431A固相自動(dòng)肽合成儀中完成。所合成肽經(jīng)過(guò)RP-HPLC純化，純度達(dá)到95%，并經(jīng)TOF-MS鑒定結(jié)構(gòu)。用表面等離子體共振技術(shù)測(cè)定上述所合jtJft與流感A型H3N2病毒HA蛋白的親和力。具體實(shí)施方式以下對(duì)采用本發(fā)明的方法用于流感A型H3N2病毒HA蛋白親和肽的設(shè)計(jì)和鑒定為例進(jìn)行詳細(xì)的描述，包括以下步驟a)肽的定量構(gòu)效關(guān)系建模；al)肽結(jié)構(gòu)表征；從文獻(xiàn)(Matsubaraetla，J.Med.Chem.2010,534441-4449)選擇57個(gè)肽樣本，每個(gè)肽含有15個(gè)氨基酸殘基。為了合理表征這些肽的結(jié)構(gòu)特征，精選20種天然氨基酸的335種性質(zhì)參數(shù)，這些變量表征氨基酸的如下性質(zhì)，α-螺旋與轉(zhuǎn)權(quán)利要求1.一種流感A型H3N2病毒血凝素蛋白親和肽，其特征在于它的氨基酸序列為氨基端-LWICRTMVQPKPAQP-羧基端。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種流感A型H3N2病毒血凝素蛋白親和肽，其特征在于它的氨基酸序列為氨基端-LWICRTMVQPKPAQP-羧基端。本肽序列是基于肽的定量結(jié)構(gòu)功能關(guān)系模型設(shè)計(jì)，經(jīng)表面等離子共振技術(shù)檢測(cè)得到。它對(duì)流感A型H3N2病毒血凝素蛋白具有高親和能力，可用于抑制流感A型H3N2病毒血凝素蛋白活性，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為抗流感A型H3N2病毒藥物。文檔編號(hào)C07K7/08GK102020702SQ20101054107公開(kāi)日2011年4月20日申請(qǐng)日期2010年11月12日優(yōu)先權(quán)日2010年11月12日發(fā)明者李元朝,楊力,梁桂兆,苗霞,趙軍,鄭潔,馬秀巖申請(qǐng)人:重慶大學(xué)