專利名稱：新型甲型h1n1流感na蛋白b細(xì)胞表位及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及新型甲型Hmi流感NA蛋白B細(xì)胞的抗原表位及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
自2009年新型甲型Hmi流感在墨西哥和美國流行以來，該型流感已蔓延全球；根據(jù)廣東地區(qū)流感監(jiān)測結(jié)果顯示，截至2010年1月底，前6個(gè)月的分離毒株中，新型甲型Hmi 流感毒株占90 %以上，是最明顯的優(yōu)勢毒株。根據(jù)Garten RJ報(bào)告，新型甲型Hmi流感NA基因來自歐亞豬流感基因 [GartenRJ, Davis CT, Russell CA, et al. Antigenic and Genetic Characteristicsof Swine-Origin 2009 A(HlNl) Influenza Viruses Circulating in Humans. Science. 2009 ； 325(5937) :197-201.感染人類的豬流感Hmi的抗原性及遺傳特征；科學(xué)；2009.]； Maurer-Stroh S 等[Maurer-Stroh S, Ma J, Lee RTC, etal. Mapping the sequence mutations of the 2009 HlNl influenza A virusneuraminidase relative to drug and antibody binding sites. BiologyDirect. 2009,4(18) : 1-9. 2009 年 Hmi 中與藥物和抗體結(jié)合位點(diǎn)有關(guān)的神經(jīng)氨酸酶的突變序列圖譜研究；生物直接；2009.]分析了該型流感NA與藥物和抗體結(jié)合位點(diǎn)，采用 Califonia-04-2009(新型 H1N1) ,Hong Kong-516-1997 (H5N1)、 Iowa-1945 (豬H1N1)等某些序列位點(diǎn)的氨基酸序列差異，發(fā)現(xiàn)位點(diǎn)變異沒有改變藥物作用，但改變了抗原表位。吳迪等[吳迪，徐天幕，孫靜，等.甲型Hmi流感病毒HA蛋白結(jié)構(gòu)模建與構(gòu)象表位分析.科學(xué)通報(bào).2009 ；54(12) :1642-1644.]根據(jù)甲型Hmi流感病毒HA 蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)序列，采用蛋白質(zhì)分析軟件，分析其可能的構(gòu)象表位；王國戧等[王國戧， 牛菊霞，賈安奎.甲型Hmi流感病毒血凝素的B細(xì)胞抗原表位預(yù)測.中國病原生物學(xué)雜志.2009 ；4(12) =890-893.]預(yù)測了甲型Hmi流感病毒血凝素的B細(xì)胞抗原表位。但已公開發(fā)表的研究具有以下缺陷=(I)Maurer-Mroh S等沒有對新型甲型Hmi 流感NA蛋白表位進(jìn)行全面研究，僅對IETCNQS氨基酸序列(序號(hào)第46-52位，作者認(rèn)為可能是表位；其它亞型毒株具有不同氨基酸序列序號(hào))等進(jìn)行理論剖析，沒有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持； (2)吳迪等對血凝素(注不是NA)三維構(gòu)象進(jìn)行分析，不涉及表位序列，也無實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持；C3)王國戧等僅采用分子生物學(xué)軟件對血凝素(注不是NA)B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行預(yù)測， 發(fā)現(xiàn)可能的45個(gè)表位肽；后者研究較為粗淺，是理論預(yù)測的初級(jí)階段。B細(xì)胞表位是指抗原中可被B細(xì)胞抗原受體(BCR)或抗體特異性識(shí)別并相互結(jié)合的線性片段或空間構(gòu)象型結(jié)構(gòu)。B細(xì)胞表位預(yù)測有助于免疫原性多肽和新型疫苗分子的設(shè)計(jì)，并有利于診斷試劑的開發(fā)以及臨床治療。如果單純使用實(shí)驗(yàn)去尋找所需要的B細(xì)胞表位，在目前的生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)水平下是不可能達(dá)到的。而采用免疫信息學(xué)方法對抗原表位進(jìn)行預(yù)測成為表位定位必不可少的工具，并發(fā)揮巨大作用。參與高能量連接的氨基酸殘基構(gòu)成抗原-抗體的關(guān)鍵性結(jié)合殘基(CBR)，CBR上氨基酸的替換將極大地影響其親和性。若CBR位于較短的連續(xù)性多肽序列內(nèi)，則其形成線性表位；若CBR位于多肽序列間隔較遠(yuǎn)的位置，通過蛋白折疊聚集在抗原表面，則其形成構(gòu)象性表位?？贵w一般通過深而狹窄的袋狀抗原結(jié)合槽與多糖、核酸、多肽、半抗原等形成的B 細(xì)胞表位相結(jié)合，在結(jié)合槽中的氨基端和羧基端通過范德華力聚合在一起。研究認(rèn)為蛋白的親水部位與蛋白的抗原性有關(guān)，計(jì)算局部平均親水性峰值發(fā)現(xiàn)蛋白中平均親水性峰值區(qū)域大多位于線性B細(xì)胞表位內(nèi)或與之相連。運(yùn)用數(shù)學(xué)方法對球蛋白的研究發(fā)現(xiàn)極性氨基酸殘基大多位于球狀蛋白表面，而非極性氨基酸大多位于蛋白內(nèi)部，并計(jì)算了蛋白中位于球狀蛋白表面的突出指數(shù)，發(fā)現(xiàn)理論計(jì)算的蛋白突出部位與實(shí)驗(yàn)確定的B細(xì)胞表位間具有較高的一致性。對蛋白的可及性即抗原中氨基酸殘基被溶劑分子接觸的可能性參數(shù)和蛋白的電荷分布參數(shù)等研究發(fā)現(xiàn)，這些參數(shù)值均可用作為預(yù)測某些蛋白抗原決定簇的重要參數(shù)。人們希望獲得相對準(zhǔn)確、盡可能短的肽鏈作為有效抗原。目前以蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和氨基酸結(jié)構(gòu)上的特點(diǎn)為理論基礎(chǔ)，不斷改進(jìn)新的預(yù)測方法和加入新的計(jì)算方法，如綜合預(yù)算法、疊加預(yù)算法等，一些新的分析軟件也相應(yīng)開發(fā)使用。目前，國外B細(xì)胞表位預(yù)測方法多數(shù)是從抗原蛋白的氨基酸一級(jí)結(jié)構(gòu)出發(fā)，以線性表位預(yù)測為主，其基本思想是綜合抗原蛋白理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、統(tǒng)計(jì)顯著性度量等指標(biāo)進(jìn)行表位預(yù)測。但是基于上述參數(shù)的表位預(yù)測，預(yù)測準(zhǔn)確度一般低于60 %，難以令人滿意。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供新型甲型Hmi流感NA蛋白B細(xì)胞的抗原表位，并篩選出其表位肽，同時(shí)制備作用于表位肽的抗體，這些表位肽或抗體可應(yīng)用于Hmi的疫苗、藥物的研制以及檢測等方面。為實(shí)現(xiàn)上述目的，采用如下的技術(shù)方案本發(fā)明的新型甲型Hmi流感NA蛋白的毒株編號(hào)為⑶-801-2009，其NA基因在 GenBank的序列號(hào)為GenBank⑶471691。本發(fā)明的新型甲型Hmi流感NA蛋白共469個(gè)氨基酸，序列如下MNPNQKIITIGSVCMTIGMANLILQIGNIISIWISHSIQLGNQNQIETCNQSVITYENNTWVNQTYVNISNTNFAAGQSVVSVKLAGNSSLCPVSGWAIYSKDNSVRIGSK⑶VFVIREPFISCSPLECRTFFLTQGALLNDKHSNGTIKDRSPYRTLMSCPIGEVPSPYNSRFESVAffSASACHDGINVLTIGISGPDNGAVAVLKYNGIITDTIKSffRNNILRTQESECACYNGSCFTYMTDGPSNGQASYKIFRIEKGKIVKSVEMNAPNYHYEECSCYPDSSEITCVCRDNVHGSNRPffVSFNQNLEYQIGYICSGIFGDNPRPNDKTGSCGPVSSNGANGVKGFSFKYGNGVfflGRTKSISSRNGFEMIffDPNGffTGTDNNFSIKQDIVGINEffSGYSGSFVQHPELTGLDCIRPCFffVELIRGRPKENTIffTSGSSISFCGVNSDTVGffSffPDGAELPFTIDK其中，下劃線部分的序列為其B細(xì)胞表位，具體來說，其B細(xì)胞表位的氨基酸序列及其位置如下所示位置肽段序列_101-104 SKDN
140-156 LNDKHSNGTIKDRSPYR168-175 SPYNSRFE218-229 SffRNNILRTQES294-302 DNWHGSNRP324-334 DNPRPNDKTGS376-389 DPNGffTGTDNNFSI428-433 RGRPKE_其中，為了使上述肽段能較好的和偶聯(lián)蛋白結(jié)合，進(jìn)而可以增強(qiáng)表位肽的免疫原性以產(chǎn)生高效價(jià)相應(yīng)抗體，在化學(xué)合成這些表位肽時(shí)，我們在有的肽段序列的前端或末端增加了半胱氨酸(C)。因而，實(shí)際應(yīng)用中，我們使用的肽段序列如下所示位置肽段序列_101-104 SKDNC140-156 CLNDKHSNGTIKDRSPYR168-175 SPYNSRFE218-229 SffRNNILRTQES294-302 DNWHGSNRP324-334 DNPRPNDKTGSC376-389 DPNGffTGTDNNFSI428-433 CRGRPKE_其中，下劃線標(biāo)注的C為化學(xué)合成中加入的氨基酸。上述八段表位序列是通過生物信息學(xué)方法分析獲得的，利用生物分析軟件進(jìn)行目的基因的核苷酸和氨基酸一般特性和氨基酸變異研究，對氨基酸變異進(jìn)行評估；然后進(jìn)行蛋白特性和結(jié)構(gòu)的分析，設(shè)置預(yù)測、篩選和評估程序，篩選B細(xì)胞表位，最后建立3D模型， 對于目的蛋白(目的基因)氨基酸變異位點(diǎn)進(jìn)行變異前后的氨基酸特性改變的比較，分析特定氨基酸位點(diǎn)變異對目的基因蛋白表位的可能影響，得到上述八段表位序列及其具體位置。進(jìn)而通過實(shí)驗(yàn)確證表位肽的特異性、表位肽抗體的敏感性、中和病毒等作用。 實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的新型甲型Hmi流感NA蛋白B細(xì)胞表位肽具有明顯的NA蛋白的某些特異性功能，具有免疫原性，與其相作用的抗體具有中和病毒作用；這就意味著表位肽在感染宿主細(xì)胞中發(fā)揮著非常重要的作用。這就為用于制備新型疫苗和藥物提供了科學(xué)依據(jù)；其免疫產(chǎn)生的抗體具有開發(fā)免疫診斷試劑的作用，尤其是表位肽氨基酸數(shù)目較長的肽段。上述表位肽可以作為檢測抗原用于開發(fā)新型甲型Hmi流感相關(guān)診斷試劑盒(檢測特異性抗體)；上述表位肽抗體能特異地與相應(yīng)的新型甲型Hmi流感NA蛋白B細(xì)胞表位中的分別結(jié)合，也可以作為開發(fā)新型甲型Hmi流感相關(guān)診斷試劑盒(檢測特異性抗原)。上述表位肽可以作為靶蛋白，用于新型甲型Hmi流感的治療；其相應(yīng)抗體可進(jìn)一步做拮抗新型Hmi病毒的藥物。
上述疫苗可包含新型甲型Hmi流感NA蛋白B細(xì)胞表位中的一種或多種抗原表位肽。本發(fā)明的新型甲型Hmi流感NA蛋白B細(xì)胞表位為新型甲型Hmi流感的診治預(yù)防奠定了基礎(chǔ)，為用于制備新型疫苗和藥物提供了科學(xué)的依據(jù)。


圖1是本發(fā)明利用生物信息學(xué)分析預(yù)測目的基因線性B細(xì)胞表位的三維立體結(jié)構(gòu)圖，紅色的部分即是已鑒定的表位肽位置。
具體實(shí)施方式
為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。需要說明的是其中所用到的生物信息學(xué)分析軟件、分析方法和相關(guān)數(shù)據(jù)庫都為本領(lǐng)域中專用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過查閱文獻(xiàn)或數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站而獲得。實(shí)施例1 新型甲型Hmi流感病毒NA蛋白B細(xì)胞表位的分析新型甲型Hmi流感病毒NA蛋白B細(xì)胞表位的分析按如下方法進(jìn)行(1)基因序列檢測與變異分析采用Primer Premier 5. 0設(shè)計(jì)并合成甲型流感病毒(Hmi毒株)的目的基因(神經(jīng)氨酸酶，NA)的RT-PCR引物；檢測目的基因核苷酸序列，根據(jù)流行病學(xué)(時(shí)間、地點(diǎn)分布) 資料，選擇目的毒株；下載國內(nèi)、外目的基因核苷酸序列；采用Lasergene 7. 1軟件和Mega 4. 0軟件，進(jìn)行目的基因的核苷酸和氨基酸一般特性和氨基酸變異研究，對氨基酸變異進(jìn)行評估。與此比較毒株目的基因核苷酸序列來自數(shù)據(jù)庫GenBank和LANL。(2)蛋白特性和結(jié)構(gòu)分析根據(jù)流感病毒目的蛋白核苷酸序列，采用SWISS-MODEL軟件分析其螺旋區(qū)和片層區(qū)(AS和SS)并采用Chimera軟件分析其螺旋區(qū)和片層區(qū)(AC和SC)；使用Protean軟件，采用Karplus-Schulz方法分析蛋白質(zhì)的表面柔性O(shè)7K)，采用Kyte-Doolittle的氨基酸親水性指標(biāo)(HPK)分析其親水性，采用Emini方法分析蛋白質(zhì)的表面可及性(SPE)，采用 Jameson-Wolf方法分析其抗原指數(shù)(AIJ)。(3)預(yù)測、篩選和評估程序①聚類與相關(guān)分析用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析目的基因編碼蛋白的相關(guān)數(shù)據(jù)。 SWISS-MODEL軟件分析的目的蛋白的螺旋區(qū)和片層區(qū)(AS和SS)中，將結(jié)果“h”設(shè)為1， 將無“h”設(shè)為0，將結(jié)果“S”設(shè)為1，將無“S”設(shè)為0 ；Chimera軟件分析的螺旋區(qū)和片層區(qū)(AC和SC)中，將結(jié)果“h”設(shè)為1，將無“h”設(shè)為0，將結(jié)果“S”設(shè)為1，將無“S”設(shè)為0。 Karplus-Schulz方法中，將結(jié)果“F”設(shè)為1，將無“F”設(shè)為0。Kyte-Doolittle方法預(yù)測其親水性、Emini方案預(yù)測蛋白質(zhì)的表面可及性、Jameson-Wolf方案預(yù)測抗原性指數(shù)按具體數(shù)值處理，計(jì)算各數(shù)值統(tǒng)計(jì)學(xué)分布和四分位數(shù)。目的基因蛋白相關(guān)數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 13. O統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件聚類、相關(guān)分析，對于各變量進(jìn)行歸類，并進(jìn)行兩兩相關(guān)性分析。②篩選B細(xì)胞表位以4個(gè)以上連續(xù)氨基酸殘基為一組的方案，初步預(yù)測篩選和預(yù)測目的蛋白抗原的B細(xì)胞表位。根據(jù)目的蛋白的螺旋結(jié)構(gòu)、片層結(jié)構(gòu)、柔性區(qū)，蛋白表面親水性、可及性、抗原指數(shù)(Al)的特性，建立一種篩選方法，進(jìn)行目的蛋白的B細(xì)胞表位預(yù)測和篩選。 篩選的具體入選程序如下a.排除條件SWISS_M0DEL方法和Chimera方法預(yù)測均無螺旋區(qū)；SWISS-MODEL方法和Chimera方法預(yù)測均無片層區(qū)(一般螺旋區(qū)和片層區(qū)常位于各自不同殘基區(qū)域)。所以，兩種方法預(yù)測均無螺旋區(qū)或兩種方法均無片層區(qū)的區(qū)域入選；b.入選參數(shù)入選參數(shù)有三項(xiàng)，包括Kyte-Doolittle方法分析氨基酸親水性、 Jameson-Wolf方法預(yù)測蛋白序列抗原指數(shù)、Emini方法預(yù)測氨基酸殘基位于蛋白質(zhì)表面； 入選條件①三項(xiàng)參數(shù)中，各單項(xiàng)參數(shù)數(shù)值> 50%四分位數(shù)；或②如果三項(xiàng)參數(shù)中，有兩項(xiàng)參數(shù)數(shù)值> 50%四分位數(shù)，此外應(yīng)滿足以下條件該區(qū)域不出現(xiàn)螺旋區(qū)和片層區(qū)。c.肽段選擇以4個(gè)及4個(gè)以上連續(xù)氨基酸殘基為一組的方案，初步預(yù)測篩選和預(yù)測目的基因蛋白的B細(xì)胞表位。根據(jù)以上a、b、c條件，綜合預(yù)測結(jié)果。③評估預(yù)測肽段參考SPSS抗原指數(shù)(SPSS’ Al)，評價(jià)目的蛋白抗原表位，SPSS 抗原指數(shù)表見表2。平均AI =總Al/氨基酸數(shù)量。具有較高平均AI的肽段是表位的主要候選者。(4)建立3D模型①建模采用SWISS-MODEL軟件和Chimera軟件，分別建立目的基因蛋白三維立體結(jié)構(gòu)模型；并用Swiss-PdbViewer軟件分析。②變異前后比較對于目的蛋白(目的基因)氨基酸變異位點(diǎn)，進(jìn)行變異前后的氨基酸特性改變的比較，分析特定氨基酸位點(diǎn)變異對目的基因蛋白表位的可能影響。通過上述分析，從目的蛋白NA氨基酸序列(本研究檢測的毒株包括GenBank中， GU471691, GU471692, GU471693, GU471694, GU471695, GU562466, GU562467, GU562468, ⑶562469 ；以及從GenBank中下載全球200余株NA氨基酸序列)，比較氨基酸位點(diǎn)變異，得到目的基因線性B細(xì)胞表位如表1所示，表1是目的基因線性B細(xì)胞表位的氨基酸序列。目的基因線性B細(xì)胞表位的三維立體結(jié)構(gòu)圖見圖1，紅色的部分即是鑒定的表位位置。表 1_______________________________________________________位置肽段_______________________________________________________101-104 SKDN140-156 LNDKHSNGTIKDRSPYR168-175 SPYNSRFE218-229 SffRNNILRTQES294-302 DNWHGSNRP324-334 DNPRPNDKTGS376-389 DPNGffTGTDNNFSI428-433 RGRPKE______________________________________________________
由于表位肽分子較小且抗原性較弱，表位肽與偶聯(lián)蛋白結(jié)合后可以增加其免疫原性并刺激產(chǎn)生足以檢測的免疫抗體；而在某些表位肽段序列的前端或末端增加了半胱氨酸 (C)，其目的是便于結(jié)合上偶聯(lián)蛋白。因而，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中我們使用的表位肽的序列如下所示位置肽段序列_101-104 SKDNC140-156 CLNDKHSNGTIKDRSPYR168-175 SPYNSRFE218-229 SffRNNILRTQES294-302 DNWHGSNRP324-334 DNPRPNDKTGSC376-389 DPNGffTGTDNNFSI428-433 CRGRPKE_其中，下劃線標(biāo)注的C為化學(xué)合成中加入的半胱氨酸。表 權(quán)利要求
1.新型甲型Hmi流感NA蛋白B細(xì)胞表位，其特征在于，具有如下所示的氨基酸序列 SKDN、LNDKHSNGTIKDRSPYR、SPYNSRFE、SffRNNILRTQES, DNffHGSNRP, DNPRPNDKTGS、DPNGffTGTDNNFSI, RGRPKE ；以及含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸插入、缺失、替代或添加并保持其結(jié)構(gòu)和活性的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求1所述的新型甲型Hmi流感NA蛋白B細(xì)胞表位的應(yīng)用，其特征在于，用于制備新型甲型Hmi流感疫苗或藥物。
3.一種疫苗，其特征在于，包含權(quán)利要求1所述的新型甲型Hmi流感NA蛋白B細(xì)胞表位中的一種或多種的抗原表位肽。
4.一種抗體或抗原結(jié)合片段，其特征在于，所述抗體或抗原結(jié)合片段特異地與權(quán)利要求1所述的新型甲型Hmi流感NA蛋白B細(xì)胞表位中的一種或多種分別結(jié)合或序列一致。
5.一種藥物，其特征在于，所述藥物含有權(quán)利要求4所述的抗體或抗原結(jié)合片段。
6.預(yù)防治療新型甲型Hmi流感感染的方法，其特征在于，施用免疫有效量的權(quán)利要求 3所述的疫苗或有效量的權(quán)利要求5所述的藥物。
7.權(quán)利要求1所述的新型甲型Hmi流感NA蛋白B細(xì)胞表位的應(yīng)用，其特征在于，作為靶蛋白用于開發(fā)新型甲型Hmi流感相關(guān)診斷試劑盒。
8.檢測新型甲型Hmi流感的方法，其特征在于，使用了權(quán)利要求7所述的診斷試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明涉及采用生物信息學(xué)結(jié)合實(shí)驗(yàn)鑒定的方法研究新型甲型H1N1流感NA蛋白B細(xì)胞表位。該B細(xì)胞表位有8段氨基酸序列，其序列如下SKDN、LNDKHSNGTIKDRSPYR、SPYNSRFE、SWRNNILRTQES、DNWHGSNRP、DNPRPNDKTGS、DPNGWTGTDNNFSI、RGRPKE。本發(fā)明的B細(xì)胞表位肽具有中和病毒等作用，可用于研發(fā)新的表位肽疫苗和藥物，開發(fā)新型甲型H1N1流感診斷試劑，還可用作治療靶點(diǎn)。
文檔編號(hào)C07K5/10GK102153621SQ20101011663
公開日2011年8月17日 申請日期2010年2月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月12日
發(fā)明者倪漢忠, 張永慧, 許元生, 黃平 申請人:廣東省疾病預(yù)防控制中心