專利名稱：皮膚與纖維化癥候中的rna干擾的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及RNA干擾(RNAi)領(lǐng)域。本發(fā)明更具體地涉及具有改進(jìn)的體內(nèi)遞送特性的核酸分子以及它們對于皮膚與纖維化癥候的用途。
背景技術(shù)：
互補寡核苷酸序列是前景光明的治療劑以及在闡明基因功能方面的有用研究工具。然而，現(xiàn)有技術(shù)中寡核苷酸分子罹受一些問題，這些問題可以阻礙它們的臨床開發(fā)，并且頻繁地使得在體內(nèi)使用此類組合物難以達(dá)到預(yù)期的有效的基因表達(dá)(包括蛋白合成)抑制。

一個主要問題是這類化合物至細(xì)胞與組織的遞送。常規(guī)的雙鏈RNAi化合物(19-29個堿基長)形成一種高度帶負(fù)電的大約1.5nm乘10_15nm大小的剛性螺旋。這種桿條式分子不能通過細(xì)胞膜并且結(jié)果是在體外以及體內(nèi)具有極其有限的效能。結(jié)果，所有常規(guī)的RNAi化合物都要求某種類型的遞送載體以促進(jìn)其組織分布與細(xì)胞吸收。這被認(rèn)為是RNAi技術(shù)的一個主要限制。已經(jīng)存在許多嘗試來對寡核苷酸應(yīng)用化學(xué)修飾以改進(jìn)其細(xì)胞吸收特性。此種修飾之一是將一種膽固醇分子附接至該寡核苷酸上。這種方法首先由Letsinger等人在1989年報道。之后，ISIS制藥公司(ISIS Pharmaceuticals, Inc.)(卡爾斯巴德,加利福尼亞(Carlsbad，CA))報道了在將該膽固醇分子附接至該寡核苷酸方面的更先進(jìn)的技術(shù)(Manoharan,1992)。隨著九十年代后期siRNAs的發(fā)現(xiàn)，在這些分子上進(jìn)行了類似類型的修飾以增強其遞送特征曲線(profile)。在文獻(xiàn)中出現(xiàn)了共軛至輕度修飾(Soutschek, 2004)以及重度修飾(Wolfrum, 2007)的siRNAs上的膽固醇分子。Yamada等人，2008還報道了進(jìn)一步改進(jìn)膽固醇介導(dǎo)的siRNAs吸收的高級連接物化學(xué)物質(zhì)的用途。盡管所有這類努力，在生物流體的存在下這些類型的化合物的吸收似乎受到抑制，導(dǎo)致體內(nèi)基因沉默的效能高度受限，由此限制了這些化合物在臨床環(huán)境中的應(yīng)用。發(fā)明概述在此描述了 sd-rxRNA分子至皮膚的有效體內(nèi)遞送以及此類分子用于基因沉默的用途。這一類別的RNAi比前述RNAi分子具有優(yōu)異的體外以及體內(nèi)效能。與本發(fā)明相關(guān)的分子作為跟受損皮膚以及纖維化有關(guān)的失調(diào)或疾患的療法具有廣泛潛力。本發(fā)明的多個方面涉及包含正義鏈以及反義鏈的雙鏈核糖核酸(dsRNA)，其中該反義鏈?zhǔn)桥c從表2、5、6、9、11、12、13、14、15、16、17以及23內(nèi)的序列中選擇的一種序列的至
少12個連續(xù)核苷酸互補，并且其中該dsRNA是一種sd-rxRNA。本發(fā)明的另外的方面涉及包含正義鏈以及反義鏈的雙鏈核糖核酸(dsRNA)，其中該正義鏈和/或該反義鏈包含從表1-27內(nèi)的序列中選擇的一種序列的至少12個連續(xù)核苷酸，并且其中該dsRNA是一種sd-rxRNA。本發(fā)明的另外的方面涉及包含正義鏈以及反義鏈的雙鏈核糖核酸(dsRNA)，其中該反義鏈?zhǔn)桥c從表2、5、6、9、11、12、13、14、15、16、17以及23內(nèi)的序列中選擇的一種序列的至少12個連續(xù)核苷酸互補，并且其中該dsRNA是一種rxRNAori。本發(fā)明的另外的方面涉及包含正義鏈以及反義鏈的雙鏈核糖核酸(dsRNA)，其中該正義鏈和/或該反義鏈包含從表1-27內(nèi)的序列中選擇的一種序列的至少12個連續(xù)核苷酸，并且其中該dsRNA是一種rxRNAori。在一些實施方案中，該dsRNA是針對CTGF。在一些實施方案中，該dsRNA的反義鏈?zhǔn)桥c從表11、12以及15內(nèi)的序列中選擇的一種序列的至少12個連續(xù)核苷酸互補。在一些實施方案中，該正義鏈和/或該反義鏈包含從表10、11、12、15、20以及24內(nèi)的序列中選擇的一種序列的至少12個連續(xù)核苷酸。在一些實施方案中，該正義鏈包含選自下組的一種序列的至少12個連續(xù)核苷酸，該組由以下項組成:SEQ ID N0s:2463、3429、2443、3445、2459、3493、2465 以及 3469。在一些實施方案中，該反義鏈包含選自下組的一種序列的至少12個連續(xù)核苷酸，該組由以下項組成:2464、3430、4203、3446、2460、3494、2466 以及 3470。在某些實施方案中，該正義鏈包含SEQ ID NO: 2463并且該反義鏈包含SEQ IDNO:24640在某些實施方案中，該正義鏈包含SEQ ID NO:3429并且該反義鏈包含SEQ IDNO:3430。 在某些實施方案中，該正義鏈包含SEQ ID NO:2443并且該反義鏈包含SEQ IDNO:4203。在某些實施方案中，該正義鏈包含SEQ ID NO: 3445并且該反義鏈包含SEQ IDNO:3446。在某些實施方案中，該正義鏈包含SEQ ID NO:2459并且該反義鏈包含SEQ IDNO: 2460。在某些實施方案中，該正義鏈包含SEQ ID NO: 3493并且該反義鏈包含SEQ IDNO:3494。在某些實施方案中，該正義鏈包含SEQ ID NO:2465并且該反義鏈包含SEQ IDNO:24660在某些實施方案中，該正義鏈包含SEQ ID NO:3469并且該反義鏈包含SEQ IDNO:3470。在一些實施方案中，該正義鏈包含選自下組的一種序列的至少12個連續(xù)核苷酸，該組由以下項組成:SEQ ID NOs: 1835、1847、1848以及1849。在某些實施方案中，該正義鏈包含一種選自下組的序列，該組由以下項組成=SEQ ID NOs: 1835、1847、1848以及1849。在一些實施方案中，該dsRNA是經(jīng)疏水修飾。在某些實施方案中，該dsRNA是連接至一種疏水軛合物。本發(fā)明的多個方面涉及包含在此描述的dsRNA分子的組合物。在一些實施方案中，該組合物包含針對為多于一種的蛋白進(jìn)行編碼的多種基因的dsRNA。在一些實施方案中，該組合物是配制用于遞送至皮膚。在某些實施方案中，該組合物是以一種中性配制品形式。在一些實施方案中，該組合物是配制用于局部遞送或用于皮內(nèi)注射。本發(fā)明的多個方面涉及包括以下的方法:將在此描述的任何dsRNA或包含在此描述的任何dsRNA的組合物遞送至對其有需要的受試者的皮膚。本發(fā)明的多個方面涉及包括以下的方法:將一種治療有效量的包含正義鏈以及反義鏈的雙鏈核糖核酸(dsRNA)給予對其有需要的受試者，其中該反義鏈?zhǔn)桥c從表2、5、6、9、
11、12、13、14、15、16、17以及23內(nèi)的序列中選擇的一種序列的至少12個連續(xù)核苷酸互補，并且其中該dsRNA是一種sd-rxRNA。本發(fā)明的另外的方面涉及包括以下的方法:將一種治療有效量的包含正義鏈以及反義鏈的雙鏈核糖核酸(dsRNA)給予對其有需要的受試者，其中該正義鏈和/或該反義鏈包含從表1-27內(nèi)的序列中選擇的一種序列的至少12個連續(xù)核苷酸，并且其中該dsRNA是一種 sd-rxRNA。本發(fā)明的另外的方面涉及包括以下的方法:將一種治療有效量的包含正義鏈以及反義鏈的雙鏈核糖核酸(dsRNA)給予對其有需要的受試者，其中該反義鏈?zhǔn)桥c從表2、5、6、
9、11、12、13、14、15、16、17以及23內(nèi)的序列中選擇的一種序列的至少12個連續(xù)核苷酸互補，并且其中該dsRNA是一種rxRNAori。本發(fā)明的另外的方面涉及包括以下的方法:將一種治療有效量的包含正義鏈以及反義鏈的雙鏈核糖核酸(dsRNA)給予對其有需要的受試者，其中該正義鏈和/或該反義鏈包含從表1-27內(nèi)的序列中選擇的一種序列的至少12個連續(xù)核苷酸，并且其中該dsRNA是一種 rxRNAori。在一些實施方案中，該方`法是一種用于治療受損皮膚方法。在一些實施方案中，該方法是一種用于治療或預(yù)防纖維化失調(diào)的方法。在一些實施方案中，該dsRNA是經(jīng)由皮內(nèi)注射而給予。在一些實施方案中，該dsRNA是局部給予至皮膚。在一些實施方案中，同時地或相繼地給予兩種或更多種核酸分子。在一些實施方案中，這些dsRNA中的一種或多種是經(jīng)疏水修飾。在某些實施方案中，這些dsRNA中的一種或多種是連接至一種疏水軛合物。在一些實施方案中，該dsRNA是針對CTGF。在某些實施方案中，該dsRNA的反義鏈?zhǔn)桥c從表11、12以及15內(nèi)的序列中選擇的一種序列的至少12個連續(xù)核苷酸互補。在一些實施方案中，該正義鏈和/或該反義鏈包含從表10、11、12、15、20以及24內(nèi)的序列中選擇的一種序列的至少12個連續(xù)核苷酸。在一些實施方案中，該正義鏈包含選自下組的一種序列的至少12個連續(xù)核苷酸，該組由以下項組成:SEQ ID N0s:2463、3429、2443、3445、2459、3493、2465 以及 3469。在某些實施方案中，該反義鏈包含選自下組的一種序列的至少12個連續(xù)核苷酸，該組由以下項組成:2464、3430、4203、3446、2460、3494、2466 以及 3470。在某些實施方案中，該正義鏈包含SEQ ID NO:2463并且該反義鏈包含SEQ IDNO: 2464。在某些實施方案中，該正義鏈包含SEQ ID NO: 3429并且該反義鏈包含SEQ IDNO:3430。在某些實施方案中，該正義鏈包含SEQ ID NO:2443并且該反義鏈包含SEQ IDNO:42030在某些實施方案中，該正義鏈包含SEQ ID NO:3445并且該反義鏈包含SEQ IDNO:3446。在某些實施方案中，該正義鏈包含SEQ ID NO:2459并且該反義鏈包含SEQ IDNO: 2460。在某些實施方案中，該正義鏈包含SEQ ID NO: 3493并且該反義鏈包含SEQ IDNO:3494。在某些實施方案中，該正義鏈包含SEQ ID NO:2465并且該反義鏈包含SEQ IDNO: 2466。在某些實施方案中，該正義鏈包含SEQ ID NO: 3469并且該反義鏈包含SEQ IDNO:3470。在一些實施方案中，該正義鏈包含選自下組的一種序列的至少12個連續(xù)核苷酸，該組由以下項組成:SEQ ID NOs: 1835、1847、1848以及1849。在一些實施方案中，該正義鏈包含一種選自下組的序列，該組由以下項組成=SEQ ID NOs: 1835、1847、1848以及1849。本發(fā)明的多個方面涉及治療或預(yù)防纖維化失調(diào)。在一些實施方案中，該纖維化失調(diào)是選自下組，該組由以下項組成:彌漫間質(zhì)性肺纖維化、肝硬化、硬皮病與腎小球腎炎、肺纖維化、肝纖維化、皮膚纖維化、肌肉纖維化、輻射纖維化、腎纖維化、增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變、再狹窄與子宮纖維化以及由于瘢痕的小梁切除術(shù)失敗。 在一些實施方案中，該dsRNA是經(jīng)由皮內(nèi)注射而給予，而在其他實施方案中，皮下地或皮表地給予一種或多種dsRNA。可以在醫(yī)療程序之前、之中和/或之后給予一種或多種dsRNA。在一些實施方案中，在該醫(yī)療程序之前8天之內(nèi)或之后8天之內(nèi)進(jìn)行給予。在一些實施方案中，該醫(yī)療程序是手術(shù)。在某些實施方案中，該手術(shù)是選擇性的。在一些實施方案中，該手術(shù)包括上皮移植或皮膚移植。在一些實施方案中，將一種或多種雙鏈核酸分子給予至移植供體位點和/或移植受體位點。
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本發(fā)明的多個方面涉及用于在損傷之前、之中和/或之后給予一種或多種dsRNA的方法。在一些實施方案中，該受試者具有一種創(chuàng)傷，比如一種慢性創(chuàng)傷。在某些實施方案中，該創(chuàng)傷是選擇性手術(shù)的結(jié)果。該創(chuàng)傷可以是外部的或內(nèi)部的。在一些實施方案中，該dsRNA是在燒傷之后給予。在此描述的方法包括用于促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的方法以及用于預(yù)防瘢痕的方法。在一些實施方案中，給予受試者的一種或多種dsRNA是針對選自下組的基因，該組由以下項組成:TGFB1、TGFB2、hTGFB 1、hTGFB2、PTGS2、SPP1、hSPP 1、CTGF 或 hCTGF。在一些實施方案中，在該受試者的皮膚上給予這一種或多種dsRNA。在某些實施方案中,這一種或多種dsRNA分子是以乳膏或軟膏的形式。在一些實施方案中，給予兩種或更多種或者三種或更多種核酸分子?？梢酝瑫r地或相繼地給予兩種或更多種核酸分子。本發(fā)明的多個方面涉及經(jīng)優(yōu)化的核酸。在一些實施方案中，一種或多種雙鏈核酸分子是經(jīng)疏水修飾。在某些實施方案中，該一種或多種雙鏈核酸分子是連接至一種疏水軛合物或多種疏水軛合物。在一些實施方案中，該一種或多種雙鏈核酸分子是連接至一種親脂性基團(tuán)。在某些實施方案中，該親脂性基團(tuán)是連接至該一種或多種雙鏈核酸分子的過客鏈。在一些實施方案中，該一種或多種雙鏈核酸分子是連接至膽固醇、一種長鏈烷基膽固醇類似物、維生素A或維生素E。在一些實施方案中，該一種或多種雙鏈核酸分子是附接至氯甲酸酯。
本發(fā)明的多個方面涉及通過修飾而經(jīng)優(yōu)化的核酸。在一些實施方案中，該一種或多種雙鏈核酸分子包括至少一個2’0甲基或2’氟修飾和/或至少一個5甲基C或U修飾。在一些實施方案中，該一種或多種雙鏈核酸分子具有一種16-28個核苷酸長度的引導(dǎo)鏈。在某些實施方案中，該一種或多種雙鏈核酸分子的核苷酸的至少40%是經(jīng)修飾的。在此描述的雙鏈核酸分子還可以附接至一種連接物。在一些實施方案中，該連接物是可質(zhì)子化的。本發(fā)明的多個方面涉及包含至少兩個單鏈區(qū)域的雙鏈核酸分子。在一些實施方案中，這些單鏈區(qū)域包含硫代磷酸酯修飾。在某些實施方案中，這些單鏈區(qū)域是位于該引導(dǎo)鏈的3’末端以及該過客鏈的5’末端。本發(fā)明的多個方面涉及用于將一種核酸遞送至受試者的方法，這些方法包括在醫(yī)療程序之前的8天之內(nèi)將一種或多種治療受損皮膚有效量的sd-rxRNA給予受試者。對于本發(fā)明的限制各自可以涵蓋本發(fā)明的不同的實施方案。因此，預(yù)期到涉及任何一個要素或要素組合的對于本發(fā)明的限制各自可以包括在本發(fā)明的各方面中。本發(fā)明在其應(yīng)用方面不限于以下描 述中所提出的或圖中所展示的構(gòu)造詳情和組成部分的安排。本發(fā)明可以具有其他實施方案并且能以不同的方法被實行或執(zhí)行。附圖簡要說明附圖并不是按比例繪制。在這些附圖中，在不同圖中示出的各個相同或接近相同的組成部分用一種相似數(shù)字符號表示。為了簡明的目的，不是每一組成部分都在每一附圖中做了標(biāo)記。附圖中:

圖1展示了靶標(biāo)基因的非限制性實例的表達(dá)譜(profile)，這些基因包括MAP4K4、SPPl、CTGF、PTGS2以及TGFB1。按照預(yù)期，靶標(biāo)基因表達(dá)在早期升高并且到第10天回歸正圖2展示的圖表描述了在皮內(nèi)注射之后使組織可視化的實驗方法。圖3展示了在皮內(nèi)注射靶向MAP4K4的sd-rxRNA之后MAP4K4的沉默。圖4展示了在皮內(nèi)注射靶向MAP4K4、PPIB以及CTGF的sd-rxRNA分子之后每一基因的沉默。圖5展示了在皮內(nèi)注射靶向MAP4K4的sd-rxRNA之后MAP4K4的沉默。展示了相對于對照而標(biāo)準(zhǔn)化的MAP4K4表達(dá)。圖6展示了在皮內(nèi)注射靶向PPIB的sd-rxRNA之后PPIB的沉默。展示了相對于對照而標(biāo)準(zhǔn)化的PPIB表達(dá)。圖7展示了在皮內(nèi)注射靶向PPIB的sd-rxRNA之后PPIB沉默的持續(xù)時間。圖8展示了在皮內(nèi)注射靶向MAP4K4的sd-rxRNA之后MAP4K4沉默的持續(xù)時間。圖9展示了利用兩種不同劑量方案而達(dá)到的等同性沉默。圖10展示了對于基因沉默有效的、靶向CTGF的sd-rxRNA分子的實例。圖11展示了對于基因沉默有效的、靶向CTGF的sd-rxRNA分子的實例。圖12展示了靶向CTGF的sd-rxRNA分子的劑量響應(yīng)。圖13展示了原始sd-rxRNA篩選的樣本。圖14展示了來自該原始sd-rxRNA篩選的符合(hit)數(shù)據(jù)。圖15展示了在給予靶向PTGS2的sd-rxRNA之后PTGS2的基因表達(dá)。圖16展示了在給予靶向hTGFBl的sd-rxRNA之后hTGFBl的基因表達(dá)。
圖17展示了在給予靶向hTGFBl的sd-rxRNA之后hTGFBl的基因表達(dá)。圖18展示了 TGFBl sd-rxRNA篩選的結(jié)果。圖19展示了在給予靶向TGFB2的sd-rxRNA之后TGFB2的基因表達(dá)。圖20展示了在給予靶向TGFB2的sd-rxRNA之后TGFB2的基因表達(dá)。圖21展示了在給予靶向TGFB2的sd-rxRNA之后TGFB2的基因表達(dá)。圖22展示了在給予靶向TGFB2的sd-rxRNA之后TGFB2的基因表達(dá)。圖23展示了在給予靶向TGFB2的sd-rxRNA之后TGFB2的基因表達(dá)。圖24展示了 TGFB2 sd-rxRNA篩選的結(jié)果。圖25展示了有效力的hSPPl sd-rxRNA的鑒別。圖26展示了有效力的hSPPl sd-rxRNA的鑒別。圖27展示了有效力的hSPPl sd-rxRNA的鑒別。圖28展示了 SPPl sd-rxRNA復(fù)合物選擇。圖29展示了連接物化學(xué)物質(zhì)的變體不影響體外sd-rxRNA的沉默活性。利用被動吸收測試在多種sd-rxRNA上(祀向Map4k4或PPIB)對兩種不同的連接物化學(xué)物質(zhì)(輕脯氨酸連接物以及ribo連接物)進(jìn)行了評估以確定有利于自身遞送的連接物。不存在遞送載體(被動轉(zhuǎn)染)情況下，用luM、0.1uM或0.0luM的sd-rxRNA轉(zhuǎn)染海拉細(xì)胞持續(xù)48hrs。任一連接物的使 用導(dǎo)致sd-rxRNA的有效遞送。圖30描述了纖維化途徑中作為中心因子的CTGF。圖31描述了創(chuàng)傷愈合各階段。圖32描述了 sd-rxRNA前導(dǎo)的化學(xué)優(yōu)化。圖33展示了經(jīng)化學(xué)優(yōu)化的CTGF LI sd-rxRNA是活性的。圖34展示了經(jīng)化學(xué)優(yōu)化的CTGF LI sd-rxRNA的體外效能。圖35展示了經(jīng)化學(xué)優(yōu)化的CTGF LI sd-rxRNA的體外穩(wěn)定性。圖36展示了經(jīng)化學(xué)優(yōu)化的CTGF L2 sd-rxRNA是活性的。圖37展示了經(jīng)化學(xué)優(yōu)化的CTGF L2 sd-rxRNA的體外效能。圖38展示了經(jīng)化學(xué)優(yōu)化的CTGF L2 sd-rxRNA的體外穩(wěn)定性。圖39提供了在體內(nèi)具有活性的復(fù)合物的總結(jié)。圖40展示了用CTGF LlB靶標(biāo)序列進(jìn)行處理導(dǎo)致mRNA沉默。圖41展示了用CTGF L2靶標(biāo)序列進(jìn)行處理導(dǎo)致mRNA沉默。圖42展示了 RX1-109的兩種皮內(nèi)注射之后的CTGF沉默。圖43展示了在SD大鼠中皮內(nèi)注射該sd-rxRNA之后皮膚中CTGF沉默的持續(xù)時間。獲取八毫米的皮膚活檢，并且將mRNA水平通過QPCR進(jìn)行量化并且標(biāo)準(zhǔn)化為一種管家基因。顯示的是與非靶標(biāo)對照(NTC)相比的沉默百分?jǐn)?shù)(%);每一時間點處的PBS是一個實驗組；*p < 0.04 ;**p < 0.002。圖44展示了經(jīng)化學(xué)優(yōu)化的CTGF L3 sd-rxRNA是活性的。圖45展示了 CTGF L4 sd-rxRNA的絕對發(fā)光。圖46展示了經(jīng)化學(xué)優(yōu)化的CTGF L4 sd-rxRNA是活性的。圖47展示了在SD大鼠中皮內(nèi)注射CTFG sd-rxRNA之后皮膚中CTGF、α -SM肌動蛋白、膠原1Α2以及膠原3Α1的mRNA表達(dá)水平的變化。通過qPCR對mRNA水平進(jìn)行量化。
圖48展示了用靶向CTGF的sd-rxRNA進(jìn)行處理，在創(chuàng)傷愈合方面沒有明顯延遲。用靶向CTGF以及靶向C0X2的sd-rxRNA組合進(jìn)行處理，觀察到一些變化。圖49展示了 Sd-rxRNA的給予在經(jīng)過至少9天的過程中降低了創(chuàng)傷寬度。圖表顯示了在大鼠中于創(chuàng)傷后3天、6天以及9天時對創(chuàng)傷的顯微測量。每一組代表5只大鼠。對每一創(chuàng)傷的兩個非連續(xù)切片進(jìn)行測量并且計算每一創(chuàng)傷的這兩個切片的平均寬度。*P〈0.05相對于PBS —種NTC。圖50展示了 sd-rxRNA的給予在經(jīng)過至少9天的過程中降低了創(chuàng)傷面積。圖表顯示了在大鼠中于創(chuàng)傷后3天、6天以及9天時對創(chuàng)傷的顯微測量。每一組代表5只大鼠。對每一創(chuàng)傷的兩個非連續(xù)切片進(jìn)行測量并且計算每一創(chuàng)傷的這兩個切片的平均寬度。*P〈0.05相對于PBS —種NTC。圖51展示了 sd-rxRNA的給予在經(jīng)過至少9天的過程中提高了創(chuàng)傷重新形成上皮的百分?jǐn)?shù)。圖表顯示了在大鼠中于創(chuàng)傷后3天、6天以及9天時對創(chuàng)傷的顯微測量。每一組代表5只大鼠。對每一創(chuàng)傷的兩個非連續(xù)切片進(jìn)行測量并且計算每一創(chuàng)傷的這兩個切片的平均寬度。*p〈0.05相對于PBS—種NTC。圖52展示了 sd-rxRNA的給予在經(jīng)過至少9天的過程中提高了平均的肉芽組織成熟度評分。圖表顯示了在大鼠中于創(chuàng)傷后3天、6天以及9天時對創(chuàng)傷的顯微測量(5=成熟，1=未成熟)。每一組代表5只大鼠。圖53展示了第9天創(chuàng)傷中的⑶68標(biāo)記(0=無標(biāo)記，3=實質(zhì)性標(biāo)記)。每一組代表5只大鼠。 圖54展示了各CTGF前導(dǎo)在體外具有不同的毒性水平。圖55展示了 RXI 109劑量按比例增加之后細(xì)胞活力的百分比(%)(寡核苷酸配制在PBS中)。圖56是階段I以及2臨床試驗設(shè)計的示意圖。圖57是階段I以及2臨床試驗設(shè)計的示意圖。圖58展示了在肝中相對于PBS對照的PPIB表達(dá)的減少百分?jǐn)?shù)(%)。通過單一的尾部靜脈注射將配制了類脂的rxRNA(10mg/kg)全身性地遞送至Balb/c小鼠(n=5)。在注射之后24小時處獲取肝組織并且通過qPCR對表達(dá)進(jìn)行分析(標(biāo)準(zhǔn)化為β_肌動蛋白)。Map4K4 rxRNAori也顯示出顯著的沉默(約83%，p〈0.001)，盡管Map4K4 sd-rxRNA沒有顯著地減少靶標(biāo)基因表達(dá)(約17% p=0.019)。TD.035.2278，公開的類脂遞送試劑，98N12-5 (I)，來自Akinc公司，2009。圖59展示了經(jīng)化學(xué)優(yōu)化的PTGS2L1 sd-rxRNA是活性的。圖60展示了經(jīng)化學(xué)優(yōu)化的PTGS2L2 sd-rxRNA是活性的。圖61展示了經(jīng)化學(xué)優(yōu)化的hTGFBlLl sd-rxRNA是活性的。圖62展示了經(jīng)化學(xué)優(yōu)化的hTGFBlLl sd-rxRNA是活性的。圖63展示了經(jīng)化學(xué)優(yōu)化的hTGFB2Ll sd-rxRNA是活性的。圖64展示了經(jīng)化學(xué)優(yōu)化的hTGFB2 sd-rxRNA是活性的。詳細(xì)說明本發(fā)明的多個方面涉及殘余基因沉默的方法與組合物。本發(fā)明至少部分地基于以下出人意料的發(fā)現(xiàn):將sd-rxRNA分子給予至皮膚，比如通過皮內(nèi)注射或皮下注射，在皮膚中產(chǎn)生基因表達(dá)的有效沉默。在此還通過基于細(xì)胞的篩選對高效力的靶向多種基因的sd-rxRNA 分子進(jìn)行了鑒別，這些基因包括 SPPl、CTGF、PTGS2、TGFBl 以及 TGFB2。sd-rxRNA代表了一種新類別的治療性RNAi分子，它們在治療受損皮膚中具有顯著潛力。sd-rxRNA 分子本發(fā)明的多個方面涉及sd-rxRNA分子。如在此使用的sd-rxRNA”或“sd-rxRNA分子”指一種自我遞送RNA分子，比如描述于2009年9月22日提交的題為“小化的自我遞送 RNAI 復(fù)合物”(“REDUCED SIZE SELF-DELIVERING RNAI COMPOUNDS.”)的 PCT
發(fā)明者阿納斯塔西婭·赫沃羅瓦, 威廉·薩洛蒙, 瓊安·卡門斯, 德米特里·薩馬爾斯基, 托得·M·伍爾夫, 帕米拉·A·帕夫克, 林恩·利伯蒂娜, 詹姆斯·卡爾迪亞, 卡倫·G·布洛克 申請人:雷克西制藥公司