專利名稱：用于治療腎細胞癌的化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于治療疾病的藥物。更具體地，本發(fā)明涉及用于治療腎細胞癌的組合物，所述組合物包括含光神霉素(mithramycin)的組合物,所述腎細胞癌包括透明細胞腎細胞癌、希佩爾-林道(Von Hippel-Lindau)病或Birt-Hogg_Dub6綜合癥。本發(fā)明還涉及光神霉素用于制備治療腎細胞癌的藥物的用途。
背景技術(shù)：
光神霉素(也稱為金霉酸、普卡霉素(plicamycin)或光輝霉素(mitramycin))是由鏈霉菌屬的各種土壤細菌產(chǎn)生的一種金霉酸型聚酮抗生素。光神霉素具有化學式 測
QB光神霉素已經(jīng)用于治療骨轉(zhuǎn)移患者的聞I丐血癥、佩吉特氏(Paget)癥、辜丸癌和白血病的靶向治療(Yuan等，Cancer 2007，110 :2682_2690)。光神霉素還顯示出具有作為用于緩和與P-地中海貧血和錸狀細胞貧血癥相關(guān)的癥狀的神經(jīng)保護藥物的潛力。光神霉素結(jié)合到DNA的小溝中富含GC的區(qū)域，并抑制了具有富含GC啟動子的基因轉(zhuǎn)錄。因此光神霉素通過結(jié)合到這些位點的轉(zhuǎn)錄因子，例如Spl家族，的調(diào)節(jié)抑制的基因轉(zhuǎn)錄。已經(jīng)證明Spl參與調(diào)節(jié)血管生成刺激物血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，且已經(jīng)有報導(dǎo)光神霉素用于抑制動物的血管增生。腎細胞癌(RCC)占所有癌癥的2 3%，且為成人中腎臟癌癥的最常見的類型。盡管常規(guī)的透明細胞腎細胞癌(ccRCC)占RCC病例的超過75%，但是RCC為具有多種組織病理亞型的異質(zhì)性障礙。RCC的非透明細胞形式包括乳突(或易染)RCC、難染細胞腫瘤、嗜酸粒細胞瘤、集尿管癌和罕見的髓樣癌。外科切除是目前首選的用于局部限制RCC的治療，且通常在RCC較早階段可以達到治愈。傳統(tǒng)上認為RCC對放射療法具有很大耐藥性，并且體外研究已經(jīng)顯示腎臟癌細胞是人類細胞類型中最不放射敏感的細胞之一。并且，已經(jīng)證明多數(shù)晩期RCC腫瘤對細胞毒素試劑具有耐藥性，因此化療在轉(zhuǎn)移的腎臟癌癥治療中的作用非常有限。RCC的大多數(shù)病例為偶發(fā)的，且所有病例的僅約3%具有遺傳原因。然而，針對RCC的罕見遺傳形式的研究已經(jīng)提供了關(guān)于家族性和偶發(fā)性RCC的在分子發(fā)病機理的有重大影響的觀點。希佩爾-林道(VHL)病為顯性遺傳的多系統(tǒng)家族性癌癥綜合癥，表征為透明細胞腎細胞癌(ccRCC)的生長以及成血管細胞瘤、胰腺損害和嗜鉻細胞瘤。VHL為遺傳性RCC的最常見原因。對VHL病的基因鑒定已經(jīng)使人們認識到在偶發(fā)性ccRCC的進化中最頻發(fā)的遺傳事件是VHL腫瘤抑制基因(TSG)的體細胞失活。進ー步的工作已經(jīng)使人們理解了 VHL TSG失活導(dǎo)致了 HIF-I和HIF-2轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)異常和缺氧-應(yīng)答基因通路的激活(Latif等，Science 1994,260 1317-20 ；Foster 等，Cancer 1994,69 :230-4 ；Gnarra 等，Nat Genet1994,7 :85-90 ；Clifford 等，Genes Chromosomes Cancer 1998,22 :200-9 ；Maxwell 等，Nature 399 :271-275,1999 ；Banks 等，Cancer Res 2006,66 :2000_7)。目前已知在含氧量正常的條件下，VHL腫瘤抑制基因產(chǎn)物，pVHL，在泛素連接酶復(fù) 合體中發(fā)揮作用，該泛素連接酶復(fù)合體靶向為在蛋白酶體中用于破壞的缺氧-應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄因子亞基(HIF-Ia和HIF-2a)。VHL失活導(dǎo)致了 HIF-I和HIF-2的水平提高，引起了關(guān)于生長和血管增生的靶基因，例如VEGF和TOGF的過表達。這些發(fā)現(xiàn)已經(jīng)提供了如索拉非尼(sorafenib)和舒尼替尼(sunitinib) (HIF靶基因通路的抑制劑)等藥物在轉(zhuǎn)移的RCC治療中的用途的理論依據(jù)(Patel等，Br JCancer. 2006,94:614-9 ;Motzer 等，J Clin Oncol. 2009，27 :3584_90)。Birt-Hogg-Dube (BHD)綜合癥為與RCC敏感性有關(guān)的另一種顯性遺傳的家族性癌癥綜合癥。BHD還與良性皮膚纖維毛囊瘤(毛囊的錯構(gòu)瘤)、多發(fā)肺囊腫和自發(fā)氣胸相關(guān)(Toro等，J. Med. Genet. 2008,45 :321-331 )。BHD-相關(guān)的腎臟腫瘤具有各種的組織病理，但通常為難染RCC/嗜酸粒細胞腺瘤。BHD綜合癥由雌酮(FLCN)基因中失活突變引起(Nickerson等，Cancer Cell2002,2 :157-164 ;Schmidt 等，Am J Hum Genet. 2005,76 :1023-33 ;Lim等，Hum Mutat. 2010Jan 31(1) :E1043-51)，且來自BHD患者的腎臟腫瘤表明了體細胞FLCN的缺失。FLCN基因產(chǎn)物的精確功能仍然正在被闡明，但已經(jīng)將雌酮(和雌酮相互作用蛋白FNIPl和FNIP2)與 mTOR 和 AMPK 信號通路相聯(lián)系(Baba 等，Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A. 2006，103 15552-15557 ；Hasumi 等，Gene 2008，415 :60-7 ；Takagi 等，0ncogene2008, 27 :5339_47)。在具有腎臟-靶向的Flcn基因純合性失活的小鼠中，腎臟腫瘤和囊腫隨著mTOR的激活而發(fā)展，并且mTOR抑制劑鈉巴霉素(rapamycin)減少了腎臟病變，并提高了存活率(Baba等，J. Natl. Cancer Inst. 2008，100 :140-154 ;Chen 等，PloS ONE 2008，33 :e3581 )。mTOR 抑制劑藥物(例如Temsirolimus、Everolimus等)已經(jīng)顯示了治療轉(zhuǎn)移RCC的希望(Molina和Motzer Clin Genitourin Cancer 2008Dec,6Suppl I :S7_13)。通常提供BHD綜合癥的患者的腎臟影像以便進行RCC的早期檢測。然而，ー些患者可能僅在患有晩期RCC之后才得到診斷。對于家族性的和偶發(fā)性的病例來說轉(zhuǎn)移的RCC的治療都具有挑戰(zhàn)性。盡管偶有患者可以對用細胞因子干擾素和白細胞介素-2的免疫療法有反應(yīng)，但是最近以針對HIF下游祀點(例如舒尼替尼(Sunitinib)、索拉非尼(Sorafenib)、貝伐珠單抗(Bevacizumab)等)，和mTOR通路(例如Temsirolimus、依維莫司(Eveix)Iimus))的靶向治療已經(jīng)成為最頻繁的處理對策。然而，這些制劑，盡管延長了生命，但不是細胞毒性的，因此靶向細胞毒性制劑的鑒定將會是重大的進展。色霉素A3(ChA3)(—種金霉酸化合物)已經(jīng)被鑒定為HIF-依賴的細胞毒素。ChA3顯示了區(qū)別地殺死ccRCC細胞系中的VHL-缺陷細胞(Sutphin等，Cancer Res2007，67 (12)，5896-5902)。已經(jīng)顯示在VHL-陽性透明細胞RCC細胞系中HIF_2a的過表達表型模擬了VHL失活對于ChA3毒性敏感性的影響。然而，ChA3在FLCN-缺陷的和FLCN-野生型的細胞系中沒有顯示出差別生長抑制活性，暗示了其不可能對BHD綜合癥的藥物治療有用。因此，有需要克服以上討論的缺陷的對腎細胞癌的治療。而且，有需要以FLCN基因缺陷的細胞和與該缺陷相關(guān)的缺陷為靶點的治療。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明，提供了一種用于治療腎細胞癌的組合物，所述組合物包括光神霉素 或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物。具體地，所述組合物適于在治療透明細胞腎細胞癌中使用。所述組合物在與希佩爾-林道病或Birt-Hogg_Dub6綜合癥相關(guān)的腎細胞癌的治療中特別有用。 本發(fā)明還提供了ー種用作抗FLCN無效(FLCN-nulI)或VHL無效(VHL-nulI)的腎細胞癌的細胞的細胞毒劑的組合物，所述組合物包括光神霉素或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物。細胞毒劑為對細胞有毒，且可導(dǎo)致細胞各種結(jié)果的制劑。細胞可能會停止活性生長和分裂，或可能經(jīng)歷壞死，或者細胞可能經(jīng)歷程序性細胞死亡(細胞凋亡)。經(jīng)歷壞死的細胞失去了細胞膜完整性，表現(xiàn)出快速膨脹，停止新陳代謝井向其周圍釋放細胞內(nèi)含物。細胞凋亡的過程為ー種有序的事件，表征為折射率的變化、細胞質(zhì)收縮、細胞核凝結(jié)和DNA裂解。凋亡的細胞停止新陳代謝，失去細胞膜完整性并裂解。本發(fā)明還提供了一種用于抑制FLCN無效的腎細胞癌細胞的生長的組合物，所述組合物包括光神霉素或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物。本發(fā)明還提供了一種用于抑制VHL無效的腎細胞癌細胞的生長的組合物，所述組合物包括光神霉素或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物。術(shù)語“抑制”意味著減少、減緩或阻止。因此，本發(fā)明的化合物可以減少、減緩或阻止腫瘤細胞的生長。如此處所使用的，“生長”意味著尺寸増加或増殖或兩者皆有。因此本發(fā)明的化合物可以抑制腫瘤細胞變得更大和/或可以防止腫瘤細胞分裂和復(fù)制，并防止腫瘤細胞的數(shù)量増加。細胞可以在體外?；蛘?，細胞可以在體內(nèi)并可以在受試者中發(fā)現(xiàn)。細胞可以來自于任何生物體，包括但不限于細菌。本發(fā)明還提供了ー種用于誘導(dǎo)FLCN無效的腎細胞癌的細胞死亡的組合物，所述組合物包括光神霉素或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物。本發(fā)明還提供了ー種用于誘導(dǎo)VHL無效的腎細胞癌的細胞死亡的組合物，所述組合物包括光神霉素或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物。本發(fā)明還提供了一種用于治療與FLCN失活相關(guān)的腎細胞癌的組合物，所述組合物包括光神霉素或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物。
本發(fā)明還提供了ー種用于治療FLCN失活相關(guān)的腎細胞癌的組合物，所述組合物包括長春新堿或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物。本發(fā)明還提供了一種用于治療與FLCN失活相關(guān)的腎細胞癌的組合物，所述組合物包括紫杉醇(taxol)或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物。本發(fā)明還提供了一種用于治療與FLCN失活相關(guān)的腎細胞癌的組合物，所述組合物包括葉下珠甙或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物。
基因可能由基因突變而失活。突變可包括點突變(變換或顛換)、插入或缺失。點突變可以為沉默突變(編碼相同的氨基酸)、錯義突變(編碼不同的氨基酸)或無義突變(編碼終止子)。插入可以改變mRNA的剪切或引起改變基因產(chǎn)物的移碼。缺失也可以改變讀碼框從而影響基因產(chǎn)物。在更大范圍，染色體結(jié)構(gòu)中的突變可以包括擴增或基因復(fù)制、染色體區(qū)域的缺失、染色體易位、中間缺失和染色體倒位。本發(fā)明還提供了一種用于治療與VHL失活相關(guān)的腎細胞癌的組合物，所述組合物包括光神霉素或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物。本發(fā)明還提供了ー種超過對FLCN-野生型細胞的對FLCN無效細胞的差別生長抑制的組合物，所述組合物包括光神霉素或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物。優(yōu)選地，所述組合物包括光神霉素或其治療上有效的衍生物或代謝物。優(yōu)選地，所述組合進ー步包括鈉巴霉素或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物。所述組合還可包括鈉巴霉素治療上有效的衍生物或代謝物。本發(fā)明還提供了光神霉素或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物用于制備治療腎細胞癌的藥物的用途。具體地，本發(fā)明提供了光神霉素或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物用于制備治療腎細胞癌的藥物的用途。本發(fā)明還提供了光神霉素或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物用于制備治療VonHippel-Lindau病或Birt_Hogg-Dub6綜合癥的藥物的用途。本發(fā)明還提供了一種治療腎細胞癌的方法，所述方法包括向受試者給藥包含光神霉素或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物的組合物。本發(fā)明還提供了一種治療腎細胞癌的方法，所述方法包括向受試者給藥包含紫杉醇(taxol )、葉下珠甙或長春新堿的組合物。本發(fā)明還提供了一種治療腎細胞癌的方法，所述方法包括向受試者給藥組合物，所述組合物包含光神霉素或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，并且所述組合物進ー步包含鈉巴霉素或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物。所述“受試者”可以包括家養(yǎng)的動物，例如貓、狗等，家畜類(例如牛、馬、豬、綿羊、山羊等)，實驗動物(如小鼠、兔子、大鼠、豚鼠等)和禽類。優(yōu)選地，所述受試者為哺乳動物，例如靈長類，更優(yōu)選為人。所述組合物可以進一歩包括藥學上可接受的載體。所述組合物以有效地治療受試者中腎細胞癌的量適當?shù)亟o藥。通常，化合物的“有效量”為需要達到ー個或多個期望結(jié)果的量。包括本發(fā)明化合物的組合物可以通過數(shù)個給藥途徑的任何ー個向受試者給藥,包括，例如ロ服(例如以水性或非水性溶液或懸浮液，片劑、丸剤、粉劑、顆粒劑、糊劑的方式進行灌服而應(yīng)用于口腔)，舌下給藥、肛門給藥、直腸給藥或陰道給藥(例如以陰道環(huán)、乳劑或泡沫劑方式)，胃腸外給藥(包括例如滅菌溶液或懸浮液的肌肉、靜脈、皮下或鞘內(nèi)給藥)，鼻部給藥，腹膜內(nèi)給藥，皮下給藥，經(jīng)皮給藥(例如以貼劑方式應(yīng)用于皮膚)，或局部地(例如以霜劑、藥膏或噴霧應(yīng)用于皮膚)。所述化合物還可以配制為吸入劑。具體地，本發(fā)明提供了一種治療透明細胞腎細胞癌的方法，所述方法包括向受試者給藥包括光神霉素的組合物。本發(fā)明還提供了一種治療透明細胞腎細胞癌的方法，所述方法包括向受試者給藥組合物，所述組合物包含光神霉素，并進一歩包括鈉巴霉素。本發(fā)明還提供了一種治療與希佩爾-林道病或Birt-Hogg_Dub6綜合癥相關(guān)的腎細胞癌的方法，所述方法包括向受試者給藥包含光神霉素的組合物。本發(fā)明還提供了ー種治療與希佩爾-林道病或Birt-Hogg-Dub6綜合癥相關(guān)的腎細胞癌的方法，所述方法包括向受試者給藥組合物，所述組合物包含光神霉素，所述組合物進ー步包含鈉巴霉素。
本發(fā)明還提供了ー種抑制FLCN無效的腎細胞癌細胞的生長的方法，所述方法包括向受試者給藥包含光神霉素的組合物。本發(fā)明還提供了ー種抑制VHL無效的腎細胞癌細胞的生長的方法，所述方法包括向受試者給藥包含光神霉素和鈉巴霉素的組合物。本發(fā)明還提供了ー種抑制VHL無效的腎細胞癌細胞的生長的方法，所述方法包括向受試者給藥包含光神霉素的組合物。本發(fā)明還提供了ー種抑制VHL無效的腎細胞癌細胞的生長的方法，所述方法包括向受試者給藥包含光神霉素和鈉巴霉素的組合物。本發(fā)明還提供了ー種超過對FLCN-野生型細胞的對FLCN無效細胞生長的差別抑制的方法，所述方法包括給藥包含光神霉素的組合物。本發(fā)明還提供了ー種超過對FLCN-野生型細胞的對FLCN無效細胞生長的差別抑制的方法，所述方法包括給藥包含光神霉素和鈉巴霉素的組合物。盡管ChA3顯示了有區(qū)別地殺死ccRCC細胞系中的VHL-缺乏細胞，但是我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ChA3在FLCN-缺乏的和FLCN-野生型的細胞系中沒有顯示出差別生長抑制活性。我們沒有發(fā)現(xiàn)色霉素A3 (ChA3)對于FLCN缺乏的細胞和FLCN陽性的細胞的生長抑制活性的任何差別。然而，已經(jīng)令人驚奇地發(fā)現(xiàn)光神霉素證明了其對超過對FLCN-野生型細胞的對FLCN無效的細胞的選擇敏感性。光神霉素顯示了在FLCN無效的細胞和FLCN-野生型細胞之間GI5tl值大約10倍的差別(即，用于FLCN-野生型細胞的光神霉素的GI5tl是用于FLCN無效的細胞的光神霉素的GI5tl的大約10倍)，優(yōu)選地，光神霉素以劑量依賴方式誘導(dǎo)了 FLCN無效的細胞中的細胞凋亡蛋白酶3/7 (caSpaSe3/7)的活性。光神霉素對于FLCN無效的細胞的毒性是對野生型FLCN表達細胞的毒性的約10倍。還令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，根據(jù)等基因(isogenic)的VHL無效和VHL-表達RCC細胞系中的VHL狀態(tài)，光神霉素顯示出差別生長抑制活性。光神霉素的活性與ChA3相反，我們沒有發(fā)現(xiàn)在FLCN缺乏的細胞系和FLCN陽性的細胞系的生長抑制活性之間ChA3的活性的任何差別。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)光神霉素顯示其超過對FLCN-野生型細胞的對于FLCN無效的細胞的選擇細胞毒素活性。因此，光神霉素展現(xiàn)出對RCC的治療，特別是作為對于FLCN-缺乏的RCC和VHL-缺乏的RCC的基因型選擇治療。此外，還令人驚奇地發(fā)現(xiàn)紫杉醇(taxol)顯示了在U0K257VHL無效的細胞和U0K257FLCN-野生型細胞之間GI5tl值有幾乎7倍的差別。葉下珠甙和長春新堿都顯示了在U0K257VHL無效的細胞和U0K257FLCN-野生型細胞之間GI5tl值有大約2倍的差別(見表I)。這說明紫杉醇、葉下珠甙和長春新堿都展現(xiàn)出對與FLCN失活相關(guān)的腎細胞癌的治療。


現(xiàn)將通過結(jié)合附圖的實施例說明本發(fā)明，其中圖IA顯示了由SRB檢測測定的6種化合物對于U0K257-FLCN-陰性細胞和U0K257-FLCN-陽性細胞生長的抑制。圖IB顯示了 U0K257-FLCN陰性細胞和U0K257-FLCN陽性細胞對于15種化合物的GI50的比例。圖2A顯示了 U0K257-FLCN陰性細胞和U0K257-FLCN陽性細胞對于6種化合物的 細胞凋亡蛋白酶3/7活性的比例。圖2B顯示了 U0K257-FLCN-陰性細胞和U0K257-FLCN-陽性細胞在響應(yīng)于藥物暴露時的細胞存活比例。圖2C顯示了具有和不具有FLCN表達的UOK細胞響應(yīng)于光神霉素暴露時細胞蛋白表達。圖3顯示了在U0K257-FLCN-陰性細胞和U0K257-FLCN-陽性細胞中由克隆形成檢驗測量的光神霉素的細胞毒性。圖4顯示了由光神霉素對786-0細胞和FTC-133細胞生長抑制的GI5tl值。圖5顯示了通過SRB檢驗測定的在對單獨的光神霉素暴露和光神霉素結(jié)合鈉巴霉素暴露的響應(yīng)中U0K257-FLCN-和U0K257-FLCN+細胞的生長抑制。圖6顯示了具有和不具有FLCN表達的UOK細胞和FTC細胞中細胞蛋白表達的基礎(chǔ)水平。圖7顯示了在單獨的光神霉素和在光神霉素結(jié)合鈉巴霉素中培養(yǎng)的U0K-257細胞和UOK-FLCN細胞比較的不成對t-檢驗。
具體實施例方式我們進行了實驗以證明在FLCN失活和VHL失活的RCC細胞系中光神霉素的基因型選擇細胞毒性，并將其與其他可能的抗癌試劑做了比較。材料由 Developmental Therapeutics Program of the National Cancer Institute(NCI) / NIH (http://dtp. nci. nih. gov)提供嗎啉代-ADR (NSC 354646)、氰基嗎啉代-ADR(NSC 357704)、棘霉素(NSC 13502)、色霉素 A3 (NSC 58514)、鴉膽丁(NSC67574)、長春新堿硫酸鹽(NSC 165563)、代代寧 B (NSC 325319)、紫杉醇(Taxol，NSC 125973)、光神霉素(NSC24559)、葉下珠甙(NSC 266492)、鹽酸比生群(NSC 337766)、多柔比星(亞德里亞霉素、NSC123127)、VM-26 (替尼泊苷，NSC 122819)、美諾立爾(NSC 269148)、N，N-ニ苯基道諾霉素(NSC 268242)、和鈉巴霉素(NSC 226080)。細胞系和細胞培養(yǎng)由 Marston Linehan 博士 和 Laura S Schmidt 博士(Urologic OncologyBranch,Centre for Cancer Research,National Cancer Institute,NationalInstitutes of Health, Bethesda, MD 20892, USA)提供源于 BHD 的人類腎癌細胞UOK-257 (U0K-FLCNつ和 FLCN 感染的 U0K-257 細胞 UOK-FLCN+ (Yang 等，Cancer GenetCytogenet. 2008Jan 15,180(2) :100_9)。U0K-257 是源自 BHD 患者的唯一的 RCC 細胞系，并具有種系FLCN移碼突變(c. 1285dupC)(在沒有無義介導(dǎo)的mRNA降解下，預(yù)料導(dǎo)致了過早的蛋白截斷(P. His429ProfsX27) (Yang 等，Cancer Genet Cytogenet. 2008Jan 15,180(2) 100-9)0我們沒有察覺到任何具有純合FLCN失活的偶發(fā)RCC細胞系。FTC-133細胞購自ECACC (Salisbury, United Kingdom)。這些細胞是源自人類甲狀腺癌的非RCC細胞系。786-0 細胞來自作者的實驗室(Clifford 等，Hum Mol Genet. 200 IMay 1,10(10)1029-38)。786-0為具有失活的VHL基因突變的腎臟癌細胞系(c. 311delG p. G104fs*55)。除了 FTC-133細胞在有DMEM和Henson (1:1)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)以外，所有細胞系都是在添加10%的胎牛血清的DMEM中培養(yǎng)。生長抑制檢測如Lu 等(Clin Cancer Res. 2001:7:2114-23)描述，利用磺酰羅丹明 B 檢驗(SRB) 測定了細胞系對于藥物-誘導(dǎo)的細胞生長抑制的敏感性。簡而言之，將附著的指數(shù)生長的細胞以3-5 X IO3細胞數(shù)/100 u L/孔接種于96-孔板中。在37°C下20 24h后，如結(jié)果部分所示，將藥物以合適的藥物濃度加入到孔中(最終DMSO濃度1%)。藥物處理72小時后，通過加入等體積的卡諾依固定液(甲醇こ酸=3:1)將細胞原位固定，洗滌，風干并用磺酰羅丹明 B (0. 4%, Sigma-Aldrich, Poole, United Kingdom)染色。在 Victor X3 多標記板讀數(shù)器上(Multilabel Plate Reader) (PerkinElmor, Beaconsfield, United Kingdom)在 570nm處測量每孔的吸光度。細胞凋亡蛋白酶ーGIo 3/7檢驗和細胞存活檢驗按照生產(chǎn)者的說明書，由細胞凋亡蛋白酶一 GIo 3/7檢驗(Promega, Southampton, United Kingdom)測定了暴露于化合物后誘導(dǎo)細胞凋亡蛋白酶3/7活化的能力。如在生長抑制檢驗中說明，接種細胞井向細胞給藥。在培養(yǎng)結(jié)束時，去除了 70 ii L培養(yǎng)基，并向剩余的培養(yǎng)基加入30 ii L檢驗試劑。在室溫下又進行了另外ー小時培養(yǎng)并同時震蕩。在Victor X3多標記板讀數(shù)器中(PerkinElmer, Beaconsfield, UnitedKingdom)測定合成發(fā)光。按照生產(chǎn)者的說明書，由CellTiter-藍細胞活力檢驗(Blue CellViability Assay) (Promega, Southampton, the United Kingdom)測定了暴露于化合物后的細胞活力。在藥物處理最后，20 u L試劑加入到96孔的培養(yǎng)基中，并另外培養(yǎng)細胞4小時。在 Victor X3 多標記板讀數(shù)器中(PerkinElmer, Beaconsfield, United Kingdom)設(shè)定570nm激發(fā)和590nm發(fā)射的熒光測量了細胞活力。克隆形成細胞生存檢驗在具有/不具有FLCN表達的U0K-257細胞中測定了光神霉素的細胞毒性。將指數(shù)生長的細胞以250至IX IO5個細胞/皿的密度接種于IOOmm培養(yǎng)皿中，藥物暴露后，將細胞接種密度調(diào)整為估計的10 300菌落/皿。使細胞附著24h，并將新制的光神霉素以合適的濃度加入到培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)基中DMSO的最終濃度為1%。對每個藥物濃度使用四個具有兩個接種密度的培養(yǎng)皿，且在每個設(shè)定條件下進行了至少三個實驗。細胞暴露于光神霉素72小時，此后將培養(yǎng)基吸出，用溫的PBS洗滌培養(yǎng)皿一次，然后加入新鮮的無藥物的培養(yǎng)基。將細胞另外培養(yǎng)1(T16天，直到明顯的菌落出現(xiàn)，用卡諾依固定液(甲醇こ酸=3:1)固定該菌落，并通過在磺酰羅丹明B (0.4%)中將細胞染色而使該菌落可見。計算大于30個細胞的菌落。未經(jīng)處理的細胞的克隆效率為UOK257-FLCN-26%，和UOK257-FLCN+34%。藥物暴露后的細胞活力表示為％控制克隆效率或存活。蛋白質(zhì)印跡分析按照標準程序，利用處理后48h的全細胞提取物測定響應(yīng)于藥物暴露時具有/不具有FLCN表達的UOK細胞中的細胞蛋白表達。按照生產(chǎn)者的說明(Bio-RadLaboratories Ltd, Hertfordshire, United Kingdom),利用 DC 蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。每個樣品的20 ii g的蛋白在12. 5% (w / v) SDS-PAGE凝膠中電泳，并電轉(zhuǎn)移至1J硝酸纖維素膜上(Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd. , Buckinghamshire, UnitedKingdom) o 使用抗 FLCN 的抗體(Arnim Pause 教授的贈品，Rosalind and MorrisGoodman Cancer Centre Montreal, Canada)、細胞凋亡蛋白酶 3 (Cell SignallingTechnology, Hertfordshire, United Kingdom)ネロ 肌胡蛋白(Sigma-Aldrich Company Ltd. , Dorset, United Kingdom)。カロ入鼠抗 IgG-HRP 偶聯(lián)物(DAK0, Ely, United Kingdom)后，利用增強化學發(fā)光(ECL+Plus，Amersham)系統(tǒng)檢測信號。細胞周期分析將具有/不具有FLCN表達的U0K-257細胞按每孔2，000個細胞接種于具有0. 1%的DMSO或lnmol/L的鈉巴霉素的96-孔板中，并在37°C /5%的C02培養(yǎng)過夜以使其附著。如結(jié)果部分表明，將藥物以合適的濃度加入到8個復(fù)制的孔中。在最后期間，小心移除培養(yǎng)基，并在85%的冰-預(yù)冷こ醇中固定細胞。去除こ醇后，在37°C的暗室中，在含0. 1%的Triton X-IOOUOOmg / mL的RNase A和IOmg / mL的碘化丙啶(PI)的PBS緩沖液中培養(yǎng)細胞20分鐘。隨后利用Acumen eX3細胞計數(shù)器(TTP LabTech)掃描96-孔板。結(jié)果基于在NCI-60板上的FLCN表達模式用COMPARE算法鑒定候選藥物NCI在1990年創(chuàng)造了組織引導(dǎo)的抗癌藥物篩選，以評估化合物的抗腫瘤活性的。建立了由來自9種不同組織型的60個腫瘤細胞系組成的細胞系板NCI60。重要地是，考慮到與具體分子改變相關(guān)的藥物活性分析，這60個細胞系包括分子缺陷譜。這些細胞系的一系列屬性得到了深入地表征，包括微列基因表達譜和體外藥物敏感性(例如已經(jīng)用>14，000種化合物對細胞系進行了細胞毒性敏感性篩選)(參見NCI Developmental TherapeuticProgram, http: / / dtp.nci.nih.gov)。為了鑒別可能以不同水平的FLCN表達差別地影響癌細胞系的候選抗癌試劑，根據(jù)公布的微陣列數(shù)據(jù)將細胞系分類為高、中或低FLCN表達子，并用COMPARE算法(Ross等，Nat Genet 2000，24 :227-35)分析。這些FLCN表達類型被用于構(gòu)建理論藥物活性模式或種子模式，能反應(yīng)以FLCN缺乏的細胞為靶點的藥物，或更具體地是以FLCN低表達子為靶點的藥物。目的是鑒別藥物，具有低FLCN表達的細胞系對所述藥物最敏感，且具有高FLCN表達的細胞系對所述藥物最有耐藥性(設(shè)定具有中等的或未確定的FLCN表達的細胞為中性靈敏度)。用COMPARE算法比較Developmental TherapeuticsProgram(DTP)數(shù)據(jù)庫(http: / / dtp. nci. nih. gov)中的單獨的化合物的FLCN種子模式，選擇對FLCN種子具有相似敏感度模式的15種化合物(所選化合物列于下表I中)。在具有/不具有FLCN表達的U0K-257細胞中篩選化合物敏感度
U0K-257是源自BHD患者并具有種系FLCN移碼突變(c. 1285dupC)的唯一的RCC細胞系(在沒有無義介導(dǎo)的mRNA裂解存在下，預(yù)料導(dǎo)致了過早的蛋白切斷)(p. His429ProfsX27) (Yang 等，Cancer Genet Cytogenet. 2008Jan 15,180(2) :100_9)。檢查U0K257-FLCf細胞和U0K257-FLCN+細胞對由選自COMPARE分析的15種化合物誘導(dǎo)的生長抑制的敏感度。接種細胞24h后，將各種濃度的化合物引入到細胞中，培養(yǎng)持續(xù)了 72小時，利用磺酰羅丹明B (SRB)檢驗評定生長抑制。然后計算GI5tl值，GI50定義為抑制50%生長所需的化合物濃度。計算得到U0K257-FLCN—和U0K257-FLCN+的GI5tl值的比例，并將其作對于FLCN突變體細胞敏感度的指示。
圖I (A)顯示了用SRB測驗測定的由氰基嗎啉代-ADR、鴉膽丁、甲基嗎啉-ADR、長春新堿、紫杉醇和光神霉素對U0K257-FLCN_ (實線)和U0K257-FLCN+ (虛線)細胞的生長抑制。細胞持續(xù)暴露于藥物的所示濃度下72小吋。點值和GI5tl值為來自于至少三個實驗的平均值土SD。圖I (B)顯示了在所有15種化合物中U0K257-FLCf和U0K257-FLCN+的GI5tl的比例。計算所述比例，并將其用作對于突變FLCN細胞敏感度的指示。 如圖I和表I所示，七種化合物相對更抑制U0K257_FLCN_細胞(比例>1 )，并且最具有選擇性的生長抑制敏感度是由光神霉素誘導(dǎo)的，其在U0K257-FLCN_細胞(64. 2±7. 9nM ；n=3)和U0K257-FLCN+細胞(3. 79±0. 39nM ；n=3)之間的GI5tl值具有幾乎10倍的差別。但是，U0K257_FLCN_細胞對其他八種化合物較不敏感(比例〈I)，且氰基嗎啉代-ADR誘導(dǎo)了最少的生長抑制敏感性，氰基嗎啉代-ADR在U0K257-FLCN"細胞(0. 62±0. 16nM ；n=3)和 U0K257-FLCK 細胞(3. 79±0. 39nM ;n=3)之間的 GI5tl 值具有 6 倍的差另1J。以上數(shù)據(jù)顯示盡管這些化合物以相同標準選自COMPARE算法，但是不同的藥物對具有/不具有FLCN表達的細胞的差別敏感度之間存在很大變化。表I在具有/不具有FLCNa的UOK細胞中化合物-誘導(dǎo)的生長抑制
權(quán)利要求
1.一種用于治療腎細胞癌的組合物，所述組合物包括光神霉素或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物。
2.如權(quán)利要求I所述的組合物，所述組合物用于治療透明細胞腎細胞癌。
3.如權(quán)利要求I或2所述的組合物，所述組合物用于治療與希佩爾-林道病或Birt-Hogg-Dub 6綜合征相關(guān)的腎細胞癌。
4.如權(quán)利要求3所述的組合物,所述組合物用于治療與Birt-Hogg-Dub6綜合征相關(guān)的腎細胞癌。
5.如前述權(quán)利要求的任一項所述的組合物，所述組合物用于抑制FLCN無效的腎細胞癌細胞的生長。
6.如前述權(quán)利要求的任一項所述的組合物，所述組合物用于抑制VHL無效的腎細胞癌細胞的生長。
7.如前述權(quán)利要求的任一項所述的組合物，所述組合物用于超過對FLCN-野生型細胞的對VHL無效的細胞的差別生長抑制。
8.如前述權(quán)利要求的任一項所述的組合物，所述組合物用于治療與FLCN失活相關(guān)的腎細胞癌。
9.如前述權(quán)利要求的任一項所述的組合物，所述組合物用于治療與VHL失活相關(guān)的腎細胞癌。
10.一種用于抑制FLCN無效的腎細胞癌細胞的生長的組合物，所述組合物包括光神霉素或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物。
11.一種用于抑制VHL無效的腎細胞癌細胞的生長的組合物，所述組合物包括光神霉素或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物。
12.—種用于對超過FLCN-野生型細胞的FLCN無效的細胞的差別生長抑制的組合物，所述組合物包括光神霉素或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物。
13.如前述權(quán)利要求的任一項所述的組合物，所述組合物進ー步包括鈉巴霉素或或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物。
14.一種實質(zhì)上如這里描述或說明的組合物或用途。
全文摘要
用于治療腎細胞癌的組合物，所述組合物包括光神霉素或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物。具體地，所述化合物適用于治療透明細胞腎細胞癌。所述化合物對治療與希佩爾-林道病或Birt-Hogg-Dubé綜合征相關(guān)的腎細胞癌尤其有用。用作抗FLCN無效和VHL無效的透明細胞腎細胞癌的細胞毒素試劑的組合物，所述組合物包括光神霉素或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物。
文檔編號A61K31/195GK102791261SQ201180010216
公開日2012年11月21日 申請日期2011年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月18日
發(fā)明者埃蒙·馬厄, 陸小虹 申請人:米羅力提絲技術(shù)有限公司