專利名稱：：一種漢族人高轉(zhuǎn)移性腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及微生物，具體涉及從一種漢族人腎透明細(xì)胞癌脊柱轉(zhuǎn)移灶中，建立有轉(zhuǎn)移表型的漢族人高轉(zhuǎn)移性腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞系■et-ccRCC，CCTCC一C200909。
背景技術(shù)：
：腎細(xì)胞癌(renalcellcarcinoma，RCC)是泌尿系統(tǒng)常見腫瘤，近幾年RCC發(fā)病率在全球呈顯著上升的趨勢(shì)。腎細(xì)胞癌臨床癥狀不典型，，易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，近30X的RCC患者初診時(shí)即發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移，其平均生存期為6-12個(gè)月，2年生存率為10%-20%。其中腎透明細(xì)胞癌最為常見，占70%-80%。RCC對(duì)放療、化療、內(nèi)分泌治療等多種腫瘤治療手段均不敏感，目前相對(duì)穩(wěn)定的治療方法為手術(shù)治療，但術(shù)后轉(zhuǎn)移率極高，1年轉(zhuǎn)移發(fā)生率為59%，2年為83%，3年為93%。在腎透明細(xì)胞癌中，轉(zhuǎn)移常見部位為肺、骨。為進(jìn)一步研究漢族人腎透明細(xì)胞癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移機(jī)制，為臨床預(yù)測(cè)、診斷及治療提供研究對(duì)象，需建立有效且穩(wěn)定的具有轉(zhuǎn)移特性的腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞系。自Ishihara報(bào)道了世界上第一個(gè)"人腎細(xì)胞癌細(xì)胞系"，至今己有許多實(shí)驗(yàn)室建立了不同病理類型的腎癌細(xì)胞系，包括來自原發(fā)及轉(zhuǎn)移部位，它們?cè)谘芯磕I癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要的作用。然而，目前為止建立的腎癌細(xì)胞系，尚無來自漢族人轉(zhuǎn)移灶可穩(wěn)定轉(zhuǎn)移的腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞系，無法對(duì)原發(fā)癌細(xì)胞系和具有穩(wěn)定轉(zhuǎn)移傾向細(xì)胞系的生物學(xué)特性進(jìn)行對(duì)比研究，也無法在漢族人腎癌研究中排除因人種遺傳背景和生活條件導(dǎo)致的差異。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于應(yīng)用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)從漢族人脊柱轉(zhuǎn)移灶中建立高轉(zhuǎn)移傾向的腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞系，并建立一種漢族人高轉(zhuǎn)移性腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞系，命名為HiMet-ccRCC。本發(fā)明的漢族人轉(zhuǎn)移性腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞系HiMet-ccRCC，己于2009年2月25日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)(地址中國(guó)武漢武漢大學(xué)430072)。保藏編號(hào)CCTCC一C200909本發(fā)明利用腎透明細(xì)胞癌患者脊柱轉(zhuǎn)移灶作為建系瘤源，采用體外培養(yǎng)方式建立了一株具有高轉(zhuǎn)移潛能的人腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞系。本發(fā)明的漢族人高轉(zhuǎn)移性腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞系是通過下列方法得到的，該方法包括下列步驟(1)原代培養(yǎng)1)轉(zhuǎn)移灶為取自上海長(zhǎng)征醫(yī)院腎透明細(xì)胞癌患者脊柱轉(zhuǎn)移灶的切除標(biāo)本，無菌條件下將該轉(zhuǎn)移灶取出放入盛有7-10mlD-Hanks液的玻璃平皿中，剔除壞死組織、脂肪組織、血管；2)浸泡組織塊于10-15ml的1640培養(yǎng)基中浸泡30-40min;3)將轉(zhuǎn)移灶剪成l-3mm'的小塊，將浸泡液及組織塊7-8ml—起轉(zhuǎn)移至離心管中，反復(fù)搖晃清洗2-3min，1500rpm，離心10min;4)棄上清，重新加入浸泡液7-8ml重新懸浮組織塊，反復(fù)搖晃清洗5min，1500卬m，離心10min;5)棄上清，用1640完全培養(yǎng)基3-4ml(含20%胎牛血清)懸浮組織塊，將懸液以lml/瓶移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶置于37"C，5%C02，95%濕度的CO,培養(yǎng)箱中孵育；6)24h后仔細(xì)吸去瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液，再加入卜l.5ml的1640完全培養(yǎng)基；7)接種完畢后，將培養(yǎng)瓶置于37°C，5%C02，95%濕度的CU培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h;8)7-14天即可見到組織塊周圍生長(zhǎng)出細(xì)胞，將培養(yǎng)基加至5-7ml。(2)傳代1)在超凈工作臺(tái)內(nèi)，取處于指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，于無菌條件下吸除培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液；2)用D-hanks液4-5ml清洗培養(yǎng)瓶2次后，加入0.25%胰蛋白酶lml，置37。C，5%C02，95%濕度的0)2培養(yǎng)箱中4-5min;3)當(dāng)在倒置顯微鏡下觀察大部分細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大，甚至看到有個(gè)別細(xì)胞漂浮起來時(shí)，加入1640完全培養(yǎng)基4ml，吸管反復(fù)輕輕吹打貼壁的細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液；4)計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至107ml，將該5-6ml細(xì)胞懸液接種于新的培養(yǎng)瓶中；(3)凍存1)取處于指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，吸除上述培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液；2)用D-hanks液4-5ml清洗培養(yǎng)瓶2次后，加入0.25%胰蛋白酶lml,置37。C，5%C02，95%濕度的0)2培養(yǎng)箱中4-5min;3)當(dāng)在倒置顯微鏡下觀察大部分細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大，甚至看到有個(gè)別細(xì)胞漂浮起來時(shí)，加入1640完全培養(yǎng)基4ml，吸管反復(fù)輕輕吹打貼壁的細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液；4)將細(xì)胞懸液收集至離心管中，1000rpm離心10min，棄上清液；5)細(xì)胞沉淀中加入凍存液1.5ml，計(jì)數(shù)并調(diào)整至5X10"細(xì)胞/ml，移入凍存管，將凍存管口密封；6)冷存管先置于4'C10min，移入-20°C30min，然后于-8(TC放置過夜，最后移入液氮；(4)復(fù)蘇1)準(zhǔn)備400-500ml的37"C-42"C的溫水，從液氮中取出凍存管，并迅速置于溫水中不斷攪動(dòng)；2)在超凈工作臺(tái)中打開凍存管，將細(xì)胞懸液吸到離心管中，1000rpm離心10min，棄去上清液；3)細(xì)胞沉淀中加入10ml1640完全培養(yǎng)基，吹打均勻制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度5X105/ml，轉(zhuǎn)移至兩個(gè)培養(yǎng)瓶中，置37"C，5%C02，95%濕度的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。復(fù)蘇后的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)與原培養(yǎng)細(xì)胞一致。上述方法中所述試劑的成分如下D-Hanks液氯化鈉8.Og，氯化鉀0.4g,Na2HP0412H200.08g，KH2P040.06g，NaHCO:i0.35g，淺酚紅2ml，超純水溶解并定容至1000ml1640培養(yǎng)基:RPMI1640粉10.4g，丙酮酸鈉0.llg，2-巰基乙醇0.01mol/L，NaHC0:,2g，超純水溶解并定容至lOOOml。1640完全培養(yǎng)基含1640培養(yǎng)基及20%(v/v)胎牛血清。0.25%胰蛋白酶含胰蛋白酶及D-Hanks液，以1:400(v/v)的比例配制。凍存液由1640完全培養(yǎng)基、小牛血清及二甲基亞砜以7:2:1的比例配制。本發(fā)明漢族人高轉(zhuǎn)移性腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞系HiMet-ccRCC，CCTCCN0.C200909，經(jīng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，其一般生物學(xué)特性表明，該細(xì)胞系呈上皮樣細(xì)胞形態(tài)，多邊不規(guī)則型，核質(zhì)比例倒置，貼壁生長(zhǎng)，接觸性生長(zhǎng)抑制喪失，超二倍體核型，染色體范圍60-80條之間，符合惡性腫瘤的遺傳學(xué)特性。細(xì)胞群體倍增時(shí)間為19.2h，克隆形成率41%。蘇木精-伊紅(HE)染色表明該細(xì)胞系核質(zhì)比例失調(diào)，核異形、雙核，且經(jīng)免疫組化分析顯示CA9、CD133均呈強(qiáng)陽性g經(jīng)不斷傳代及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)具有低轉(zhuǎn)移傾向。凍存后復(fù)蘇率達(dá)80%以上，復(fù)蘇后的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)與原培養(yǎng)細(xì)胞一致。本發(fā)明的又一目的是提供一種漢族人低轉(zhuǎn)移性腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞系HiMet-ccRCC，CCTCCNO.C200909,作為建立篩選制備檢測(cè)與防治漢族人腎細(xì)胞癌藥物的細(xì)胞模型的應(yīng)用。通過在NOD-SCID鼠皮下注射細(xì)胞(2X1()6個(gè)細(xì)胞)，并將皮下成瘤原位移植的方法，進(jìn)行了6輪鼠間傳代，成瘤時(shí)間由皮下接種時(shí)90天減少到7天，每輪原位成瘤率均為100%，且隨傳代次數(shù)的增加肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率逐漸增至100%。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>*其余兩只死亡時(shí)腫瘤達(dá)500,3，疑為惡液質(zhì)致死結(jié)論以上結(jié)果表明，本發(fā)明細(xì)胞系具有典型的腫瘤細(xì)胞系特征，且可致使N0D-SCID鼠發(fā)生穩(wěn)定轉(zhuǎn)移。本發(fā)明建立的漢族人高轉(zhuǎn)移性腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞系，為深入研究漢族人腎透明細(xì)胞癌的病因?qū)W，腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究及抗轉(zhuǎn)移的藥物篩選提供試驗(yàn)?zāi)Ｐ汀Dr貼壁生長(zhǎng)的腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞(ioox)。細(xì)胞為典型的上皮樣細(xì)胞，形狀不規(guī)則，貼壁生長(zhǎng)，接觸性抑制喪失，細(xì)胞核膜、核仁輪廓明顯，核仁清晰，胞質(zhì)少，核糖體顆粒豐富，大部分細(xì)胞雙核或多核圖2HE染色可見HiMet-ccRCC細(xì)胞核質(zhì)比例失調(diào)，核異形、雙核圖3腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞2X106細(xì)胞/0.2ml劑量接種N0D-SCID鼠皮下40天后，形成腫瘤體積為2X1.3X1.2Xlcm圖4第6輪，NOD-SCID鼠腎包膜接種8天后肺部自發(fā)轉(zhuǎn)移率100%，肺部見多個(gè)轉(zhuǎn)移灶具體實(shí)施例方式實(shí)施例lHiMet-ccRCC細(xì)胞的獲得1)轉(zhuǎn)移灶為取自上海長(zhǎng)征醫(yī)院腎透明細(xì)胞癌患者脊柱轉(zhuǎn)移灶的切除標(biāo)本，無菌條件下將該轉(zhuǎn)移灶取出放入盛有10mlD-Hanks液的玻璃平皿中，以浸沒大半組織為準(zhǔn)，剔除壞死組織、脂肪組織、血管等；2)浸泡組織塊于15ml1640培養(yǎng)基中浸泡30min;3)將轉(zhuǎn)移灶用眼科剪剪成lmm3的小塊，將浸泡液及組織塊一起轉(zhuǎn)移至離心管中，配平離心管，反復(fù)搖晃清洗2min。1500rpm，離心10min;4)棄上清，重新加入浸泡液7ml重新懸浮組織塊，反復(fù)搖晃清洗5min，1500rpm，離心10min;5)棄上清，用lml1640完全培養(yǎng)基(含20%胎牛血清)懸浮組織塊，將懸液以lml/瓶移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶置于37"C，5%C02，95%濕度的C02培養(yǎng)箱中孵育；6)24h后仔細(xì)吸去瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液，再加入lml的1640完全培養(yǎng)基；7)接種完畢后，將培養(yǎng)瓶置于37'C，5%C02，95%濕度的0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。8)7天后可見組織塊周圍生長(zhǎng)出細(xì)胞，此時(shí)可將1640完全培養(yǎng)基加至5ml。實(shí)施例2漢族人高轉(zhuǎn)移性腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞系動(dòng)物實(shí)驗(yàn)1)取細(xì)胞懸液(2X10，胞/0.2ml)分別注射3只5周齡NOD-SCID鼠(第二軍醫(yī)大學(xué)腫瘤研究所提供)背部皮下。90天后處死NOD-SCID鼠，進(jìn)行第1輪種植，取皮下瘤切成直徑lmm的組織小塊接種于腎包膜下，40天后原位形成直徑lcm的腫瘤。2)取上述原位瘤材復(fù)種于NOD-SCID鼠腎包膜下，進(jìn)行第2輪種植，39天后NOD-SCID鼠衰竭，取出肺轉(zhuǎn)移灶復(fù)種于腎包膜下。3)27天后，取出上述肺轉(zhuǎn)移灶復(fù)種于腎包膜下進(jìn)行第3輪。重復(fù)上述過程直至第6輪。以上結(jié)果表明，本發(fā)明細(xì)胞系具有典型的腫瘤細(xì)胞系特征，且可致使NOD-SCID鼠發(fā)生穩(wěn)定轉(zhuǎn)移。為深入研究中國(guó)人正常腎細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞在生物學(xué)、免疫、代謝及遺傳學(xué)方面的差異以及腎癌臨床研究提供穩(wěn)定的材料來源。權(quán)利要求1、一種漢族人高轉(zhuǎn)移性腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞系HiMet-ccRCC，CCTCCNO.C200909。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述漢族人高轉(zhuǎn)移性腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞系HiMet-ccRCC，CCTCCNO.C200909,其特征在于所述細(xì)胞系呈上皮樣細(xì)胞形態(tài)，多邊不規(guī)則型；貼壁生長(zhǎng)，接觸性生長(zhǎng)抑制喪失；超二倍體核型，染色體范圍60-80條之間；細(xì)胞群體倍增時(shí)間為19.2h，克隆形成率41%;HE染色表明該細(xì)胞系核質(zhì)比例失調(diào)，核異形、雙核，且經(jīng)免疫組化分析顯示CA9、CD133均呈強(qiáng)陽性。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述漢族人高轉(zhuǎn)移性腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞系HiMet-ccRCC，CCTCCNO.C200909,其特征在于所述細(xì)胞系是通輝下列方法得到的，該方法包括下列步驟(1)原代培養(yǎng)1)轉(zhuǎn)移灶為取自上海長(zhǎng)征醫(yī)院腎透明細(xì)胞癌患者脊柱轉(zhuǎn)移灶的切除標(biāo)本，無菌條件下將該轉(zhuǎn)移灶取出放入盛有7-10mlD-Hanks液的玻璃平皿中，剔除壞死組織、脂肪組織、血管；2)浸泡組織塊于10-15ml的1640培養(yǎng)基中浸泡30-40min;3)將轉(zhuǎn)移灶剪成l-3mnV'的小塊，將浸泡液及組織塊7_8ml—起轉(zhuǎn)移至離心管中，反復(fù)搖晃清洗2-3min，1500rpm，離心10min;4)棄上清，重新加入浸泡液7-8ml重新懸浮組織塊，反復(fù)搖晃清洗5min，1500rpm，離心10min;5)棄上清，用1640完全培養(yǎng)基3-4ml(含2096胎牛血清)懸浮組織塊，將懸液以lml/瓶移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶置于37。C，5%C02，95%濕度的C02培養(yǎng)箱中孵育；6)24h后仔細(xì)吸去瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液，再加入1-1.5ml的1640完全培養(yǎng)基;7)接種完畢后，將培養(yǎng)瓶置于37°C,5%C02，95%濕度的0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h;8)7-14天即可見到組織塊周圍生長(zhǎng)出細(xì)胞，將培養(yǎng)基加至5-7ml;(2)傳代1)在超凈工作臺(tái)內(nèi)，取處于指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，于無菌條件下吸除培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液；2)用D-hanks液4-5ml清洗培養(yǎng)瓶2次后，加入0.25%胰蛋白酶lml，置37。C，5%C02，95。/。濕度的C02培養(yǎng)箱中4-5min;3)當(dāng)在倒置顯微鏡下觀察大部分細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大，甚至看到有個(gè)別細(xì)胞漂浮起來時(shí)，加入1640完全培養(yǎng)基4ml，吸管反復(fù)輕輕吹打貼壁的細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液；4)計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至lO'Vml，將該5-6ml細(xì)胞懸液接種于新的培養(yǎng)瓶中；(3)凍存1)取處于指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，吸除上述培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液；2)用D-hanks液4-5ml清洗培養(yǎng)瓶2次后，加入0.25%胰蛋白酶lml，置37。C，5%C02，95。/o濕度的C02培養(yǎng)箱中4-5min;3)當(dāng)在倒置顯微鏡下觀察大部分細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大，甚至看到有個(gè)別細(xì)胞漂浮起來時(shí)，加入1640完全培養(yǎng)基4ml，吸管反復(fù)輕輕吹打貼壁的細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液；4)將細(xì)胞懸液收集至離心管中，1000rpm離心10min，棄上清液；5)細(xì)胞沉淀中加入凍存液1.5ml，計(jì)數(shù)并調(diào)整至5Xl(f細(xì)胞/ni1，移入凍存管，將凍存管口密封；6)冷存管先置于4匸10min，移入-2(TC30min，然后于-80。C放置過夜，最后移入液氮；(4)復(fù)蘇1)準(zhǔn)備400-500ml的37"C-42"C的溫水，從液氮中取出凍存管，并迅速置于溫水中不斷攪動(dòng)；2)在超凈工作臺(tái)中打開凍存管，將細(xì)胞懸液吸到離心管中，1000rpm離心lOmin，棄去上清液；3)細(xì)胞沉淀中加入10ml1640完全培養(yǎng)基，吹打均勻制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度5X107ml，轉(zhuǎn)移至兩個(gè)培養(yǎng)瓶中，置37°C，5%C02，95%濕度的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4、根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其特征在于所述D-Hanks液為氯化鈉8.Og、氯化鉀0.4g、歸P0412H200.08g、KH2P040.06g、NaHC030.35g、1%酚紅2ml、超純水溶解并定容至1000ml。5、根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其特征在于所述1640培養(yǎng)基為RPMI1640粉10.4g，丙酮酸鈉O.llg,2-巰基乙醇0.01mol/L,Na跳2g,超純水溶解并定容至1000ml。6、根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其特征在于所述1640完全培養(yǎng)基為含1640培養(yǎng)基及20%v/v胎牛血清。7、根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其特征在于所述0.25%胰蛋白酶為含胰蛋白酶及D-Hanks液，以1:400v/v的比例配制。8、根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其特征在于所述凍存液由1640完全培養(yǎng)基、小牛血清及二甲基亞砜以7:2:1的比例配制。9、一種如權(quán)利要求1所述漢族人高轉(zhuǎn)移性腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞系HiMet-ccRCC，CCTCCN0.C200909，作為建立篩選制備檢測(cè)與防治漢族人腎細(xì)胞癌藥物細(xì)胞模型的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種從漢族人腎透明細(xì)胞癌脊柱轉(zhuǎn)移灶中，建立有轉(zhuǎn)移表型的漢族人高轉(zhuǎn)移性腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞系HiMet-ccRCC，CCTCC-C200909。本發(fā)明利用腎透明細(xì)胞癌患者脊柱轉(zhuǎn)移灶作為建系瘤源，采用體外培養(yǎng)方式建立了一株具有高轉(zhuǎn)移潛能的人腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞系。試驗(yàn)表明本發(fā)明細(xì)胞系具有典型的腫瘤細(xì)胞系特征，且可致使NOD-SCID鼠發(fā)生穩(wěn)定轉(zhuǎn)移。可作為建立篩選制備檢測(cè)與防治漢族人腎細(xì)胞癌藥物的細(xì)胞模型的應(yīng)用。文檔編號(hào)C12R1/91GK101508972SQ20091004720公開日2009年8月19日申請(qǐng)日期2009年3月6日優(yōu)先權(quán)日2009年3月6日發(fā)明者常文軍,曹廣文,林麗萍,譚曉潔,賀松琴申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)