一種細(xì)胞早期不可逆損傷程度的檢測方法及檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，特別涉及一種細(xì)胞早期不可逆損傷程度的檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)胞是生物體的基本結(jié)構(gòu)單位。細(xì)胞的生命活動是在內(nèi)、外環(huán)境的動態(tài)平衡過程中進(jìn)行的。細(xì)胞和組織遭受不能耐受的有害因子刺激時，則可能引起損傷。較輕的細(xì)胞損傷是可逆的，消除刺激因子后，受損傷細(xì)胞可恢復(fù)常態(tài)，通常稱之為亞致死性細(xì)胞損傷。細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷是不可逆的，最終引起細(xì)胞死亡。引發(fā)細(xì)胞損傷的原因很多，可以歸納為:缺氧、化學(xué)物質(zhì)和藥物、物理因素、生物因子、營養(yǎng)失衡、內(nèi)分泌因素、免疫反應(yīng)、遺傳變異、衰老等若干大類。
[0003]由多種因素引發(fā)的細(xì)胞損傷，其發(fā)生機(jī)制復(fù)雜。細(xì)胞膜的破壞、氧自由基增多、胞漿內(nèi)高游離鈣、缺氧、化學(xué)毒作用和遺傳物質(zhì)變異等，對于細(xì)胞損傷的發(fā)生具有重要意義。這幾方面的機(jī)制通常是相互結(jié)合或是互為因果地導(dǎo)致細(xì)胞的損傷。缺氧是諸多致病因素引起細(xì)胞損傷的一個非常重要的基本環(huán)節(jié)。多種原因引發(fā)的缺氧最終都導(dǎo)致線粒體氧化磷酸化受抑制，使細(xì)胞能量來源三磷酸腺苷(ATP)生成減少，造成細(xì)胞膜鈉-鉀泵、鈣泵功能低下和胞漿內(nèi)蛋白質(zhì)合成、脂肪代謝障礙等，造成無氧糖酵解過程的活化。酵解會進(jìn)一步使細(xì)胞酸中毒、溶酶體膜破裂、大量降解酶釋放形成細(xì)胞自身消化。缺氧還可使氧自由基等活性氧類物質(zhì)增多，膜磷脂丟失，脂質(zhì)崩解，細(xì)胞骨架破壞等。輕度、較短時間缺氧所致的細(xì)胞損傷通常是可逆的，嚴(yán)重缺氧或/和較長時間的輕度缺氧所致的細(xì)胞損傷是不可逆的，引發(fā)細(xì)胞壞死。
[0004]包括移植用供體器官在內(nèi)的某些狀態(tài)下的組織器官，由于缺氧而造成不可避免的、不同程度的細(xì)胞損傷。這些細(xì)胞損傷可直接引發(fā)誤診、誤治:對于器官移植手術(shù)來說，移植排斥反應(yīng)是移植失敗的主因，而供體器官的質(zhì)量下降可以引起超急性排斥反應(yīng)和慢性排斥反應(yīng)，因此供體器官質(zhì)量是移植成敗的重要決定因素之一。供體器官質(zhì)量是由供體來源(活供體、腦死亡供體、死亡供體)、供體健康狀況、熱缺血時間、灌注保存方法、冷儲存時間、運輸方式等多種因素綜合決定。由于移植醫(yī)學(xué)的特殊性，供體群趨于老齡化、活供體源遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于需求，因而死亡供體成為主要器官源，使相應(yīng)的供體器官質(zhì)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)無法保障。本應(yīng)在移植手術(shù)前對供體器官的質(zhì)量進(jìn)行嚴(yán)格評估，然而，世界上目前除了配型和病毒檢測以外，沒有對供體器官的質(zhì)量監(jiān)控的任何其他手段，只是對供體器官的“保質(zhì)期”有大致的限定，從而造成相當(dāng)一部分移植手術(shù)因源標(biāo)本質(zhì)量問題而失敗，即便移植手術(shù)成功，受過損傷的供體器官往往也不具備正常器官的功能，使患者不必要的接受一次無意義的手術(shù)，無謂地加重病人經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)、社會保險負(fù)擔(dān)，更重要的是，使病人多承受一次危及生命的手術(shù)創(chuàng)傷。
[0005]目前在器官移植以外的科研、醫(yī)療領(lǐng)域，對細(xì)胞損傷的檢測手段主要有:利用細(xì)胞缺氧后失去能量合成而致使三磷酸腺苷(ATP)水平下降為原理，對三磷酸腺苷/ 二磷酸腺苷比值(ATP/ADP)的檢測。此類以檢測氧、養(yǎng)為標(biāo)準(zhǔn)的對細(xì)胞損傷的評價方法，由于在常規(guī)供體器官采樣操作中需要對供體器官進(jìn)行灌注，而灌注液里含有上述ATP等成份，因而針對上述成份的檢測無法在對供體器官質(zhì)量的評估中使用，類似方法還包括針對細(xì)胞損傷后的有害分子一氧化氮(NO)、活性氧(ROS)等成份的細(xì)胞損傷評估手段。
[0006]綜上所述，目前急需研發(fā)一種能夠廣泛應(yīng)用于對器官移植中供體器官內(nèi)細(xì)胞損傷進(jìn)行定量評估的技術(shù)方法，以保障移植手術(shù)的合理性以及對移植術(shù)后效果的預(yù)測。
[0007]維持細(xì)胞骨架蛋白等基本組成結(jié)構(gòu)的正常功能是保障細(xì)胞生存的前提。胞襯蛋白是一種細(xì)胞膜骨架蛋白，一個較大的異源二聚體蛋白，由α亞基和β亞基組成，并且具有典型的106個氨基酸構(gòu)成的被稱作α胞襯蛋白重復(fù)體的連續(xù)基序，在維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定、結(jié)構(gòu)及形狀中起重要作用。隨著對α胞襯蛋白結(jié)構(gòu)與功能地深入研究，人們發(fā)現(xiàn)α胞襯蛋白還參與多種生物途徑，如細(xì)胞粘附及細(xì)胞伸展、細(xì)胞周期等。更重要的是，從病理學(xué)角度出發(fā)，骨架蛋白的損傷與細(xì)胞膜損傷、溶酶體釋放一道是細(xì)胞不可逆損傷的三大標(biāo)志，最終導(dǎo)致細(xì)胞核崩解而完全失去生命行為及生理功能。因此，α胞襯蛋白，作為細(xì)胞骨架和細(xì)胞膜的重要組成部分，是細(xì)胞不可逆損傷的評價指標(biāo)。
[0008]重要的生物分子(例如細(xì)胞膜蛋白、細(xì)胞骨架蛋白等)在細(xì)胞內(nèi)執(zhí)行生命所需的最基本生物功能，因而維持這些重要分子的正常功能是保障細(xì)胞生存的前提。此類生物分子上的化學(xué)修飾(例如磷酸化、甲基化等)往往決定了該分子能否正常發(fā)揮其功能。在細(xì)胞損傷早期，存在于這些重要生物分子上的化學(xué)修飾隨著損傷的加重而發(fā)生漸進(jìn)性改變，從而影響細(xì)胞基本生理功能，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。蛋白質(zhì)的磷酸化修飾是生物體內(nèi)共價修飾方式之一(指在蛋白質(zhì)加入一個磷酸基團(tuán)，此修飾由于能夠反轉(zhuǎn)蛋白的生理功能而在生物化學(xué)中占有重要地位)。在哺乳動物細(xì)胞生命周期中，大約有1/3的蛋白質(zhì)發(fā)生過磷酸化修飾；在脊椎動物基因組中，有5%的基因編碼的蛋白質(zhì)是參與磷酸化和去磷酸化過程的蛋白激酶和磷酸(酯)酶。磷酸化修飾本身所具有的簡單、靈活、可逆的特性以及磷酸基團(tuán)的供體三磷酸腺苷(ATP)的易得性，使得磷酸化修飾被真核細(xì)胞所選擇接受成為一種最普遍的調(diào)控手段。蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化這一可逆過程幾乎調(diào)節(jié)著包括細(xì)胞的增殖、發(fā)育、分化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、神經(jīng)活動、肌肉收縮及腫瘤發(fā)生等過程在內(nèi)的所有生命活動，目前已經(jīng)知道有許多人類疾病是由于異常的磷酸化修飾所引起，而有些磷酸化修飾卻是某種疾病所導(dǎo)致的后果。在真核細(xì)胞中最常見的磷酸化修飾是在蛋白質(zhì)的絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基側(cè)鏈羥基磷酸化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]發(fā)明目的:本發(fā)明的目的在于提供一種靈敏、準(zhǔn)確的早期細(xì)胞損傷程度檢測方法。
[0010]技術(shù)方案:本發(fā)明提供的一種細(xì)胞損傷程度檢測方法，通過檢測細(xì)胞骨架蛋白的化學(xué)修飾變化程度作為評價細(xì)胞不可逆損傷早期的損傷程度的參數(shù)，即以細(xì)胞骨架蛋白發(fā)生化學(xué)修飾變化的分子數(shù)量與細(xì)胞骨架蛋白未發(fā)生化學(xué)修飾變化的分子數(shù)量的比值作為評價被檢測樣品中細(xì)胞不可逆損傷的程度的參數(shù)。
[0011]通過檢測包括細(xì)胞骨架蛋白在內(nèi)的能執(zhí)行重要細(xì)胞生命功能的分子的變化來評價細(xì)胞損傷程度，由于該類分子參與細(xì)胞骨架、細(xì)胞質(zhì)膜等重要細(xì)胞成分的構(gòu)建，因此該類分子損傷必然造成細(xì)胞不可逆損傷。
[0012]作為優(yōu)選，所述細(xì)胞骨架蛋白為α胞襯蛋白。
[0013]作為另一種優(yōu)選，所述化學(xué)修飾包括磷酸化。
[0014]申請人通過大量研究發(fā)現(xiàn)，在生物組織和器官失去氧、養(yǎng)供給后的細(xì)胞損傷過程中，細(xì)胞能量來源減少，造成細(xì)胞膜鈉-鉀泵、鈣泵功能低下，細(xì)胞膜通透性增加，高濃度鈣離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，導(dǎo)致細(xì)胞釋放I丐蛋白酶，I丐蛋白酶在Ct胞襯蛋白的薄弱環(huán)節(jié)(第1176號酪氨酸處)將其降解、切斷成兩個降解片段。重要的是，降解產(chǎn)物與所剩余的完整α胞襯蛋白的比值(即降解比例)與細(xì)胞所受損傷程度呈現(xiàn)極為密切的正相關(guān)趨向。
[0015]申請人進(jìn)一步通過對α胞襯蛋白作為細(xì)胞損傷的指示物的研究過程中發(fā)現(xiàn)，α胞襯蛋白的第1176號酪氨酸的磷酸化的喪失，使磷酸基團(tuán)所導(dǎo)致的蛋白構(gòu)象變化對該薄弱位點的保護(hù)作用消失，從而使該位點對鈣蛋白酶的易感性增強；相對于α胞襯蛋白被鈣蛋白酶切斷來說，1176酪氨酸磷酸化的喪失是更為早期的細(xì)胞損傷的特征，也成為細(xì)胞損傷演變?yōu)椴豢赡嫘袨榈拈_始。更重要的是，細(xì)胞內(nèi)該氨基酸的總體磷酸化水平與細(xì)胞損傷程度呈現(xiàn)極為密切的負(fù)相關(guān)趨向。
[0016]具體而言，細(xì)胞在不可逆損傷過程早期發(fā)生的病理生理改變(即細(xì)胞骨架蛋白α胞襯蛋白在1176號酪氨酸上的去磷酸化過程)如圖1所示。圖1b顯示了細(xì)胞可逆性損傷的機(jī)制:細(xì)胞外游離鈣離子11由于細(xì)胞膜泵失活、通透性增加而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，同時休眠狀態(tài)的鈣蛋白酶12被激活；但由于α胞襯蛋白的磷酸化保護(hù)仍然存在，因而被激活狀態(tài)下的鈣蛋白酶15無法接近1176號酪氨酸，無法切割降解α胞襯蛋白。圖1c顯示了細(xì)胞不可逆損傷早期的機(jī)制:磷酸基團(tuán)14從α胞襯蛋白1176號酪氨酸上脫落，鈣蛋白酶15在鈣離子11的協(xié)同下接近1176號酪氨酸，對α胞襯蛋白13進(jìn)行切割降解。圖1d顯示了細(xì)胞不可逆損傷后期的機(jī)制胞