一種腫瘤靶標(biāo)的篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種腫瘤靶標(biāo)的篩選方法。
【背景技術(shù)】
[0002]腫瘤是目前醫(yī)學(xué)面臨的重要挑戰(zhàn)之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年我國(guó)癌癥死亡人數(shù)約200萬，近二十年來癌癥的發(fā)病率呈直線上升趨勢(shì)。雖然各國(guó)在癌癥基礎(chǔ)研宄和臨床治療領(lǐng)域投入巨大，但所取得的成果仍不令人滿意。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，體細(xì)胞遭遇突變后會(huì)比鄰近的細(xì)胞增殖更快，導(dǎo)致了癌癥的發(fā)生。這使得癌細(xì)胞易受裂解細(xì)胞的靶標(biāo)介質(zhì)攻擊，由此產(chǎn)生如:放射性療法，細(xì)胞毒性化學(xué)療法(cytotoxic chemotherapies)和最近的革E標(biāo)治療法。
[0003]腫瘤靶向治療技術(shù)是指在無創(chuàng)或微創(chuàng)條件下以腫瘤為目標(biāo)，采用有選擇、針對(duì)性較強(qiáng)、患者易于接受、反應(yīng)小的局部或全身治療，最終達(dá)到有效控制腫瘤，減少腫瘤周圍正常組織損傷為目的的各種手段的總稱。目前，腫瘤靶向治療憑借其特異性與靶向性，在腫瘤治療中發(fā)揮越來越重要作用，成為腫瘤治療的主攻方向。腫瘤靶向治療技術(shù)按治療原理可分為生物性靶向治療、化學(xué)性靶向治療、物理性靶向治療三大類。尋找合適的腫瘤靶標(biāo)是生物性靶向治療的緊急任務(wù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種腫瘤靶標(biāo)的篩選方法，包含以下步驟:
[0005]步驟1:用差異蛋白顯示技術(shù)獲得特定腫瘤標(biāo)志物的全蛋白，經(jīng)過水解獲得肽段，經(jīng)超高效液相和飛行時(shí)間質(zhì)譜獲得肽段的序列；
[0006]步驟2:將特異性結(jié)合所述序列的肽段的單克隆抗體與組織庫進(jìn)行特異性篩選；
[0007]步驟3:挑選與組織庫中陰性組織不表達(dá)、僅該特定腫瘤組織表達(dá)的肽段結(jié)合的單抗，該單抗對(duì)應(yīng)的肽段即為目的腫瘤靶標(biāo)。
[0008]作為優(yōu)選，步驟I所述全蛋白采用差異蛋白顯示技術(shù)或單抗捕獲技術(shù)或其結(jié)合獲得。
[0009]作為優(yōu)選，步驟2所述組織庫陰性組織包括正常組織及不同種類的腫瘤組織。
[0010]作為優(yōu)選，步驟3所述篩選為免疫組化、Elisa。
[0011]本發(fā)明使用差異蛋白顯示技術(shù)和腫瘤標(biāo)志物單克隆技術(shù)從腫瘤細(xì)胞系、腫瘤活檢組織、腫瘤患者血清或體液等臨床樣本中獲得腫瘤標(biāo)志物全蛋白，經(jīng)過水解獲得肽段，經(jīng)超高效液相和飛行時(shí)間質(zhì)譜獲得肽段的序列。將此序列通過多肽合成、純化獲得高純度的多肽。將合成肽制備出單克隆抗體與組織庫進(jìn)行特異性篩選，選取與正常組織不表達(dá)，只與一種腫瘤組織表達(dá)的單克隆抗體進(jìn)行抗體藥物的應(yīng)用開發(fā)，所對(duì)應(yīng)的表位肽進(jìn)行瘤苗的研制和樹突狀細(xì)胞的體外活化。
[0012]本發(fā)明所述方法篩選獲得的腫瘤靶標(biāo)特異性高，氨基酸序列較短，適合開展特異性的樹突狀細(xì)胞體外遞呈T淋巴細(xì)胞進(jìn)行特異性的CTL殺傷實(shí)驗(yàn)和臨床細(xì)胞免疫治療，較目前開展的利用細(xì)胞因子或腫瘤活檢組織等體外誘導(dǎo)的CTL具有較高的特異性，更安全有效，是當(dāng)今最符合細(xì)胞免疫治療原理的技術(shù)。
[0013]術(shù)語與定義:
[0014]靶標(biāo):是指在腫瘤細(xì)胞中所特有的，并且只存在于某一種腫瘤細(xì)胞而不表達(dá)于正常細(xì)胞或其它種類腫瘤細(xì)胞的特異性的抗原決定簇。由腫瘤細(xì)胞本身所產(chǎn)生或由機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞反應(yīng)而產(chǎn)生的，反映腫瘤存在和生長(zhǎng)的一類物質(zhì)。靶標(biāo)可以是腫瘤標(biāo)志物、表位肽、突變基因等。
[0015]DC細(xì)胞(Dendritic Cell，即樹突狀細(xì)胞)，是正常人體內(nèi)存在的一種具有強(qiáng)大的抗原呈遞功能的一類特殊細(xì)胞，能夠直接攝取、加工和呈遞抗原，刺激體內(nèi)的初始型T細(xì)胞活化，是機(jī)體免疫應(yīng)答的“啟動(dòng)者”。DC相當(dāng)于信使，將抗原信息傳遞給可以發(fā)揮免疫效應(yīng)和殺傷功能的效應(yīng)者即T細(xì)胞。
【附圖說明】
[0016]圖1示本發(fā)明所述方法的流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017]本發(fā)明公開了一種腫瘤靶標(biāo)的篩選方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0018]為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
[0019]實(shí)施例1:靶標(biāo)設(shè)計(jì)及抗體制備
[0020]1.靶標(biāo)的設(shè)計(jì):取活檢腫瘤組織、腫瘤細(xì)胞系、腫瘤患者血清或體液等臨床樣本中，經(jīng)過蛋白質(zhì)組學(xué)差異蛋白顯示技術(shù)和與所取腫瘤活檢組織相關(guān)的標(biāo)志物單抗捕獲技術(shù)兩路并行獲得該腫瘤標(biāo)志物的蛋白，經(jīng)過水解，在超高效液相和串聯(lián)的飛行時(shí)間質(zhì)譜上篩選確定靶標(biāo)的序列范圍。
[0021]2.靶標(biāo)的合成:將確定的靶標(biāo)序列通過固相合成及在線裂解，經(jīng)UPLC和Q-TOF進(jìn)行分子量、純度及二級(jí)結(jié)構(gòu)鑒定，在蛋白純化系統(tǒng)上獲得高純度的表位肽。
[0022]3.靶標(biāo)單抗的制備和特異性篩選:將合成的高純度表位肽通過細(xì)胞融合制備單克隆抗體。
[0023]實(shí)施例2:ELISA方法篩選單克隆抗體細(xì)胞株
[0024]具體步驟如下:
[0025]1.包被免疫原合成表位肽
[0026]I)將合成純化的多肽稀釋到終濃度lug/ml
[0027]2)每孔200ul，用封口膜封上.
[0028]3)至于4°C冰箱過夜
[0029]2.洗板(洗板機(jī)洗3遍)拍干
[0030]3.封閉
[0031]I)配5%脫脂奶粉，滿孔封閉
[0032]2)附上封口膜至于37°C水浴鍋里溫育2小時(shí)
[0033]4.洗板拍干(同2)
[0034]5.吸取亞克隆單克隆抗體孔的培養(yǎng)上清(每孔100ul，37°C水浴鍋里溫育I小時(shí))，空白對(duì)照使用PBS
[0035]6.洗板拍干(洗板機(jī)洗5遍)
[0036]7.加酶標(biāo)記二抗
[0037]I)用 PBS 1:5000 倍稀釋
[0038]2)每孔lOOul，37°C水浴鍋里溫育0.5小時(shí)
[0039]9.洗板拍干(洗板機(jī)洗5遍)
[0040]10.加底物(每孔lOOul，37°C水浴鍋里溫育10-20分鐘)
[0041]11.加終止液(每孔5Oul)
[0042]進(jìn)行吸光度檢測(cè)，結(jié)果顯示，吸光度大于0.5為陽性(標(biāo)準(zhǔn):0.5-1.0為+ ;1.0-2.0為++ ;2.0-3.0為+++ ；4.0以上為++++)，優(yōu)選陽性強(qiáng)者。
[0043]實(shí)施例3:組織庫篩選
[0044]使用所述單抗經(jīng)過免疫組化在組織庫上進(jìn)行特異性篩選，確定特異性靶標(biāo)序列。
[0045]陰性組織包括:
[0046]1、與所取樣本的不同種腫瘤組織，每種30例；
[0047]2、正常組織:包括心臟、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟、輸尿管、胃、垂體、腎上腺、甲狀腺、甲狀旁腺、淋巴結(jié)、膀胱、小腦、大腦皮質(zhì)、結(jié)腸、眼球、乳腺、胰腺、前列腺、皮膚、肌肉、睪丸、胸腺、子宮、卵巢、輸卵管、骨髓、胎盤組織、血管(內(nèi)皮)、血細(xì)胞、脊髓。
[0048]陽性組織:與所述樣本的同種腫瘤組織，包括高、中、低及未分化各種分化程度的活檢標(biāo)本，每種10例；
[0049]選取檢測(cè)結(jié)果為:正常組織陰性、不同種腫瘤組織陰性、同種腫瘤陽性的單克隆抗體，該單抗對(duì)應(yīng)的肽段即為目的腫瘤靶標(biāo)。將該單克隆抗體進(jìn)行抗體藥物的應(yīng)用開發(fā)，所對(duì)應(yīng)的表位肽進(jìn)行瘤苗的研制和樹突狀細(xì)胞的體外活化。
[0050]實(shí)施例4:靶標(biāo)單克隆抗體免疫組化特異性篩選
[0051]石蠟切片:取正常組織芯片蠟塊、結(jié)腸癌組織芯片蠟塊和其他腫瘤組織芯片蠟塊進(jìn)行石蠟切片，烤片，58°C，20分鐘，
[0052]常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水；二甲苯I 20min—二甲苯II 20min—100%酒精I(xiàn) 1min-100% II 1min-95% 5min—80% 5min—70% 5min
[0053]阻斷:滅活內(nèi)源性過氧化物酶:3% H2O2 37°C孵育lOmin，PBS沖洗3X5min ；
[0054]抗原修復(fù):置0.0lM枸櫞酸緩沖液(PH 6.0)中用煮沸(95。。，15 — 20min)，自然冷卻20min以上，再用冷水沖洗缸子，加快冷卻至室溫，PBS沖洗3X5min。
[0055]正常羊血清工作液封閉，37°C lOmin，傾去勿洗。
[0056]滴加結(jié)腸癌靶標(biāo)單克隆抗體4°C冰箱孵育過夜，PBS沖洗3X5min (用PBS緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照)；滴加生物素標(biāo)記二抗，37°C孵育30min，PBS沖洗3X5min ；
[0057]滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，37 °C孵育Omin，PBS沖洗3X5min ；
[0058]DAB/H202反應(yīng)染色，自來水充分沖洗后，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片，鏡檢。
[0059]結(jié)果顯示，正常組織芯片蠟塊陰性，結(jié)腸癌組織芯片蠟塊中50%以上陽性，其他腫瘤組織芯片蠟塊陰性，該單抗對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)即為目的靶標(biāo)表位肽。
[0060]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種腫瘤靶標(biāo)的篩選方法，其特征在于，包含以下步驟: 步驟1:獲得特定腫瘤標(biāo)志物的全蛋白，經(jīng)過水解獲得肽段，經(jīng)超高效液相和飛行時(shí)間質(zhì)譜獲得肽段的序列； 步驟2:將特異性結(jié)合所述序列肽段的單克隆抗體與組織庫進(jìn)行特異性篩選； 步驟3:挑選出與組織庫中陰性組織不表達(dá)、僅該特定腫瘤組織表達(dá)的肽段結(jié)合的單抗，該單抗對(duì)應(yīng)的肽段即為目的腫瘤靶標(biāo)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，步驟I所述全蛋白采用差異蛋白顯示技術(shù)或單抗捕獲技術(shù)或其結(jié)合獲得。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，步驟2所述組織庫陰性組織包括正常組織及不同種類的腫瘤組織。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，步驟3所述篩選的方法為免疫組化、Elisa0
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種腫瘤靶標(biāo)的篩選方法，即用差異蛋白顯示技術(shù)獲得特定腫瘤標(biāo)志物的全蛋白，經(jīng)過水解獲得肽段，經(jīng)超高效液相和飛行時(shí)間質(zhì)譜獲得肽段的序列；將特異性結(jié)合所述序列的肽段的單克隆抗體與組織庫進(jìn)行特異性篩選；挑選出與正常組織不表達(dá)、僅一種腫瘤組織表達(dá)的肽段結(jié)合的單抗，該單抗對(duì)應(yīng)的肽段即為目的腫瘤靶標(biāo)。本發(fā)明所述方法獲得的腫瘤靶標(biāo)具有高特異性，氨基酸序列短，適合開展特異性的樹突狀細(xì)胞體外遞呈T淋巴細(xì)胞進(jìn)行特異性的CTL殺傷實(shí)驗(yàn)和臨床細(xì)胞免疫治療，具有良好的應(yīng)用前景。
【IPC分類】G01N33-577
【公開號(hào)】CN104655849
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510082069
【發(fā)明人】李彬
【申請(qǐng)人】河北博海生物工程開發(fā)有限公司
【公開日】2015年5月27日
【申請(qǐng)日】2015年2月15日