專利名稱：血根堿在制備提高順鉑抗腫瘤療效的增敏藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于腫瘤化療增敏藥物領(lǐng)域，涉及血根堿的新用途，即在制備提高抗腫瘤藥物順鉬療效的增敏藥物中的應(yīng)用?；熓抢没瘜W(xué)藥物殺死腫瘤細(xì)胞、抑制腫瘤細(xì)胞的生長繁殖和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的分化的一種治療方式，它是一種全身性治療手段對原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶和亞臨床轉(zhuǎn)移灶均有治療作用，但是化療治療腫瘤在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時，也將正常細(xì)胞和免疫(抵抗)細(xì)胞一同殺滅?；熀蟪３霈F(xiàn)免疫功能下降，白細(xì)胞和血小板下降，甚者紅細(xì)胞、血色素下降等骨髓抑制表現(xiàn)，有食欲下降、飲食量減少、惡心、嘔吐、腹脹、腹痛、腹瀉或便秘等消化道癥狀，以及一系列的腎臟毒性和肝臟毒性。因此特別是中晚期腫瘤或身體虛弱的病人，盲目使用化療，不僅會導(dǎo)致病情迅速惡化，更會加速病人的死亡。在臨床上常用的抗腫瘤化學(xué)治療藥物有70多種。而且，新藥還在不斷地發(fā)展。因此，放射治療是惡性腫瘤的主要治療手段和輔助治療方法，是目前惡性腫瘤治療中不可缺少的治療方法。然而由于化學(xué)治療藥物的非特異性以及給藥途徑的限制，化學(xué)治療藥物也將產(chǎn)生正常組織和器官的損傷，從而帶來的副作用也限制了化學(xué)治療藥物在惡性腫瘤治療中的廣泛應(yīng)用。為了減輕腫瘤治療中化學(xué)治療藥物對正常組織人體的危害，研究能提高化學(xué)治療藥物療效，降低治療中化學(xué)治療藥物的用藥劑量，從而降低正常組織和細(xì)胞的損傷的增敏藥物是化學(xué)治療藥物腫瘤治療中重要的研究方向。我國有幾千味傳統(tǒng)天然藥物歷經(jīng)數(shù)千年臨床，為尋找有效預(yù)防藥物提供了豐富的藥源，因此從天然傳統(tǒng)藥物中篩選治療或輔助治療腫瘤的藥物，不僅可行，而且非常經(jīng)濟(jì)。血根堿主要存在于白屈菜的全草、紫堇的塊、根博落回的全草、血水草的地上部分。它具有非常廣泛的藥理作用，早期的研究發(fā)現(xiàn)它具有抗炎、抗菌、抗氧化并對中樞神經(jīng)有麻醉作用，另外還有抑制膽堿酯酶活性，加強心臟活動、刺激唾液分泌，并具有利尿、外周抗腎上腺素解交感作用。被中醫(yī)和北美的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)使用已經(jīng)有幾個世紀(jì)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，血根堿還具有很好的抗腫瘤作用而且有廣譜的抗腫瘤活性，而且對正常細(xì)胞沒有毒性作用。但未見血根堿與常規(guī)化療藥聯(lián)合作用是否可以增加其療效降低其毒副作用的研究報道。所述血根堿的化學(xué)名稱為3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2， 5-diphenyltetrazolium bromide)，分子式為 C20H14ClNO4 · χΗ20，其結(jié)構(gòu)式如下所示
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乙醚及水等。其熔點為278-279°C?，F(xiàn)有技術(shù)中未見任何有關(guān)所述血根堿具有提高順鉬腫
背景技術(shù)：
所述血根堿易溶在二甲亞砜、丙酮、乙醇、甲醇、瘤治療療效的增敏作用方面的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明目的是提供血根堿的新用途，即在制備提高順鉬腫瘤治療療效的增敏藥物的應(yīng)用。為達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是血根堿在制備提高順鉬腫瘤治療療效的增敏藥物中的應(yīng)用。上述技術(shù)方案中，將無毒副作用濃度的血根堿直接加到正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液中，所述無毒副作用濃度的血根堿的濃度小于等于0. 5 μ mol/L,處理M小時后采用MTT 細(xì)胞染色法檢測細(xì)胞生長和存活率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小于0. 5 μ mol/L的血根堿對正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的生長都不產(chǎn)生任何的影響。采用無毒副作用濃度的0. 5 μ mol/L的血根堿處理肺癌H446細(xì)胞M小時后，再在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同劑量(0，3 μ g/ml和6 μ g/ml)順鉬，并繼續(xù)培養(yǎng)M小時，最后采用臺盼藍(lán)染色法檢測細(xì)胞存活率。研究結(jié)果表明無毒副作用濃度的血根堿(0.5 μ mol/L)處理可以明顯提高肺癌H446細(xì)胞對順鉬的敏感性。因此，本發(fā)明要求保護(hù)血根堿在制備提高順鉬抗腫瘤療效的增敏藥物中的應(yīng)用， 所述提高順鉬抗腫瘤療效的增敏藥物可在對腫瘤細(xì)胞生長無任何明顯作用的用藥濃度條件下，提高順鉬抗腫瘤的療效。優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述腫瘤為肺癌。本發(fā)明所述的增敏包括能夠增加腫瘤細(xì)胞對于化療藥物敏感性的作用。本發(fā)明同時要求保護(hù)一種能提高順鉬抗腫瘤療效的增敏藥物，其主要活性成分為血根堿。由于上述技術(shù)方案運用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點1.本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)血根堿可以在無毒副作用下提高順鉬抗腫瘤的療效，因此，血根堿可以用于制備提高順鉬抗腫瘤療效的增敏藥物，在無毒副作用的低濃度下，顯著性地提高腫瘤細(xì)胞對順鉬治療的敏感性。


圖1是不同濃度血根堿處理對肺癌細(xì)胞生長的影響；圖2是實施例一中血根堿預(yù)處理聯(lián)合順鉬對腫瘤細(xì)胞存活率的影響。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述(1)材料人類肺癌H446細(xì)胞購于美國ATCC公司。血根堿(彡98. 0 %，型號 84480)、胰酶、活細(xì)胞代謝物還原劑噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMS 0)購于美國Sigma公司，D-MEM培養(yǎng)基和血清購于Gibcol公司。倒置CKX41顯微鏡和C-7070數(shù)碼相機購于 OLYMPUS 公司。血根堿由DMSO溶解制備成2mmol/L的儲備液，_20°C保存?zhèn)溆谩Ｓ们坝猛耆囵B(yǎng)基配置成所需濃度。(2)細(xì)胞培養(yǎng)取對數(shù)生長期的肺癌細(xì)胞接種并培養(yǎng)于37°C、含5% CO2飽和濕度條件下M小時。直接采用培養(yǎng)液稀釋血根堿到實驗所需濃度。對照組則僅加DMS0，其濃度與最高血根堿藥物濃度組一致，但所有實驗中DMSO含量均低于< 1/104。(3)血根堿無毒劑量的檢查用0. 25%的胰酶消化對數(shù)生長期的肺癌H446細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，將5 X104/ml的肺癌細(xì)胞分別接種于96孔培養(yǎng)板，每孔接種200 μ 1。在 37°C、含5% CO2和飽和濕度條件培養(yǎng)M小時后，加入濃度分別為0、0. 25,0. 5,0. 75、1、1· 25 和1. 5 μ mol/L的血根堿，每一濃度設(shè)6個復(fù)孔。然后在細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)20小時后，加入20 μ L 濃度為5mg/ml的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4小時后輕輕吸掉培養(yǎng)基。加入150 μ L的DMSO振蕩溶解 10分鐘。在酶標(biāo)儀上選取570nm主波長和630nm參考波長測定吸光值，對照組細(xì)胞存活率設(shè)為100%，其余各組細(xì)胞存活率=(各濃度組吸光值/對照組吸光值)X 100%。獨立實驗重復(fù)3次以上，實驗數(shù)據(jù)均采用SP S S統(tǒng)計軟件計算ICltl值，有90%以上的細(xì)胞存活的藥物濃度為無毒或低毒劑量，為后續(xù)實驗確定藥物的使用濃度。結(jié)果見圖1。(4)血根堿與順鉬聯(lián)合用協(xié)同抗腫瘤作用將處于對數(shù)生長期的人肺癌細(xì)胞系 H446 (5 X IOVmL)接種至6孔板中，培養(yǎng)M小時后加入無毒濃度(0. 5 μ mol/L)的血根堿處理24小時，每一濃度設(shè)3個復(fù)孔。然后加入不同劑量(0,3 μ g/ml和6 μ g/ml)的順鉬。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)M小時后，采用臺盼藍(lán)染色法，計算細(xì)胞存活率及細(xì)胞死亡率。對照組細(xì)胞存活率設(shè)為100%，其余各組細(xì)胞存活率=(各濃度組活細(xì)胞數(shù)/對照組活細(xì)胞數(shù))X 100%。 所得結(jié)果如圖2所示，圖2為無毒副作用濃度血根堿預(yù)處理對順鉬處理后肺癌細(xì)胞H446 細(xì)胞存活率及細(xì)胞死亡率的影響圖，其中，sanguinarine為血根堿，cisplatin為順鉬。數(shù)據(jù)為來自三個獨立實驗結(jié)果的平均值士標(biāo)準(zhǔn)差。a與對照組比較ρ < 0. 05 ；b與對照組比較ρ < 0. 01 ；c血根堿+順鉬3 μ g/ml與順鉬3 μ g/ml比較ρ < 0. 01 ；d血根堿+順鉬 6 μ g/ml與順鉬6μ g/ml比較ρ < 0.01。從圖2可以看出，無毒副作用濃度0. 5 μ mol/L 的血根堿處理后，聯(lián)合順鉬化學(xué)治療時，3 μ g/ml和6μ g/ml順鉬組的細(xì)胞死亡率分別從 (14. 88士 1. 62) %增加至(30. 64士 1. 88) %, (p = 0. 0002)和從(36. 90士2. 23) %增加至 (69. 51 士7. 41)%, (ρ = 0. 0009)細(xì)胞死亡率幾乎都增長了 1倍。因此，采用無毒副作用濃度0. 5 μ mol/L的血根堿預(yù)處理可以明顯提高腫瘤細(xì)胞的順鉬化學(xué)治療的療效。
權(quán)利要求
1.血根堿在制備提高順鉬抗腫瘤療效的增敏藥物中的應(yīng)用。
2.一種提高順鉬抗腫瘤療效的增敏藥物，其特征在于，所述提高順鉬抗腫瘤療效的增敏藥物的主要活性成分為血根堿。
全文摘要
本發(fā)明屬于腫瘤化療的增敏藥物領(lǐng)域，涉及血根堿的新用途，即在制備提高順鉑化學(xué)治療療效的增敏藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所述血根堿可以用于制備提高順鉑化學(xué)治療療效的增敏藥物，可以在無毒副作用的低濃度下，提高腫瘤細(xì)胞的順鉑化學(xué)治療的療效。無毒副作用濃度的血根堿處理后，聯(lián)合順鉑化學(xué)治療時，與單獨的順鉑化學(xué)治療相比，細(xì)胞死亡率提高了100%，幾乎增長了1倍。
文檔編號A61P35/00GK102283839SQ20111026961
公開日2011年12月21日 申請日期2011年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月13日
發(fā)明者徐加英, 樊賽軍 申請人:蘇州大學(xué)