專利名稱：碳納米管表面層層自組裝制備增敏型免疫反應(yīng)探針的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種增敏型免疫反應(yīng)探針的制備方法，尤其涉及一種碳納 米管表面層層自組裝制備增敏型免疫反應(yīng)探針的方法。
背景技術(shù)：
酶免疫分析技術(shù)是以酶為標記物的免疫分析技術(shù)，它將高特異性的免 疫反應(yīng)和酶促反應(yīng)相結(jié)合，已被廣泛應(yīng)用于臨床診斷、食品分析和環(huán)境分 析等領(lǐng)域。過氧化物酶(peroxidase)是酶免疫分析技術(shù)中應(yīng)用最廣泛的標記酶。 酶免疫分析技術(shù)的靈敏度在很大程度上依賴于標記酶催化反應(yīng)產(chǎn)生檢測 信號的靈敏度。開發(fā)新型增敏型酶標免疫反應(yīng)體系具有重要的應(yīng)用前景。
近年來，納米材料在酶免疫分析技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用引起了分析工作者廣 泛的興趣。其中碳納米管由于其獨特的理化性質(zhì)如導(dǎo)體和半導(dǎo)體性質(zhì)、極 高的機械強度、良好的吸附能力、較大的比表面積和長徑比、較多的催化 位點等而備受關(guān)注。將^5友納米管應(yīng)用于免疫分析中，可以增加固定生物分 子的數(shù)量，從而增強反應(yīng)信號。同時，碳納米管對生物分子活性中心與電 極間電子傳遞具有促進作用，能夠提高電化學(xué)酶免疫分析的檢測性能。
然而，目前碳納米管在免疫分析技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用還有待于進一步改 進。首先，目前碳納米管的增敏方式比較單一，大多將碳納米管作為抗體 或抗原的固定化基質(zhì)使用，通過增大抗體或抗原的固定量來提高待測物中 抗原或抗體的結(jié)合量來增加信號響應(yīng)。將碳納米管改性制備增敏型免疫反 應(yīng)探針，這一新型碳納米管增敏作用方式，有望取得更好的增強效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種碳納米管表面層層自組裝制備增敏型免疫反應(yīng)探針的 方法。本發(fā)明針對不同的被檢測物選用不同的氧化物酶標記抗體，在碳納 米管表面層層自組裝制備增敏型免疫反應(yīng)探針。
一種碳納米管表面層層自組裝制備增敏型免疫反應(yīng)探針的方法，將表
面自組裝改性的碳納米管依次分散于溶液A、溶液B中進行自組裝操作使 碳納米管表面附著修飾層，按預(yù)定次數(shù)循環(huán)所述的組裝操作使碳納米管表 面的修飾層達到一定厚度，得到增敏型免疫反應(yīng)探針；
所述的溶液A為伴刀豆球蛋白溶液，伴刀豆球蛋白溶液的濃度為 0.01-5mg/mL。
所述的溶';^B為過氧化物酶和過氧化物酶標記抗體混合溶液。 含糖的生物分子或用糖基標記的生物分子與植物凝集素間具有特異
性生物親和作用，過氧化物酶分子含糖基，與凝集素伴刀豆球蛋白具有較
強的生物識別作用。伴刀豆球蛋白修飾層可用于親和組裝過氧化物酶以及
過氧化物酶標記抗體。
所述的表面自組裝改性的碳納米管是表面經(jīng)過陽離子聚電解質(zhì)、陰離
子聚電解質(zhì)和過氧化物酶層層自組裝改性的碳納米管。
所述的表面自組裝改性的碳納米管的制備方法如下 (1)將碳納米管在3mo1 L"硝酸中回流純化4-12h后，離心分離，得 到純化的碳納米管，將純化的碳納米管放入濃硝酸和濃橋u酸混合液(體積 比1: 3)中超聲2-6h使碳納米管羧基化，離心分離并反復(fù)用二次蒸餾水 沖洗直到碳納米管溶液達到中性。用0.5-15molL"氫氧化鈉將羧基化的碳 納米管溶液的pH值調(diào)節(jié)為7.0-10.0,使碳納米管表面帶上COCT，得到表 面帶負電的碳納米管；
(2)將表面帶負電的碳納米管依次分散于溶液C、溶液D、溶液E中 進行自組裝操作使碳納米管表面附著改性層，循環(huán)所述的碳納米管在溶液D、溶液E中的組裝操作1 ~ 10次直至碳納米管表面的改性層為預(yù)定厚度， 得到表面自組裝改性的碳納米管；
所述的溶液C為陽離子聚電解質(zhì)溶液，所述的陽離子聚電解質(zhì)可以為 殼聚糖、聚烯丙基胺鹽酸鹽、聚二曱基二烯丙基氯化銨，聚乙烯亞胺；溶 液C中陽離子聚電解質(zhì)的濃度為0.01 -5mg/mL 。
所述的溶液D為陰離子聚電解質(zhì)溶液，所述的陰離子聚電解質(zhì)為聚對 苯乙烯磺酸鈉、硫酸酯化多糖、多糖硫酸酯、羧曱基纖維素鈉、聚丙烯酸 或海藻酸鈉；溶液D中陰離子聚電解質(zhì)的濃度為0.01-5mg/mL。
所述的溶液E為過氧化物酶溶液，溶液的濃度為0.1-5mg/mL，溶液 pH值低于過氧化物酶的等電點。所述的過氧化物酶，為辣根過氧化物酶、 ,勞過氧化物酶或馬鈴薯過氧化物酶。
層層自組裝(LBL)技術(shù)是制備有序納米生物復(fù)合物的有效方法，具有 條件溫和、過程可重復(fù)、可在分子水平上控制組裝量等優(yōu)點。可用于高效、 可控地構(gòu)建基于碳納米管的增敏型免疫反應(yīng)探針-信號放大型酶標抗體
(peroxidase)n-Ab <>
LbL技術(shù)可在分子水平上控制組裝量、調(diào)節(jié)組裝膜結(jié)構(gòu)，且組裝條件 溫和，組裝過程高度可重復(fù)，組裝層數(shù)可調(diào)。靜電作用力和生物親和作用， 是LbL技術(shù)中最常應(yīng)用的驅(qū)動力。靜電層層自組裝法在層層自組裝法技術(shù) 中應(yīng)用最為廣泛，它是一種以靜電力為驅(qū)動力，通過陰、陽離子聚電解質(zhì) 交替沉積構(gòu)造多層膜的新技術(shù)。圖l為碳納米管表面靜電自組裝過程示意 圖，表面帶負電的碳納米管表面可以通過靜電自組裝法得到陽離子聚電解 質(zhì)改性膜。陽離子聚電解質(zhì)改性膜又可進一步與帶有相反電荷的陰離子聚 電解質(zhì)溶液組裝。溶液pH值低于過氧化物酶的等電點時，過氧化物酶帶正 電，也可與表面帶負電的陰離子聚電解質(zhì)發(fā)生靜電自組裝。重復(fù)在聚陰離 子和過氧化物酶中的組裝操作l ~ 10次直至^ 友納米管表面的改性層為預(yù)定 厚度，得到自組裝改性的碳納米管。所述的溶液B的配制方法如下
在0.01-5mg/mL的過氧化物酶溶液中加入過氧化物酶標記抗體，過氧 化物酶標記抗體在溶液B中的濃度為0.1ng/mL-5mg/mL,所述的過氧化物 酶，為辣根過氧化物酶、蘆夢過氧化物酶或馬鈴薯過氧化物酶。
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用的時間均為5-60min。
循環(huán)所述的自組裝操作1-10次，可得到增敏型免疫反應(yīng)探針。 本發(fā)明增敏型免疫反應(yīng)探針制備的基本原理是以過氧化物為標記酶， 將大量的過氧化物酶與抗體共固定在碳納米管表面。該探針與待測樣品中 和抗原特異性結(jié)合形成結(jié)合體時，每個待測抗原對應(yīng)增敏型探針上大量的 過氧化物酶。與常規(guī)免疫分析中每個待測抗原對應(yīng)單個或少量過氧化物酶 相比，使用增敏型免疫反應(yīng)探針的免疫分析體系具有顯著提高的檢測靈敏 度。
本發(fā)明方法一般均可在常溫下的水溶液中操作，所述的溶液A ~ E也 均采用水溶液體系。
碳納米管由于其獨特的理化性質(zhì)如導(dǎo)體和半導(dǎo)體性質(zhì)、極高的機械強 度、良好的吸附能力、較大的比表面積、較多的結(jié)合位點等而備受關(guān)注。 將碳納米管應(yīng)用于免疫分析中，可以增加固定生物分子的數(shù)量，從而增強 反應(yīng)信號。圖2為自組裝改性的碳納米管表面親和組裝制備增敏型免疫反 應(yīng)探針的示意圖。通過靜電作用制備的改性膜最外層的過氧化物酶與凝集 素伴刀豆球蛋白具有較強的生物識別作用?？膳c伴刀豆球蛋白層層自組裝 得到修飾層。循環(huán)在伴刀豆球蛋白和過氧化物酶中的組裝操作直至碳納米 管表面的修飾層為預(yù)定厚度，得到增敏型免疫反應(yīng)探針。
本發(fā)明針對不同的被檢測物選用不同的氧化物酶標記抗體，在碳納米 管表面層層自組裝制備增敏型免疫反應(yīng)探針。本發(fā)明制備的增敏型免疫反 應(yīng)探針與待測樣品中和抗原特異性結(jié)合形成結(jié)合體時，每個待測抗原對應(yīng)
7增敏型探針上大量的過氧化物酶。與常^見免疫分析中每個^f寺測抗原對應(yīng)單 個或少量過氧化物酶相比，使用增敏型免疫反應(yīng)探針的免疫分析體系具有 顯著提高的檢測靈敏度。
本發(fā)明利用層層自組裝制備增敏型免疫反應(yīng)探針的方法制備條件溫 和，標記酶、抗體固定量可控。


圖1為制備表面自組裝改性的碳納米管的流程示意圖。
疫反應(yīng)探針的流程示意圖。
具體實施例方式
實施例1 增敏型癌胚抗原免疫反應(yīng)探針的制備
將碳納米管在3mo1 U'硝酸中回流純化6h后，離心分離，得到純化 的碳納米管，將純化的碳納米管放入濃硝酸和濃硫酸混合液(體積比1: 3) 中超聲4h使碳納米管羧基化，離心分離并反復(fù)用二次蒸餾水沖洗直到碳 納米管溶液達到中性。用5mo1 U1氫氧化鈉將羧基化的碳納米管溶液的pH 值調(diào)節(jié)為8.0,使碳納米管表面帶上COO-,得到表面帶負電的碳納米管；
將表面帶負電的碳納米管依次分散于聚烯丙基胺鹽酸鹽溶液、聚對苯 乙烯磺酸鈉溶液、辣根過氧化物酶溶液中進行自組裝操作使碳納米管表面 附著改性層，聚烯丙基胺鹽酸鹽溶液和聚對苯乙烯磺酸鈉溶液的濃度均為 0.5mg/mL,辣根過氧化物酶溶液的濃度為0.5mg/mL，辣根過氧化物酶溶 液的pH值為6.0，循環(huán)所述的碳納米管在聚對苯乙烯磺酸鈉溶液、辣根過氧 化物酶中的組裝操作4次，得到表面自組裝改性的碳納米管；
將表面自組裝改性的碳納米管依次分散于溶液A (伴刀豆球蛋白溶 液)、溶液B (辣一艮過氧化物酶和辣根過氧化物酶標記癌胚抗原抗體的混合溶液)中進行自組裝操作使碳納米管表面附著修飾層，伴刀豆球蛋白溶
液的濃度為0.3mg/mL，溶液B中辣根過氧化物酶溶液的濃度為lmg/mL， 辣根過氧化物酶標記癌胚抗原抗體的濃度為O.lmg/mL,循環(huán)所述的組裝 操作5次，得到增敏型癌胚抗原免疫反應(yīng)探針。
實施例2 增敏型癌抗原125免疫反應(yīng)探4十的制備
將碳納米管在3mo1 L"硝酸中回流純化8h后，離心分離，得到純化 的碳納米管，將純化的碳納米管放入濃硝酸和濃硫酸混合液(體積比1: 3 ) 中超聲6h使碳納米管羧基化，離心分離并反復(fù)用二次蒸餾水沖洗直到碳 納米管溶液達到中性。用3molU1氫氧化鈉將羧基化的碳納米管溶液的pH 值調(diào)節(jié)為9.0，使碳納米管表面帶上COCT，得到表面帶負電的碳納米管；
將表面帶負電的碳納米管依次分散于聚二曱基二烯丙基氯化銨溶液、 海藻酸鈉溶液、蘆夢過氧化物酶溶液中進行自組裝才喿作使^暖納米管表面附 著改性層，聚二曱基二烯丙基氯化銨溶液和海藻酸鈉溶液的濃度均為 2mg/mL,,夢過氧化物酶溶液的濃度為lmg/mL， f夢過氧化物酶溶液的 pH值為6.5,循環(huán)所述的碳納米管在海藻酸鈉溶液、,夢過氧化物酶中的組 裝操作6次，得到表面自組裝改性的碳納米管；
將表面自組裝改性的碳納米管依次分散于溶液A (伴刀豆球蛋白溶 液)、溶液B (,夢過氧化物酶和,夢過氧化物酶標記癌抗原125抗體的 混合溶液)中進行自組裝操作使碳納米管表面附著修飾層，伴刀豆球蛋白 溶液的濃度為0.8mg/mL,溶液B ,夢過氧化物酶溶液的濃度為2mg/mL, ,夢過氧化物酶標記癌抗原125抗體的濃度為0.01mg/mL,循環(huán)所述的組 裝操作4次，得到增敏型癌抗原125免疫反應(yīng)探針。
實施例3 增敏型鐵蛋白免疫反應(yīng)探針的制備
將碳納米管在3mo1 L"硝酸中回流純化4h后，離心分離，得到純化 的碳納米管，將純化的碳納米管放入濃硝酸和濃石克酸混合液(體積比1: 3)中超聲3h使碳納米管羧基化，離心分離并反復(fù)用二次蒸餾水沖洗直到碳 納米管溶液達到中性。用lOmol L"氫氧化鈉將羧基化的碳納米管溶液的
pH值調(diào)節(jié)為9.5，使碳納米管表面帶上cocr,得到表面帶負電的碳納米 管；
將表面帶負電的碳納米管依次分散于聚乙烯亞胺溶液、羧甲基纖維素 鈉溶液、馬鈴薯過氧化物酶溶液中進行自組裝操作使碳納米管表面附著改
性層，聚乙烯亞胺溶液和羧曱基纖維素鈉溶液的濃度均為0.1mg/mL,馬鈴 薯過氧化物酶溶液的濃度為0.1mg/mL，馬鈴薯過氧化物酶溶液的pH值為 5.5,循環(huán)所述的碳納米管在羧曱基纖維素鈉溶液、馬鈴薯過氧化物酶中的 組裝操作3次，得到表面自組裝改性的碳納米管；
將表面自組裝改性的碳納米管依次分散于溶液A伴刀豆球蛋白溶液、 溶液B (馬鈴薯過氧化物酶和馬鈴薯過氧化物酶標記鐵蛋白抗體的混合溶 液)中進行自組裝操作使碳納米管表面附著修飾層，伴刀豆球蛋白溶液的 濃度為0.05mg/mL,溶液B馬鈴薯過氧化物酶溶液的濃度為0.1mg/mL， 馬鈴薯過氧化物酶標記鐵蛋白抗體的濃度為lmg/mL,循環(huán)所述的組裝操 作7次，得到增敏型鐵蛋白免疫反應(yīng)探針。
權(quán)利要求
1、一種碳納米管表面層層自組裝制備增敏型免疫反應(yīng)探針的方法，將表面自組裝改性的碳納米管依次分散于溶液A、溶液B中進行自組裝操作使碳納米管表面附著修飾層，按預(yù)定次數(shù)循環(huán)所述的自組裝操作得到增敏型免疫反應(yīng)探針；所述的溶液A為伴刀豆球蛋白溶液。所述的溶液B為過氧化物酶和過氧化物酶標記抗體的混合溶液。
2、 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述的表面自組裝改性的 碳納米管是表面經(jīng)過陽離子聚電解質(zhì)、陰離子聚電解質(zhì)和過氧化物酶層層 自組裝改性的碳納米管。
3、 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的表面自組裝改性的 碳納米管的制備方法如下(1) 將碳納米管經(jīng)純化、羧基化后得到表面帶負電的碳納米管；(2) 將表面帶負電的碳納米管依次分散于溶液C、溶液D、溶液E中 進行自組裝操作使碳納米管表面附著改性層，循環(huán)所述的碳納米管在溶液 D、溶液E中的組裝操作1 ~ 10次直至碳納米管表面的改性層為預(yù)定厚度， 得到表面自組裝改性的碳納米管；所述的溶液C為陽離子聚電解質(zhì)溶液，所述的陽離子聚電解質(zhì)可以為 殼聚糖、聚烯丙基胺鹽酸鹽、聚二曱基二烯丙基氯化銨，聚乙烯亞胺；溶 液C中聚電解質(zhì)的濃度為0.01-5mg/mL。所述的溶液D為陰離子聚電解質(zhì)溶液，所述的陰離子聚電解質(zhì)為聚對 苯乙烯磺酸鈉、硫酸酯化多糖、多糖硫酸酯、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸 或海藻酸鈉；溶液D中聚電解質(zhì)的濃度為0.01 -5mg/mL。所述的溶液E為過氧化物酶溶液，溶液的濃度為0.1-5mg/mL。
4、 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述的溶液B的配制方法如下在0.01-5mg/mL的過氧化物酶溶液中加入過氧化物酶標記抗體，過氧化物酶標記抗體在溶液B中的濃度為0.1ng/mL-5mg/mL;
5、 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述的伴刀豆球蛋白溶液的濃度為0.01-5mg/mL。
6、 如權(quán)利要求1 5任一項所述的方法，其特征在于所述的過氧化物酶為辣根過氧化物酶、聲筍過氧化物酶或馬鈴薯過氧化物酶。
7、 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述的表面自組裝改性的碳納米管每次在溶液A及溶液B中分散后作用的時間均為5-60min。
8、 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于循環(huán)所述的自組裝操作1-10次，得到增敏型免疫反應(yīng)探針。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種碳納米管表面層層自組裝制備增敏型免疫反應(yīng)探針的方法，將表面自組裝改性的碳納米管分別分散于伴刀豆球蛋白溶液、過氧化物酶溶液中，依靠伴刀豆球蛋白與過氧化物酶的特異性生物識別作用，可以層層自組裝達到預(yù)定厚度，得到增敏型免疫反應(yīng)探針。本發(fā)明利用層層自組裝制備的增敏型免疫反應(yīng)探針，將大量的過氧化物酶與抗體共固定在碳納米管表面。該探針與待測樣品中和抗原特異性結(jié)合形成結(jié)合體時，每個待測抗原對應(yīng)增敏型探針上大量的過氧化物酶，可顯著提高免疫反應(yīng)的檢測靈敏度。本發(fā)明利用層層自組裝制備增敏型免疫反應(yīng)探針的方法制備條件溫和，標記酶、抗體固定量可控。
文檔編號G01N33/535GK101482561SQ20091009609
公開日2009年7月15日 申請日期2009年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月9日
發(fā)明者奚鳳娜, 林賢福, 陳志春 申請人:浙江大學(xué)