專利名稱：α1,3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)染材料及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，具體涉及ー種作用于腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的α 1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)染材料，及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在我國，腫瘤發(fā)病率高，病例數(shù)相當(dāng)龐大。一直以來，人們都為攻克腫瘤而不懈努力，并提出了多種治療方法，如放療、化療等等，但這些治療手段或多或少存在諸如療效不理想、副作用大、治療費(fèi)用高等問題。因此，有必要繼續(xù)對(duì)腫瘤的治療進(jìn)行深入探索，開發(fā)出更加有效的治療手段。超急性排斥反應(yīng)(Hyperacute Rejection,HAR)由受體內(nèi)(如人、猴)預(yù)存的天然抗體與異種供體(如豬)器官血管內(nèi)皮細(xì)胞上的抗原靶分子結(jié)合激活補(bǔ)體系統(tǒng)，導(dǎo)致補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒作用或/和直接激活血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放血小板激活因子引起血栓形成。其中，抗原革E分子的末端均是由α 1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(α 1，3-galaetosyltransferase, α I,3GT)催化連接的α半乳糖殘基。因此，在腫瘤的治療中，利用HAR反應(yīng)，能夠有效地在腫瘤部位導(dǎo)致補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒作用毀壞癌細(xì)胞或/和引起局部血栓形成，切斷腫瘤組織的養(yǎng)分供給，從而達(dá)到抗腫瘤的目的。然而，a 1，3GT只存在于非靈長類哺乳動(dòng)物，而不存在于高級(jí)靈長目細(xì)胞內(nèi)，故人類無α半乳糖抗原表達(dá)。因此，要利用前述HAR反應(yīng)進(jìn)行腫瘤治療，必須尋找合適的手段將al，3GT導(dǎo)入人體中。目前，含有α1，3GT基因質(zhì)粒的材料已經(jīng)被研制出來，并可以直接被注射到腫瘤部位進(jìn)行相關(guān)治療。然而，這種含有a 1，3GT基因質(zhì)粒的材料不具備靶向性，無法特異性地作用于待治療的腫瘤部位，且注射有效劑量不易掌握，a 1，3GT定位表達(dá)范圍和水平的不確定性，決定了其難以發(fā)揮有效治療作用。因此，有必要用適當(dāng)?shù)妮d體對(duì)a 1，3GT基因進(jìn)行裝載，并對(duì)載體材料加以修飾，使其具備針對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在干，針對(duì)現(xiàn)有含有a 1，3GT基因質(zhì)粒的材料不具備靶向性，無法特異性地作用于待治療的腫瘤部位的缺陷，提供ー種對(duì)新生血管內(nèi)皮細(xì)胞具有良好的靶向性的α I，3GT基因轉(zhuǎn)染材料及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明的目的是提供ー種α 1，3GT基因轉(zhuǎn)染材料。本發(fā)明的另一目的是提供所述a 1，3GT基因轉(zhuǎn)染材料的制備方法。本發(fā)明所述a 1，3GT基因轉(zhuǎn)染材料包括α I，3GT基因質(zhì)粒、用于裝載該質(zhì)粒的PEG偶聯(lián)的納米脂質(zhì)體、以及通過所述PEG偶聯(lián)在所述納米脂質(zhì)體上的Endoglin抗體分子；所述α I，3GT基因轉(zhuǎn)染材料中，各組份的質(zhì)量比為a 1，3GT基因質(zhì)粒PEG偶聯(lián)的納米脂質(zhì)體Endoglin抗體分子=(O. I O. 3) (8. 8 13. 2) (O. 8 I. 2)，優(yōu)選地，該比例為(O. I O. 15) (12. I 13. 2) (I. I I. 2)。 優(yōu)選地，所述α 1，3GT基因質(zhì)粒為5. 75kb真核表達(dá)質(zhì)粒。
優(yōu)選地,所述裝載有質(zhì)粒的PEG偶聯(lián)的納米脂質(zhì)體微粒的粒徑可為40 200nm。更優(yōu)選地，所述裝載有質(zhì)粒的PEG偶聯(lián)的納米脂質(zhì)體微粒的粒徑可為40 45nm,由于腫瘤部位新生血管相對(duì)較少且管徑較細(xì)，粒徑較小的脂質(zhì)體微粒能夠更有效地到達(dá)靶細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)更好的治療效果。優(yōu)選地,所述Endoglin抗體分子可為單克隆抗體(monoclonal antibody,mAb)或單鏈抗體(single-chain variable fragment (scFv) antibody, scFv Ab),分子量可為 20 180k道爾頓。
優(yōu)選地，本發(fā)明采用的偶聯(lián)劑為聚こニ醇衍生物等，所述聚こニ醇衍生物可選自ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺-聚こニ醇(DSPE-PEG)或ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺-聚こニ醇-馬來酰亞胺(DSPE-PEG-maleimide)等PEG衍生物，偶聯(lián)劑的PEG的分子量可為1000 4000。本發(fā)明所述Endoglin抗體偶聯(lián)的脂質(zhì)體的制備方法包括以下步驟I)制備PEG修飾的磷脂薄層；2)重懸所述磷脂薄層，加入a 1，3GT基因質(zhì)粒，制得裝載有質(zhì)粒的PEG偶聯(lián)的納米脂質(zhì)體顆粒；3)對(duì)所述裝載有質(zhì)粒的PEG偶聯(lián)的納米脂質(zhì)體顆粒進(jìn)行均一化和純化；4)巰基化Endoglin抗體分子；5)將所述巰基化的Endoglin抗體分子偶聯(lián)在所述裝載有質(zhì)粒的PEG偶聯(lián)的納米脂質(zhì)體顆粒上，得所述a 1，3GT基因轉(zhuǎn)染材料。優(yōu)選地，在步驟I中，所述制備PEG修飾的磷脂薄層的具體方法包括用三氯甲烷將棕櫚酰油酰磷脂酰膽堿、雙十二烷基ニ甲基溴化銨、ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺-聚こニ醇2000和ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺-聚こニ醇2000-馬來酰亞胺分別配制成20mg/mL、5mg/mL、20mg/mL和10mg/mL的相應(yīng)濃度，并按摩爾比(90 100) (2 4) (2 4) I的比例在樣品瓶中進(jìn)行混合；充分混勻后，通氮?dú)饬?時(shí)間應(yīng)不少于IOmin)除去有機(jī)溶劑，并不斷旋轉(zhuǎn)樣品瓶，直至形成磷脂薄層(該磷脂薄層將在后續(xù)操作步驟中形成PEG偶聯(lián)的納米脂質(zhì)體載體)；而后置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中真空蒸發(fā)2h。其中，雙十二烷基ニ甲基溴化銨為陰離子表面活性剤，將在清洗過程中除去。優(yōu)選地，在步驟2中，所述裝入a 1，3GT基因質(zhì)粒，制備納米脂質(zhì)體顆粒的具體方法包括往步驟I所述樣品瓶中加入50mM、pH = 7. O的TRIS-HCl緩沖液，該緩沖液與所述步驟I所得PEG修飾的磷脂薄層的質(zhì)量比為(10 250) 1，輕微旋轉(zhuǎn)和震蕩后，置水浴超聲波儀處理3min，充分重懸步驟I獲得的PEG修飾的磷脂薄層，同時(shí)應(yīng)盡量避免氣泡的產(chǎn)生；依次逐滴加入a 1，3GT基因質(zhì)粒、濃度為35% 75%的こ醇和200mM的CaCl2溶液，并使al，3GT基因質(zhì)粒與所述步驟I所得PEG修飾的磷脂薄層的質(zhì)量比為(0. I O. 3) (8.8- 13. 2)，并使得こ醇的終濃度達(dá)到35 40% (V/V) 'CaCl2的終濃度達(dá)到4mM ；將瓶蓋旋緊并密封，進(jìn)行7 12個(gè)循環(huán)的反復(fù)凍融，得到脂質(zhì)體顆粒，其中，每ー個(gè)凍融循環(huán)包括5 IOmin液氮-2 5min 37°C水浴_4 7min室溫靜置。優(yōu)選地，在步驟3中，所述納米脂質(zhì)體顆粒的均一化和純化的具體方法包括將步驟2)得到的脂質(zhì)體顆粒依次通過膜擠出器中的400nm、100nm和50nm雙層微孔濾膜各15 25次；在HEPES緩沖液中透析2 4h回收得到的質(zhì)粒脂質(zhì)體，期間更換透析液一次。優(yōu)選地,在步驟4中，所述巰基化Endoglin抗體的具體方法包括；將Endoglin抗體與IOmM的Traut’ s試劑(Traut’ s Reagent)在避光室溫巰基化反應(yīng)I 2h,其中所述Endoglin抗體與所述Traut’s Reagent質(zhì)量比為I : (100 160),隨后超濾2 4次，除去Traut’s Reagent的同時(shí),將緩沖液置換成HEPES緩沖液；所述Endoglin抗體可為單克隆抗體或單鏈抗體，分子量可為20 180k道爾頓。優(yōu)選地,在步驟5中，所述將Endoglin抗體分子偶聯(lián)在PEG修飾的納米脂質(zhì)體上的具體方法包括將步驟4得到的巰基化Endoglin抗體迅速加入步驟3得到的脂質(zhì)體顆粒中，室溫下氮?dú)獗Ｗo(hù)環(huán)境中，搖晃偶聯(lián)反應(yīng)過夜，其中所述巰基化Endoglin抗體分子與所述步驟I所得PEG修飾的磷脂薄層的質(zhì)量比為(O. 8 I. 2) (8. 8 13. 2)。本發(fā)明還提供了ー種如上所述的α 1，3GT基因轉(zhuǎn)染材料的應(yīng)用，該 基因轉(zhuǎn)染材料用于制備治療實(shí)體腫瘤的藥物。本發(fā)明所述a 1，3GT基因轉(zhuǎn)染材料由于修飾有Endoglin抗體分子，因此對(duì)新生血管內(nèi)皮細(xì)胞具有良好的靶向性，故而可廣泛運(yùn)用于各類實(shí)體腫瘤的早期治療。在臨床使用中，當(dāng)該復(fù)合脂質(zhì)體特異性作用于腫瘤組織新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的時(shí)候，其裝載的a 1，3GT基因能夠得到釋放和表達(dá)，能夠有效地在腫瘤部位引發(fā)HAR反應(yīng)，導(dǎo)致補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒作用毀壞癌細(xì)胞或/和引起局部血栓形成，切斷腫瘤組織的養(yǎng)分供給，實(shí)現(xiàn)治療腫瘤的目的。


下面將結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)ー步說明，附圖中圖I為本發(fā)明所述α 1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)染材料的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為本發(fā)明所述α 1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)染材料的制備方法流程圖；圖3為本發(fā)明實(shí)施例中的al，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)染材料透射電鏡圖像(Χ10000)；圖4為本發(fā)明所述α 1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)染材料在Endoglin穩(wěn)定表達(dá)的293Τ細(xì)胞株中的表達(dá)(Χ40倍)；圖5為本發(fā)明所述α 1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)染材料在小鼠體內(nèi)Ih的代謝情況；圖6為本發(fā)明所述α 1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)染材料在小鼠體內(nèi)2. 5h的代謝情況；圖7為本發(fā)明所述α 1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)染材料在小鼠體內(nèi)4h的代謝情況；圖8為本發(fā)明所述α 1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)染材料在小鼠各組織器官的代謝分布情況；圖9為本發(fā)明所述α 1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)染材料及對(duì)照組材料治療荷瘤小鼠的結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)ー步詳細(xì)說明。Pegylated immunoliposomes (PILs)是經(jīng)聚乙ニ酉享(PEG)修飾的、粒徑控制在 100納米左右的納米免疫脂質(zhì)體，是ー種新的非病毒基因轉(zhuǎn)移載體系統(tǒng)。在現(xiàn)有研究中，人們已經(jīng)將多種抗體結(jié)合在脂質(zhì)體上，制備出各種不同用途的免疫脂質(zhì)體材料。Endoglin是20世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)的一個(gè)和腫瘤新生血管相關(guān)的膜表面同型ニ聚體糖蛋白分子(分子量約為180kDa),是轉(zhuǎn)化生長因子-β I (transforming growthfactor- β 1，TGF-β I)和細(xì)胞表面受體結(jié)合時(shí)的輔助分子。Endoglin和TGF-β I結(jié)合后，可調(diào)節(jié)TGF-β I和其受體結(jié)合后下游的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，從而促進(jìn)腫瘤新生血管生成?，F(xiàn)已有許多研究表明=Endoglin主要分布于新生血管的內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤周圍組織的細(xì)胞表面，其它正常組織幾乎均不表達(dá)。因此，Endoglin和腫瘤血管生成密切相關(guān)，是腫瘤血管生成的標(biāo)志性分子之一。由于不同組織來源的腫瘤新生血管均起源于內(nèi)皮細(xì)胞，各種腫瘤的新生血管具有均質(zhì)性，所表達(dá)的特異抗原物質(zhì)具有共性，這樣就可避免不同腫瘤由于遺傳物質(zhì)在不斷突變所導(dǎo)致的不同組織起源的腫瘤抗原的異質(zhì) 性，因此針對(duì)腫瘤新生血管的治療手段有可能應(yīng)用于各種腫瘤。因此，Endoglin是腫瘤抗血管治療和靶向治療的理想靶點(diǎn)，具有誘人的臨床應(yīng)用前景。因此，如果用PILs對(duì)a 1,3GT進(jìn)行裝載，并在載體表面修飾的Endoglin抗體，則能夠制備出ー種a 1，3GT基因轉(zhuǎn)染材料，使得該基因轉(zhuǎn)染材料具有對(duì)Endoglin分子的特異性結(jié)合能力。Endoglin抗體能夠使該α I, 3GT基因轉(zhuǎn)染材料特異性作用于腫瘤組織的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞，使得裝載的α半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因在腫瘤組織處得到表達(dá)，從而引發(fā)HAR反應(yīng)，達(dá)到摧毀腫瘤的目的。從理論上推測(cè)，該材料對(duì)各類腫瘤均具有良好的靶向性，可以廣泛運(yùn)用于各類實(shí)體腫瘤的早期治療。目前，尚未見針對(duì)腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的a 1，3GT基因靶向轉(zhuǎn)染材料的相關(guān)報(bào)道。下面將結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)ー步說明，這些附圖和實(shí)施例應(yīng)當(dāng)被理解為是說明性的，而非對(duì)本發(fā)明的限制。圖I所示為本發(fā)明所述a 1，3GT基因轉(zhuǎn)染材料的結(jié)構(gòu)示意圖。101為所述α 1，3GT基因質(zhì)粒，該質(zhì)粒優(yōu)選為5. 75kb真核表達(dá)質(zhì)粒。102為納米脂質(zhì)體微粒，其粒徑范圍為40 200nm，具有以下特殊性質(zhì)I)能夠提高納米脂質(zhì)體顆粒的水溶性和避免體內(nèi)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的非特異性吞噬，以及延長納米脂質(zhì)體顆粒在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間而達(dá)到提高靶組織和靶細(xì)胞對(duì)納米顆粒攝取的目的；2)増加此類抗腫瘤藥物的溶解度和穩(wěn)定性，減弱或消除免疫原性、抗原性和毒性，提高藥物的治療指數(shù)，擴(kuò)大臨床用藥范圍；3)改善藥物的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)，延長藥物在體內(nèi)的半衰期等。103為偶聯(lián)劑，具體為聚こニ醇衍生物，包括ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺-聚こニ醇(DSPE-PEG)或ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺-聚こニ醇-馬來酰亞胺(DSPE-PEG-maleimide)等PEG衍生物，用作本發(fā)明偶聯(lián)劑的PEG的分子量為1000 4000。104為Endoglin抗體分子,該抗體為單克隆抗體(monoclonal antibody, mAb)或單鏈抗體(single-chain variable fragment (scFv) antibody, scFv Ab),分子量為約 20 180k道爾頓。圖2所示為所述α 1，3GT基因轉(zhuǎn)染材料的制備方法流程圖。201為制備PEG修飾的磷脂薄層的步驟，具體包括用三氯甲烷將棕櫚酰油酰磷脂酰膽堿(POPC)、雙十二烷基二甲基溴化銨(DDAB)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000 (DSPE-PEG2000)和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-馬來酰亞胺(DSPE-PEG2000-maleimide)分別配制成 20mg/mL、5mg/mL、20mg/mL和 10mg/mL 的相應(yīng)濃度，并按摩爾比(90 100) (2 4) (2 4) I的比例在樣品瓶中進(jìn)行混合；充分混勻后，通氮?dú)饬?時(shí)間應(yīng)不少于IOmin)除去有機(jī)溶劑，并不斷旋轉(zhuǎn)樣品瓶，直至形成磷脂薄層；而后置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中真空蒸發(fā)2h。202為裝入a I，3GT基因質(zhì)粒，制備納米脂質(zhì)體顆粒的步驟，具體包括往步驟201所述樣品瓶中加入50mM、pH = 7. O的TRIS-HCl緩沖液，該緩沖液與所述步驟201所得PEG修飾的磷脂薄層的質(zhì)量比為(10 250) 1，輕微旋轉(zhuǎn)和震蕩后，置水浴超聲波儀處理3 5min，充分重懸所述步驟I)獲得的PEG修飾的磷脂薄層，同時(shí)應(yīng)盡量避免氣泡的產(chǎn)生；依次逐滴加入a 1，3GT基因質(zhì)粒、濃度為35% 75%的乙醇和200mM的CaCl2溶液，并使α 1，3GT基因質(zhì)粒與所述步驟201所得PEG修飾的磷脂薄層的質(zhì)量比為(O. I O. 3) (8. 8 13. 2)、乙醇的終濃度達(dá)到體積分?jǐn)?shù)為35 40%、CaCl2的終濃度達(dá)到4mM ;將瓶蓋旋緊并密封，進(jìn)行7 12個(gè)循環(huán)的反復(fù)凍融，得到脂質(zhì)體顆粒，其中，每一個(gè)凍融循環(huán)包括5 IOmin 液氮-2 5min 37°C水浴_4 7min室溫靜置。203為脂質(zhì)體顆粒的均一化和純化步驟，具體包括將步驟202得到的脂質(zhì)體顆粒依次通過膜擠出器中的400nm、100nm和50nm雙層微孔濾膜各15 25次，以完成脂質(zhì)體的均一化；在HEPES緩沖液(25mM HEPES, HOmMNaCl, pH7. O)中透析2 4h回收得到的脂質(zhì)體顆粒，期間更換透析液一次，以完成脂質(zhì)體的純化。204為巰基化Endoglin抗體的步驟，具體包括；將Endoglin抗體與IOmM的Trauf s試劑(2-亞氨氫氯化硫醇經(jīng)50mM四硼酸鈉，pH9. 4配制而成)在避光室溫巰基化反應(yīng)I 2h,其中所述Endoglin抗體與所述Traut’ s試劑質(zhì)量比為I : (100 160),隨后超濾2 4次，除去Traut’ s試劑的同時(shí)，將緩沖液置換成HEPES緩沖液。205為將步驟204得到的巰基化Endoglin抗體迅速加入步驟203得到的脂質(zhì)體顆粒中，室溫下氮?dú)獗Ｗo(hù)環(huán)境中，搖晃偶聯(lián)反應(yīng)過夜(10 18h)，其中所述巰基化Endoglin抗體分子與所述步驟201所得PEG修飾的磷脂薄層的質(zhì)量比為(O. 8 1.2) (8. 8 13. 2)。實(shí)施例I :制備粒徑為IOOnm的α 1，3GT基因轉(zhuǎn)染材料，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行表征，具體制備步驟如下I)用三氯甲烷將 POPC、DDAB、DSPE-PEG2000 和 DSPE-PEG2000_maleimide 分別配制成 20mg/mL、5mg/mL、20mg/mL 和 10mg/mL 的相應(yīng)濃度，并按 18. 6 μ mo I、O. 6 μ mo I、O. 6 μ mo I和0. 2 μ mo I的量混合于Agilent色譜樣品瓶中；充分混勻后，通氮?dú)饬?5min除去有機(jī)溶齊U，并不斷旋轉(zhuǎn)樣品瓶，直至形成磷脂薄層；而后置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中真空蒸發(fā)2h。2)取出樣品瓶，加入0. 2mL TRIS-HCl緩沖液(50mM，pH7. 0)，輕微旋轉(zhuǎn)和震蕩后，置水浴超聲波儀處理3min，充分重懸磷脂混合物，同時(shí)應(yīng)盡量避免氣泡的產(chǎn)生；依次逐滴加入增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)質(zhì)粒DNA (350 μ g)、60%乙醇(終濃度35%，V/V)、200mMCaCl2溶液(終濃度4mM);將瓶蓋旋緊并密封，進(jìn)行5個(gè)循環(huán)(每一個(gè)循環(huán)包括5min液氮-2min 37°C水浴_4min室溫靜置)的反復(fù)凍融，得到質(zhì)粒脂質(zhì)體。3)將步驟2)得到的質(zhì)粒脂質(zhì)體依次通過膜擠出器中的400nm(20次)、100nm(20次)和50nm(21次)雙層微孔濾膜，完成脂質(zhì)體的均一化；在HEPES緩沖液(25mM HEPES,140mM NaCl, pH7. O)中透析2h回收得到的質(zhì)粒脂質(zhì)體,期間更換透析液一次,完成脂質(zhì)體的純化。4)將 Endoglin 抗體 I. 6mg 與 200 μ L IOmM 的 Traut’ s Reagent (2_ 亞氨氫氯化硫醇經(jīng)50mM四硼酸鈉，pH9. 4配制而成)，避光室溫巰基化反應(yīng)Ih,隨后采用MicroconUltracel YM-30超濾離心管超濾3次，除去Traut’ s Reagent的同時(shí)，將緩沖液置換成HEPES緩沖液。5)將步驟2-4得到的巰基化Endoglin抗體迅速加入步驟2_3得到的脂質(zhì)體顆粒中，室溫下氮?dú)獗Ｗo(hù)環(huán)境中，搖晃偶聯(lián)反 應(yīng)過夜。圖3所示為所制備α 1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)染材料的透射電鏡圖像，可以看到脂質(zhì)體顆粒粒徑約為lOOnm，且粒徑分布均勻。粒徑測(cè)定采用動(dòng)態(tài)光散射法進(jìn)行，測(cè)得所制備Endoglin抗體偶聯(lián)的質(zhì)粒DNA脂質(zhì)體的粒徑為100. 78 ± I. 94nm，與圖3中透射電鏡觀
察結(jié)果一致。實(shí)施例2 :制備粒徑為40nm的α 1，3GT基因轉(zhuǎn)染材料，具體制備步驟如下I)用三氯甲烷將 POPC、DDAB、DSPE-PEG2000 和 DSPE-PEG2000_maleimide 分別配制成 20mg/mL、5mg/mL、20mg/mL 和 10mg/mL 的相應(yīng)濃度，并按 18. 6 μ mo I、O. 6 μ mo I、O. 6 μ mo I和0. 2 μ mo I的量混合于Agilent色譜樣品瓶中；充分混勻后，通氮?dú)饬?5min除去有機(jī)溶齊U，并不斷旋轉(zhuǎn)樣品瓶，直至形成磷脂薄層；而后置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中真空蒸發(fā)2h。2)取出樣品瓶，加入4mL TRIS-HCl緩沖液(50mM，pH7. O)，輕微旋轉(zhuǎn)和震蕩后，置水浴超聲波儀處理3min，充分重懸磷脂混合物，同時(shí)應(yīng)盡量避免氣泡的產(chǎn)生；依次逐滴加入增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)質(zhì)粒0嫩(14(^8)、60%乙醇(終濃度35%，V/V)、200mMCaCl2溶液(終濃度4mM);將瓶蓋旋緊并密封，進(jìn)行7個(gè)循環(huán)(每一個(gè)循環(huán)包括5min液氮-2min 37°C水浴_4min室溫靜置)的反復(fù)凍融，得到質(zhì)粒脂質(zhì)體。3)將步驟2)得到的質(zhì)粒脂質(zhì)體依次通過膜擠出器中的400nm(25次)、IOOnm(25次)和50nm(25次)雙層微孔濾膜，完成脂質(zhì)體的均一化；在HEPES緩沖液(25mM HEPES,140mM NaCl, pH7. O)中透析2h回收得到的質(zhì)粒脂質(zhì)體,期間更換透析液一次,完成脂質(zhì)體的純化。4)將 Endoglin 抗體 I. 6mg 與 200 μ L IOmM 的 Traut’ s Reagent (2_ 亞氨氫氯化硫醇經(jīng)50mM四硼酸鈉，pH9. 4配制而成)，避光室溫巰基化反應(yīng)Ih,隨后采用MicroconUltracel YM-30超濾離心管超濾3次，除去Traut’ s Reagent的同時(shí)，將緩沖液置換成HEPES緩沖液。5)將步驟2-4得到的巰基化Endoglin抗體迅速加入步驟2_3得到的脂質(zhì)體顆粒中，室溫下氮?dú)獗Ｗo(hù)環(huán)境中，搖晃偶聯(lián)反應(yīng)過夜。實(shí)施例3 :制備α 1，3GT/EGFP融合基因轉(zhuǎn)染材料，并用于細(xì)胞內(nèi)表達(dá)實(shí)驗(yàn)研究。該融合基因轉(zhuǎn)染材料具體制備步驟基本同實(shí)施例I所述步驟，不同處為步驟2中的水浴超聲波儀處理后，依次逐滴加入α 1，3GT/EGFP融合基因質(zhì)粒DNA(350 μ g)、60%乙醇(終濃度35%, V/V)、200mM CaCl2溶液(終濃度4mM)，再進(jìn)行5個(gè)循環(huán)的反復(fù)凍融。步驟1、3、4和5均與實(shí)施例I相同。圖4所示為所制備α l，3GT/EGFP融合基因轉(zhuǎn)染材料在Endoglin穩(wěn)定表達(dá)的 293Τ細(xì)胞株中的表達(dá)。該圖結(jié)果表明，本發(fā)明所述α 1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)染材料能夠與Endoglin蛋白特異性結(jié)合，其裝載的基因質(zhì)?？梢缘玫搅己帽磉_(dá)，該基因轉(zhuǎn)染材料具備臨床應(yīng)用前景。實(shí)施例4 :制備α 1，3GT基因/LSS670復(fù)合轉(zhuǎn)染/成像材料，并用于小鼠體內(nèi)代謝實(shí)驗(yàn)研究。該復(fù)合轉(zhuǎn)染/成像材料具體制備步驟基本同實(shí)施例I所述步驟，不同處為步驟2中的水浴超聲波儀處理后，依次逐滴加入a 1，3GT基因質(zhì)粒DNA(200y g)、LSS670染料(150 μ g)、60%乙醇(終濃度35%，V/V)、200mM CaCl2溶液(終濃度4mM)，再進(jìn)行5個(gè)循環(huán)的反復(fù)凍融。步驟1、3、4和5均與實(shí)施例I相同。同時(shí),制備Endoglin抗體偶聯(lián)的載LSS670成像材料脂質(zhì)體,用作該實(shí)驗(yàn)研究的對(duì)照組。該成像材料具體制備步驟基本同實(shí)施例I所述步驟，不同處為步驟2中的水浴超聲波儀處理后，依次逐滴加入LSS670染料(150 μ g)、60%乙醇(終濃度35%，V/V)、200mMCaCl2溶液(終濃度4mM)，再進(jìn)行5個(gè)循環(huán)的反復(fù)凍融。步驟1、3、4和5均與實(shí)施例I相 同。圖5-圖7為本發(fā)明所述αI，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)染材料在小鼠體內(nèi)的代謝情況。其中，每張圖片所示小鼠從左到右所給的藥物依次為柯達(dá)專利染料LSS670的游離染料對(duì)照組、Endoglin抗體偶聯(lián)的載LSS670成像材料脂質(zhì)體對(duì)照組和本實(shí)施例所述α 1，3GT基因/LSS670復(fù)合轉(zhuǎn)染/成像材料實(shí)驗(yàn)組。藥物通過尾靜脈注射給入小鼠體內(nèi)，由于小鼠沒有荷瘤，因此沒有明顯靶向的位點(diǎn)。由于游離的LSS670有代謝非?？斓奶攸c(diǎn)，從I小時(shí)的結(jié)果已經(jīng)可以看到，對(duì)照組代謝速度明顯大于實(shí)驗(yàn)組。到了 2. 5小時(shí)和4小時(shí)的數(shù)據(jù)，可以明顯看到，對(duì)照組基本只剩下膀胱附近的信號(hào)，而實(shí)驗(yàn)組在整個(gè)身體，尤其是臟器都還有明顯的信號(hào)。圖8為本發(fā)明所述α 1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)染材料在小鼠各組織器官的代謝分布情況。從上向下依次為腦、心、肺、腸、肝、脾、腎、膀胱，從左到右所給的藥物依次為柯達(dá)專利染料LSS670的游離染料對(duì)照組、Endoglin抗體偶聯(lián)的載LSS670成像材料脂質(zhì)體對(duì)照組和本實(shí)施例所述a 1，3GT基因/LSS670復(fù)合轉(zhuǎn)染/成像材料實(shí)驗(yàn)組。將各組實(shí)驗(yàn)用小鼠于注射4小時(shí)后進(jìn)行解剖，并取出腦、心、肺、腸、肝、脾、腎、膀胱等器官，進(jìn)行新鮮器官組織中轉(zhuǎn)染材料代謝分布情況的直接成像。檢測(cè)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組信號(hào)明顯高于對(duì)照組。綜合圖7和圖8所示的結(jié)果，可以得出，本發(fā)明所述α I，3GT基因轉(zhuǎn)染材料在機(jī)體內(nèi)代謝緩慢，有充分時(shí)間隨血液循環(huán)到達(dá)病灶部位。因此，本發(fā)明所述α 1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)染材料具備較好的臨床應(yīng)用前景。同時(shí)本實(shí)施例的研究表明，利用本發(fā)明所述的方法，還可以制備a 1，3GT基因/成像材料復(fù)合轉(zhuǎn)染/成像材料，能夠同時(shí)用于腫瘤的治療和病灶部位成像。圖9為采用本發(fā)明所述a 1，3GT基因轉(zhuǎn)染材料及對(duì)照組材料治療荷瘤小鼠的結(jié)果圖。圖9中ENG+GT為本發(fā)明制備的用Endoglin抗體偶聯(lián)的裝載有al，3GT基因的納米脂質(zhì)體微粒；GT為a 1，3GT基因；ENG為Endoglin抗體；GT為a 1，3GT基因；VECT0R為空載體。橫軸D為導(dǎo)入荷瘤體內(nèi)的天數(shù)。豎軸為荷瘤小鼠的存活率。在該實(shí)驗(yàn)中，ENG、GT、VECTOR均為對(duì)照組，將上述4中材料分別于荷人免疫系統(tǒng)SCID鼠人肺癌動(dòng)物模型建立后的第I天(Dl)，即第I次接種/D1，第2次接種/D12，觀察其療效直至D50。圖9示出了用Endoglin抗體偶聯(lián)在納米脂質(zhì)體微粒將該基因?qū)胫貥?gòu)人免疫系統(tǒng)荷人肺腺癌SCID鼠體內(nèi)，產(chǎn)生的抗腫瘤效果圖。從圖9中可以看到，運(yùn)載al，3GT基因的靶向轉(zhuǎn)染材料具有較理想的抗腫瘤作用。因此采用該基因轉(zhuǎn)染材料制備的藥物也具有較理想的抗腫瘤作用。應(yīng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行說明，而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在不背離 本發(fā)明的精神和范圍的情況下對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。
權(quán)利要求
1.ー種α 1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)染材料，其特征在于包括α 1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因質(zhì)粒、用于裝載該質(zhì)粒的PEG偶聯(lián)的納米脂質(zhì)體、以及通過所述PEG偶聯(lián)在所述納米脂質(zhì)體上的Endoglin抗體分子；所述α 1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)染材料中，各組份的質(zhì)量比為α ，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因質(zhì)粒PEG偶聯(lián)的納米脂質(zhì)體Endoglin抗體分子=(O. I O. 3) (8. 8 13. 2) (O. 8 I. 2)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的α ，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)染材料，其特征在干所述α 1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因質(zhì)粒為5. 75kb真核表達(dá)質(zhì)粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的α1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)染材料，其特征在于 所述裝載有質(zhì)粒的PEG偶聯(lián)的納米脂質(zhì)體微粒的粒徑為40 200nm ； 所述Endoglin抗體分子為單克隆抗體或單鏈抗體,分子量為20 180k道爾頓； 所述PEG由下述聚こニ醇衍生物提供ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺-聚こニ醇或ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺-聚こニ醇-馬來酰亞胺PEG衍生物，PEG的分子量為1000 4000。
4.ー種根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的α I, 3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)染材料的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 1)制備PEG修飾的磷脂薄層； 2)重懸所述磷脂薄層，加入α1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因質(zhì)粒，制得裝載有質(zhì)粒的PEG偶聯(lián)的納米脂質(zhì)體顆粒； 3)對(duì)所述裝載有質(zhì)粒的PEG偶聯(lián)的納米脂質(zhì)體顆粒進(jìn)行均一化和純化； 4)巰基化Endoglin抗體分子； 5)將所述巰基化的Endoglin抗體分子偶聯(lián)在所述裝載有質(zhì)粒的PEG偶聯(lián)的納米脂質(zhì)體顆粒上，得所述α ，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)染材料。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的al，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)染材料的制備方法，其特征在于，所述步驟I)的具體步驟包括用三氯甲烷將棕櫚酰油酰磷脂酰膽堿、雙十二烷基ニ甲基溴化銨、ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺-聚こニ醇2000和ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺-聚こニ醇2000-馬來酰亞胺分別配制成20mg/mL、5mg/mL、20mg/mL和10mg/mL的相應(yīng)濃度，并按摩爾比(90 100) (2 4) (2 4) I的比例在樣品瓶中進(jìn)行混合；充分混勻后，通以時(shí)間不少于IOmin的氮?dú)饬鞒ビ袡C(jī)溶劑，并不斷旋轉(zhuǎn)樣品瓶，直至形成PEG修飾的磷脂薄層；而后置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中真空蒸發(fā)2h。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的al，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)染材料的制備方法，其特征在于所述步驟2)的具體步驟包括往步驟I)所述樣品瓶中加入50mM、pH = 7. O的TRIS-HCl緩沖液，該緩沖液與所述步驟I)所得PEG修飾的磷脂薄層的質(zhì)量比為(10 250) 1，輕微旋轉(zhuǎn)和震蕩后，置水浴超聲波儀處理3min，充分重懸所述步驟I)獲得的PEG修飾的磷脂薄層，同時(shí)應(yīng)盡量避免氣泡的產(chǎn)生；依次逐滴加入a 1，3GT基因質(zhì)粒、濃度為35% 75%的こ醇和200mM的CaCl2溶液，并使α 1，3GT基因質(zhì)粒與所述步驟I)所得PEG修飾的磷脂薄層的質(zhì)量比為(O. I O. 3) (8. 8 13. 2)、こ醇的終濃度達(dá)到體積分?jǐn)?shù)為35 40%、CaCl2的終濃度達(dá)到4mM ;將瓶蓋旋緊并密封，進(jìn)行7 12個(gè)循環(huán)的反復(fù)凍融，得到脂質(zhì)體顆粒，其中，每ー個(gè)凍融循環(huán)包括5 IOmin液氮-2 5min 37°C水浴_4 7min室溫靜置。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的al，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)染材料的制備方法，其特征在于，所述步驟3)的具體步驟包括將步驟2)得到的脂質(zhì)體顆粒依次通過膜擠出器中的400nm、IOOnm和50nm雙層微孔濾膜各15 25次；在HEPES緩沖液中透析2 4h回收得到的脂質(zhì)體顆粒，期間更換透析液一次。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的al，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)染材料的制備方法，其特征在于，所述步驟4)的具體步驟包括將Endoglin抗體與IOmM的Traut’ s試劑在避光室溫巰基化反應(yīng)I 2h,其中所述Endoglin抗體與所述Traut’s試劑質(zhì)量比為I : (100 160),隨后超濾2 4次，除去Traut’ s試劑的同吋，將緩沖液置換成HEPES緩沖液。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的al，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)染材料的制備方法，其特征在于，所述步驟5)的具體步驟包括將步驟4)得到的巰基化Endoglin抗體迅速加入步驟3)得到的脂質(zhì)體顆粒中，室溫下氮?dú)獗Ｗo(hù)環(huán)境中，搖晃偶聯(lián)反應(yīng)過夜，其中所述巰基化Endoglin抗體分子與所述步驟I)所得PEG修飾的磷脂薄層的質(zhì)量比為(O. 8 I. 2) (8. 8 13. 2)。
10.ー種根據(jù)權(quán)利要求I 3中任意一項(xiàng)所述的α 1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)染材料的應(yīng)用，其特征在于，該基因轉(zhuǎn)染材料用于制備治療實(shí)體腫瘤的藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種α1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)染材料，包括α1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因質(zhì)粒、用于裝載該質(zhì)粒的PEG偶聯(lián)的納米脂質(zhì)體、以及通過所述PEG偶聯(lián)在所述納米脂質(zhì)體上的Endoglin抗體分子。本發(fā)明的α1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)染材料對(duì)腫瘤組織的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞具有良好的靶向性，當(dāng)其特異性作用于腫瘤組織的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的時(shí)候，裝載的α1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因能夠得到表達(dá)，在腫瘤組織局部引發(fā)超急性排斥反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)治療腫瘤的目的。本發(fā)明還涉及該α1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)染材料的制備方法及應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K47/34GK102716497SQ201110189239
公開日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2011年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月7日
發(fā)明者盧小玲, 彭宜, 趙永祥 申請(qǐng)人:盧小玲, 趙永祥