專利名稱：：半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的制作方法半乳糖基轉(zhuǎn)移酶本發(fā)明涉及編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的多核苷酸。此外，本發(fā)明涉及其部分多核苷酸以及包含這些多核苷酸的載體，用于其表達(dá)或基因破壞的目的，涉及用所述多核苷酸或其部分或衍生自其的DM轉(zhuǎn)染的重組宿主細(xì)胞、組織或生物，以及在這些宿主細(xì)胞、組織或生物中產(chǎn)生的糖蛋白。此外，本發(fā)明涉及其表達(dá)產(chǎn)物在體外以及體內(nèi)的用途。過(guò)去，使用多種轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系統(tǒng)，如由細(xì)菌、真菌(如酵母)、昆蟲(chóng)、植物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的那些細(xì)胞系統(tǒng)產(chǎn)生的異源蛋白。在原核生物中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)不能以與真核系統(tǒng)中產(chǎn)生的真核生物蛋白相似的方式進(jìn)行翻譯后修飾，即，它們不能在特定氨基酸殘基如天冬氨酸(N)殘基處用合適的糖進(jìn)行糖基化(N-連接的糖基化)。此外，由于，例如細(xì)菌不能形成半胱氨酸二疏鍵，細(xì)菌產(chǎn)生的真核生物蛋白的折疊可能是不合適的。此外，細(xì)菌產(chǎn)生的重組蛋白經(jīng)常作為不溶性包含體聚集和積累。真核細(xì)胞系統(tǒng)更好地適于產(chǎn)生在多種真核生物如人類中發(fā)現(xiàn)的糖基化蛋白質(zhì)，因?yàn)檫@種細(xì)胞系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)所產(chǎn)生蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，如N-糖基化。然而，在用適于產(chǎn)生用作例如藥物的蛋白質(zhì)序列的異源基因轉(zhuǎn)化的真核細(xì)胞系統(tǒng)中遇到的一個(gè)問(wèn)題是此類蛋白質(zhì)上的糖基化模式通常獲得天然模式，即產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的真核細(xì)胞系統(tǒng)的模式產(chǎn)生的糖基化蛋白質(zhì)包含非動(dòng)物糖基化模式并且這些非動(dòng)物糖基化模式物中，；已經(jīng)通過(guò)消除植物特異:糖殘基i，2:木糖(ai，:巖藻糖克服了該限制，所述1,2-木糖和a1，3-巖藻糖在植物中通常連接到N-聚糖的核心結(jié)構(gòu)(Lerouge等人，1998PlantMol.Biol.38，31-48;Rayon等人，1998J.ExperimentalBot.49，1463-1472)。在擬南芥(爿ra6油;"sf/"/謹(jǐn))(Strasser等人，2004FEBSLett.561，132-136)和莒蘚類小立碗蘚(尸//sc咖〃re//3/a";^)(EP1431394;Koprivova等人，2004PlantBiotechnol.J.2，517-523)的情況下，產(chǎn)生了顯示完全缺少核心ct1，3-巖藻糖和1，2-木糖殘基的N-聚糖模式的突變體。令人驚奇地，盡管進(jìn)行了完全類型的N-聚糖模式的修飾，但是在這些突變體中沒(méi)有觀察到形態(tài)學(xué)改變或存活力的改變。除了加入上述兩個(gè)植物特異性殘基外，取決于GlcMc-轉(zhuǎn)移酶I、GlcNAc-轉(zhuǎn)移酶II和高爾基體a-甘露糖苷酶的作用，在植物和哺乳動(dòng)物中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和順面高爾基體中糖蛋白成熟的步驟是相同的(Lerouge等人，1998PlantMol.Biol.38，31-48)。在這兩個(gè)界中，進(jìn)一步的N-聚糖延長(zhǎng)以不同的方式進(jìn)行。盡管在哺乳動(dòng)物中，末端GlcNAc殘基立即被P1，4-(或偶爾&1，3-)-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶作用的屏蔽-IgG顯著除外(該步驟僅僅部分發(fā)生)-在植物中的延長(zhǎng)僅僅通過(guò)P1，3-半乳糖基化作用，但是僅僅非常小部分的聚糖似乎經(jīng)歷該修飾，如可以從多種結(jié)構(gòu)類型的相對(duì)豐度推導(dǎo)出。哺乳動(dòng)物中的半乳糖殘基可以被唾液酸加帽并且僅僅相當(dāng)罕見(jiàn)地被巖藻糖取代。再次，植物是不同的，因?yàn)樗鼈儧](méi)有唾液酸化并且在連接末端1，3-連接的半乳糖殘基的情況下，它們基本上總是巖藻糖化倒數(shù)第二位的GlcNAc殘基，從而形成路易斯a(Lewisa)(LeA)決定簇。顯然，e1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶是限速酶，而多數(shù)植物細(xì)胞含有足夠的a1，4-Fuc-轉(zhuǎn)移酶活性以確保含有觸角的每個(gè)Gal被巖藻糖基化。LeA結(jié)構(gòu)是人血型決定簇。它在健康成年人中是罕見(jiàn)的，但是作為唾液酸基-路易斯a(sLeA)，它#皮眾所周知地發(fā)現(xiàn)于惡性組織如結(jié)腸癌中。無(wú)論如何，含有糖蛋白的LeA很少?gòu)闹参锓蛛x并且在立碗蘚屬(戶力/"o邁/"e7/a)的情況下，它們以多至總的可溶性糖蛋白的5。/0的量存在_不管從野生型植物分離還是從缺少核心巖藻糖和木糖的糖改造的突變體分離(Koprivova等人，2003PlantBiol.5，582-591;Koprivova等人，2004PlantBiotechnol.J.2，517-523)。而對(duì)涉及在植物中產(chǎn)生路易斯a型聚糖結(jié)構(gòu)的oc1，4-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行了一些研究(Joly等人，2002J.ExperimentalBot.53，1429—1436;Bakker等人，2001FEBSLett.507，307-312)。關(guān)于涉及植物中N聚糖結(jié)構(gòu)延長(zhǎng)的特異性P1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶沒(méi)有可用的信息。在真核生物中，p1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶顯示出廣鐠的受體特異性以及不同的組織表達(dá)才莫式(Hennet2002Cell.Mol.LifeSci.59，1081-1095;Amado等人，1998J.Biol.Chem.21，12770-12778)。在人P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶2的01，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶家族的不同成員中，已經(jīng)在體外表明該酶在半乳糖殘基向GlcNAcP和卵清蛋白的轉(zhuǎn)移中具有活性-代表復(fù)雜型N-聚糖結(jié)構(gòu)作為受體底物(Amado等人，1998J.Biol.Chem.21，12770-12778)。根據(jù)人類中同源P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶家族的存在，數(shù)據(jù)庫(kù)分析揭示在不同的植物物種，如擬南芥(JraWtfopWsMa7/a/ja)和水稻(Or/zasa">a)中，存在卩1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因的類似的更大基因家族。這些P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因成員沒(méi)有一個(gè)被描述為編碼這樣的酶，該酶包含在體外或體內(nèi)將半乳糖從UDP-半乳糖轉(zhuǎn)移到具有末端非還原性GlcNAc殘基的受體底物，例如，轉(zhuǎn)移到復(fù)雜型N-聚糖的非還原末端殘基的能力。本發(fā)明的目的是鑒定、克隆和測(cè)序編碼植物P1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的一種或多種基因一一包括非編碼的對(duì)應(yīng)基因組序列，和制備載體，所述載體包含所述基因、其DNA片段或者其改變的DNA或衍生的DNA或者其包含缺失的DNA。另一目的是產(chǎn)生包含一種或多種這些載體的宿主細(xì)胞、組織或生物以產(chǎn)生完全缺少路易斯a型N-聚糖結(jié)構(gòu)的糖蛋白。另一目的是產(chǎn)生包含一種或多種這些栽體的宿主細(xì)胞、組織或生物，以產(chǎn)生具有改進(jìn)的路易斯a型N-聚糖結(jié)構(gòu)的糖蛋白。另一目的是提供核苷酸序列，其編碼用于將酶靶向晚期高爾基池的膜結(jié)構(gòu)域。因此，本發(fā)明提供了i)DNA分子，其包含根據(jù)SEQIDNO:1的序列，具有從堿基對(duì)513到堿基對(duì)2417的開(kāi)放閱讀框，或者與上述序列具有至少50%同一性或者包含由于遺傳密碼與上面的DNA序列簡(jiǎn)并的序列，所述序列編碼具有P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性的植物蛋白或與其互補(bǔ)，ii)DNA分子，其包含根據(jù)SEQIDNO:2的序列，具有從堿基對(duì)1到堿基對(duì)1902的開(kāi)放閱讀框，或者與上述序列具有至少50%同一性或者包含與由于遺傳密碼與上面的DNA序列簡(jiǎn)并的序列，所述序列編碼具有(31，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性的植物蛋白或與其互補(bǔ)，ni)DM分子，其包含根據(jù)SEQIDN0:24的序列，具有從堿基對(duì)321到堿基對(duì)2387的開(kāi)放閱讀框，或者與上述序列具有至少50%同一性或者包含與由于遺傳密碼與上面的DM序列簡(jiǎn)并的序列，所述序列編碼具有P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性的植物蛋白或與其互補(bǔ)，iv)DNA分子，其包含根據(jù)SEQIDNO:25的序列，具有從堿基對(duì)1到堿基對(duì)2052的開(kāi)放閱讀框，或者與上述序列具有至少50%同一性或者包含與由于遺傳密碼與上面的DNA序列簡(jiǎn)并的序列，所述序列編碼具有)31，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性的植物蛋白或與其互補(bǔ)，v)DNA分子，其包含根據(jù)SEQIDNO:3的序列，代表對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:l的包括內(nèi)含子序列和外顯子序列的從堿基對(duì)1到堿基對(duì)6187的基因組DM結(jié)構(gòu)，允許用基因組序列產(chǎn)生敲除構(gòu)建體，vi)DNA分子，其包含根據(jù)SEQIDNO:4的序列，代表對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2的包括內(nèi)含子序列和外顯子序列的從堿基對(duì)1到堿基對(duì)4087的基因組DNA結(jié)構(gòu)，允許用基因組序列產(chǎn)生敲除構(gòu)建體。因?yàn)樘腔D(zhuǎn)移酶家族是高度趨異的(圖1)并且僅僅保守區(qū)(圖1中粗體)是高度相似的，所以本發(fā)明還提供了DNA分子，其包含與根據(jù)SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:24或SEQIDNO:25任一個(gè)的序列具有至少20%總體同一性并且與SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的七個(gè)保守結(jié)構(gòu)域的序列具有至少80%同一性的序列，所述七個(gè)保守結(jié)構(gòu)域編碼SEQIDNO:19或SEQIDNO:20的蛋白質(zhì)的氨基酸387-392(DLFIGI或ELFVGI)、402-409(RMAVRKTW)、425-428(FVAL)、455-465(DRYDIVVLKTV)、479-489(YIMKCDDDTFV或HVMKCDDDTFV)、536-548(YPIYANGPGYILS或YPTTANGPGHLS)和570-576(EDVSVGI)，或者包含與由于遺傳密碼上面的序列簡(jiǎn)并的序列，所述序列編碼具有P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性的植物蛋白或與其互補(bǔ)。還提供了DNA分子，其包含與根據(jù)SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:24或SEQIDNO:25任一個(gè)的序列具有至少20%總體同一性并且編碼SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的七個(gè)保守結(jié)構(gòu)域的保守氨基酸的至少95%，優(yōu)選全部的序列，所述保守氨基酸選自SEQIDNO:19或SEQIDNO:20的蛋白質(zhì)的氨基酸388(L)、402(R)、404(A)、406(R)、408(T)、409(W)、425(F)、455(D)、457(Y)、463(K)、464(T)、481(M)、482(K)、484(D)、486(D)、488(F)、489(V)、536(Y)、537(P)、542(G)、544(G)、545(Y)、548(S)、570(E)、571(D)、572(V)、575(G)和576(I)，或者包含由于遺傳密碼與上面的序列簡(jiǎn)并的序列，所述序列編碼具有p1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性的植物蛋白或與其互補(bǔ)。優(yōu)選地，總體序列同一性為至少25%、至少30%、至少35%、至少40%或至少45%。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，保守結(jié)構(gòu)域的序列同一性為至少90%、至少95%或100%。具有SEQIDNO:1的序列的開(kāi)放閱讀框編碼具有634個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(圖2，SEQIDNO:19)。SEQIDNO:1編碼的蛋白質(zhì)在Leu20到Leu39之間的區(qū)域中含有跨膜結(jié)構(gòu)域，并且包含如HennetQOO2Cell.Mol.LifeSci.59，1081-1095，圖2)所述的人(31，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶中存在的七個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，以及如Amado等人(1998J.Biol.Chem.21，12770-12778，圖2)所述的多數(shù)位于C-末端的保守氨基酸。具有SEQIDNO:2的序列的開(kāi)放閱讀框編碼具有633個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(圖3,SEQIDNO:20)。SEQIDNO:2編碼的蛋白質(zhì)在Leu20到Leu39之間的區(qū)域中含有跨膜結(jié)構(gòu)域，并且包含如Hennet(2002Cell.Mol.LifeSci.59,1081-1095，圖2)所述的人P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶中存在的七個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，以及如Amado等人(1"8J.Biol.Chem.21,12770-12778，圖2)所述的多數(shù)位于C-末端的保守氨基酸。具有SEQIDNO:24的序列的開(kāi)放閱讀框編碼具有688個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(圖4;SEQIDNO:26)，其是SEQIDNO:1的蛋白質(zhì)的選擇性剪接變體。ii具有SEQIDNO:25的序列的開(kāi)放閱讀框編碼具有683個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(圖5，SEQIDNO:27),其是SEQIDNO:2的蛋白質(zhì)的選擇性剪接變體。本發(fā)明還涉及如SEQIDNOs.3或4給出的該基因的基因組序列，以及分離形式的根據(jù)本發(fā)明的所有其他DM分子或蛋白質(zhì)(如果沒(méi)有明確描述)?？梢酝ㄟ^(guò)不同方法分析植物P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的活性。根據(jù)Amado等人(199SJ.Biol.Chem.21,12770-12778)，編碼(31，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的可溶分泌形式-缺少跨膜結(jié)構(gòu)域的構(gòu)建體可被克隆到例如適于轉(zhuǎn)染桿狀病毒的表達(dá)載體中并在Sf9細(xì)胞中擴(kuò)增；可以純化所得的表達(dá)產(chǎn)物并隨后測(cè)定|31，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性。由于分析比活性，另一方法可以是在合適的宿主像小立碗蘚中過(guò)表達(dá)p1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，通過(guò)制備經(jīng)設(shè)計(jì)成編碼根據(jù)本發(fā)明的P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的完整開(kāi)放閱讀框的表達(dá)構(gòu)建體并通過(guò)產(chǎn)生對(duì)根據(jù)本發(fā)明的P1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因的至少一種轉(zhuǎn)基因的立碗蘚屬林系來(lái)實(shí)現(xiàn)所述過(guò)表達(dá)。所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因林系顯示出提高的糖基化N-聚糖含量。可以如Koprivova等人(2003PlantBiol.5，582-591)和Koprivova等人(20(MPlantBiotechnol.J.2，517-523)所述從立碗蘚屬分離N-聚糖模式并分析?？梢匀缦麻g接測(cè)定本發(fā)明的(31，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性在合適的宿主如小立碗蘚中定向破壞負(fù)責(zé)的基因，其導(dǎo)致在半乳糖從UDP-半乳糖轉(zhuǎn)移至N-聚糖上的非還原性末端GlcNAc殘基的方面，對(duì)P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性的抑制，因此缺少末端半乳糖化。再次，可以如Koprivova等人(2003PlantBiol.5，582-591)和Koprivova等人(2004PlantBiotechnol.J.2，517-523)所述從立碗蘚屬分離N-聚糖模式并分析。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的P1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶是GlcNAc-P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶。備選地，P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性的降低可以通過(guò)常用于該類型目的的方法實(shí)現(xiàn)，例如，公知的反義策略、有義策略、核酶技術(shù)、PNA技術(shù)或者RM干擾策略。根據(jù)本發(fā)明，用包含至少SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:24或SEQIDNO:25的序列(其編碼功能性P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶)的核酸序列轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞、組織或生物。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，編碼序列連接到調(diào)節(jié)序列，如啟動(dòng)子和終止序列，允許P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)，得到顯示P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性的表達(dá)產(chǎn)物。關(guān)于宿主細(xì)胞組織或生物，有效連接到P1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶編碼序列的調(diào)節(jié)序列可以是異源的。在另一實(shí)施方案中，有效連接到&1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶編碼序列的調(diào)節(jié)序列可以因?yàn)樗玫乃拗鞫峭吹?。有效連接到P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶編碼序列的調(diào)節(jié)序列可以由用于轉(zhuǎn)染的載體提供或者可以如下在體內(nèi)建立通過(guò)定向整合如同源重組將131，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶編碼序列導(dǎo)入合適的基因座，導(dǎo)致P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶編碼序列與宿主細(xì)胞、組織或生物的內(nèi)源調(diào)節(jié)序列的有效功能裝配。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，包含P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)產(chǎn)物或其部分，如缺少跨膜結(jié)構(gòu)域的可溶形式可以用于在體外或體內(nèi)糖脂或糖蛋白上N-聚糖的延長(zhǎng)。在另一實(shí)施方案中，所得的包含末端1，3連接的半乳糖殘基的N-聚糖可以在體外或體內(nèi)用額外的糖殘基像巖藻糖、半乳糖或唾液酸殘基進(jìn)一步延長(zhǎng)。因此，本發(fā)明涉及具有N-聚糖糖結(jié)構(gòu)的新的糖蛋白，所述N-聚糖糖結(jié)構(gòu)包含含有末端糖殘基的復(fù)雜類型的N-聚糖，如半乳糖、額外的巖藻糖、唾液酸或其組合。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，這些糖蛋白是表面蛋白，將復(fù)雜類型的N-聚糖呈遞給細(xì)胞的外部環(huán)境，例如允許蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)接觸(如與抗體、其他細(xì)胞等接觸)或者分泌型蛋白，如抗體或紅細(xì)胞生成素。根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的此類糖蛋白高度適于接種，特別是人類的體外和體內(nèi)接種。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供了根據(jù)SEQIDN0:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:24或SEQIDNO:25的核苷酸序列，其編碼用于將異源蛋白質(zhì)靶向晚期高爾基池的跨膜結(jié)構(gòu)域。在優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)天然跨膜結(jié)構(gòu)域與根據(jù)本發(fā)明的P1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的這些跨膜結(jié)構(gòu)域的交換，將顯示出N-聚糖的延長(zhǎng)活性的P1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶或唾液酸基轉(zhuǎn)移酶乾向晚期高爾基池。根據(jù)本發(fā)明，提供了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其包含至少一種功能異常的P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶核苷酸序列。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞選自植物，例如，浮萍屬(Lemna)物種、蕪萍屬(WolfHa)物種、稻、胡蘿卜、谷物、玉米和煙草物種。在本發(fā)明的更優(yōu)選的實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞選自苔蘚類，包括蘚類和苔類，立碗蘚屬(/%/"咖/"6//3)、葫蘆蘚屬(尸war/a)、7JC薛屬(5>Aag/2w/z/)、角齒薛屬(Cerafo^")、地4&屬(larc力ai3/7a)和嚢果蘚屬(5^力aerocar/70S)的物種。苔蘚類細(xì)胞優(yōu)選來(lái)自小立碗蘚。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的宿主是苔蘚類，尤其小立碗蘚，其是單倍體非維管陸生植物可用于產(chǎn)生糖改造的重組蛋白(W001/25456)。在小立碗蘚以及在其他植物中，已經(jīng)檢測(cè)到路易斯a型結(jié)構(gòu)(Koprivova等人2003PlantBiol.5，582-591;Koprivova等人2004PlantBiotechnol.J.2，517-523)。盡管從植物中沒(méi)有鑒定到在延長(zhǎng)N-聚糖結(jié)構(gòu)中顯示特異活性的P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，但是選擇立碗蘚屬作為該未知類型的糖基轉(zhuǎn)移酶的推定來(lái)源。蘚類的生命周期受到光合自養(yǎng)的配子體世代的支配。所述生命周期完全不同于高等植物的生命周期，其中孢子體是優(yōu)勢(shì)世代并且在高等植物和莒蘚植物之間觀察到許多顯著的不同。包括蘚類的莒蘚植物的配子體的特征是兩個(gè)不同的發(fā)育階段。通過(guò)頂端生長(zhǎng)發(fā)育的原絲體生長(zhǎng)成僅兩種細(xì)胞類型的絲狀網(wǎng)絡(luò)(綠絲細(xì)月包(c力7oro"e/za/和莖yf絲纟田月包(caw/0/7e/Hs/ce//))。第二個(gè)階段被稱作配子托，通過(guò)從簡(jiǎn)單的頂端系統(tǒng)的莖生長(zhǎng)分化。兩個(gè)階段都是光合自養(yǎng)活性的。已經(jīng)表明對(duì)于在培養(yǎng)瓶中懸浮培養(yǎng)以及生物反應(yīng)器培養(yǎng)，培養(yǎng)原絲體而不分化成更復(fù)雜的配子托(wo01/25456)。沒(méi)有為高等植物描述含有僅僅一些細(xì)胞類型的完全分化的和光合自養(yǎng)活性多細(xì)胞組織的培養(yǎng)。蘚類細(xì)胞系統(tǒng)的遺傳穩(wěn)定性提供了超過(guò)植物細(xì)胞培養(yǎng)的重要的優(yōu)點(diǎn)。在苔蘚植物(非維管植物)和高等植物(維管植物)之間，在生化水平上存在一些重要的差異。小立碗蘚中的硫酸鹽同化與高等植物中的顯著不同。高等植物中硫酸鹽同化的關(guān)鍵酶是腺苷酰5，-磷酸硫酸還原酶。在小立碗蘚，共存在通過(guò)磷酸腺苷5，-磷酸疏酸還原酶的備選途徑(Koprivova等人(2002)J.Biol.Chem.277，32195-32201)。該途徑還沒(méi)有在高等植物中表征。此外，苔蘚類、藻類和蕨類家族中的許多成員產(chǎn)生多種多不飽和的脂肪酸(Dembitsky(1993)Prog.LipidRes.32，281-356)。例如，認(rèn)為花生四烯酸和二十碳五烯酸僅僅由低等植物而不由高等植物產(chǎn)生。已經(jīng)從小立碗蘚克隆了多不飽和脂肪酸代謝的一些酶(厶6-酰基去飽和酶)(Girke等人(1998)，PlantJ,15,39-48)和△6延伸酶的組分(Zank等人(2002)PlantJ31，255-268)。在高等植物中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)對(duì)應(yīng)的基因。該事實(shí)似乎證實(shí)在高等植物和低等植物之間在生化水平上存在本質(zhì)上的不同。此外，苦蘚植物顯示出其核DM中高度有效的同源重組，其是植物的一個(gè)獨(dú)特特征，使得可以進(jìn)行定向基因破壞(Girke等人(1998)PlantJ，15，39—48;Strepp等人(1998)ProcNatlAcadSciUSA95,4368-4373;Koprivova(2002)J.Biol.Chem.277，32195-32201;由Reski(1999)Planta208，301-309;Schaefer和Zryd(2001)PlantPhys127，1430-1438;Schaefer(2002)Annu.Rev.PlantBiol.53，477-501;Koprivova等人2004PlantBiotechnol.J.2，517-523;Brucker等人2005Planta220，864-874綜述)，進(jìn)一步闡明了與高等植物的顯著差異。然而，在一些情況下，該機(jī)制改變糖基化模式的用途已經(jīng)被證明是有問(wèn)題的，如在本文實(shí)施例中所示。小立碗蘚中N-乙酰基葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶I(GNTl)的破壞導(dǎo)致特異轉(zhuǎn)錄物的丟失，但是僅僅導(dǎo)致N-糖基化模式的微小差異。這些結(jié)果與vonSchaewen等人(1993)PlantPhysiol102，1109-1118)等人觀察到的在缺少GNT1的突變擬南芥植物中高爾基體修飾的復(fù)雜聚糖的丟失形成直接對(duì)照。從而，小立碗蘚中的敲除沒(méi)有導(dǎo)致N-糖基化模式的15預(yù)期修飾。盡管對(duì)于糖基轉(zhuǎn)移酶GNT1,敲除策略在編碼pl，2-木糖基轉(zhuǎn)移酶和al，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的基因破壞方面是不成功的，但是在小立碗蘚中成功地進(jìn)行了敲除。此外，人P1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶向雙敲除小立碗蘚植物的基因組中的整合導(dǎo)致哺乳動(dòng)物樣N-連接的糖基化模式，沒(méi)有植物特異性巖藻糖基和木糖基殘基并且具有哺乳動(dòng)物樣末端1，4半乳糖基殘基。發(fā)現(xiàn)半乳糖基轉(zhuǎn)移酶是有活性的。苔蘚植物細(xì)胞，如小立碗蘚細(xì)胞，可以是適于根據(jù)本文所述的本發(fā)明方法轉(zhuǎn)化的任何細(xì)胞，并且可以是蘚類原生質(zhì)體細(xì)胞、在原絲體組織中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞或其他細(xì)胞類型。實(shí)際上，技術(shù)人員將理解包含根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化的苔蘚植物細(xì)胞群體的蘚類植物組織，如轉(zhuǎn)化的原絲體組織也形成本發(fā)明的一方面。如本文所用的"功能異常的"指^l，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(f31，3-GalT)的指定的轉(zhuǎn)移酶核苷酸序列基本上不能編碼這樣的niRNA，該mRM編碼能夠修飾植物的具有1，3連接的末端半乳糖殘基的N-連接的聚糖的功能性P1，3-GalT蛋白。在酶原中，功能異常的p1,3-GalT植物轉(zhuǎn)移酶核苷酸序列包含向苔蘚植物細(xì)胞核基因組(不管它真的是天然的苔蘚植物基因組，即還沒(méi)有由人用其他核酸序列轉(zhuǎn)化的苔蘚植物細(xì)胞，或者在轉(zhuǎn)化的苔蘚植物細(xì)胞核基因組中，其中以前已經(jīng)對(duì)希望的核酸序列進(jìn)行了核酸序列插入)中包含的內(nèi)源(即基因組)天然P1，3-Ga1T基因中定向插入外源核苷酸序列，其基本上抑制或阻抑了編碼功能P1,3-GalT活性的mRNA的轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明的另一方面涉及生物學(xué)功能栽體，其包含上述DNA分子之一或者其具有至少20個(gè)堿基對(duì)的不同長(zhǎng)度的部分。為了轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞，能夠擴(kuò)增的獨(dú)立載體是必須的，其中取決于宿主細(xì)胞、轉(zhuǎn)染機(jī)理、任務(wù)和DNA分子大小，可以使用合適的載體。因?yàn)榇罅坎煌d體是已知的，其列舉將超過(guò)本發(fā)明的限制并且因此沒(méi)有在此處給出，尤其因?yàn)檩d體是技術(shù)人員非常公知的(關(guān)于技術(shù)人員已知的本說(shuō)明書(shū)中使用的載體以及所有技術(shù)和術(shù)語(yǔ)，參考SambrookManiatis)。理想地，載體具有小分子量并且將包含選擇基因以便在細(xì)胞中導(dǎo)致容易識(shí)別的表型，從而能夠容易地選擇含有載體或無(wú)栽體的宿主細(xì)胞。為了得到高產(chǎn)率的DNA和對(duì)應(yīng)基因產(chǎn)物，載體將包含強(qiáng)啟動(dòng)子，以及增強(qiáng)子、基因擴(kuò)增信號(hào)和調(diào)節(jié)序列。此外，對(duì)于載體的自主復(fù)制，復(fù)制原點(diǎn)是重要的。多腺苷酸化位點(diǎn)負(fù)責(zé)mRNA和RNA轉(zhuǎn)錄物的剪接信號(hào)的正確的加工。如果將噬菌體、病毒或病毒顆粒用作栽體，那么包裝信號(hào)將控制載體DNA的包裝。例如，為了在植物中轉(zhuǎn)錄，Ti質(zhì)粒是合適的，并且對(duì)于分別在昆蟲(chóng)細(xì)胞、桿狀病毒和昆蟲(chóng)中的轉(zhuǎn)錄，可以使用轉(zhuǎn)座子，如P元件。如果將上述發(fā)明性載體插入植物或植物細(xì)胞中，內(nèi)源P1,3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因的基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后抑制通過(guò)與其同源的轉(zhuǎn)基因或其部分在有義方向的轉(zhuǎn)錄得到。此外，對(duì)于該有義技術(shù)，參考出版物Baucombe1996，Plant.Mol.Biol.，9:373-382，和Brigneti等人，1998，EMB0J.17:6739-6746。該"基因沉默"策略是抑制|31，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)的有效方法，也參考Waterhouse等人，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95:13959-13964。此外，本發(fā)明涉及生物學(xué)功能載體，其包含以啟動(dòng)子反義方向的上述實(shí)施方案之一的DNA分子或其不同長(zhǎng)度的部分。如果該載體在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)染，那么將讀出"反義mRNA"，其與P1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的mRNA互補(bǔ)并且將與其復(fù)合。該結(jié)合將阻止正確的加工、轉(zhuǎn)運(yùn)、穩(wěn)定性，或者通過(guò)阻止核糖體退火，它將阻止P1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的翻譯從而阻止其正常的基因表達(dá)。盡管可以將該DNA分子的完整序列插入載體中，但是其部分序列因?yàn)樗鼈兊妮^小尺寸而對(duì)于某些目的是有益的。在反義方面，例如，重要的是DNA分子足夠大以便形成足夠大的反義raRNA，其將結(jié)合到轉(zhuǎn)移酶mRNA。合適的反義RNA分子包含例如，50到200個(gè)核苷酸，因?yàn)樵S多已知的、天然存在的反義RNA分子包含約IOO個(gè)核苷酸。為了尤其有效地抑制活性|31，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)，有義技術(shù)和反義技術(shù)的組合是合適的(Waterhouse等人，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA，95:13959-13964)。有利地，使用快速雜交的RNA分子。具有超過(guò)50個(gè)核苷酸的反義RNA分子的效率將取決于體外退火動(dòng)力學(xué)。從而，例如，快速退火的反義RNA分子顯示出比緩慢雜交的RNA分子更大的蛋白質(zhì)表達(dá)抑制(Wagner等人，1994，A畫(huà).Rev.Microbiol.,48:713-742;Rittner等人，1993，Nucl.AcidsRes.，21:1381-1387)。此類快速雜交的反義RNA分子尤其包含大量外部堿基(游離末端和連接效率)，大量結(jié)構(gòu)性亞結(jié)構(gòu)域(組分)以及低程度的環(huán)(Patzel等人1998;NatureBiotechnology,16;64-68)。反義RNA分子的4艮設(shè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)可以例如借助計(jì)算機(jī)程序根據(jù)所選的合適的反義RNADNA序列進(jìn)行確定。，DNA分子的不同的序列區(qū)可以插入到載體中。一種可能性例如在于向載體中插入僅僅負(fù)責(zé)核糖體退火的那部分。在mRNA的該區(qū)域中的阻斷將足夠終止整個(gè)翻譯。該反義分子的尤其高的效率也導(dǎo)致該基因的5，和3，非翻譯區(qū)。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的DNA分子包括包含缺失、插入和/或替代突變的序列。突變核苷酸的數(shù)目是可變的并且從一個(gè)到多個(gè)缺失、插入或替代的核苷酸不等。還可能的是通過(guò)突變偏移閱讀框。在這種"敲除基因"中，僅僅重要的是P1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)受到干擾，并且阻止了活性功能性酶的形成。這樣，突變位點(diǎn)是可變的，只要阻止了酶促活性蛋白質(zhì)的表達(dá)。優(yōu)選地，酶的催化區(qū)域中的突變位于C-末端區(qū)。在DNA序列中插入突變的方法是技術(shù)人員公知的，因此不必在這里詳細(xì)討論誘變的多種可能性。巧合誘變(coincidentalmutagenese),以及尤其是定向誘變，例如，位點(diǎn)定向誘變、寡核苷酸控制的誘變或者借助限制酶的誘變可以用于該情況中。備選地，核酶或者siRM技術(shù)可以用于在具有野生型P1，3-GalT活性的細(xì)胞中降低或消除P1，3-GaltT活性?；诒绢I(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)，siRNA對(duì)本發(fā)明的適用是直接的(例如，Nat.Reviews:RNAinterferencecollection(2005年10月))。本發(fā)明還提供了編碼核酶的DNA分子，所述核酶包含兩個(gè)序列部分，每個(gè)部分為至少10到15個(gè)堿基對(duì)，所述序列部分與上迷本發(fā)明DNA的序列部分互補(bǔ)使得核酶與從天然P1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶DNA分子轉(zhuǎn)錄的mRNA復(fù)合并將其切割。核酶將通過(guò)與所述mRM配對(duì)的互補(bǔ)堿基來(lái)識(shí)別P1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的mRNA。隨后，在該酶被翻譯之前，核酶將以序列特異性方式切割并破壞所述RNA。從切割的底物解離后，核酶將與RM分子重復(fù)雜交并作為特異性內(nèi)切核酸酶。通常，核酶可被特異性產(chǎn)生用于失活某些mRM，即使編碼蛋白質(zhì)的完整DM序列未知。如果核糖體沿著mRNA緩慢移動(dòng)，那么核酶是尤其有效的。在那種情況下，核酶更容易地發(fā)現(xiàn)mRNA上的無(wú)核糖體位點(diǎn)。為此原因，慢核糖體突變體也適于作為核酶的系統(tǒng)(J.Burke，1997，NatureBiotechnology;15，414-415)。該DM分子分別對(duì)于植物p1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)的下調(diào)和抑制是尤其有利的。一種可能的方法也是使用不同形式的核酶，即"小"核酶。"小"核酶對(duì)于切割較大的mRNA分子尤其有效。"小"核酶是錘頭型核酶，其具有短的寡核苷酸接頭而不是莖/環(huán)n。二聚體"小"核酶是尤其有效的(Kuwabara等人，1998，NatureBiotechnology,16;961-965)。因此，本發(fā)明還涉及包含兩種最后提到的DM分子(突變或核酶-DNA分子)之一的生物功能載體。上面關(guān)于載體所述的也應(yīng)用于該情況。這種載體可以例如插入到微生物中并且可以用于產(chǎn)生高濃度的上述DM分子。此外，這種載體對(duì)于將特異DNA分子插入植物生物中以便下調(diào)或完全抑制該生物中的131，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生是尤其好的。上述所有栽體也可以用(31，3-GalT的基因組序列如SEQIDNOs.3或4制備。本發(fā)明的莒蘚植物細(xì)胞或其祖先細(xì)胞可以是以前用異源目的基因轉(zhuǎn)化的任何細(xì)胞，所述目的基因編碼被糖基化的目的蛋白質(zhì)的一級(jí)序列，所述目的蛋白質(zhì)具有如本文所述的哺乳動(dòng)物糖基化模式。優(yōu)選地，糖基化模式為人類型的糖基化模式。備選地，苔蘚植物細(xì)胞可用多種19核苷酸序列轉(zhuǎn)化多次，即同時(shí)或者隨時(shí)間轉(zhuǎn)化，所述核苷酸序列編碼至少一種主要的目的蛋白質(zhì)序列，通常用于人或哺乳動(dòng)物，如牲畜物種，包括牛、羊、馬和豬種類的至少一種藥物蛋白，其需要根據(jù)如本文所述的本發(fā)明方法在其上具有哺乳動(dòng)物糖基化模式。此類用于哺乳動(dòng)物，包括人的藥物糖蛋白包括但不限于蛋白質(zhì)，如VEGF，干擾素，如cc-干擾素、p-干擾素、Y-干擾素，選自因子VII、VIII、IX、X、XI和XII的凝血因子，生育激素，包括黃體化激素，促卵泡激素生長(zhǎng)因子，包括表皮生長(zhǎng)因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子、粒細(xì)胞集落刺激因子等等，催乳素，催產(chǎn)素，促曱狀腺激素，促腎上腺皮質(zhì)素，降鈣素，曱狀旁腺素，促生長(zhǎng)素抑制素，紅細(xì)胞生成素(EPO)，酶，如p-葡糖腦苷脂酶，血紅蛋白，膠原，融合蛋白，如TNFot受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域與IgG的Fc部分的融合蛋白，等等。此外，本發(fā)明的方法可以用于產(chǎn)生免疫球蛋白，如抗體，如特異性單克隆抗體或其活性片段。關(guān)于在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)適用于本發(fā)明的蘚類如薄嚢鮮(力e;^o6r/"/z//7jT/尸oryzze)和中位泥炭蘚(S/力ag/7Wz咖《e"s/7/c"/z/)的詳細(xì)信息是現(xiàn)有技術(shù)已知的(見(jiàn)例如，E.Wilbert，"Biotechnologicalstudiesconcerningthemasscultureofmosseswithparticularconsiderationofthearachidonicacidmetabolism",Ph.D.thesis,UniversityofMainz(1991);H.RudolphandS.Rasmussen,StudiesonsecondarymetabolismofSphagnumcultivatedinbioreactors，Crypt.Bot.，3，pp.67-73(1992))。對(duì)于本發(fā)明目的特別優(yōu)選的是使用小立碗蘚，因?yàn)樵谠撋锷蠈?shí)施了分子生物學(xué)技術(shù)(綜述見(jiàn)R.Reski，Development,geneticsandmolecularbiologyofmosses,Bot.Acta,111，pp.1-15已經(jīng)開(kāi)發(fā)了合適的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)用于立碗蘚屬的生物技術(shù)開(kāi)發(fā)以產(chǎn)生異源蛋白。例如，通過(guò)使用微粒槍向原絲體組織中直接轉(zhuǎn)移DNA已經(jīng)進(jìn)行了成功的轉(zhuǎn)化。也成功地實(shí)現(xiàn)了PEG介導(dǎo)的DNA向蘚類原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)移。已經(jīng)為小立碗蘚多次描述了PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法并且得到了(1998))。瞬時(shí)和穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體(見(jiàn)例如，K.ReutterandR.Reski，Productionofaheterologousproteininbioreactorculturesoffullydifferentiatedmossplants,PI.TissuecultureandBiotech.,2，pp.142-147(1996))。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供了產(chǎn)生至少一種苔蘚植物細(xì)胞的方法，在所述細(xì)胞中3-GalT活性被顯著減小，所述方法包括向所述細(xì)胞中導(dǎo)入i)第一種核酸序列，其特異靶向根據(jù)SEQIDNO:1的內(nèi)源(31，3編碼核苷酸序列和ii)第二種核苷酸序列，其特異靶向根據(jù)SEQIDNO:2的內(nèi)源P1，3編碼核苷酸序列。技術(shù)人員將理解所述第一種和第二種轉(zhuǎn)移酶核苷酸序列向苔蘚植物細(xì)胞的導(dǎo)入順序不是重要的它可以以任何順序進(jìn)行。笫一種和第二種核酸序列可以靶向位于苔蘚植物細(xì)胞的細(xì)胞核基因組中的內(nèi)源的天然P1，3-GalT基因的特定部分，所述部分通過(guò)其特定限制酶限定，例如，根據(jù)如本文提供的實(shí)施例。通過(guò)用與靶標(biāo)天然轉(zhuǎn)移酶基因特異整合的核苷酸序列特異靶向天然P1，3-GalT基因的序列，所述序列的表達(dá)如果不被完全破壞也受到實(shí)質(zhì)性損傷。優(yōu)選地，上文提到的所有糖基化的哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)都是人類型的。預(yù)期用于在本發(fā)明中產(chǎn)生的其他蛋白質(zhì)包括用于獸醫(yī)護(hù)理的蛋白質(zhì)并且可以對(duì)應(yīng)于本文提到的人類蛋白質(zhì)的動(dòng)物同源物。外源啟動(dòng)子是指導(dǎo)入至目的核酸序列之前并且與其有效結(jié)合的啟動(dòng)子。從而，外源啟動(dòng)子是這樣的啟動(dòng)子，其被置于如本文定義的所選核酸組分之前并且不由通常與如在野生型環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的目的核酸組分結(jié)合的天然或自然啟動(dòng)子組成。從而，啟動(dòng)子可以對(duì)于目的苔蘚植物細(xì)胞是天然的但是不與野生型苔蘚植物細(xì)胞前面的目的核酸有效結(jié)合。通常，外源啟動(dòng)子是從不同于宿主細(xì)胞的來(lái)源轉(zhuǎn)移到宿主苔蘚植物細(xì)胞的啟動(dòng)子。關(guān)于具有改進(jìn)的P1，3-糖基化的N-聚糖結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生，編碼P-l，3-GalT蛋白、如本文所述的糖基化和哺乳動(dòng)物蛋白的cDNA含有在苔蘚植物細(xì)胞中有效的至少一種類型的啟動(dòng)子，例如誘導(dǎo)型或組成型21啟動(dòng)子，其有效連接p-1，3-GalT核酸序列和/或如本文定義和如本發(fā)明提供的糖基化的哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)的第二種核酸序列。如所討論的，這使得可以控制基因的表達(dá)。如應(yīng)用于啟動(dòng)子的術(shù)語(yǔ)"誘導(dǎo)型"是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。實(shí)質(zhì)上，處于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下的表達(dá)應(yīng)答所應(yīng)用的刺激(其可以在細(xì)胞中產(chǎn)生或者外源提供)而被"打開(kāi)，，或者增加。刺激的性質(zhì)在啟動(dòng)子之間不同。不存在合適的刺激時(shí)，一些誘導(dǎo)型啟動(dòng)子引起很小或不可檢測(cè)水平的表達(dá)(或無(wú)表達(dá))。其他誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在不存在刺激時(shí)引起可檢測(cè)的組成型表達(dá)。不管不存在刺激時(shí)表達(dá)水平如何，在正確刺激的存在下，從任何誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的表達(dá)都增加了。優(yōu)選的條件是其中當(dāng)應(yīng)用相關(guān)刺激時(shí)，表達(dá)水平增加至有效改變表型特征的量。從而，可以使用誘導(dǎo)型(或者"可開(kāi)關(guān)的")啟動(dòng)子，不存在刺激時(shí)，該啟動(dòng)子引起基礎(chǔ)表達(dá)水平，該水平太低而不能引起希望的表型(并且實(shí)際上可以是零)。當(dāng)應(yīng)用刺激時(shí)，表達(dá)升高(或者打開(kāi))到引起希望的表型的水平。如本文提到的，苔蘚植物表達(dá)系統(tǒng)也是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。苔蘚植物啟動(dòng)子，尤其小立碗蘚啟動(dòng)子，是能夠結(jié)合宿主DM依賴型RM聚合酶并且啟動(dòng)編碼序列(例如，結(jié)構(gòu)基因)下游(3，)轉(zhuǎn)錄成mRNA的任何DNA序列。啟動(dòng)子將具有轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，其通常在編碼序列的5，末端附近放置。該轉(zhuǎn)錄起始區(qū)通常包括RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)("TATA盒")和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。苔蘚植物啟動(dòng)子也可以具有被稱作上游激活序列(UAS)的第二個(gè)結(jié)構(gòu)域，其如果存在，通常在結(jié)構(gòu)基因遠(yuǎn)端。UAS允許調(diào)節(jié)的(誘導(dǎo)型)表達(dá)。不存在UAS時(shí)發(fā)生組成型表達(dá)。受調(diào)節(jié)的表達(dá)可以是陽(yáng)性或陰性的，從而增強(qiáng)或減弱轉(zhuǎn)錄。技術(shù)人員將理解編碼苔蘚植物代謝途徑中酶的莒蘚植物啟動(dòng)子序列可以提供尤其有用的啟動(dòng)子序列。此外，不在自然中發(fā)生的合成啟動(dòng)子也可以作為苔蘚植物啟動(dòng)子發(fā)揮功能。例如，一種莒蘚植物啟動(dòng)子的MS序列與另一苔蘚植物啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活化區(qū)結(jié)合，產(chǎn)生合成的雜合啟動(dòng)子。合適啟動(dòng)子的一個(gè)實(shí)例是Zeidler等人(1996)Plant.Mol.Biol.30，199-205)所述的用于小立碗蘚的TOP10表達(dá)系統(tǒng)的啟動(dòng)子。此外，苔蘚植物啟動(dòng)子可以包括非莒蘚植物來(lái)源的天然存在的啟動(dòng)子，其具有結(jié)合苔蘚植物依賴MA的RNA聚合酶并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的能力。此類啟動(dòng)子的實(shí)例包括稻P-肌動(dòng)蛋白1啟動(dòng)子和衣藻(Chlamydomonas)RbcS啟動(dòng)子(Zeidler等人(1999)J.PlantPhysiol.154，641-650)，Cohen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:1078，1980;Henikoff等人，Nature,283:835，1981;Hollenberg等人，Curr.TopicsMicrobiol.Immunol"96:119，1981;Hollenberg等人，"TheExpressionofBacterialAntibioticResistanceGenesintheYeastSaccharomycescerevisiae11，in:PlasmidsofMedical,EnvironmentalandCommercialImportance(eds.LN.TimmsandA.Puhler)，1979;Mercerau-Puigalon等人，Gene，11:163，1980;Panthier等人，Curr.Genet.，2:109，1980)。根據(jù)本發(fā)明的DNA分子可以在苔蘚植物中細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。啟動(dòng)子序列可以與DNA分子直接連接，在該情況下重組蛋白N-末端的第一個(gè)氨基酸將總是甲硫氨酸，其由mRNA上的AUG起始密碼子編碼。如果希望，可以通過(guò)與溴化氰在體外溫育從蛋白質(zhì)切除N-末端的曱硫氨酸。備選地，外源蛋白也可以從莒蘚植物細(xì)胞分泌到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，這可以如下實(shí)現(xiàn)通過(guò)產(chǎn)生編碼融合蛋白的嵌合DNA分子，所述融合蛋白包含通過(guò)外源蛋白在苔蘚植物細(xì)胞中分泌或分泌到細(xì)胞外的前導(dǎo)序列片段。優(yōu)選地，在前導(dǎo)片段和外源基因之間存在存在加工位點(diǎn)，其可以在體內(nèi)或體外被切除。前導(dǎo)序列片段通常編碼由疏水氨基酸組成的信號(hào)肽，其指導(dǎo)蛋白質(zhì)從細(xì)胞的分泌。編碼合適的信號(hào)序列的DNA可以來(lái)自所分泌的苫蘚植物蛋白質(zhì)的基因，如存在非吝蘚植物來(lái)源的前導(dǎo)序列，如VEGF前導(dǎo)序列，其也提供了苔蘚植物細(xì)胞中的分泌。被苔蘚植物識(shí)別并且在莒蘚植物細(xì)胞中有功能的轉(zhuǎn)錄終止序列是位于翻譯終止密碼子的3，并且從而與編碼區(qū)側(cè)翼啟動(dòng)子在一起的調(diào)節(jié)區(qū)。這些序列指導(dǎo)mRNA的轉(zhuǎn)錄，所述mRNA可以;陂翻譯成DM編碼的多肽。在小立碗蘚中起作用的合適的終止序列的實(shí)例是花椰菜花葉病毒的終止區(qū)。通常，將包括啟動(dòng)子、前導(dǎo)(如果希望)序列、目的編碼序列和轉(zhuǎn)錄終止序列的組分一起置于本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體中。表達(dá)構(gòu)建體通常在DNA質(zhì)粒中保持，質(zhì)粒是能夠在宿主如細(xì)菌中穩(wěn)定保持的染色體外元件。DNA質(zhì)?？梢跃哂袃蓚€(gè)復(fù)制起點(diǎn)，從而允許其在苔蘚植物中表達(dá)和在原核宿主中克隆和擴(kuò)增。一般說(shuō)來(lái)，如果質(zhì)粒具有用于在原核宿主細(xì)胞中克隆和擴(kuò)增的一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，那么是足夠的。此外，DNA質(zhì)粒可以是高或低拷貝數(shù)質(zhì)粒。高拷貝數(shù)質(zhì)粒將通常具有約5到約200,通常約IO到約150個(gè)拷貝數(shù)。含有高拷貝數(shù)質(zhì)粒的宿主優(yōu)選具有至少約10個(gè)，更優(yōu)選至少約20個(gè)拷貝數(shù)?？梢愿鶕?jù)載體和外源蛋白對(duì)宿主的影響選擇高或低拷貝數(shù)載體(見(jiàn)例如，Brake等人，同上)。備選地，表達(dá)構(gòu)建體可以與整合載體一起整合到苔蘚植物基因組中。整合載體通常含有與苔蘚植物染色體同源的至少一個(gè)序列，其允許載體整合，并且優(yōu)選含有在表達(dá)構(gòu)建體側(cè)翼的兩個(gè)同源序列。通過(guò)如本文所述和示例選擇用于包括在載體中的合適的同源序列，可以將整合載體導(dǎo)入苔蘚植物的特定基因座中。一個(gè)或多個(gè)表達(dá)構(gòu)建體可以整合。載體中包括的染色體序列可以作為單個(gè)區(qū)段在載體中存在，其導(dǎo)致完整載體的整合，或者作為與染色體中相鄰區(qū)段同源并且在載體中表達(dá)構(gòu)建體側(cè)翼的兩個(gè)區(qū)段存在，其可以導(dǎo)致僅僅表達(dá)構(gòu)建體的穩(wěn)定整合。通常，染色體外和整合表達(dá)構(gòu)建體可以含有可選擇標(biāo)記，其允許被轉(zhuǎn)化的莒蘚植物細(xì)胞的選擇?？蛇x擇標(biāo)記可以包括可以在苔蘚植物宿主中表達(dá)的生物合成基因，如G418或者潮霉素B抗性基因，其在苔蘚植物細(xì)胞中分別賦予對(duì)G418和潮霉素B的抗性。此外，合適的可選擇標(biāo)記也可以為苔蘚植物細(xì)胞提供在毒性化合物如金屬存在下生長(zhǎng)的能力。備選地，可以將一些上述組分一起置于轉(zhuǎn)化載體中。轉(zhuǎn)化栽體通常包含可選擇標(biāo)記，其或者在DNA質(zhì)粒中保持或者發(fā)展為整合載體，如上述。備選地，通過(guò)實(shí)現(xiàn)如立碗蘚屬中觀察到的高產(chǎn)率轉(zhuǎn)化事件，可以避免使用標(biāo)記進(jìn)行轉(zhuǎn)化事件的選擇。向莒蘚植物細(xì)胞中導(dǎo)入外源DNA的方法是本領(lǐng)域公知的，并且由SchaeferD.G."PrinciplesandprotocolsforthemossPhyscomitrellapatens",(May2001)InstituteofEcology,LaboratoryofPlantCellGenetics,UniversityofLausanne;ReutterK.andReskiR.，PlantTissueCultureandBiotechnologySeptember1996,Vol.2，No.3;ZeidlerM等人，(1996)，PlantMolecularBiology30:199-205描述。技術(shù)人員完全能夠構(gòu)建載體并設(shè)計(jì)如上述的重組核酸序列或基因表達(dá)的方案?？梢赃x擇或構(gòu)建含有合適的調(diào)節(jié)序列的載體，所述調(diào)節(jié)序列包括啟動(dòng)子序列、終止子片段、多聚腺苷酸化序列、增強(qiáng)子序列、才示^己基因和其他合適的序歹'J。其它纟田節(jié)見(jiàn)，J^口，MolecularCloning:aLaboratoryManual:2ndedition,Sambrooketal，1989，ColdSpringHarborLaboratoryPress。關(guān)于核酸操作，如在核酸構(gòu)建體的制備、誘變、測(cè)序、DNA向細(xì)胞的導(dǎo)入、基因表達(dá)和蛋白質(zhì)分析中的許多已知的技術(shù)和方案在CurrentProtocolsinMolecularBiology,第二版，Ausubel等人eds.，JohnWiley&Sons,1992中詳細(xì)描述。將Sambrook等人和Ausubel等人的公開(kāi)引入本文作為參考。如上述，可選擇遺傳標(biāo)記可以促進(jìn)轉(zhuǎn)基因苔蘚植物細(xì)胞的選擇并且這些可以由嵌合基因組成，所述嵌合基因賦予如本文提到的可選擇表型。當(dāng)向莒蘚植物細(xì)胞中導(dǎo)入編碼所選的糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸序列和包含糖基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽序列時(shí)，必須考慮本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的一些考慮事項(xiàng)。待插入的核酸應(yīng)該在構(gòu)建體內(nèi)裝配，所述構(gòu)建體含有將驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄的有效調(diào)節(jié)元件。將構(gòu)建體轉(zhuǎn)移入細(xì)胞的方法必須是可用的。25一旦構(gòu)建體在細(xì)胞膜內(nèi)，向內(nèi)源染色體物質(zhì)的整合將會(huì)發(fā)生或不發(fā)生。本發(fā)明還包括用如上述載體或構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，特別是莒蘚植物或微生物細(xì)胞。從而，提供了包括如本文所述的本發(fā)明的核苷酸序列的宿主細(xì)胞，如苔蘚植物細(xì)胞。在細(xì)胞內(nèi)，核酸序列可以摻入染色體內(nèi)。還根據(jù)本發(fā)明，提供了莒蘚植物細(xì)胞，其具有整合入其基因組中的至少一個(gè)核苷酸序列，尤其如本發(fā)明提供的異源核苷酸序列，所述核苷酸序列處于用于控制如本文所述的表達(dá)的調(diào)節(jié)序列的有效控制下。編碼序列可以有效連接一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)序列，其可以是用于本發(fā)明的核酸序列異源或外源的，如與用于其表達(dá)的核酸序列不天然結(jié)合。可以將本發(fā)明的核苷酸序列置于外源誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下以將表達(dá)置于用戶的控制下。本發(fā)明的另一方面提供了制備此類苔蘚植物細(xì)胞、尤其小立碗蘚的方法，包括向苔蘚植物細(xì)胞中導(dǎo)入預(yù)期用于本發(fā)明的核酸序列或者包括預(yù)期用于本發(fā)明的序列的至少一種合適的栽體，并引起或允許載體和苔蘚植物細(xì)胞基因組之間重組以向基因組中導(dǎo)入所述序列。本發(fā)明延及苔蘚植物細(xì)胞，尤其小立碗蘚細(xì)胞，其含有編碼多肽序列的GalT核苷酸和/或核苷酸序列并且由于所述核苷酸序列向祖先細(xì)胞的導(dǎo)入而適用于本發(fā)明，所述多肽序列用于向所述細(xì)胞加入哺乳動(dòng)物糖基化模式。術(shù)語(yǔ)"異源的"可以用于指使用遺傳改造，即通過(guò)人的干預(yù)向苔蘚植物細(xì)胞或其祖先中導(dǎo)入了所討論的基因和/或核苷酸序列?？梢蕴峁┺D(zhuǎn)基因苔蘚植物細(xì)胞，即對(duì)于所討論的核苷酸序列是轉(zhuǎn)基因的。轉(zhuǎn)基因可以在基因組外栽體上或者摻入，優(yōu)選穩(wěn)定摻入基因組中。異源基因可以代替內(nèi)源的等同基因，即通常執(zhí)行相同或相似功能的基因，或者插入序列對(duì)于內(nèi)源基因或其他基因來(lái)說(shuō)是附加的。導(dǎo)入異源基因的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是能夠?qū)⑿蛄械谋磉_(dá)置于所選啟動(dòng)子控制下，以便能夠根據(jù)偏愛(ài)影響表達(dá)。對(duì)苔蘚植物細(xì)胞異源或外源或外來(lái)的核苷酸序列可以在該類型、林系或者物種的細(xì)胞中是非天然存在的。從而，核苷酸序列可以包括特定類型的莒蘚植物細(xì)胞如小立碗蘚細(xì)胞的編碼序列或來(lái)自所述細(xì)胞的編碼序列，所述編碼序列被置于不同類型或物種的苔蘚植物細(xì)胞的背景中。另一可能性是核苷酸序列被置于吝蘚植物細(xì)胞內(nèi)，其中它或同源物被發(fā)現(xiàn)是天然的，但是其中該核苷酸序列與該類型或物種或抹系的細(xì)胞內(nèi)不天然存在的核酸連接和/或相鄰，如有效連接用于控制表達(dá)的一種或多種調(diào)節(jié)序列，如啟動(dòng)子序列。苔蘚植物或其他宿主細(xì)胞內(nèi)的序列可被識(shí)別為異源的、外源的或外來(lái)的。本發(fā)明還包括如本文公開(kāi)的或者本文的信息和提示可得到的核酸分子組合的希望的多肽表達(dá)產(chǎn)物。還提供了制備此類表達(dá)產(chǎn)物的方法，通過(guò)在合適條件下在合適的宿主細(xì)胞如大腸桿菌中從編碼所述表達(dá)產(chǎn)物的核苷酸序列表達(dá)實(shí)現(xiàn)所述方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員完全能夠構(gòu)建載體和設(shè)計(jì)用于表達(dá)和回收重組基因表達(dá)產(chǎn)物的方案和系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明的多肽可以是如本文提到的多肽的等位基因、變體、片段、衍生物、突變體或同源物。等位基因、變體、片段、衍生物、功能或者可以是其功能突變體。在如本文所述用于人類的藥物蛋白的上下文中，技術(shù)人員將理解此類蛋白質(zhì)的一級(jí)序列和它們的糖基化模式將模擬人類中發(fā)現(xiàn)的一級(jí)序列和糖基化模式或優(yōu)選與其相同。關(guān)于本發(fā)明的核酸序列或關(guān)于氨基酸序列的"同一性"可以用于指完整序列或其基本部分的同一性。如上面已經(jīng)提到的，高水平的氨基酸同一性可以局限于功能上重要的結(jié)構(gòu)域或者區(qū)域，例如，本文鑒定的任何結(jié)構(gòu)域。具體地，本發(fā)明提供了如本文提供具體苔蘚植物細(xì)胞來(lái)源的多肽序列的同源物，以及此類同源物的突變體、變體、片段和衍生物。從而，本發(fā)明還涉及多肽，其包括具有如本文定義的P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶功能的氨基酸序列并且可以用本文提供的序列信息得到。根據(jù)本發(fā)明的p1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶可以在氨基酸水平上與本文公開(kāi)的序列的氨基酸序列，特別與PpGalTl、PpGalT2、PpGalTlas或PpGalT2as(圖2-5)具有至少約50%、或至少55%、或至少約60%、或至少約65%、或至少約70%、或至少約75%、或至少約80%的同一性、或至少約85%、或至少約88%的同一性、或至少約90%的同一性、和最優(yōu)選至少約95%的同一性或更高同一性，條件是此類蛋白質(zhì)具有在本發(fā)明上下文中符合的P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性。當(dāng)將所討論的序列與例如PpGalTl、PpGaiT2、PpGalTlas或PpGalT2as比較時(shí)，所提到的％同一性將優(yōu)選在包含如圖l所述的7個(gè)保守結(jié)構(gòu)域的區(qū)域中給出(包括如本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)可想到的合適的"-，，)。在一些實(shí)施方案中，特定序列的等位基因、變體、衍生物、突變體衍生物、突變體或同源物可以顯示出與該特定序列的很小的總體同一性，例如，至少20%、或至少25%、或至少30%、或至少35%、或至少40%、或至少45%(即例如約20%、或約25。/q、或約30%、或約35%、或約40%、或約45%(即例如20%或更高))。然而，在功能上重要的結(jié)構(gòu)域或區(qū)域中，氨基酸同一性可以高得多。使用生物信息學(xué)方法可以鑒定推定的功能上重要的結(jié)構(gòu)域或區(qū)域，所述方法包括比較同源物的序列。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的P1，3-GalT蛋白質(zhì)在根據(jù)圖1的7個(gè)保守結(jié)構(gòu)域(粗體氨基酸殘基)中顯示出80%以上，特別90%以上的同源性，特別優(yōu)選保守氨基酸(通過(guò)圖1中的"*"代表)完全存在(或至少95%的程度)。根據(jù)本發(fā)明的P1,卜GalT的特別優(yōu)選的變體包含80%以上，優(yōu)選90%以上，特別100%的如圖l所示的保守氨基酸。不同多肽的功能上重要的結(jié)構(gòu)域或區(qū)域可以組合用于從編碼核酸表達(dá)為融合蛋白。例如，如果合適的話，不同同源物的尤其有利的或希望的性質(zhì)可以在雜合蛋白質(zhì)中組合，使得所得的具有卩1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶功能的表達(dá)產(chǎn)物可以包括多種親本蛋白的片段。同一性可以被容易地計(jì)算為比對(duì)序列的％值(包括智能"-")。通過(guò)在本領(lǐng)域中用作標(biāo)準(zhǔn)的Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的TBLASTN程序定義和確定氨基酸序列的相似性。具體地，可以使用TBLASTN2.0與矩陣BLOSUM62和GAP罰分存在11，延伸1?？梢允褂玫牧硪粯?biāo)準(zhǔn)程序是Best-FU，其是WisconsinPackage,第八版(1994年9月)(GeneticsComputerGroup,575ScienceDrive,28Madison,Wisconsin,USA，Wisconsin53711)的一部分。BestFit進(jìn)行兩個(gè)序列之間最佳區(qū)段相似性的最佳比對(duì)。使用Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.(1981)2:482-489)的局部同一性算法，通過(guò)插入空位以最大化匹配數(shù)目發(fā)現(xiàn)最佳比對(duì)。其他算法包括GAP，其使用Needleman和Wunsch算法來(lái)比對(duì)兩個(gè)完整序列，其最大化匹配數(shù)目并最小化空位數(shù)目。與使用任何算法一樣，通常使用默認(rèn)參數(shù)，對(duì)于GAP，空位產(chǎn)生罰分=12，空位延伸罰分-4。備選地，可以使用空位產(chǎn)生罰分3和空位延伸罰分0.1。算法FASTA(其使用Pearson和Lipman(1988)PNASUSA85:2444-2448的方法)是另一備選方案。產(chǎn)生重組宿主細(xì)胞，尤其植物細(xì)胞或植物的有利的方法在于分別向宿主細(xì)胞或植物的基因組中插入特別包含失活突變的根據(jù)本發(fā)明的DNA分子，以代替非突變的同源序列(Schaefer等人，1997，PlantJ.;11(6):1195-1206)。該方法從而從而不用載體而是用純的DM分子發(fā)揮功能。例如，通過(guò)基因轟擊、顯微注射或者PEG介導(dǎo)的直接DNA轉(zhuǎn)移等等向宿主中插入根據(jù)本發(fā)明的DNA分子，這僅是3個(gè)實(shí)例。該DNA分子結(jié)合到宿主基因組中的同源序列，使得同源重組，從而缺失、插入或替代突變的接受將導(dǎo)致基因組例如可以分別抑制或者完全阻斷P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)。本發(fā)明的另一方面分別涉及植物、植物組織或植物細(xì)胞，它們的P1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性小于天然植物或者植物細(xì)胞中存在的P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性的50%、尤其小于20%，特別優(yōu)選0%。這些植物或植物細(xì)胞分別的優(yōu)點(diǎn)是它們產(chǎn)生的糖蛋白不包含或幾乎不包含任何P1，3-結(jié)合的半乳糖。如果這些植物的產(chǎn)物分別被人或哺乳動(dòng)物身體吸收，那么將沒(méi)有針對(duì)P1，3連接的半乳糖表位的免疫反應(yīng)。優(yōu)選地，分別提供了重組植物或植物細(xì)胞，它們通過(guò)上述方法之一制備，它們的P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的產(chǎn)生分別被抑制或者被完全阻斷。本發(fā)明還涉及包含與本發(fā)明的DNA分子的序列以及其部分序列互補(bǔ)的堿基序列的PM分子。PNA(肽核酸)是DNA樣分子，其核堿基與假29肽骨架結(jié)合。PNA通常通過(guò)Watson-Crick堿基配對(duì)和螺旋形成與互補(bǔ)的DNA、RNA或PNA寡聚體雜交。肽骨架確保對(duì)酶降解的更大抗性。從而PNA分子是改進(jìn)的反義試劑。核酸酶和蛋白酶都不能攻擊PNA分子。如果與互補(bǔ)序列結(jié)合，PNA分子的穩(wěn)定性包含DNA和RNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、端粒酶和核糖體的足夠的空間阻斷。如果PNA分子包含上述序列，那么它將分別結(jié)合到編碼P1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的DNA或DNA的位點(diǎn)，從而以此方式能夠抑制該酶的轉(zhuǎn)錄。由于它既不轉(zhuǎn)錄也不翻譯，PNA分子將通過(guò)合成制備，例如，借助t-Boc技術(shù)。有利地，提供了PNA分子，其包含對(duì)應(yīng)于本發(fā)明DNA分子的序列以及其部分序列的堿基序列。該P(yáng)NA分子將與P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的mRNA或mRNA的位點(diǎn)復(fù)合，從而該酶的翻譯將被抑制。關(guān)于反義RNA給出的類似討論同樣適用于該情況。從而，例如，尤其有效的復(fù)合區(qū)是mRM的翻譯起始區(qū)或者5，非翻譯區(qū)。本發(fā)明的另一方面涉及分別制備植物、組織或細(xì)胞，尤其植物細(xì)胞的方法，所述植物、組織或細(xì)胞包含P1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平上被阻斷的表達(dá)，其特征在于將本發(fā)明的PNA分子插入細(xì)胞中。為了在細(xì)胞中插入一種或多種PNA分子，再次使用常規(guī)方法，如電穿孔或者顯微注射。如果PNA寡聚體結(jié)合到細(xì)胞滲透肽，如transportan或pAntp(Pooga等人，1998，NatureBiotechnology,16;857-861)，那么尤其有效的是插入。本發(fā)明提供了制備重組糖蛋白的方法，其特征在于用表達(dá)所述糖蛋白的基因轉(zhuǎn)染其P1,3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的產(chǎn)生受抑制或完全阻斷的本發(fā)明重組植物或植物細(xì)胞或者其中已經(jīng)根據(jù)本發(fā)明方法插入了PNA分子的植物或組織或細(xì)胞，從而表達(dá)所述重組糖蛋白。這樣，如上文已經(jīng)描述，將包含所希望的蛋白質(zhì)基因的載體分別轉(zhuǎn)染到宿主或宿主細(xì)胞中，如已經(jīng)在上文所述。所轉(zhuǎn)染的植物細(xì)胞將表達(dá)希望的蛋白質(zhì)，并且它們沒(méi)有或幾乎沒(méi)有任何l31，3-結(jié)合的半乳糖。從而，它們不引發(fā)已經(jīng)在上面提到的在人或脊推動(dòng)物身體中的免疫應(yīng)答。在這些系統(tǒng)中可以產(chǎn)生任何蛋白質(zhì)。有利地，提供了制備重組人糖蛋白的方法，其特征在于用表達(dá)所述糖蛋白的基因轉(zhuǎn)染其P1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的產(chǎn)生受抑制或完全阻斷的本發(fā)明重組植物或植物細(xì)胞或者其中已經(jīng)根據(jù)本發(fā)明方法插入了PNA分子的植物或組織或細(xì)胞，從而表達(dá)所述重組糖蛋白。通過(guò)該方法，可能在植物(植物細(xì)胞)中產(chǎn)生人類蛋白質(zhì)，其如果被人體攝入，那么不會(huì)引發(fā)針對(duì)P1，3-結(jié)合的半乳糖酶殘基的任何免疫反應(yīng)。從而，可能利用作為食物的植物類型如香蕉、馬鈴薯和/或番茄產(chǎn)生重組糖蛋白。該植物的組織包含重組糖蛋白，從而例如，通過(guò)從組織提取該重組糖蛋白并隨后施用，或者直接通過(guò)食用該植物組織，重組糖蛋白被攝入人體中。優(yōu)選地，提供了制備用于醫(yī)藥用途的重組人糖蛋白的方法，其中用表達(dá)所述糖蛋白的基因轉(zhuǎn)染其P1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的產(chǎn)生受抑制或完全阻斷的本發(fā)明重組植物或植物細(xì)胞或者其中已經(jīng)根據(jù)本發(fā)明方法插入了PNA分子的植物或組織或細(xì)胞，從而表達(dá)所述重組糖蛋白。這樣，可以使用具有醫(yī)學(xué)目的的任何蛋白質(zhì)。此外，本發(fā)明涉及根據(jù)上述方法的重組糖蛋白，其中它們已經(jīng)在植物系統(tǒng)中制備并且其中它們的肽序列包含在非半乳糖基轉(zhuǎn)移酶減少的植物系統(tǒng)中表達(dá)的蛋白質(zhì)中發(fā)生的P1，3-結(jié)合的半乳糖殘基的50%以下，尤其20。/。以下，尤其優(yōu)選0%。自然，不包含pi，3-結(jié)合的半乳糖殘基的糖蛋白將是優(yōu)選的。P1，3-結(jié)合的半乳糖的量將取決于P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的上述抑制的程度。優(yōu)選地，本發(fā)明涉及重組人糖蛋白，其已經(jīng)根據(jù)上述方法在植物系統(tǒng)中產(chǎn)生并且其肽序列包含在非半乳糖基轉(zhuǎn)移酶減少的植物或系統(tǒng)中表達(dá)的蛋白質(zhì)中發(fā)生的P1，3-結(jié)合的半乳糖殘基的50%以下，尤其20%以下，尤其優(yōu)選0%。尤其優(yōu)選的實(shí)施方案涉及用于醫(yī)藥用途的重組人糖蛋白，其已經(jīng)酶減少的植物系統(tǒng)中表達(dá)的蛋白質(zhì)中發(fā)生的P1，3-結(jié)合的半乳糖殘基的50%以下，尤其20%以下，尤其優(yōu)選0%。另一方面包括包含本發(fā)明的糖蛋白的藥物組合物。除了本發(fā)明的糖蛋白之外，所述藥物組合物還包含此類組合物常見(jiàn)的其它添加劑。這些是例如，多種緩沖成分的合適的稀釋劑(例如，Tris-HCl、乙酸鹽、磷酸鹽、pH和離子強(qiáng)度、添加劑，如表面活性劑和增溶劑(例如，Tween80，Polysorbate80)，防腐劑(例如，硫柳汞、苯曱醇)，佐劑，抗氧化劑(例如，抗壞血酸、偏亞硫酸氫鈉)，乳化劑，填充劑(例如，乳糖、甘露醇)，聚合物如聚乙二醇與蛋白質(zhì)的共價(jià)鍵，在聚合化合物的微粒組分中摻入物質(zhì)，如聚乳酸、聚乙醇酸，等等，或者在脂質(zhì)體中，摻入適于各自處理的輔劑和/或載體物質(zhì)。此類組合物將影響本發(fā)明糖蛋白的物理?xiàng)l件、穩(wěn)定性、體內(nèi)釋放速率和體外排泄速率。本發(fā)明還提供了選擇樣品中編碼P1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的DNA分子的方法，其中將本發(fā)明的經(jīng)標(biāo)記的DNA分子與樣品混合，所述經(jīng)標(biāo)記的DNA分子與編碼(31，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的DNA分子結(jié)合。可以檢測(cè)、定量和選擇雜交的DNA分子。為了樣品含有經(jīng)標(biāo)記的DNA分子可與之雜交的單鏈DNA,例如通過(guò)加熱將樣品變性。一種可能的方法是可能在加入內(nèi)切核酸酶后通過(guò)在瓊脂糖凝膠上電泳分離待測(cè)定的DNA。轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素的膜上后，將與對(duì)應(yīng)的同樣DNA分子雜交的根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)標(biāo)記的DNA分子混合("DM印跡")。另一可能的方法在于使用來(lái)自根據(jù)本發(fā)明的DM分子序列的特異和/或簡(jiǎn)并的引物，通過(guò)依賴PCR的方法發(fā)現(xiàn)來(lái)自其他物種的同源基因。優(yōu)選地，上面鑒定的本發(fā)明方法的樣品包含植物生物的基因組DNA。通過(guò)該方法，以非?？焖俸陀行У姆绞綔y(cè)定許多植物的P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因的存在。以這種方式，分別可能的是選擇不包含該基因的植物，或者通過(guò)上述方法抑制或完全阻斷此類植物中01,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)，從而它們隨后可用于轉(zhuǎn)染和產(chǎn)生(人)糖蛋白。本發(fā)明還涉及編碼P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的DNA分子，其已經(jīng)根據(jù)兩種上述方法選擇并且隨后已經(jīng)從樣品分離。這些方法可以用于其他測(cè)定法?？梢詫?duì)它們測(cè)序并又用作發(fā)現(xiàn)(31，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的DNA探針。這些經(jīng)標(biāo)記的DM分子將與它們從中分離的生物相關(guān)的生物發(fā)揮功能，更有效地作為本發(fā)明DNA分子的探針。本發(fā)明還涉及制備人和其他脊推動(dòng)物糖蛋白的"植物化"糖類單位的方法，其中將巖藻糖單位以及上述DNA分子編碼的P1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶分別與包含糖單位或糖蛋白的樣品混合，從而P1，3-位的半乳糖將被P1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶分別結(jié)合到所述糖單位或結(jié)合到糖胥白。通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的克隆l31,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的方法，可能產(chǎn)生大量的純化的酶。為了得到完全活性的轉(zhuǎn)移酶，通過(guò)了合適的反應(yīng)條件。本發(fā)明將通過(guò)下面的實(shí)施例和附圖詳細(xì)解釋，這些實(shí)施例和附圖當(dāng)然不是限制性的。圖1顯示了p1，3-GalT的氨基酸比對(duì)。P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的7個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域以粗體字母標(biāo)出。保守氨基酸殘基用星號(hào)指出。如下預(yù)測(cè)根據(jù)來(lái)自人的參考序列(CAA75344，來(lái)自人的^1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶)的相似性BAD17812(來(lái)自稻的推定的P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶)=17%;NP174003(來(lái)自擬南芥的推定的P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶)=16%;PpGalTl(來(lái)自小立碗蘚的P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶1)=15%;Pp-GalT2(來(lái)自小立碗蘚的P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶2)=16%;圖2顯示了從來(lái)自小立碗蘚的P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶1基因的編碼DNA序列預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)序列。跨膜結(jié)構(gòu)域通過(guò)粗體字母標(biāo)出；和圖3顯示了從來(lái)自小立碗蘚的P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶2基因的編碼DNA序列預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)序列?？缒そY(jié)構(gòu)域通過(guò)粗體字母標(biāo)出；圖4顯示了來(lái)自小立碗蘚的P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶1基因的選擇性剪接變體的蛋白質(zhì)序列。額外的55個(gè)氨基酸的剪接插入序列用粗體字標(biāo)出。圖5顯示了來(lái)自小立碗蘚的pi，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶2基因的選擇性剪接變體的蛋白質(zhì)序列。額外的50個(gè)氨基酸的剪接插入序列用粗體字標(biāo)出。實(shí)施例方法和材料植物材料使用在N-聚糖的核心結(jié)構(gòu)中缺少巖藻糖和木糖殘基的小立碗蘚的糖改造的雙敲除林系(Koprivova等人2004PlantBiotechnol.J.2，517-523)。標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件植物在無(wú)菌條件下在植物無(wú)機(jī)液體修飾Knop培養(yǎng)基(100Gmg/1Ca(N03)2x4H20250mg/1KCl，250mg/1KH2P04，250mg/1MgS04x7H20和12.5mg/1FeS04X7H20;pH5.8(Reski和Abel(1985)Planta165,354-358)中無(wú)菌生長(zhǎng)。植物生長(zhǎng)在含有200ml培養(yǎng)基的500ml錐形瓶中并且將錐形瓶在CertomatR搖床(B.BraunBiotechInternational,德國(guó))上以120rpm搖動(dòng)。生長(zhǎng)室中的條件為25+/-3°C和16:8h的光暗方案。通過(guò)兩個(gè)熒光管(OsramL58W/25)從上面為錐形瓶照明，提供35微摩爾—V2。通過(guò)用Ultra-Turrax勻漿器(IKA，Staufen，德國(guó))崩解將并接種含有100ml新鮮Knop培養(yǎng)基的兩個(gè)新的500ml錐形瓶，對(duì)培養(yǎng)物每周亞培養(yǎng)一次。原生質(zhì)體分離過(guò)濾后，將蘚類原絲體在0.5M甘露醇中預(yù)培育。30分鐘后，向該懸浮液加入4%崩潰酶(Driselase)(Sigma，Deisenhofen，德國(guó))。將崩潰酶溶解于0.5M甘露醇(pH5.6-5.8)中，以3600rpm離心10分鐘并通過(guò)穿過(guò)0.22微米濾器(MillexGP，MilliporeCorporation,USA)除菌。將含有1%崩潰酶(終濃度)的懸浮液在黑暗中室溫下溫育并溫和攪拌(在溫育2小時(shí)后達(dá)到最佳的原生質(zhì)體產(chǎn)率)Schaefer，"PrinciplesandprotocolsforthemossPhyscomitrellapatens"，(May2001)InstituteofEcology,LaboratoryofPlantCellGenetics,UniversityofLausa腸。將懸浮液穿過(guò)具有100微米和50微米孔徑的濾網(wǎng)(Wilson,CLF，德國(guó))。將懸浮液在無(wú)菌離心管中離心并且以55g在室溫下沉降原生質(zhì)體10分鐘(加速3;減速3;Multifuge3S-R，Kendro,德國(guó))(Schaefer,同上)。將原生質(zhì)體溫和重懸浮在3M培養(yǎng)基(15mMMgCl2x2H20;0.1%MES;0.48M甘露醇；pH5.6;540m0sm;過(guò)濾除菌，Schaefer等人(1991)MolGenGenet226，418-424)中。再次以55g在室溫下離心懸浮液IO分鐘(加速3;減速3;Multifuge3S-R，Kendro，德國(guó))。將原生質(zhì)體溫和重懸浮在3M培養(yǎng)基((15mMMgCl2x2H20;0.1%MES;0.48M甘露醇；pH5.6;540raOsm;過(guò)濾除菌，Schaefer等人(199DMolGenGenet226，418-424)中。為了計(jì)數(shù)原生質(zhì)體，將小體積的懸浮液轉(zhuǎn)移到Fuchs-Rosenthal-室中。轉(zhuǎn)化方案為了轉(zhuǎn)化，將原生質(zhì)體在冰上黑暗中溫育30分鐘。隨后，通過(guò)室溫下以55g沉降原生質(zhì)體10分鐘(加速3;減速3;Multifuge3S-R，Kendro)。將原生質(zhì)體以1.2x106個(gè)原生質(zhì)體/ml的濃度重懸浮在3M培養(yǎng)基(15mMMgChx2H20;0.1%MES;0.48M甘露醇；pH5.6;540mOsffl;過(guò)濾除菌，Schaefer等人(199DMolGenGenet226，418-424)中(ReutterandReski(1996)Productionofaheterologousproteininbioreactorculturesoffullydifferentiatedmossplants,PI.TissuecultureandBiotech.，2，pp.142-147)。將25微升該原生質(zhì)體懸浮液分配到新的無(wú)菌離心管中，加入5微升DNA溶液(在H20中柱純化的DNA(Qiagen，Hilden，德國(guó))；10-IOO微升；最佳DNA量為6微克)，并最后加入25微升PEG溶液(高壓滅菌后40%PEG4000;0.4M甘露醇；0.1MCa(N03)2;pH6)。將懸浮液立即但是溫和混合，然后在室溫并偶爾溫和混合下溫育6分鐘。通過(guò)加入l、2、3和4ml3M培養(yǎng)基漸近式稀釋?xiě)腋∫骸Ｔ?0。C以55g離心懸浮液10分鐘(加速3;減速3;Multifuge3S-R，35生培養(yǎng)基(改進(jìn)的Knop培養(yǎng)基；5%葡萄糖；3%甘露醇；540mOsm;pH5.6-5.8)中重懸浮沉淀物。如Strepp等人(1998)ProcNatlAcadSciUSA95，4368-4373)所述的進(jìn)行再生。通過(guò)分子篩選鑒定轉(zhuǎn)基因克隆。蘚類植物聚糖的MALDI-TofMS將植物材料在液體培養(yǎng)物中培養(yǎng)，過(guò)濾分離，在液氮中冷凍并在-80。C保存。該材料在干冰下運(yùn)輸。在Prof.Dr.F.Altmann，Glycobio-logyDivision,InstitutfiirChemie，UniversitStftirBodenkultur，Vienna,Austria的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行MALDI-TOFMS分析。用胃蛋白酶消化轉(zhuǎn)基因0.2到0.5g鮮重的小立碗蘚材料。如Wilson等人(2001)所述從消化物得到N-聚糖。基本上，通過(guò)用肽N-聚糖酶A處理來(lái)釋放聚糖并通過(guò)MALDI-TOF質(zhì)譜法在DYNAMO(The函BioAnalysis，SantaFe，NM)上分析。1.鑒定P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因盡管沒(méi)有描述來(lái)自人類的(31，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(P-1，3galT)在N-聚糖結(jié)構(gòu)的延長(zhǎng)方面的生物功能性，但是選擇人的P-1，3galT2(檢索號(hào)CAA75344)的序列作為起始序列?；贖e腦t(2002Cell.Mol.LifeSci.59,1081-1095)所述的7個(gè)保守結(jié)構(gòu)域并結(jié)合Amado等人(1998J.Biol.Chem.273，12770-12778)所述的保守氨基酸，進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)篩選。由于該策略，鑒定了被描述為推定的P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的來(lái)自擬南芥的一個(gè)序列(檢索號(hào)NP174003)和來(lái)自稻的一個(gè)序列(檢索號(hào)BAD17812)。盡管對(duì)于這兩個(gè)物種，在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中列出了推定的P1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的許多蛋白質(zhì)序列，但是只有這兩個(gè)序列在7個(gè)保守結(jié)構(gòu)域和一些高度保守的額外氨基酸這兩方面顯示出相似性。然而，如果與CAA75344比較，這兩個(gè)序列的總體同一性是非常低的，在NP174003的情況下，總體同一性為16%，在BADl"n的情況下為17%(圖1)。所有三個(gè)蛋白質(zhì)序列都用于篩選小立碗蘚數(shù)據(jù)庫(kù)的非公共"表達(dá)序列標(biāo)簽"(EST)。鑒定了表達(dá)序列標(biāo)記，其編碼包含與131，3-半乳36糖基轉(zhuǎn)移酶的7個(gè)保守結(jié)構(gòu)域具有一定相似性的肽序列。該EST用于設(shè)計(jì)引物用于克隆目的和對(duì)包含小立碗蘚的基因組序列的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步篩選P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因家族。所得的序列包含兩個(gè)推定的01，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因，其包括內(nèi)含子和外顯子序列和基因結(jié)構(gòu)((3-1，3galT1對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:1和SEQIDNO:3并且P-1，3galT2對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2和SEQIDNO:4)。從開(kāi)放閱讀框預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)序列(p1，3-GalT1(圖2)和P1，3-GalT2(圖3)包含跨膜結(jié)構(gòu)域、7個(gè)保守結(jié)構(gòu)域和許多保守氨基酸(圖1)。1.1從小立碗蘚克隆P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶1基因的編碼序列通過(guò)PCR用cDNA和引物M0B1251,(SEQIDNO:5:5'-CTGAATATCCGTGGCCAA-3。和引物MOB1410(SEQIDNO:6:5'-TTCGAGCTCATGAAGAGGGGGTCGAGACT-3')從小立碗蘚擴(kuò)增編碼P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列(SEQIDNO:1:5'AGTTGTCGATTTGTTGTTTTTGATATGTAAGGCGGT-tgttttcgccaacagaactgacatcatttggattttttttacgcgtggatgtgc-cctctttttaaaaaatttccgcgtggaanagagacgggggtttgtaatggaggcaggctgtg-gtcatcacccctagtatagcctgtcaagagagttcaaattcggtaatatgAagagggggtc-gagactaccggatatggcgtgtacagggcggcaaagaaatgatcttatcctagttgcaat-tgtttgcttgttttttatggtgatattcatcccaccatatctccaaatgaactcacttccgga-cattgattctcctgattcggacaagaaatcatcaagctactcgaaaaaaaccactctagaagccaatagtaag-gaggaacgccgtagtccggggaataccacaggcgacattgtttctctggatgatgtgatag-atcgtgcctggtctgctggtgccaaagcgtgggaagaactggaaactgcgttaagaaatg-gagaaggtgtctcaaagaatgtcagtaatgccactgcaaatgctgatccgtgtccagcat-cactctctgcagcagggaaaaagttagacgaattgggtaaagtcttccccttgccctgtg-gtctaatgtttgggtcagccattactctgattggaaagcctcgagaggctcacatg-gagtacaaaccgccaatcgccagagttggggaaggcgtctctccatatgtcatg-gtttcccagttcttagtagagttacaaggcttaaaggtggtgaaaggtgaag-atcctcctcgaattctacacttgaatcctcgacttcgtggtgattggagctggaaacccat-cattgagcacaacacttgttatcggaaccagtggggtcctgcccaccgatgcgagggttg-gcaagtgcctgaatacgaagaaactgttgacggtcttcccaagtgcgagaagtggcttcgag-atgatggcaagaaacctgcttcaacgcaaaaatcttggtggcttggaagattagttg-gtcgttctgacaaggagacgcttgaatgggagtacccattatctgagggtcgg-catcagctcgtttccttatcgtgtgggttacgctgtggaagaaacaacggggata-taccaagatagatttatttattgggatcatgtccagcagtaaccattttgcagaacggatg-gcagtaaggaagacgtggtttcaatctaaagctattcaatcttcgcaggccgtg-gctcgcttctttgtagctctgcatgcaaacaaggatatcaatatgcagttgaagaaggag-gacgatgggaaatgctgcaacttgtgaggaaaatacatacaatgaatgtgttcaacg-gtctttaccagacagaattactttgggtcgggaaccagatatagcagacagctca-cattcaattcagccgtgttgatccagaggggtaattgatagtttccttgtcccctaccctctc-tagaggtggagatcttacaacttaatcaaatgatcctctgcaatgtcacttgtcacaatact-TAGTATAGCTCAAAAI2GGCCACGGATATTCAGGAATGTTCATCTTGTAAGGTCGCAGCTTGT-ATCGTCAGAATCAGTGTTTTCGACACTCCCCGGTGGAGTATTTTTTCGATTCTCT-TGATTCCACTCAAGTGGTACTAGCTTATATTTAGTGAGGCCTGGAACCCAAGTAGT-GAGACATGGTTAGGATTTAGTGTTCAAAATCTG3',.起始和終止密碼子用粗體字母指出)。將擴(kuò)增產(chǎn)物用SacI和MscI消化并克隆到SacI/SmaI消化的載體pRTlOl(Toepfer等人1987NAR15，5890)中。通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證克隆的序列。1.2從小立碗蘚克隆p1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶2基因的編碼序列通過(guò)PCR用cDNA和引物PpP1-3GalT2for(SEQIDNO:7:5'-TACGAGCTCATGAAGAGGG-GTGTGAGACC-3。和引物Pp(3卜3GalT2rev(SEQIDNO:8:5'-GTAGAGCTCTCACAAGGTGCAGCACTTG-V)從小立碗蘚擴(kuò)增編碼01，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列(SEQIDNO:2:5'-GAATTCACTTCCCGATATTGATTCCCCTGTTTTGGAGAAGAAAGTAT-CAAAGCTTGGGAAGAGCTGGAAATTGCATTCAGACAGGGAGAACATTTTTCGAAGAAG-CACCTTTACCAACAGGCAAGATAGAGTTATTTGTTGGAATCATGTCAAGCAGCAAT-CACTTTGCAGAACGTATGGCAGTAAGAAAGACGTGGTTTCAGTCTCTGGT-TCAATCTGCAGCTGMGAAAGAGGCTGACTATTACGGCGATA-TGATAATTTTACCTTTCATCGACAGATATGATATAGTGGTTCTTAAGACCGT-TGAAATTTTCAAGTTTGGGGTCCAGAATGTTACAGTTAGCCA;GTCATGAAATGTGACGAT-GACACATTTGTAAGGATTGACAGCGTTCTTGAAGAGATTCGAACGACGTCAGTAGGACAGG-GCCTTTACATGGGCAGCATGAATGAGTTTCATAGACCCCTTCGTTCTGGGAAGTGGGCCGT-GACAGTTGAGGAGTGGCCTGAGCGCATTTACCCAACATACGCAAATGGTCCAGGATA-CATCCTTTCGGAAGATATTGTGCATTTTATAGTGGAGGAGAGCAAAAGAAATAATTTGAGGT-TATTTAAGATGGAGGACGTCAGCGTAGGTATATGGGTACGCGAGTATGCAAAGAT-GAAGTACGTGCAATACGAGCATAGCGTACGGTTTGCTCAAGCCGGTTGTATACCTAACTACCT-GACAGCGCACTATCAATCGCCGCGTCAAATGCTGTGTCTGTGGGACAAGGTGCTTGCTAC-CAATGACGGCAAGTGCTGCACCTTGTGA-3'起始和終止密碼子用粗體字母指出)。將擴(kuò)增產(chǎn)物用SacI消化并克隆到SacI消化的載體pRTl(U(Toepfer等人1987NAR15，5890)中。通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證克隆的序列。2.1從小立碗蘚產(chǎn)生P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶1基因的敲除構(gòu)建體通過(guò)用來(lái)自小立碗蘚的基因組DM進(jìn)行的PCR產(chǎn)生小立碗蘚的P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶1基因的定向基因破壞的敲除構(gòu)建體。在一個(gè)PCR中，用引物MOB1336(SEQIDNO:9:5'-TACGGATCCAACTTCGAGTTCGTGTCTGTA-30和引物MOB1333(SEQIDNO:10:5'-ACACTAAGGTTCTAATCAATGTCCGGAAGTGAG-30擴(kuò)增敲除構(gòu)建體的5，部分。在第二個(gè)PCR中，用引物MOB1334(SEQIDNO:11:TTAGAAGCTTAGTGTACGCTGAGTGTCTACATTG-30和引物MOB1335(SEQIDNO:12:5'-CATTGTCGACCCTACACAGCTCTTAACGTCTAC-30擴(kuò)增敲除構(gòu)建體的3，部分。將兩種擴(kuò)增的構(gòu)建體都用Hindill(在引物序列MOB1333和MOB1334中以粗體字母指出限制酶位點(diǎn))消化并在隨后的連接反應(yīng)中用T4DNA連接酶連接。所得的連接和純化的DNA序列用作模板用于用引物MOB1336和MOB1335進(jìn)行進(jìn)一步的PCR。所得的擴(kuò)增產(chǎn)物P1-3GalTlko(SEQIDNO:13:5'—CAACTT.C-40GAGTTCGTGTCTGTATGAAGAAGTCCACGGGTTCAATGTGTTAAGACTTAGGC-TAGACCATGATTGGTTTATTACAGTGGTCATTCAAATCCTATTTGATTTGAGAAT-GTATTTACTTCGTTGTGTTGGGAGATGATTGTTCCCTCGAATTCTATGCGGTAGCTAC-GTTTTTGTGATTGTGTGTTCAAGTTTGGTGCAGTATTGTTAAAATTTGGGTGAT-TAGGCTGACGGTAAATGTCTGTGGATGTAGCCTAGTGATGTATTTGATCTCG-GAGTACCTTCGCATGTTCAACGTGAACTGAATTATGTTAATTAAGCTGAGCAA—TGTTTTTTATGGTGATATTCATCCCACCATATCTCCAAATGAACTCACTTCCGGACAT-TGATTAGAAGCTTAGTGTACGCTGAGTGTCTACATTGTGTATTGAATGTTCCTTAGAAT-TGTTTGTTTGTTTATGTTTTTATTTTTATATTTCTGCCGGCTATTGAGGAAGAATA-CATTCAAATTGTTCAGGATTCGGACAAGAAATCATCAAGCTACTCGAAAAAAACCACTCTA-GCGTTAAGAAATGGAGAAGGTGTCTCAAAGAATGTCAGTAATGCCACTGCAAATGCTG-ATCCGTGTCCAGCATCACTCTCTGCAGCAGGGAAAAAGTTAGACGAATTGG-GAAAGCCTCGAGAGGCTCACATGGAGTACAAACCGCCAATCGCCftGAGTTGGGGAAG-GAGGGTTGGCAAGTGCCTGAATACGAAGAAACTGGTGAGTGCTGATTCCACCGCAC--3';HindIII限制酶位點(diǎn)以粗體字母指出)相對(duì)于小立碗蘚的P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因1的基因組序列包含270bp的缺失，其此外在對(duì)應(yīng)cDNA的早期5，部分啟動(dòng)終止密碼子。從而，當(dāng)通過(guò)同源重組整合到小立碗蘚的基因組中時(shí)得到功能異常的P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因。該敲除構(gòu)建體用于單獨(dú)或者與敲除構(gòu)建體pl-3GalT2ko(見(jiàn)2.2)一起轉(zhuǎn)化小立碗蘚。使用合適的引物組合通過(guò)PCR進(jìn)行推定的轉(zhuǎn)化植物的篩選。2,2從小立碗蘚產(chǎn)生|31，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶2基因的敲除構(gòu)建體通過(guò)用來(lái)自小立碗蘚的基因組DNA進(jìn)行的PCR產(chǎn)生小立碗蘚的P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶2基因的定向基因破壞的敲除構(gòu)建體。在一個(gè)PCR中，用引物MOB1339(SEQIDNO:14:-TGGCACGATACAGTGGCATGA-30和引物MOB1337(SEQIDNO:15:5'-TGGAATTGATTCAAGAAACGGTGGGATGA-30擴(kuò)增敲除構(gòu)建體的5，部分。在第二個(gè)PCR中，引物MOB1338(SEQIDNO:16:5'-TGAATTGCATAACGAAGACACCGTCTA-30和引物M0B1313(SEQIDNO:17:5'-CAAGCAGCGGAGACCTTGCAATGC-3')用于擴(kuò)增敲除構(gòu)建體的3，部分。兩個(gè)擴(kuò)增的構(gòu)建體都用EcoRI(引物序列MOB1337和MOB1338中的限制酶位點(diǎn)用粗體字母指出)消化并在隨后的連接反應(yīng)中用T4DNA連接酶連接。所得的連接和純化的DM序列用作模板用于用引物MOB1339和MOB1313進(jìn)行進(jìn)一步的PCR。所得的擴(kuò)增產(chǎn)物Pl-3GalHko(SEQIDNO:18:5'-TGGCACGATACAGTGGCATGAGATTTATCGCT-GCCAAACTGTGGACAATGATGTTTGAAACAGTCTATTCATCACTGGTTGGCAAATTCTAT-GTACAGGGCTAAAAGGGCCAAACTAGGCTTAACAGCAGTGATCGAGGTTCTTGAGCAGGAT-TACGAAACAGTGACATTTATAAGCTTTGTGTCGTCACTACTTTGAGCCTTCAGAGTA-GATTAGAGTGATCACTTTGATCCTTTTGCAAACGCTGAAAGGAGTAAGTCTGATTGT-GAGTGGCGTACAAGTGATCCAGAAAGCAAGAATCATG-CGGGTGTGGGATGTACAGGGCGGCAAAGAAACAATCTAATCATAGTGGCAATCATATGTTTGGTTTTTATAGCGATATTCATCCCACCGTTTCTTGAAT-GAATTCCATAACGAAGACACCGTCTAAAGCTTCACAGGTTAGTGCAGAAATGATTGGTTCGC-GTTTTGGAGAAGAAAGTATCAAGCTATTTGAAAAAAGTCACTCTGGAAACTTACAGTAAAGAG-GAACGCCGTAGTCCAGGGAACACAACAGGTGACATTGTTTCGCTGGAAGATGTGATAG-ATCGCGCCTGGTCTGCCGGCGCCAAAGCTTGGGAAGAGCTGGAAATTGCATTCAGACAGG-GAGAACATTTTTCGAAGAAGGACAATAATGCCAATGCAACTGCAGATCCATGCCCAGCAT-GTCTAATGTTTGGATCAGCCATAACTCTCATTGGAAAGCCACGGGAAGCTCACATG-AGTTCATAATGGAGTTACAGGGCTTGAAGGTGGTAAAAGGTGAAGATCCTCCTA-GAATCCTCCACATAAACCCTCGACTCCGTGGTGACTGGAGCTGGAAACCCATCAT-TGAGCATAATACATGCTATCGAAACCAGTGGGGCCCAGCTCATCGGTGTGAAGGTTG-GCAAGTACCTGAATACGAAGAAACCGGTGAGTGCTGGTTCCAT-TG-3';EcoRI限制酶位點(diǎn)以粗體字母指出)相對(duì)于小立碗蘚的P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因2的基因組序列包含148bp的缺失，其此外在對(duì)應(yīng)cDM的早期5，部分啟動(dòng)終止密碼子。從而，當(dāng)通過(guò)同源重組整合到小立碗蘚的基因組中時(shí)得到功能異常的P1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因。該敲除構(gòu)建體用于單獨(dú)或者與敲除構(gòu)建體P卜3GalTlko(見(jiàn)2.1)組合轉(zhuǎn)化小立碗蘚。使用合適的引物組合通過(guò)PCR進(jìn)行推定的轉(zhuǎn)化植物的篩選。3.MALDI-TOF質(zhì)i普法缺少植物特異性核心oc1，3巖藻糖和P1，2木糖殘基的糖改造的小立碗蘚林系的N-聚糖-本文用作對(duì)照-顯示出在這種林系中加工的植物N-聚糖的典型的結(jié)構(gòu)特征，如Koprivova等人2004PlantBiotechnol.J.2，517-523)中所述；即沒(méi)有與Asn結(jié)合的GlcNAc的oc1,3-連接的巖藻糖，并且沒(méi)有與P甘露糖殘基Pi,2-連接的木糖，路易斯a表位(與GlcNAc連接的oc1,4-巖藻糖基和P1，3-半乳糖基殘基)作為非還原末端成分(表1)。相比，在額外包含P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶1和P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶2基因的定向基因破壞的糖改造的小立碗蘚林系分離的N-聚糖上沒(méi)有檢測(cè)到路易斯a表位(與GlcMc連接的a1，4-巖藻糖基和P1，3-半乳糖基殘基)。43<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>表l:雙敲除體和四敲除體小立碗蘚林系的N-聚糖結(jié)構(gòu)。從相同條件(100ml培養(yǎng)瓶，Knop培養(yǎng)基)下生長(zhǎng)的植物材料分離N-聚糖，殘基，GF-包含巖藻糖和半乳糖(P1，3-連接的)的路易斯a結(jié)構(gòu)，Gn-N-乙酰葡糖胺，M/Man-甘露糖SEQIDNO:1cDNApi-3GalTlGTCCAGCAGTAACCATTTTGCAGAACGGATGGCAGTAAGGAAGACGTG-TGTCCCCTACCCTCTCTAGAGGTGGAGATCTTACAACTTAATCAAATGATCCTCTGCAATGTCACTTGT-racAATACTTAGTATAGCTCAAAATTGGCCACGGATATTCAGGAATGTTCATCTTGTAAGGTCGCAGCTTGT-TGGTGAAGAGACATGGTTAGGATTTAGTGTTCAAAATCTGSEQIDNO:2cDNAPpPl-3GalT2ATGAAGAGGGGTGTGAGACCACCGGGTGTGGGATGTACAGGGCGGCAAAGAAACAATCTAAT-CATAGTGGCAATCATATGTTTGGTTTTTATAGCGATATTCATCCCACCGTTTCTTGAAAT-GAATTCACTTCCCGATATTGATTCCCCTGTTTTGGAGAAGAAAGTAT-CAAGCTATTTGAAAAAAGTCACTCTGGAAACTTACAGTAAAGAGGAACGCCGTAGTCCAGG-GAACACAACAGGTGACATTGTTTCGCTGGAAGATGTGATAGATCGCGCCTGGTCTGCCGGCGC-CAAAGCTTGGGAAGAGCTGGAAATTGCATTCAGACAGGGAGAACATTTTTCGAAGAAG-GACAATAATGCCAATGCAACTGCAGATCCATGCCCAGCATCACTCTTTACAACAGGAAAG-GAATTGGACAATTTAGGAAGGGTCTTCCCACTGCCTTGTGGTCTAATGTTTGGATCAGC-TGGGGAAGGTGTCTCTCCATACGTCATGGTGTCCCAGTTCATAATGGAGTTACAGGGCT-TGAAGGTGGTAAAAGGTGAAGATCCTCCTAGAATCCTCCACATAAACCCTCGACTCCGTGGTGACTG-GTGTGAAGGTTGGCAAGTACCTGAATACGAAGAAACCGTGGACGGTCTTCCCAAGTGC-GCGATTAGTTGGTCATTCCGACAAGGAGACGCTTGAATGGGAGTATCCATTGTCCGAAG-CACTTTGCAGAACGTATGGCAGTAAGAAAGACGTGGTTTCAGTCTCTGGT-TATCCAATCCTCCCAAGCGGTGGCTCGCTTCTTTGTAGCTCTGCATGCAAACAAGGATA-TCAATCTGCAGCTGAAGAAAGAGGCTGACTATTACGGCGATA-TGATAATTTTACCTTTCATCGACAGATATGATATAGTGGTTCTTAAGACCGT-TGAAATTTTCAAGTTTGGGGTCCAGAATGTTACAGTTAGCCACGTCATGAAATGTGACGAT-GACACATTTGTAAGGATTGACAGCGTTCTTGAAGAGATTCGAACGACGTCAGTAGGACAGG-GCCTTTACATGGGCAGCATGAATGAGTTTCATAGACCCCTTCGTTCTGGGAAGTGGGCCGT-46<formula>formulaseeoriginaldocumentpage47</formula>CGTAGTCCGGGGAATACCACAGGCGACATTGTTTCTCTGGATGATGTGATAGATCGTGCCTGGTCTGCTGGTGOGCAAATGCTGATCCGTGTCCAGCATCACTCTCTGCA(3CAGGGAAAAAGTTAGACGAATTGGGTAAAGTCTTCCCCT-GCCTGAATACGAAGAAACTGgtgagtgctgattccaccgcaccagtttgtgttttttatgctgacactatgcttct-GAGTTCGTTCTCACCATTCGAGCAGGTGTTGAAGGGTTTCATGTGACTATCGATGGTCGTCACAT—gtctttcttttttctttttttcttttttattttctggagggggggggggtaatgcaaat—tacgaaagttcatttgtattatcaacaatggaataacaataatgacggccccatccttcagacaccaggaacattacctataccagactacgtct-gggtaagtctgaagaattaattataaccaagaaactagttgtattcactgtttttctttttacgcccat—tatttttaaagcaacgaattgataaataaataacatattaat—gtttttaactttaaagtttttttcccgtatttagtataagatttcgtcaaaacgattaggtgattagatcgaacat-tatctaattgcactctacttatatgatatgaagagtaatttctcttagcagaagctacatcctgctatttccttgg-attagtttaagggtatcgttgtgatgtgtgtctagttagtcttaaaatctgtgcaaatcgattcat—caaatctcattaactttcgaattattagtgatcatctacataagtggtctgttgattgctgaaaggtggctgt-tgcgtatttaactttttcggtgaatgtcttattgaattgtgatgtagCATGCAAACAAGGATATCAATATGCAGT-gcaatttggggatggtgataatgaggcttgataccaactgaaggttaggtgacttttaacactaggttctgct-tactgtgcagGTCCAGAATGTCACAGCTAAGTATATTATGAAGTGTGACGATGACACTTTTGTGAGGAT-TGATAGCGTTCTCGAAGAGATTCGAACTACTTCAATATCACAAGGCCTTTACATGGGTAGCATGAAT-attgcaaggatttatttg-gcatcgtttgttaaatgcatttttcaattttcttttgcttaaaatatctctgttgtcgatatctcctcatgatct-tgcattgtgaacatgagaagatatgaaatgtgaactcaatattcttctatgatcatgtgcagTTATTTAAGATG-TATCAATCCCTCTTAGCATCAGTGATCGTCAGAATCAGTGTTTTCGACACTCCCCGGTG-GATTTAGTGTTCAAAATCTG3SEQIDNO:4基因組DNAPp(U-3GalT2gtgtataggttagaaggta仁taact:tcgcttcacatagacgtcgctatcaagaacaggattcacgtgtcagt—tacagtggctatggacagccagatatgccatcaactggtgatgaagacataacgaagacac—cgtctaaagcttcacaggttagtgcagaaatgattggtt:cgccctcgctatgccagtcaggcttactgagttc-49GGGGCCCAGCTCATCGGTGTGAAGGTTGGCAAGTACCTGAATACGAAGAAACCGgtgagtgctggttCCat-cacactttatcttttcatagtgacacggttctttttaggtgtac:tagtgttgaaagctgtgcatgttaaatg-TGAATGGGAGTATCCATTGTCCGAAGGTCGGGAGTTTGTTCTCACCATTCGAGCAGGTGTAGAAGGATTTCACT-atgaggtttaccgcaggtatatttggtctcattgtcaagtgtgtgtgtgtgtgt-tagaatttgaacagcactacttacttaccatttttaatgaatcccttgttgggttgtgatgcagCATGCAAACAAG-TGATATAGTGGTTCTTAAGACCGTTGAAATTTTCAAGTTTGGGgtaagcgaat—gaggttcgatgctgattaaagcttaggtgatttaaaagcacggtgttgcttgctatgcagGTCCAGAATGT-TACAGTTAGCCACGTCATGAAATGTGACGATGACACATTTGTAAGGATTGACAGCGTTCTTGAA-tatteatttcttctgaaatctcaagaaaaatgaaaaatgcttgagaaacgctcgtagccgtatcacattat-gcgaattccaaaaaagaatgtggaacaaaagttctt:gtgaaaataattgata仁g仁tcaaattgtacacatttat—gcactaag3taagatatgtgca3at3gtgccttccagtggtctagaaaatgcttgtttttttttg-gaagctttaactttatttagcttgaacatcttgtttgagggttggtgaccaagta3gaag-gtccatacaagacaataaatggattggttcgtgcatgtacagGAGTGGCCTGAGCGCATTTACCCAA-CATACGCAAATGGTCCAGGATACATCCTTTCGGAAGATATTGTGCATTTTATAGTGGAGGA-tgaaaccttcatcttggacagttttccatccatgtatctcctgtcattataattgcattatagaactgttcgcgt-gctttctgttgaccttatattgtggatatgtatctcttcagtactacggagacgatatgaaacataagtttgata-ATGAAGTACGTGCAATACGAGCATAGCGTACGGTTTGCTCAAGCCGGTTGTATACCTAACTACCT-GCTGCACCTTGTGASEQIDNO-24cDNApi,3-GalTl選擇性剪接變體以粗體字母顯示165個(gè)核苷酸剪接插入序列(nt471-653)ATGCGAGGAGGAGGCTGTGTTTGTTGCCCGAAGAGATGGGATGGTTTATGTGTAGTGCAGGGGTTGGATGTGAAGCACCTGTTTGAAGGAGTCTGCGAGAGTTTGAAATTCGGATTCAGAGTGCGGCGATCGATGGTGCAACGTTGTTAGCAGTGATTGTTTTCGCCAACAGAACTGACATCATTTGGATTTTTTTTACGCGTGGATGTGCCCTCTTTTTAAAAAATTTCCGCGTGGAAAAGAGACGGGGGTTTGTAATGGAGGCAGGCTGTGGTCATCACCCCTAGTATAGCCTGTCAAGAGAGTTCAAATTCGGTAATATOAAGAGGGGGTCGAGACTACCGGATATGGCGTGTACAGGGCGGCAAAGAAATGATCTTATCCTAGTTGCAATTGTTTGCTTGTTTTTTATGGTGATATTCATCCCACCATATCTCCAAATGAACTCACTTCCGGACATTGATTCTCCTGTCGAGAAGCTAGAAGATGATGATGATGCTGTCTTCACTTCTCATAGACGTCGTAACCAAGAGCAGArTTCAGTTGTCACTGACAGTGGTCAGAGACGGACAGTTATGCCATCTTCGACTGGTGCGGAGGACGTAACGAATGCACCGTCTAAAGATTCACAGGATTCGGACAAGAAATCATCAAGCTACTCGAAAAAAACCACTCTAGAAGCCAATAGTAAGGAGGAACGCCGTAGTCCGGGGAATACCACAGGCGACATTGTTTCTCTGGATGATGTGATAGATCGTGCCTGGTCTGCTGGTGCCAAAGCGTGGGAAGAACTGGAAACTGCGTTAAGAAATGGAGAAGGTGTCTCAAAGAATGTCAGTAATGCCACTGCAAATGCTGATCCGTGTCCAGCATCACTCTCTGCAGCAGGGAAAAAGTTAGACGAATTGGGTAAAGTCTTCCCCTTGCCCTGTGGTCTAATGTTTGGGTCAGCCATTACTCTGATTGGAAAGCCTCGAGAGGCTCACATGGAGTACAAACCGCCAATCGCCAGAGTTGGGGAAGGCGTCTCTCCATATGTCATGGTTTCCCAGTTCTTAGTAGAGTTACAAGGCT丁AAAGGTGGTGAAAGGTGAAGATCCTCCTCGAATTCTACACTTGAATCCTCGACTTCGTGGTGATTGGAGCTGGAAACCCATCATTGAGCACAACACTTGTTATCGGAACCAGTGGGGTCCTGCCCACCGATGCGAGGGTTGGCAAGTGCCTGAATACGAAGAAACTGTTGACGGTCTTCCCAAGTGCGAGAAGTGGCTTCGAGATGATGGCAAGAAACCTGCTTCAACGCAAAAATCTTGGTGGCTTGGAAGATTAGTTGGTCGTTCTGACAAGGAGACGCTTGAATGGGAGTACCCATTATCTGAGGGTCGGGAGTTCGTTCTCACCATTCGAGCAGGTGTTGAAGGGTTTCATGTGACTATCGATGGTCGTCACATCAGCTCGTTTCCTTATCGTGTGGGTTACGCTGTGGAAGAAACAACGGGGATATTAGTAGCAGGAGACGTTGATGTGATGTCTATCACAGTGACATCCCTACCCTTAACACATCCTAGCTACTACCCTGAGTTAGTTTTGGAATCGGGGGACATTTGGAAGGCACCACCTGTCCCAGCTACCAAGATAGATTTATTTATTGGGATCATGTCCAGCAGTAACCATTTTGCAGAACGGATGGCAGTAAGGAAGACGTGGTTTCAATCTAAAGCTATTCAATCTTCGCAGGCCGTGGCTCGCTTCTTTGTAGCTCTGCATGCAAACAAGGATATCAATATGCAGTTGAAGAAGGAGGCAGACTATTATGGCGATATTATAATCCTGCCTTTCATCGACAGATATGATATAGTGGTTCTCAAGACCGTTGAAATTTGCAAGTTTGGGGTCCAGAATGTCACAGCTAAGTATATTATGAAGTGTGACGATGACACTTTTGTGAGGATTGATAGCGTTCTCGAAGAGATTCGAACTACTTCAATMCACAAGGCCTTTACATGGGTAGCATGAATGAGTTTCACAGGCCTCTTCGTTCTGGAAAGTGGGCCGTGACTGCCGAGGAATGGCCTGAGCGAATTTACCCAATATATGCTAATGGACCAGGATATATCCTGTCAGAGGATATTGTGCATTTCATTGTGGAGATGAATGAGAGAGGCAGTTTGCAGTTATTTAAGATGGAGGACGTCAGTGTTGGAATATGGGTACGCGAATATGCGAAGCAAGTGAAGCACGTTCAATACGAACATAGCATACGGTTTGCTCAAGCCGGTTGTATACCGAAATACTTGACAGCTCATTACCAATCGCCGCGTCAAATGCTGTGTCTGTGGGACAAGGTACTTGCTCATGACGATGGGAAATGCTGCAACTTGTGASEQIDNO:25cDNApl,3-GalT2選擇性剪接變體以粗體字母顯示150個(gè)核苷酸剪接插入序列(ntl51-300)ATGAAGAGGGGTGTGAGACCACCGGGTGTGGGATGTACAGGGCGGCAAAGAAACAATCTAATCATAGTGGCAATCATATGTTTGGTTTTTATAGCGATATTCATCCCACCGTTTCTTGAAATGAATTCACTTCCCGATATTGATTCCCCTGTGTATAGGTTAGAAGGTATTAACTTCGCTTCACATAGACGTCGCTATCAAGAACAGGATTCACGTGTCAGTTACAGTGGCTATGGACAGCCAGATATGCCATCAACTGGTGATGAAGACATAACGAAGACACCGTCTAAAGCTTCACAGGTTTTGGAGAAGAAAGTATCAAGCTATTTGAAAAAAGTCACTCTGGAAACTTACAGTAAAGAGGAACGCCGTAGTCCAGGGAACACAACAGGTGACATTGTTTCGCTGGAAGATGTGATAGATCGCGCCTGGTCTGCCGGCGCCAAAGCTTGGGAAGAGCTGGAAATTGCATTCAGACAGGGAGAACATTTTTCGAAGAAGGACAATAATGCCAATGCAACTGCAGATCCATGCCCAGCATCACTCTTTACAACAGGAAAGGAATTGGACAATTTAGGAAGGGTCTTCCCACTGCCTTGTGGTCTAATGTTTGGATCAGCCATAACTCTCATTGGAAAGCCACGGGAAGCTCACATGGAGTACAAACCGCCAATCGCCAGAGTTGGGGAAGGTGTCTCTCCATACGTCATGGTGTCCCAGTTCATAATGGAGTTACAGGGCTTGAAGGTGGTAAAAGGTGAAGATCCTCCTAGAATCCTCCACATAAACCCTCGACTCCGTGGTGACTGGAGCTGGAAACCCATCATTGAGCATAATACATGCTATCGAAACCAGTGGGGCCCAGCTCATCGGTGTGAAGGTTGGCAAGTACCTGAATACGAAGAAACCGTGGACGGTCTTCCCAAGTGCGAGAAGTGGCTTCGAGGCGATGACAAAAAACCTGCTTCGACCCAAAAATCCTGGTGGCTTGGGCGATTAGTTGGTCATTCCGACAAGGAGACGCTTGAATGGGAGTATCCATTGTCCGAAGGTCGGGAGTTTGTTCTCACCATTCGAGCAGGTGTAGAAGGATTTCACTTAACTATTGATGGTCGGCACATCAGTTCGTTCCCTTATCGTGCGGGTTATGCTATGGAAGAAGCAACAGGAATATCAGTGGCAGGAGACGTCGATGTTCTTTCGATGACAGTAACATCATTACCTTTAACACATCCCAGCTACTACCCTGAGTTGGTTTTGGATTCGGGTGATATCTGGAAGGCACCACCTTTACCAACAGGCAAGATAGAGTTATTTGTTGGAATCATGTCAAGCAGCAATCACTTTGCAGAACGTATGGCAGTAAGAAAGACGTGGTTTCAGTCTCTGGTTATCCAATCCTCCCAAGCGGTGGCTCGCTTCTTTGTAGCTCTGCATGCAAACAAGGATATCAATCTGCAGCTGAAGAAAGAGGCTGACTATTACGGCGATATGATAATTTTACCTTTCATCGACAGATATGATATAGTGGTTCTTAAGACCGTTGAAATTTTCAAGTTTGGGGTCCAGAATGTTACAGTTAGCCACGTCATGAAATGTGACGATGACACATTTGTAAGGATTGACAGCGTTCTTGAAGAGATTCGAACGACGTCAGTAGGACAGGGCCTTTACATGGGCAGCATGAATGAGTTTCATAGACCCCTTCGTTCTGGGAAGTGGGCCGTGACAGTTGAGGAGTGGCCTGAGCGCATTTACCCAACATACGCAAATGGTCCAGGATACATCCTTTCGGAAGATATTGTGCATTTTATAGTGGAGGAGAGCAAAAGAAATAATTTGAGGTTATTTAAGATGGAGGACGTCAGCGTAGGTATATGGGTACGCGAGTATGCAAAGATGAAGTACGTGCAATACGAGCATAGCGTACGGTTTGCTCAAGCCGGTTGTATACCTAACTACCTGACAGCGCACTATCAATCGCCGCGTCAAATGCTGTGTCTGTGGGACAAGGTGCTTGCTACCAATGACGGCAAGTGCTGCACCTTGT權(quán)利要求1.DNA分子，其特征在于其包含根據(jù)SEQIDNO1的序列，具有從堿基對(duì)513到堿基對(duì)2417的開(kāi)放閱讀框；根據(jù)SEQIDNO2的序列，具有從堿基對(duì)1到堿基對(duì)1902的開(kāi)放閱讀框；根據(jù)SEQIDNO24的序列，具有從堿基對(duì)321到堿基對(duì)2387的開(kāi)放閱讀框；或根據(jù)SEQIDNO25的序列，具有從堿基對(duì)1到堿基對(duì)2052的開(kāi)放閱讀框；或與上述序列的至少一個(gè)具有至少50％同一性；或者包含由于遺傳密碼與上面的序列簡(jiǎn)并的序列；所述序列編碼具有β1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性(β1，3-Ga1T活性)的植物蛋白質(zhì)或與其互補(bǔ)。2.DNA分子，其包含與根據(jù)SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:24或SEQIDNO:25的任一個(gè)的序列具有至少20%總體同一性并且與SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的七個(gè)保守結(jié)構(gòu)域的序列具有至少80%同一性的序列，所述七個(gè)保守結(jié)構(gòu)域編碼SEQIDNO:19或SEQIDNO:20的蛋白質(zhì)的氨基酸387-392(DLFIGI或ELFVGI)、402-409(RMAVRKTW)、425-428(FVAL)、455-465(DRYDIVVLKTV)、479-489(YIMKCDDDTFV或HVMKCDDDTFV)、536-548(YPIYANGPGYILS或YPTYANGPGYILS)和570-576(EDVSVGI)，或者包含由于遺傳密碼與上面的序列簡(jiǎn)并的序列，所述序列編碼具有(31，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性的植物蛋白或與其互補(bǔ)。3.DNA分子，其包含與才艮據(jù)SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:24或SEQIDNO:25任一個(gè)的序列具有至少20%總體同一性并且編碼SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的七個(gè)保守結(jié)構(gòu)域的保守氨基酸的至少95%的序列，所述保守氨基酸選自SEQIDNO:19或SEQIDNO:20的蛋白質(zhì)的氨基酸388(L)、402(R)、404(A)、406(R)、408(T)、409(W)、425(F)、455(D)、457(Y)、463(K)、464(T)、481(M)、482(K)、484(D)、486(D)、楊(F)、489(V)、536(Y)、537(P)、542(G)、544(G)、545(Y)、548(S)、570(E)、571(D)、572(V)、575(G)和576(I)，或者包含由于遺傳密碼與上面的序列簡(jiǎn)并的序列，所述序列編碼具有P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性的植物蛋白或與其互補(bǔ)。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的DM分子，其特征在于它編碼具有GlcMc-P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4的DNA分子，其特征在于它編碼在將半乳糖從UDP-半乳糖轉(zhuǎn)移到非還原性GlcNAc殘基方面具有活性的蛋白質(zhì)。6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的DM分子，其特征在于它編碼在將半乳糖從UDP-半乳糖轉(zhuǎn)移到與蛋白質(zhì)連接的N-聚糖結(jié)構(gòu)的非還原性GlcNAc殘基方面具有活性的蛋白質(zhì)。7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的DNA分子，其特征在于它與根據(jù)SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:24或SEQIDNO:25的序列之一具有至少70%、優(yōu)選至少80%,特別至少90%同一性，或者由于遺傳密碼與其簡(jiǎn)并或與其互補(bǔ)。8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的DNA分子，其特征在于它包含根據(jù)SEQIDNO:l的序列，具有從堿基對(duì)513到堿基對(duì)2417的開(kāi)放閱讀框；或根據(jù)SEQIDNO:2的序列，具有從堿基對(duì)1到堿基對(duì)1902的開(kāi)放閱讀框；或與上述序列的至少一個(gè)具有至少50%同一性；或包含由于遺傳密碼與上面的序列簡(jiǎn)并的序列；所述序列編碼具有P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性(P1，3-GalT活性)的植物蛋白質(zhì)或與其互補(bǔ)。9.DNA分子，其特征在于它包含根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的DNA分子的部分序列，并且與根據(jù)SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:24或SEQIDNO:25的序列具有至少80%同一性或者與其互補(bǔ)，并且具有15到300,優(yōu)選20到50個(gè)堿基對(duì)的大小。10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的DNA分子，其特征在于它與可檢測(cè)的標(biāo)記物質(zhì)共價(jià)結(jié)合。11.表達(dá)載體，其特征在于它包含根據(jù)權(quán)利要求1-IO任一項(xiàng)的DNA分子。12.表達(dá)載體，其特征在于它包含與啟動(dòng)子反向的根據(jù)權(quán)利要求1-IO任一項(xiàng)的DM分子。13.編碼核酶的DNA分子，其特征在于它具有兩個(gè)序列區(qū)，每個(gè)具有至少10到15個(gè)堿基對(duì)的長(zhǎng)度并且與根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的DNA分子的序列區(qū)互補(bǔ)使得所述核酶與天然P1，3-GalT分子轉(zhuǎn)錄的mRM復(fù)合并切割所述mRNA。14.生物功能載體，其特征在于它包含根據(jù)權(quán)利要求13的DNA分子。15.克隆P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的方法，其特征在于將根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的DNA分子克隆到栽體中，隨后轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞、宿主組織或宿主中，通過(guò)選擇和擴(kuò)增所轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞得到細(xì)胞系，所述細(xì)胞系表達(dá)活性P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶。16.克隆P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的方法，其特征在于將根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)但是缺少至少跨膜編碼序列的DNA分子克隆到載體中，隨后轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞、宿主組織或宿主中，通過(guò)選擇和擴(kuò)增所轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞得到細(xì)胞系，所述細(xì)胞系表達(dá)活性P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶。17.根據(jù)權(quán)利要求15或16的方法表達(dá)的蛋白質(zhì)，其特征在于它在P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶方面是有活性的并且用于在體外或體內(nèi)延長(zhǎng)糖蛋白的N-聚糖。18.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的序列的編碼跨膜結(jié)構(gòu)域的DNA序列，其特征在于所編碼的跨膜結(jié)構(gòu)域有效連接到異源蛋白，尤其優(yōu)選酶，更尤其優(yōu)選涉及蛋白質(zhì)的翻譯后修飾的酶。19.DM載體，其包含根據(jù)SEQIDNO.3或SEQIDNo.4的核酸序列。20.分別制備重組宿主細(xì)胞，尤其植物細(xì)胞或植物的方法，其中|31，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的產(chǎn)生分別受到抑制或完全停止，其特征在于分別向所述宿主細(xì)胞或植物插入根據(jù)權(quán)利要求11、12、14或19的載體的至少一種或包含根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的DNA分子的載體，其中所述DNA分子包含缺失、插入和/或替代突變。21.分別制備重組宿主細(xì)胞，尤其植物細(xì)胞或植物的方法，其特征在于分別向所述宿主細(xì)胞或植物的基因組的非突變的同源序列位置上插入根據(jù)權(quán)利要求1-IO任一項(xiàng)的DNA分子，其中所述DNA分子包含缺失、插入和/或替代突變。22.重組植物或植物細(xì)胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求ll、12、14或19的載體的至少一種或包含根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的DNA分子的載體，其中所述DNA分子包含缺失、插入和/或替代突變，并且它們的內(nèi)源P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的產(chǎn)生分別受到抑制或完全停止。23.包含根據(jù)權(quán)利要求1-IO任一項(xiàng)的DNA分子的重組植物或植物序列位置上包含缺失、插入和/或替代突變，并且它們的內(nèi)源P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的產(chǎn)生受到抑制或完全停止。24.肽核酸(PNA)分子，其特征在于它包含與根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的DNA分子的編碼P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的序列互補(bǔ)的堿基序列。25.肽核酸(PNA)分子，其特征在于它包含與根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的DNA分子的編碼P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的序列對(duì)應(yīng)的堿基序列。26.分別產(chǎn)生在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平具有阻斷的P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的植物、或細(xì)胞，尤其植物細(xì)胞的方法，其特征在于向所述細(xì)胞中插入根據(jù)權(quán)利要求24或25的PNA分子。27.產(chǎn)生重組糖蛋白的方法，其特征在于將分別根據(jù)權(quán)利要求22或23的重組植物、植物細(xì)胞或植物組織，或者分別其中插入根據(jù)權(quán)利要求24或25的PNA分子并且在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平具有阻斷的p1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的植物、植物組織或細(xì)胞用編碼所述糖蛋白的基因轉(zhuǎn)染，從而表達(dá)所述重組糖蛋白。28.產(chǎn)生重組人糖蛋白的方法，其特征在于將分別根據(jù)權(quán)利要求"或23的重組植物、植物細(xì)胞或植物組織，或者分別其中插入根據(jù)權(quán)利要求24或25的PNA分子并且在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平具有阻斷的p1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的植物、植物組織或細(xì)胞用編碼所述糖蛋白的基因轉(zhuǎn)染，從而表達(dá)所述重組糖蛋白。29.產(chǎn)生用于醫(yī)藥用途的重組人糖蛋白的方法，其特征在于將分別根據(jù)權(quán)利要求22或23的重組植物、植物細(xì)胞或植物組織，或者分別其中插入根據(jù)權(quán)利要求24或25的PNA分子并且在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平具有阻斷的p1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的植物、植物組織或細(xì)胞用編碼所述糖蛋白的基因轉(zhuǎn)染，從而表達(dá)所述重組糖蛋白。30.產(chǎn)生具有N-聚糖的糖蛋白的方法，其包括用根據(jù)權(quán)利要求15或16克隆的活性P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶在體外或體內(nèi)延長(zhǎng)糖蛋白的N-聚糖。31.選擇樣品中編碼01，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的DNA分子的方法，其特征在于向所述樣品中加入根據(jù)權(quán)利要求10的DNA分子，該分子結(jié)合到編碼P1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的DNA分子。32.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其特征在于所述樣品包含植物生物的基因組DNA。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了編碼半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的DNA分子，包含功能異常的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因的重組宿主細(xì)胞、組織或生物，包含導(dǎo)入的功能性半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的重組宿主細(xì)胞、組織或生物，用其產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，產(chǎn)生半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的方法以及其載體和用途。文檔編號(hào)C12N9/10GK101522891SQ200780036186公開(kāi)日2009年9月2日申請(qǐng)日期2007年9月28日優(yōu)先權(quán)日2006年9月29日發(fā)明者C·施特默爾,G·戈?duì)?H·勞恩哈特,R·雷斯基,S·倫辛,W·約斯特申請(qǐng)人:格里革新生物技術(shù)有限公司