專利名稱：β-1,4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I在制備肝癌診斷制劑中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及β -1，4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I在制備肝 癌診斷制劑中的應(yīng)用。更具體地，涉及將β _1，4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I作為肝癌初篩、診斷和 預(yù)后判斷以及肝癌手術(shù)后預(yù)后判斷及復(fù)發(fā)診斷方面的一項(xiàng)指標(biāo)。
背景技術(shù)：
原發(fā)性肝癌(簡稱肝癌)是我國常見的惡性腫瘤之一，其腫瘤發(fā)病率在男性為 第三位，僅次于胃癌及食管癌，女性則為第四位。我國每年新增患者11萬，人群發(fā)病率為 23. 7/10萬人。由于肝癌起病隱匿，患者就診時(shí)大多已屬中、晚期，再加上合并肝硬化率高 及手術(shù)后復(fù)發(fā)率高等多種因素，治療效果較差，死亡率高。因此對(duì)于肝癌的初篩、診斷和預(yù) 后判斷以及肝癌手術(shù)后預(yù)后判斷及復(fù)發(fā)診斷顯得尤為重要，目前的檢測(cè)指標(biāo)具有一定局限 性，迫切需要找到新的診斷指標(biāo)。大量研究證實(shí)人及動(dòng)物模型肝癌細(xì)胞與正常肝細(xì)胞相比 蛋白質(zhì)及脂質(zhì)糖基化存在差異。有些糖基化發(fā)生改變的糖蛋白已應(yīng)用于人類肝癌的診斷、 分期和預(yù)后評(píng)估；同時(shí)一些聚糖衍生物已被應(yīng)用于肝癌的輔助治療。肝癌細(xì)胞中的異常糖基化主要包括糖蛋白和糖脂組分的改變。其中糖蛋白是蛋白 質(zhì)和寡糖鏈通過共價(jià)結(jié)合的復(fù)合物，主要有兩種連接方式一種為糖鏈與肽鏈中絲氨酸或 蘇氨酸的羥基氧相連，稱為0-糖鏈；另一種為糖鏈與肽鏈中天冬酰胺的酰胺鍵相連，稱為 N-糖鏈。其中以N-糖鏈的連接方式較多，與腫瘤的關(guān)系也較密切。Van Beek在比較不同惡 性程度的大鼠肝癌細(xì)胞、胎肝和新生鼠肝細(xì)胞膜上糖蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)，所有肝癌細(xì)胞都有含多 量巖藻糖的糖蛋白出現(xiàn)，且與惡性程度無關(guān)，而胎肝和新生鼠肝細(xì)胞則無此種改變，證明糖 蛋白糖基化改變是一個(gè)惡性腫瘤的現(xiàn)象，而與細(xì)胞的正常生長無關(guān)。這種腫瘤細(xì)胞的糖蛋 白糖鏈分子增大的現(xiàn)象即所謂的Warren-Glick現(xiàn)象。進(jìn)一步研究表明，糖鏈的相對(duì)分子質(zhì) 量增加是由于糖鏈分支的增加，其中尤以糖鏈上唾液酸的增加為多見。肝癌中常見的N-聚 糖改變類型可歸納為表1所列的9種情況。糖蛋白的糖基化需要糖基轉(zhuǎn)移酶的參與，因此肝癌細(xì)胞糖蛋白中糖鏈結(jié)構(gòu)的改變 必然與轉(zhuǎn)移酶的活性改變有關(guān)。酶活力改變與N-聚糖結(jié)構(gòu)改變的一致性已有大量實(shí)驗(yàn)證 明，如在亞硝胺誘發(fā)大鼠肝癌時(shí)，肝中堿性磷酸酶(ALP)的N-聚糖中平分型N-乙酰葡糖 胺(GlcNAc)和天線數(shù)增多分別與GIcNAc轉(zhuǎn)移酶(GlcNAcT)-III和V的活力增高相符合。 H印G2肝癌株中甲胎蛋白(AFP)的N-聚糖有較多的C2C2，6三天線和核心Fuc，其GlcNAcT-V 和α 1，6-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶(al，6-FucT)的活力均較高。HuH_7肝癌株的AFP只含極少的平 分型GlcNAc和C2C2，6三天線結(jié)構(gòu)，其GlcNAcT-III和V均較低。研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染GlcNAc T-III的高轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞表面的E-鈣粘蛋白(E-cadherin)從細(xì)胞表面脫落減少，細(xì)胞的 侵襲及轉(zhuǎn)移能力降低，結(jié)構(gòu)分析顯示E-鈣粘蛋白聚糖上的平分型GlcNAc增多，而β 1，6連 接GlcNAc的則減少，提示GIcNAcT-V的活力被抑制。因此，GIcNAcT-V和GlcNAcT-III分 別可看作與促腫瘤轉(zhuǎn)移或抗腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的糖基轉(zhuǎn)移酶。此外，我們的研究顯示β1，4半 乳糖基轉(zhuǎn)移酶I(GalT I)可使人肝癌細(xì)胞株N-聚糖上的β 1，6連接GlcNAc表達(dá)增多，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和侵襲以及在裸鼠體內(nèi)的病灶形成。
表1.肝癌中糖蛋白N-聚糖改變的類型
權(quán)利要求
1.β -1，4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I在制備肝癌診斷制劑中的應(yīng)用，其中，將肝組織或者血液 樣本中β _1，4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I活性作為肝癌診斷指標(biāo)；所述的β_1，4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶 I活性增強(qiáng)是指組織樣本的β_1，4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I表達(dá)量增加，或者樣本中β_1，4半乳 糖苷鍵的數(shù)量的增加。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，將肝組織和血液中β_1，4半乳糖基轉(zhuǎn)移 酶I活性增強(qiáng)作為肝癌初篩的診斷指標(biāo)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，將肝組織和血液中β_1，4半乳糖基轉(zhuǎn)移 酶I活性增強(qiáng)作為肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)的診斷指標(biāo)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，其中肝組織樣本的β_1，4半乳糖基轉(zhuǎn)移 酶I表達(dá)量的檢測(cè)方法是提取肝組織樣本的RNA，然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，擴(kuò)增β-1，4半乳糖 基轉(zhuǎn)移酶I的核苷酸編碼序列，所得產(chǎn)物多于對(duì)照的即為肝組織樣本的β_1，4半乳糖基轉(zhuǎn) 移酶I表達(dá)量增加。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述肝組織樣本中β_1，4半乳糖苷鍵數(shù) 量的檢測(cè)方法是將肝組織樣本制成石蠟切片，脫蠟入水；加入Η202或者甲醇阻斷內(nèi)源性 的過氧化物酶，加入抗生物素蛋白阻斷內(nèi)源性的生物素；唾液酸酶消化，封閉，然后加入生 物素-蓖麻凝集素-I孵育過夜；加入標(biāo)記過的抗生物素蛋白-生物素孵育，顯色；對(duì)照組用 羊血清代替生物素-蓖麻凝集素-I，或者在加入生物素-蓖麻凝集素-I的同時(shí)添加半乳糖 競爭抑制。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，采用辣根過氧化酶進(jìn)行標(biāo)記，二氨基聯(lián)苯 胺顯色。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，血液樣本中β_1，4半乳糖苷鍵數(shù)量的檢 測(cè)方法是提取血液樣本中的血清蛋白，western blot轉(zhuǎn)移到PVDF膜，封閉過夜，與標(biāo)記過 的蓖麻凝集素-I孵育，洗膜，然后檢測(cè)蓖麻凝集素-I的結(jié)合數(shù)量，蓖麻凝集素-I的結(jié)合數(shù) 量的增加即為肝組織樣本中β -1，4半乳糖苷鍵數(shù)量的增加。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，采用辣根過氧化酶進(jìn)行標(biāo)記，ECL化學(xué)發(fā) 光系統(tǒng)檢測(cè)蓖麻凝集素-I的結(jié)合數(shù)量。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及β-1，4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I在制備肝癌診斷制劑中的應(yīng)用。本發(fā)明將β-1，4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I活性作為肝癌診斷指標(biāo)；β-1，4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I活性增強(qiáng)是指其表達(dá)量增加，或者樣本中β-1，4半乳糖苷鍵的數(shù)量的增加。將本發(fā)明的β-1，4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I活性指標(biāo)用于肝癌初篩、診斷和預(yù)后判斷以及肝癌手術(shù)后預(yù)后判斷及復(fù)發(fā)診斷，特異靈敏，高效簡易，而且本發(fā)明的檢測(cè)方法只需提取患者很少量的肝組織或者血液樣本進(jìn)行體外反應(yīng)，大大減輕了患者的痛苦及其家屬的負(fù)擔(dān)。此外，該指標(biāo)還可以與甲肽蛋白等其它肝癌診斷標(biāo)記優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，作為肝癌確診的依據(jù)。
文檔編號(hào)C12Q1/48GK102041295SQ200910197379
公開日2011年5月4日 申請(qǐng)日期2009年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月19日
發(fā)明者徐潔杰, 惲小婧, 江建海, 顧建新 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)