專利名稱：用于乙醇生產(chǎn)的可利用木糖的發(fā)酵單胞菌的木糖醇合成突變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物及基因工程領(lǐng)域。更具體地，開發(fā)了一株對葡萄糖-果糖氧化 還原酶基因進行了遺傳修飾的、可利用木糖的發(fā)酵單胞菌。該菌株在發(fā)酵及乙醇生產(chǎn)期間 木糖代謝中的有害的副產(chǎn)物——木糖醇的產(chǎn)量降低了。
背景技術(shù)：
通過微生物來生產(chǎn)乙醇可為化石燃料提供替代的能源來源，因而是目前研究中 的一個重要領(lǐng)域。運動發(fā)酵單胞菌是一種可生長在葡萄糖、果糖、及蔗糖上、通過恩杜糖 解途徑將這些糖類代謝為co2和乙醇的產(chǎn)乙醇細菌。盡管野生型菌株不能以木糖為碳源， 但已構(gòu)造了可生長在這種糖上的重組運動發(fā)酵單胞菌菌株(US 5514583，US5712133，W0 95/28476, Feldmann et al. (1992)Appl MicrobiolBiotechnol 38 :354-361, Zhang et al. (1995) Science 267:240-243)。木糖是可水解的木質(zhì)纖維素原料中主要的戊糖，因此可在發(fā)酵中提供充足的、低 廉的可用碳源。已對運動發(fā)酵單胞菌改造使其表達木糖代謝所需的四種酶1)木糖異構(gòu) 酶，催化木糖向木酮糖的轉(zhuǎn)化；2)木酮糖激酶，將木酮糖磷酸化形成木酮糖5-磷酸；3) 轉(zhuǎn)酮醇酶及 4)轉(zhuǎn)酸醇酶(US 5514583，US 6566107 ；Zhang et al. (1995) Science267 240-243)。通過這四種酶的聯(lián)合作用以及細胞正常的代謝機制，三分子的木糖被轉(zhuǎn)化為二 分子的葡萄糖6-磷酸及一分子的甘油醛3-磷酸，隨后在葡萄糖一側(cè)的途徑中被轉(zhuǎn)化為乙 醇和C02(參見

圖1)。盡管已經(jīng)成功構(gòu)建了用于木糖代謝的運動發(fā)酵單胞菌菌株，但這些菌株不能如利 用葡萄糖那樣，利用木糖生長并產(chǎn)生乙醇。導(dǎo)致利用木糖生長不良的一個因素是產(chǎn)生了 作為木糖代謝副產(chǎn)物的木糖醇(Feldmann et al.同上；Kim et al. (2000)Applied and EnvironmentalMicrobiology 66 :186-193)。木糖醇通過木酮糖激酶被磷酸化，產(chǎn)生木糖醇 5_磷酸，它在細胞中累積并抑制細菌生長。木糖醇的合成也降低了乙醇產(chǎn)量，因為可利用木 糖的重組運動發(fā)酵單胞菌菌株不能將木糖醇轉(zhuǎn)化為乙醇。此外，木糖醇也是木糖異構(gòu)酶的 潛在抑制劑(Smith etal. (1991) Biochem J. 277 :255_261)，該酶可催化工程菌木糖代謝途 徑中利用木糖的第一個步驟。參見圖2表示木糖醇合成及作用的圖表。尚未確定在體內(nèi)與木糖醇合成有關(guān)的生理途徑及酶。不過，已表明來自野生型 運動發(fā)酵單胞菌的無細胞提取物在添加了 NADPH時可還原木糖生成木糖醇(Feldmann et al.，同上)，并且該反應(yīng)是由NADPH依賴的醛糖還原酶來催化的。也表明了運動發(fā)酵
3單胞菌的無細胞提取物可在沒有添加NADPH的情況下將少量的木糖轉(zhuǎn)化為木糖醇，而且 在這些條件下當(dāng)還向反應(yīng)混合物中加入了純化的木糖異構(gòu)酶時木糖醇產(chǎn)量增加了 3-4倍 (Danielson,2001, University of Colorado MastersThesis)。由于木糖異構(gòu)酶能夠?qū)⒛?糖轉(zhuǎn)化為木酮糖，近來實驗的合理推論是運動發(fā)酵單胞菌中的酶——葡萄糖_果糖氧化還 原酶(GF0R)可以利用木糖作為電子供體、木酮糖作為電子接納體來生成木糖醇，這些將在 下文進行更為詳盡的討論。因此，基于體外實驗，在運動發(fā)酵單胞菌中至少存在兩條木糖醇 產(chǎn)生途徑，但是它們在生理條件下對木糖醇形成的貢獻程度仍待確定。為了高水平地生產(chǎn)乙醇，在可能導(dǎo)致滲透壓休克的高濃度可發(fā)酵碳源中培養(yǎng)運 動發(fā)酵單胞菌。當(dāng)將野生型菌株轉(zhuǎn)移到含> 200g/L葡萄糖和果糖或者> 360g/L蔗糖的 液體培養(yǎng)基中時，在開始生長前的長時間的延遲期即為滲透壓休克(Loos et al. (1994)J Bacterioll76 =7688-7693)。此外，當(dāng)將野生型菌株轉(zhuǎn)移到高濃度的這些糖類中時，向培養(yǎng) 基中添加山梨糖醇可減少延遲期(Wiegert et al. (1996)ArchMicrobiol 166 :32_41，Loos et al同上)。也表明了當(dāng)在濃縮的葡萄糖與果糖混合物(Loos et al.同上)或者濃縮的蔗糖 溶液(_，Weigert et al同上，Loos et al同上)中培養(yǎng)野生型運動發(fā)酵單胞菌時，周質(zhì) 酶——葡萄糖-果糖氧化還原酶(GF0R)在滲透壓平衡中發(fā)揮重要作用。簡而言之，GF0R與 其緊密結(jié)合的輔助因子以如圖表1中所示的典型的乒乓機制來催化葡萄糖到葡糖酸內(nèi)酯 的氧化以及后來的果糖到山梨糖醇的還原。在周質(zhì)空間產(chǎn)生的山梨糖醇逆濃度梯度轉(zhuǎn)運到 細胞內(nèi)，在那里它由于不發(fā)生進一步的代謝而累積到很高水平。細胞內(nèi)高濃度的山梨糖醇 會消除質(zhì)膜內(nèi)外的滲透壓差異，恢復(fù)滲透壓平衡。當(dāng)在低濃度蔗糖(< 150g/L)中進行培養(yǎng)時，一株不能產(chǎn)生山梨糖醇的野生型運 動發(fā)酵單胞菌的自發(fā)突變株可比野生型細胞生產(chǎn)出更高水平的乙醇，但該菌株不能在高濃 度蔗糖中生長(Kirk and Doelle (1993) Biotechnol. Letters 15:985-990)。后來發(fā)現(xiàn)該 突變株缺少葡萄糖-果糖氧化還原酶(GF0R)的表達，這使得它不能將任何蔗糖來源的果糖 轉(zhuǎn)化為多余的副產(chǎn)物山梨糖醇(Wiegert et al.同上)。也表明可通過向培養(yǎng)基中添加山 梨糖醇的方式來恢復(fù)山梨糖醇缺陷的突變株在高濃度蔗糖中的生長(Wiegert et al.，同 上)。因此，當(dāng)在濃縮的葡萄糖與果糖混合物中或者濃縮的可被宿主細胞轉(zhuǎn)化酶水解為葡萄 糖與果糖的蔗糖中培養(yǎng)運動發(fā)酵單胞菌時，GF0R通過合成山梨糖醇在滲透壓平衡中發(fā)揮著 至關(guān)重要的作用。
葡萄糖 + GFOR-NADP+ 葡糖酸內(nèi)酯 + GFOR-NADPH GFOR-NADPH + 果糖 - 山梨糖酵 + GFOR-NADP+圖表 ICN1600850 (A)描述了一株具有失活的GF0R基因從而不能利用木糖的運動發(fā)酵單 胞菌突變株，以及使用該菌株來進行乙醇生產(chǎn)。當(dāng)葡萄糖、果糖和蔗糖用作碳源時，該菌株 中沒有山梨糖醇的產(chǎn)生會導(dǎo)致更高水平的乙醇。在改造后的、利用木糖及葡萄糖混合物(沒有添加蔗糖或果糖)生長的、可利用木 糖的運動發(fā)酵單胞菌菌株中降低或消除了葡萄糖-果糖氧化還原酶酶活的效應(yīng)仍是未知的。對于當(dāng)在含木糖的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)時能夠產(chǎn)生更多量乙醇的、可利用木糖的運 動發(fā)酵單胞菌菌株仍有需求。申請人已經(jīng)通過確定體內(nèi)木糖醇產(chǎn)生的主要途徑、并利用基 因失活消除了與其形成有關(guān)的酶的活性、進而生成了具有更高乙醇產(chǎn)量的運動發(fā)酵單胞菌 菌株，從而解決了該問題。發(fā)明概述本發(fā)明涉及諸如運動發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)這樣的發(fā)酵單胞菌菌株， 當(dāng)在存在木糖的情況下進行培養(yǎng)時，其木糖醇產(chǎn)量降低了，而乙醇產(chǎn)量增高了。申請人已 發(fā)現(xiàn)在可代謝木糖的運動發(fā)酵單胞菌中木糖醇產(chǎn)量主要是由葡萄糖-果糖氧化還原酶 (GF0R)這個酶來介導(dǎo)的。構(gòu)建了不表達GF0R的遺傳改良菌株(譬如敲除GF0R的突變株)， 發(fā)現(xiàn)當(dāng)利用含有木糖的糖類混合物上培養(yǎng)，木糖醇的產(chǎn)量降低了。當(dāng)利用存在山梨醇的高 糖混合物培養(yǎng)時，GF0R敲除突變株還可以比表達GF0R的親代菌株消耗更多的木糖并產(chǎn)生 更高濃度的乙醇。此外，GF0R敲除突變株的乙醇產(chǎn)量(消耗每克糖產(chǎn)生的乙醇量)有了顯 著增高。因此，本發(fā)明提供了能夠通過在糖類培養(yǎng)基中發(fā)酵，利用木糖來生產(chǎn)乙醇的發(fā)酵 單胞菌屬的重組微生物，所述微生物含有至少一種可降低葡萄糖_果糖氧化還原酶酶活的 遺傳修飾。本發(fā)明包括能夠利用木糖產(chǎn)生乙醇的發(fā)酵單胞菌菌株，它由于GF0R基因的遺傳 改造而表現(xiàn)出GF0R活性的降低。任何GF0R活性的降低均在本發(fā)明范疇內(nèi)，包括完全失活 針對GF0R活性的基因和/或完全敲除GF0R酶活的突變。此外，本發(fā)明提供了生成GF0R活性有所降低的發(fā)酵單胞菌菌株的方法，其包括a)提供能夠在適當(dāng)條件下利用木糖產(chǎn)生乙醇的重組發(fā)酵單胞菌菌株；及b)向(a)中的重組發(fā)酵單胞菌菌株引入至少一種遺傳修飾，其中所述修飾可降低 葡萄糖_果糖氧化還原酶活性。附圖、生物保藏及序列描述的簡要說明可通過下述詳細描述、附圖及作為本發(fā)明一部分的附加的序列描述來更為充分地 了解本發(fā)明。圖1所示的是用于改造運動發(fā)酵單胞菌以利用木糖的四種酶(框內(nèi))以及使用木 糖進行乙醇生產(chǎn)的生化途徑的示意圖。圖2所示的是改造后木糖途徑的前兩個步驟(框內(nèi))、木糖醇合成、木糖醇5-磷酸 形成(一種毒性削弱的中間物)及木糖醇對木糖異構(gòu)酶的抑制的示意圖。圖3所示的是對轉(zhuǎn)酮醇酶(A)、轉(zhuǎn)醛醇酶(B)、木糖異構(gòu)酶(C)和木酮糖激酶(D) 進行酶測定的策略。圖4所示的是pMODPgaptaltktCm的質(zhì)粒圖譜。圖5所示的是pMODPgapxylABCm的質(zhì)粒圖譜。圖6所示的是在用PgapxylAB轉(zhuǎn)化的T2C、T3C、T4C和T5C譜系中木糖異構(gòu)酶(XI) 和木酮糖激酶(XK)活性的圖。圖7所示的是在用PgapxylAB轉(zhuǎn)化的T2C、T3C、T4C和T5C譜系中轉(zhuǎn)醛醇酶(TAL) 和轉(zhuǎn)酮醇酶(TKT)活性的圖。圖8所示的是所選擇的適于利用木糖的菌株菌落的％理論乙醇產(chǎn)量及％理論木糖利用圖。圖9所示的是適應(yīng)利用木糖的菌株在含5%葡萄糖的RM(RMG)中培養(yǎng)50代之前或 之后于含5%木糖(RMX5%)的RM(豐富培養(yǎng)基)上培養(yǎng)70小時時的生長圖。圖10所示的是所選擇的菌株——ZW658與對照菌株——8b相比較，在RM+10%葡 萄糖(RMG10% ) (A、B)及RM+8%木糖(RMX8% ) (C、D)中的生長、葡萄糖或木糖利用及乙醇
與木糖醇產(chǎn)量圖。圖11所示的是所選擇的菌株——ZW658與對照菌株——8b相比較，在不含醋酸鹽 (A、B)或含有 0.6% 醋酸鹽(C、D)的、RM+10% 葡萄糖(RMG10% )及 RM+8% 木糖(RMX8% ) 中的生長、葡萄糖或木糖利用及乙醇與木糖醇產(chǎn)量圖。圖12所示的是在為了對GF0R基因進行插入失活而構(gòu)建自殺構(gòu)建體時所制備的質(zhì) 粒、以及終產(chǎn)物GF0RSp-9ffff的圖譜。圖13所示的是用來構(gòu)建木糖異構(gòu)酶表達質(zhì)?！猵ZB 188/Kan-XylA而制備的載 體的圖譜，以及用于該構(gòu)建體的大腸桿菌木糖異構(gòu)酶表達盒的圖表(框內(nèi))圖14所示的是在存在或者沒有木糖異構(gòu)酶表達時，具有或者不具有GF0R基因失 活的ZW1菌株的木糖醇與木酮糖產(chǎn)量圖。圖15所示的是利用總計為97g/L木糖+葡萄糖培養(yǎng)沒有(A)或者具有(B)GFOR基 因失活的可利用木糖的運動發(fā)酵單胞菌菌株時，其生長、葡萄糖或木糖利用及乙醇產(chǎn)量圖。圖16所示的是利用總計為188g/L木糖+葡萄糖培養(yǎng)沒有(A)或者具有(B)GFOR 基因失活的可利用木糖的運動發(fā)酵單胞菌菌株時，其生長、葡萄糖或木糖利用及乙醇產(chǎn)量 圖。圖17所示的是在存在不同濃度山梨糖醇時具有GF0R基因失活的、可利用木糖的 運動發(fā)酵單胞菌菌株的生長圖。圖18所示的是在沒有(A、B)或存在(C、D)醋酸鹽、利用總計為174g/L木糖+葡 萄糖培養(yǎng)沒有(A、C)或者具有(B、D)GF0R基因失活的可利用木糖的運動發(fā)酵單胞菌菌株 時，其木糖利用、乙醇產(chǎn)量及木糖醇產(chǎn)量圖。圖19所示的是在沒有(A、B)或存在(C、D)醋酸鹽、利用總計為203g/L木糖+葡 萄糖培養(yǎng)沒有(A、C)或者具有(B、D)GF0R基因失活的可利用木糖的運動發(fā)酵單胞菌菌株 時，其木糖利用、乙醇產(chǎn)量及木糖醇產(chǎn)量圖。圖20所示的是在添加了用于增加緩沖能力的碳酸氫鉀的、沒有(A、B)或存在(C、 D)醋酸鹽、利用總計為203g/L木糖+葡萄糖培養(yǎng)沒有(A、C)或者具有(B、D)GF0R基因失 活的可利用木糖的運動發(fā)酵單胞菌菌株時，其木糖利用、乙醇產(chǎn)量及木糖醇產(chǎn)量圖。圖21所示的是在進行可控pH的發(fā)酵中，在存在醋酸鹽、利用總計為189g/L木糖 +葡萄糖培養(yǎng)具有GF0R基因失活的可利用木糖的運動發(fā)酵單胞菌菌株時，其木糖與葡萄糖 利用、乙醇產(chǎn)量及木糖醇產(chǎn)量圖。圖22所示的是pZB 188/Kan以及可在運動發(fā)酵單胞菌中復(fù)制的Cre表達載體pZB 188/kan-Cre的質(zhì)粒圖譜。圖23A所示的是在可控pH條件下，在含有醋酸鹽的高葡萄糖+木糖中ZW801-4與 ZW800生長的比較。圖23B所示的是ZW801-4相對于ZW800的葡萄糖與木糖利用及乙醇產(chǎn)量圖。
圖24所示的是ZW801-4中翻譯后的突變序列與野生型GF0P蛋白的比對?？赏ㄟ^下述詳細描述以及作為本申請一部分的附加序列描述來更為充分地理解 本發(fā)明。下列序列符合37C. F. R. 1. 821-1. 825 (“對含核苷酸序列和/或氨基酸序列事項的 專利申請的要求_序列規(guī)則”)，并與世界知識產(chǎn)權(quán)組織(WIP0)標準ST. 25 (1998)、EP0及 PCT的序列列表要求(規(guī)則5. 2及49. 5 (a-bis)、以及行政指導(dǎo)208項與附錄C)相一致。核 苷酸及氨基酸序列數(shù)據(jù)中所用的符號和格式符合37C. F. R. § 1. 822中給出的規(guī)則。在此用光盤來提供序列列表。因此根據(jù)37CFR 1. 52 (e)通過參考的方式將含有序 列列表的光盤的內(nèi)容并入本申請。光盤以一式兩份的形式來提交，彼此間相互一致。光盤 標記為“拷貝1-序列列表”和“拷貝2-序列列表”。光盤含有下列文件CL3604seq list. ST25。SEQ ID N0s:l和2是用于從pZB4中擴增含甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因啟動子 (Pgap)的DNA片段的引物的核苷酸序列。SEQ ID NOs 3和4是用于從pZB4中擴增含tal編碼區(qū)的DNA片段的引物的核苷 酸序列。SEQ ID NOs 5和6是用于從Pgap及tal片段中擴增含Pgaptal的DNA片段的引物 的核苷酸序列。SEQ ID NOs 7和8是用于從pZB186中擴增含loxP: :Cm的DNA片段的引物的核
苷酸序列。SEQ ID NO :9是pM0DPgaptaltktCm質(zhì)粒的完整核苷酸序列。SEQ ID NOs 10和11是用于在具有pM0DPgaptaltktCm的轉(zhuǎn)化子中擴增含tal及 tkt編碼區(qū)的3kb DNA片段的引物的核苷酸序列。SEQ ID NO 12是pM0DPgapxylABCm質(zhì)粒的完整核苷酸序列。SEQ ID NOs 13 和 14 是用于從具有 pM0DPgapxylABCm 的 T2C、T3C、T4C 及 T5C 整合 子中擴增1.6kb PgapxylA DNA片段的引物的核苷酸序列。SEQ ID NOs 15 和 16 是用于從具有 pM0DPgapxylABCm 的 T2C、T3C、T4C 及 T5C 整合 子中擴增1.3kb xylB DNA片段的引物的核苷酸序列。SEQ ID NOs 17和18是用于從含pgm基因的3，末端部分、ldh基因及adhl基因 的5，末端部分的運動發(fā)酵單胞菌W1基因組DNA中擴增2268bp DNA片段的引物的核苷酸 序列。SEQ ID NOs 19和20是用于從pACYC184中擴增四環(huán)素抗性盒的引物的核苷酸序 列。SEQ ID NOs 21和22是用于生成loxP位點的寡聚核苷酸序列。SEQ ID NOs 23和24是用于生成loxP位點的寡聚核苷酸序列。SEQ ID NOs 25和26是用于從pHP 15578中擴增Specr盒的引物的核苷酸序列。SEQ ID NOs :27和28是用于從ZW1基因組DNA中擴增3' GF0R側(cè)翼DNA的引物 的核苷酸序列。SEQ ID NOs :29和30是用于從ZW1基因組DNA中擴增5' GF0R側(cè)翼DNA的引物 的核苷酸序列。
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SEQ ID NO :31 是 pGF0RSp-9ffff 質(zhì)粒的核苷酸序列。SEQ ID NOs 32和33是用于從pET_24a中擴增Karf-盒的引物的核苷酸序列。SEQ ID NO 34是來源于pZB4的大腸桿菌xylA表達盒的核苷酸序列。SEQ ID NOs 35和36是用于擴增Cre_表達盒的引物的核苷酸序列。SEQ ID NO 37是ZW801-4中被破壞的GF0R編碼區(qū)的完整的核苷酸序列(從起始 密碼子到原有的終止密碼子)。EQ ID NO 38是野生型GF0R編碼區(qū)的完整的核苷酸序列(從原有的起始密碼子 到原有的終止密碼子)。申請人:根據(jù)國際承認的用于專利程序的微生物保藏的布達佩斯條約將下述 生物學(xué)保藏物保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC) 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 發(fā)明詳述本發(fā)明描述了通過修飾內(nèi)源葡萄糖-果糖氧化還原酶(GF0R)基因進行了改造的 可利用木糖的重組發(fā)酵單胞菌菌株，以及制備GF0R被修飾的發(fā)酵單胞菌菌株的方法。本文 所述的方法包括任何可消除或減少GF0R酶活性的遺傳修飾，它可在木糖代謝期間導(dǎo)致木 糖醇產(chǎn)量的降低并增加乙醇產(chǎn)量。經(jīng)遺傳修飾后的、GF0R酶活性降低的、可利用木糖的發(fā) 酵單胞菌可用于通過發(fā)酵來生產(chǎn)乙醇的方法。通過全新的發(fā)酵單胞菌菌株所生產(chǎn)的乙醇可 用作化石燃料的替代能源。下述縮寫及定義將用于闡明本發(fā)明及權(quán)利要求?！捌咸烟?果糖氧化還原酶〃縮寫為GF0R。RM是豐富培養(yǎng)基。RMG5 % 是 RM+5 % 葡萄糖。RMG10% 是 RM+10% 葡萄糖。RMX8 % 是 RM+8 % 木糖。RMX2 % 是 RM+2 % 木糖。RMX5 % 是 RM+5 % 木糖。RMGX10% 8%是 RM+10%葡萄糖和 8%木糖。RMGX5% 8%是冊+5%葡萄糖和8%木糖?！盎颉笔侵赴ň幋a序列之前(5’非編碼序列)或之后(3’非編碼序列)的調(diào)控 序列在內(nèi)的可表達特定蛋白的核酸片段。“天然基因”或“野生型基因”是指與其自身調(diào)控序 列以天然狀態(tài)存在的基因。“嵌合基因”是指任何非天然基因的基因，含有不會同時以天然 狀態(tài)存在的調(diào)控序列及編碼序列。因此，嵌合基因可含有來自不同來源的調(diào)控序列及編碼 序列，或者來自相同來源的調(diào)控序列與編碼序列以與天然狀態(tài)不同的方式排列在一起。“內(nèi)
8源基因”是指在生物基因組中位于其天然位置的天然基因。“外源”基因是指在宿主生物中 通常不存在的基因，但是通過轉(zhuǎn)基因方式導(dǎo)入到宿主生物中。外源基因可包括插入到非天 然生物體內(nèi)的天然基因，或者嵌合基因。術(shù)語“基因構(gòu)建體”是指編碼用于表達一種或多種特定蛋白的核酸片段。在基因 構(gòu)建體中，基因在性質(zhì)上可以是天然的、嵌合的或者外源的。典型地，基因構(gòu)建體會含有“編 碼序列”?！熬幋a序列”是指編碼特定氨基酸序列的DNA序列?！皢幼印被颉捌鹗伎刂茀^(qū)”是指能夠控制編碼序列表達的DNA序列或者有功能的 RNA。通常，編碼序列位于啟動子序列的3’端。啟動子可以全部來自天然基因，或者由來自 天然存在的不同啟動子的不同元件組成，或者還可以含有合成的DNA片段。本領(lǐng)域的技術(shù) 人員知道在不同的組織或者細胞類群中、或在不同的發(fā)育階段、或為了對不同的環(huán)境條件 做出應(yīng)答，可使用不同的啟動子來指導(dǎo)基因表達。在絕大多數(shù)細胞類群中可在大部分時間 使基因進行表達的啟動子通常稱之為“組成型啟動子”。本申請中所用術(shù)語“表達”是指來源于某個基因的正義(mRNA)或反義RNA的轉(zhuǎn)錄 及穩(wěn)定累積。表達也可以指將mRNA翻譯為多肽?！胺戳x抑制”是指產(chǎn)生的反義RNA轉(zhuǎn)錄物 能夠抑制靶蛋白的表達?！斑^表達”是指在轉(zhuǎn)基因生物中基因產(chǎn)物的產(chǎn)量超過了正常的或非 轉(zhuǎn)化生物中的產(chǎn)量水平?！肮惨种啤笔侵刚xRNA轉(zhuǎn)錄物或片段的產(chǎn)生能夠抑制相同的或者 基本上相似的外源或內(nèi)源基因的表達(U. S. 5，231，020)。本申請中所用術(shù)語“信使RNA (mRNA) ”是指沒有內(nèi)含子并可由細胞翻譯為蛋白的 RNA。本申請中所用術(shù)語“非功能基因”是指不表達所編碼蛋白的基因——該基因在野 生型菌株中通常是內(nèi)源的?？稍谌魏嗡缴稀┤甾D(zhuǎn)錄、RNA加工或翻譯水平上破壞非 功能基因的表達。典型地，非功能基因極少或者不表達所編碼的蛋白。然而，它仍可編碼比 野生型蛋白具有更低酶活性的修飾蛋白。本申請中所用術(shù)語“轉(zhuǎn)化”是指將核酸片段轉(zhuǎn)入到宿主生物中，并可穩(wěn)定遺傳。轉(zhuǎn) 入的核酸可以是可在宿主細胞中維持的質(zhì)粒的形式，或者某些轉(zhuǎn)入的核酸也可以整合到宿 主細胞的基因組中。含有轉(zhuǎn)化核酸片段的宿主生物被稱為“轉(zhuǎn)基因”或“重組”或者“轉(zhuǎn)化” 生物。本申請中所用術(shù)語“質(zhì)?！奔啊拜d體”是指通常攜帶不參與細胞核心代謝的基因的 額外的染色體元件，一般以環(huán)狀雙鏈DNA分子的形式存在。這些元件可以是來自任何來源 的自主復(fù)制序列、基因組整合序列、噬菌體或核苷酸序列、線性或環(huán)狀、單鏈或雙鏈DNA或 RNA，其中一些核苷酸序列連接起來或者重構(gòu)成為獨特的構(gòu)建體，它可將啟動子片段、產(chǎn)生 所需基因產(chǎn)物的DNA序列以及合適的3’非翻譯序列轉(zhuǎn)入到細胞中。術(shù)語“可操作連接到”是指將核酸序列連接到單個核酸片段上，從而使其中某個的 功能受到另一個的影響。例如，啟動子當(dāng)能夠影響編碼序列的表達時，它可操作連接到編碼 序列上(即，編碼序列處于啟動子的轉(zhuǎn)錄控制下)。編碼序列可以正義方向或反義方向可操 作連接到調(diào)控序列上。術(shù)語“選擇標記”是指某種鑒定因子，通常是能夠根據(jù)標記基因的效果——例如對 抗生素的抗性來進行選擇的抗生素或化學(xué)抗性基因，其中上述效果用于追蹤目標核酸的遺 傳和/或鑒定繼承了目標核酸的細胞或生物。
術(shù)語“基本上消除了”木糖醇產(chǎn)生及“基本上沒有”副產(chǎn)物木糖醇是指使用典型的 實驗室分析所檢測木糖醇的量接近或者近似為0的情形。術(shù)語“高濃度的混合糖類”是指在培養(yǎng)基中的總糖濃度能使可利用木糖的運動發(fā) 酵單胞菌的GF0R突變株的生長受到抑制。盡管確切濃度會隨培養(yǎng)基中的其它組分有很大 變化，典型地，它高于約100g/L。術(shù)語“可發(fā)酵的糖”是指在發(fā)酵過程中可用作微生物的碳源的寡糖與單糖。術(shù)語“木質(zhì)纖維”是指同時含有木質(zhì)素及纖維素的組分。木質(zhì)纖維原料也可含有 半纖維素。術(shù)語“纖維質(zhì)”是指含有纖維素及包括半纖維素在內(nèi)的其它成分的組分。術(shù)語“糖化作用”是指從多糖中產(chǎn)生可發(fā)酵的糖類。術(shù)語“預(yù)處理的生物量”是指在糖化作用前進行過預(yù)處理的生物量?！吧锪俊笔侵溉我獾睦w維質(zhì)或木質(zhì)纖維原料，并包括含有纖維素、優(yōu)選地進一步 含有半纖維素、木質(zhì)素、淀粉、多糖和/或單糖的原料。生物量也可以含有其它組分，譬如蛋 白和/或脂類。生物量可以是單一來源，或者生物量可包括來自一種來源以上的混合物； 例如，生物量可以包括玉米棒子及玉米干草的混合物，或者草及葉子的混合物。生物量包括 單不限定于，生物能源作物、農(nóng)作物剩余物、城市生活垃圾、工業(yè)固體廢物、來自造紙廠的淤 泥、庭園垃圾、木材及林業(yè)垃圾。生物量的實施例，包括但不限定于，玉米粒、玉米棒子、諸 如玉米殼這樣的作物剩余物、玉米秸稈、草、小麥、小麥桿、大麥、大麥桿、秸稈、水稻桿、柳枝 稷、廢紙、甘蔗渣、高梁、大豆、從磨碎的谷子、樹木、枝條、根、葉片、木片、鋸屑、灌木和矮樹 中獲得的組分、蔬菜、水果、花及動物肥料?！吧锪克猱a(chǎn)物”是指由生物量糖化作用獲得的產(chǎn)物。生物量也可以在糖化作用 前進行預(yù)處理。本文所用的標準重組DNA及分子克隆技術(shù)在本領(lǐng)域是周知的，在Sambrook,J. ,Fritsch,E. F. and Maniatis,T. Molecular Cloning :A Laboratory Manual，2nd ed. ；Cold Spring Harbor Laboratory :ColdSpring Harbor，New York， 1989 (在下文 為 ‘‘Maniatis，，)；and bySilhavy, T. J.，Bennan，M. L and Enquist， L. W. Experiments withGene Fusions ；Cold Spring Harbor Laboratory :Cold Spring Harbor，New York，1984 ；and by Ausubel，F(xiàn).M. et al.，In Current Protocolsin Molecular Biology, published by Greene Publishing and Wiley-Interscience，1987， 中有描述。本發(fā)明涉及增加乙醇生產(chǎn)的、可利用木糖的發(fā)酵單胞菌的改造菌株。通過可利用 木糖的運動發(fā)酵單胞菌來提高乙醇產(chǎn)量的挑戰(zhàn)在于減少或消除木糖醇的合成，這(a)意味 著不會對碳吸(carbon sink)收造成增值；(b)抑制木糖利用的第一個步驟；及(c)可被磷 酸化成抑制細菌生長的毒性削弱的中間物。申請人已發(fā)現(xiàn)內(nèi)源GF0R酶主要負責(zé)體內(nèi)木糖 醇的合成，通過減少或消除GF0R酶活，可提高從木糖到乙醇的生產(chǎn)(速度、產(chǎn)量及滴度)?？衫媚咎堑陌l(fā)酵單胞菌宿主菌株任何能夠利用木糖作為碳源的發(fā)酵單胞菌菌株均可用作制備本發(fā)明菌株的宿主。 發(fā)酵單胞菌菌株，譬如已經(jīng)對木糖發(fā)酵成乙醇進行了改造的運動發(fā)酵單胞菌是更為有用 的。內(nèi)源基因可提供部分代謝途徑，或可通過任意已知的遺傳操作技術(shù)來進行改變以提供對木糖代謝有用的具有酶活性的蛋白。例如，內(nèi)源轉(zhuǎn)酮醇酶可與其它導(dǎo)入的酶活性相互補 產(chǎn)生木糖利用途徑。典型地，如通過參考整合到本申請中的US 5514583所述，將4個基因?qū)?入到運動發(fā)酵單胞菌中用來表達參與木糖代謝的4個酶(圖1)。它們包括編碼催化木糖轉(zhuǎn) 化為木酮糖的木糖異構(gòu)酶、及將木酮糖磷酸化以形成木酮糖5-磷酸的木酮糖激酶的基因。 此外，戊糖磷酸化途徑中的兩個酶——轉(zhuǎn)酮醇酶和轉(zhuǎn)醛醇酶，能將木酮糖5-磷酸轉(zhuǎn)化為可 將戊糖代謝與糖酵解中恩杜糖解途徑相關(guān)聯(lián)的中間物，可使木糖代謝為乙醇。編碼這些酶 的DNA序列可從諸如腸道細菌及某些酵母與真菌這樣的能代謝木糖的眾多微生物中的任 一一種來獲得。編碼區(qū)的來源包括黃單胞菌(Xanthomonas)、克雷伯氏桿菌(Klebsiella)、 埃希氏菌(Escherichia)、紅細菌(Rhodobacter)、黃桿菌(Flavobacterium)、醋 木干胃(Acetobacter)、罾 || 木干胃(Gluconobacter)、卞艮；^ 胃(Rhizobium)、 ± ■木干胃 (Agrobacterium)、沙門氏菌(Salmonella)、假單胞菌(Pseudomonads)及發(fā)酵單胞菌 (Zymomonas)。特別有用的是大腸桿菌的編碼區(qū)。編碼DNA序列可操作地連接到諸如運動發(fā)酵單胞菌甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動 子(GAP啟動子)，及運動發(fā)酵單胞菌烯醇化酶啟動子(EN0啟動子)這樣的、可在運動發(fā) 酵單胞菌細胞中表達的啟動子上。編碼區(qū)可單獨通過啟動子來表達，或者兩個或多個編 碼區(qū)連接成一個用同一個啟動子進行表達的操縱子。得到的嵌合基因可導(dǎo)入到發(fā)酵單 胞菌中并維持在質(zhì)粒上，或使用譬如同源重組、定點整合或隨機整合的方式整合到基因 組中。具體所用的可利用木糖的菌株包括CP4(pZB5) (US 5514583)、ATCC31821/pZB5 (US 6566107)、8b(US20030162271 ；Mohagheghi et al.，(2004)Biotechnol. Left. 25 ；321-325) 及ZW658 (在本文中進行描述；保藏，ATTCC#PTA-7858)。也可在本發(fā)明過程中使用進行了其它改造以利用不屬于天然底物的、與木糖類似 的其它糖類的發(fā)酵單胞菌菌株。在us 5843760中描述了改造后可利用阿拉伯糖的運動發(fā) 酵單胞菌菌株的實施例，通過參考的方式并入到本申請中。發(fā)現(xiàn)由GF0R進行的木糖醇合成由可利用木糖的運動發(fā)酵單胞菌菌株合成的有害副產(chǎn)物——木糖醇，會降低乙醇 的產(chǎn)量并導(dǎo)致可抑制細菌生長的毒性組分——木糖醇-5-磷酸的形成(參見圖2)。此外， 木糖醇是在改造后木糖利用途徑中的第一個酶——木糖異構(gòu)酶的有效抑制物，它的合成會 降低細胞代謝木糖的能力。盡管體外實驗已表明在運動發(fā)酵單胞菌中至少有兩個木糖醇形 成的途徑(Feldmann et al.同上，Danielson et al.同上)，申請人發(fā)現(xiàn)生理產(chǎn)生的大部 分木糖醇是GF0R酶活的結(jié)果。如本文所述，現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)由在含有木糖的培養(yǎng)基上培養(yǎng)的可 利用木糖(或野生型運動發(fā)酵單胞菌的木酮糖合成的衍生物)的運動發(fā)酵單胞菌菌株合成 的木糖醇的量在缺少GF0R酶活時明顯降低了。申請人已發(fā)現(xiàn)木糖到木酮糖的轉(zhuǎn)化是體內(nèi) GF0R介導(dǎo)的木糖醇產(chǎn)生的先決條件，該反應(yīng)僅發(fā)生在可表達木糖異構(gòu)酶的運動發(fā)酵單胞菌 菌株中。因此，認為改造后可利用木糖生長的運動發(fā)酵單胞菌菌株中木糖醇的主要生理性 來源是由GF0R通過圖表II和III中描述的其中一個或兩個反應(yīng)來合成的。
木糖 +GFOR-NADP+木糖酸 +GFOR-NADPH
GFOR-NADPH + 未酮糖 ^~~ 木糖醇 + GFOR-NADP+
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圖表 II 需注意在兩個圖表中，木酮糖作為GF0R專性的電子接納體，并且該化合物被還原 成木糖醇，作為對比，在已知利用果糖的反應(yīng)中會產(chǎn)生山梨糖醇(圖表I)。盡管GF0R對葡萄 糖和果糖十分具有特異性，但已表明它也可以使用其它糖類作為電子供體和電子接納體， 雖然相當(dāng)稀少(Zachariou and Scopes (1986) Journal of Bacteriologyl67 :863_869)。 因此，當(dāng)將木糖和果糖與純化后的蛋白一起溫育時，可觀察到山梨糖醇的產(chǎn)生，但同使用葡 萄糖的對照反應(yīng)相比，GF0R酶活約降低了 12倍。在同一篇論文中，表明了木酮糖可以替代 果糖作為電子接納體，該反應(yīng)生成了如圖表III中所述的木糖醇。然而，使用該底物組合， GF0R的酶活性降低了約14倍。除了這些觀察資料外，還表明當(dāng)向提供木酮糖來源的反應(yīng) 混合物中加入純化的木糖異構(gòu)酶時，從野生型運動發(fā)酵單胞菌制備的無細胞提取物能夠從 木糖生成木糖醇(Danielson同上)，因此表明了 GF0R也能夠催化圖表II所述的反應(yīng)。不 過，無論在活細胞中是否發(fā)生了這些GF0R介導(dǎo)的反應(yīng)、如果發(fā)生了它們對體內(nèi)木糖醇的形 成又有多大程度的影響，在申請人的發(fā)現(xiàn)之前仍有待確定。同樣不確定的還有也存在于野 生型運動發(fā)酵單胞菌無細胞提取物中的能夠直接將木糖轉(zhuǎn)化為木糖醇的NADPH依賴的醛 糖還原酶活性(Feldmarm et al.同上)。實際上，沒有一個利用無細胞提取物的實驗關(guān)注 過上述關(guān)于GF0R與NADPH依賴的醛糖還原酶對體外木糖醇形成的相對貢獻，更不用說在經(jīng) 過相關(guān)條件下的體內(nèi)實驗了。因此，申請人關(guān)于在改造后可利用木糖生長的運動發(fā)酵單胞 菌，于生理條件下，在含木糖培養(yǎng)基中主要是由GF0R來負責(zé)木糖醇的產(chǎn)生的這個發(fā)現(xiàn)是令 人震驚的，不能通過以前的技術(shù)進行預(yù)測。改變GF0R基因表達對本發(fā)明中可利用木糖的發(fā)酵單胞菌進行改造，使其GF0R編碼基因的表達降低 或者不表達，從而減少木糖醇的合成。本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的、任何可減少有功能的酶的 遺傳修飾方法均可用來改變GF0R的表達。方法包括但不限制于，刪除編碼GF0R的基因的 整個基因或其一部分、將一段DNA片段插入到GF0R基因(在啟動子或者編碼區(qū)內(nèi))中從 而不表達蛋白或者在更低水平進行表達、向GF0R編碼區(qū)引入可增加終止密碼子或移碼的 突變從而不表達有功能的蛋白、以及向GF0R編碼區(qū)引入一個或多個突變以改變氨基酸從 而表達的是無功能的或者只有較低酶活性的蛋白。此外，可通過表達反義RNA或干擾RNA 來封閉GF0R的表達，可引入能夠產(chǎn)生共抑制的構(gòu)建體。本領(lǐng)域技術(shù)人員利用編碼GF0R酶 的已知序列(SEQ ID NO :3)可以很容易地實現(xiàn)所有這些方法。在某些修飾過程中，GF0R 編碼序列周圍的DNA序列也是有用的，其可由運動發(fā)酵單胞菌完整基因組序列(GenBank Accession#AE008692)中獲得。如本申請實施例3和5中所示，一種特別合適的用來產(chǎn)生遺傳修飾的GF0R菌株的 方法是，使用通過結(jié)合有壯觀霉素抗性基因或者其它選擇標記的GF0R側(cè)翼DNA序列介導(dǎo)的 同源重組，將選擇標記插入到GF0R編碼區(qū)從而不會表達有功能的GF0R酶。此外，選擇標記也可以有位點特異性的重組位點，通過接下來表達相應(yīng)的位點特異性的重組酶，可在不回 復(fù)GF0R基因活性的情況下將抗性基因從GF0R基因上切除。位點特異性重組會留下一個重 組位點，它會破壞GF0R酶的表達。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知，可構(gòu)建同源重組載體，在切除 選擇標記后同樣可在GF0R基因中產(chǎn)生缺失。優(yōu)選地，應(yīng)徹底消除GF0R的表達，不過，GF0R表達的顯著降低也是本發(fā)明的體現(xiàn)。 在此情況下，無功能的GF0R基因是指不以正常方式發(fā)揮功能，從而低于GF0R酶的正常水 平。某些基因失活的方法可導(dǎo)致仍有某些殘留的低水平表達，譬如共抑制。本文中，修飾的 GF0R菌株是指具有較少或者沒有GF0R酶活性的遺傳修飾菌株。GF0R修飾菌株的生長和乙 醇生成在缺少或者存在其它糖類(“混合糖類”)的情況下，于含木糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā) 明中GF0R修飾的、可利用木糖的發(fā)酵單胞菌?；旌咸穷惡兄辽僖环N除木糖之外的其它糖 類。任何可為發(fā)酵單胞菌細胞代謝提供能量來源的糖類、或者任何存在于含有木糖的混合 物中的糖類均可包括在內(nèi)。希望能夠利用由生物量糖化作用(biomasssaccharification) 產(chǎn)生的糖類培養(yǎng)GF0R修飾的、可利用木糖的運動發(fā)酵單胞菌細胞。典型地，例如專利申請 W02004/081185以及共有且共同未決的美國專利申請60/670437中所述那樣，生物量是經(jīng) 過預(yù)處理的，然后如 Lynd，L. R.，et al. (Microbiol. Mol. Biol. Rev. (2002)66:506-577)所 綜述用糖化作用的酶進行處理。生物量糖化作用產(chǎn)生的糖類，典型地含有木糖與葡萄糖、果 糖、蔗糖、半乳糖、甘露糖和/或阿拉伯糖的混合物。優(yōu)選地，混合糖類組分中含有木糖與葡 萄糖，其中也可以有其它糖類?；旌衔镏胁煌穷惖谋壤梢杂泻艽蟛町?，典型地，木糖至少為總糖量的約10%。 優(yōu)選地，木糖為約40%至約60%之間。在糖類中存在由某些生物量譬如甘蔗渣的糖化作用 所產(chǎn)生的果糖，可替代一部分木糖或者葡萄糖，這樣木糖至少占糖類混合物的約10%。此 外，阿拉伯糖來源于半纖維素，并且是來源于含半纖維素的糖化生物量的混合糖類中的典 型成分。在不屬于GF0R修飾菌株的、可利用木糖的運動發(fā)酵單胞菌菌株不會產(chǎn)生木糖醇 的發(fā)酵條件下，本發(fā)明中GF0R修飾的可利用木糖的運動發(fā)酵單胞菌菌株可生長并產(chǎn)生與 非GF0R修飾菌株等量的乙醇。例如，在譬如約100g/L的混合糖類、其中葡萄糖與木糖的 比為5 4的低糖培養(yǎng)基中，GF0R修飾的、可利用木糖的運動發(fā)酵單胞菌細胞表現(xiàn)得與非 GF0R修飾菌株很相似。為了在發(fā)酵時獲得最大的乙醇產(chǎn)量及效率，希望可在含包括木糖在內(nèi)的高水平糖 類的培養(yǎng)基中培養(yǎng)可利用木糖的產(chǎn)乙醇生物。為了培養(yǎng)本發(fā)明的運動發(fā)酵單胞菌菌株，可 在培養(yǎng)基中使用高濃度的混合糖類。這樣可以直接使用生物量糖化作用的糖類，或者略加 稀釋后使用，從而減少發(fā)酵物體積——這在商業(yè)規(guī)模的乙醇生產(chǎn)中是很受歡迎的。使用高 糖濃度可產(chǎn)生更高濃度的乙醇。在發(fā)酵培養(yǎng)基中混合糖類的濃度典型地為至少約120g/L 直至約300g/L。特別有用的是濃度在約150g/L到約235g/L之間的高濃度混合糖類。在期望生產(chǎn)乙醇的高濃度混合糖類條件下，GF0R修飾的可利用木糖的運動發(fā)酵單 胞菌所用的發(fā)酵培養(yǎng)基中含有山梨糖醇。申請人驚奇地發(fā)現(xiàn)向高混合糖類培養(yǎng)基中添加山 梨糖醇可使GF0R修飾的、可利用木糖的運動發(fā)酵單胞菌生長很好，而未加入山梨糖醇的、 GF0R修飾的、可利用木糖的運動發(fā)酵單胞菌極少生長或不生長。這與可產(chǎn)生GF0R的菌株明顯相反，后者在延遲期12-36小時后不添加山梨糖醇的情況下能夠適應(yīng)濃縮的糖類混合 物。在缺少果糖或蔗糖(作為果糖來源)的培養(yǎng)基中，認為GF0R不會合成山梨糖醇或者在 滲透適應(yīng)中發(fā)揮作用。當(dāng)生長培養(yǎng)基中沒有果糖時，如圖表I所示的GF0R在山梨糖醇合成 中的已知反應(yīng)無法繼續(xù)。具有正常GF0R酶活性的、可利用木糖的運動發(fā)酵單胞菌菌株能夠 在濃縮的葡萄糖和木糖混合物中生長的能力——盡管有一個長的延遲期，表明了通過GF0R 進行的山梨糖醇合成對于滲透適應(yīng)不是必需的，因為沒有果糖，GF0R不會合成山梨糖醇。因 而在缺少果糖的生長培養(yǎng)基中，消除GF0R酶活性不會對山梨糖醇產(chǎn)生水平有什么影響，在 濃縮的葡萄糖和木糖混合物中，GF0R修飾的、可利用木糖的運動發(fā)酵單胞菌菌株生長對山 梨糖醇的需求是完全未料到的。在培養(yǎng)基中可含有濃度在約2mM到200mM之間的山梨糖醇(D-山梨糖醇和/或 L-山梨糖醇)。在培養(yǎng)基中更為適合的終濃度為濃度在約2mM到lOOmM之間，濃度在5mM 到20mM之間是優(yōu)選的。在培養(yǎng)基中也可使用甘露醇來替代山梨糖醇，或與山梨糖醇一起使 用。在通過參考并入本申請的共有且共同未決的美國申請#60/847997中，發(fā)現(xiàn)甘露醇具有 與山梨糖醇相似的效應(yīng)。此外，發(fā)現(xiàn)半乳糖醇和/或核糖醇可用來替代山梨糖醇或甘露醇 或者與其一起使用。山梨糖醇、甘露醇、半乳糖醇、核糖醇或其組合均可以以同關(guān)于山梨糖 醇的描述中相同的濃度來應(yīng)用。在不屬于GF0R修飾菌株的、可利用木糖的運動發(fā)酵單胞菌菌株能夠產(chǎn)生木糖醇 的發(fā)酵條件下，譬如在存在或缺少諸如乙酸鹽這樣的抑制物的高糖培養(yǎng)基中，本發(fā)明的 GF0R修飾的、可利用木糖的運動發(fā)酵單胞菌菌株表現(xiàn)得要優(yōu)于GF0R未修飾的菌株。申請人 發(fā)現(xiàn)所消耗的木糖總量與最終乙醇滴度在GF0R修飾菌株中均大于未修飾的菌株。此外，在 相應(yīng)處理條件下，GF0R修飾的、可利用木糖的運動發(fā)酵單胞菌在發(fā)酵中沒有產(chǎn)生木糖醇，盡 管在本文實施例6中所示的特定環(huán)境中通過非GF0R機制可能會有少量合成。木糖利用及乙醇生產(chǎn)中的改進在不同的發(fā)酵條件下會有所變化。在GF0R未被 修飾的、可利用木糖的運動發(fā)酵單胞菌菌株可產(chǎn)生高水平木糖醇的條件下，缺少木糖醇合 成對GF0R突變體會產(chǎn)生更大影響。例如，當(dāng)在培養(yǎng)基中存在諸如乙酸鹽這樣的抑制物時， GF0R未修飾的菌株產(chǎn)生了更多量的木糖醇。這種木糖醇的產(chǎn)生可通過GF0R突變來徹底消 除，該突變會使得木糖利用及乙醇產(chǎn)生比在不使用GF0R突變體來產(chǎn)生少量木糖醇的條件 下有更大增加。由于在處理后的纖維質(zhì)生物量中特別存在乙酸鹽，希望利用來源于處理后 的纖維質(zhì)生物量的碳源生長的、產(chǎn)乙醇生物對乙酸鹽具有更低的敏感性。因此，當(dāng)在發(fā)酵中 使用生物量水解物時，利用GF0R修飾的、可利用木糖的運動發(fā)酵單胞菌菌株進行的發(fā)酵會 特別有益。生產(chǎn)乙醇的發(fā)酵對于乙醇生產(chǎn)，將重組的GF0R修飾的、可利用木糖的運動發(fā)酵單胞菌接種到含包 括木糖在內(nèi)的混合糖類的培養(yǎng)基上。當(dāng)混合糖類的濃度高到可抑制生長時，培養(yǎng)基含有山 梨糖醇、甘露醇或其混合物。半乳糖醇或核糖醇可以替代山梨糖醇或甘露糖醇，或與它們組 合使用。在可進行發(fā)酵并產(chǎn)生乙醇的培養(yǎng)基上培養(yǎng)運動發(fā)酵單胞菌。發(fā)酵在無需補充空氣、 氧氣或其它氣體的條件下進行(它包括諸如厭氧、微需氧或者微好氧發(fā)酵這樣的條件)至 少約24小時，也可進行30小時或以上。到達最大乙醇產(chǎn)量的時間是不同的，依賴于發(fā)酵條 件。典型地，如果在培養(yǎng)基中存在抑制物，則需要有更長的發(fā)酵周期。發(fā)酵可以在約30°C到約37°C之間的溫度下于約4. 5到約7. 5的pH值下進行。在實驗室規(guī)模的發(fā)酵中，以及在可產(chǎn)生商品化用量的乙醇的規(guī)模放大的發(fā)酵中， 可在含包括木糖在內(nèi)的混合糖類的培養(yǎng)基中培養(yǎng)GF0R修飾的、可利用木糖的運動發(fā)酵單 胞菌，當(dāng)希望獲得商品化產(chǎn)量的乙醇時，可應(yīng)用不同的培養(yǎng)方法。例如，可通過批式培養(yǎng)及 持續(xù)培養(yǎng)方法從GF0R修飾的、可利用木糖的運動發(fā)酵單胞菌進行大規(guī)模產(chǎn)物的生產(chǎn)。典型 的批式培養(yǎng)法是一個封閉的體系，其中在培養(yǎng)開始時設(shè)定好培養(yǎng)基的組分，在培養(yǎng)過程中 不進行人為改變。這樣，在培養(yǎng)過程開始時，將培養(yǎng)基與期望的生物一起溫育，不需向體系 中加入什么即可進行生長并有代謝活性。不過典型地，“批式”培養(yǎng)根據(jù)加入的碳源來分批， 通常嘗試去控制諸如pH及氧濃度這樣的因素。在批式體系中，系統(tǒng)的代謝物及生物量組分 持續(xù)改變直至培養(yǎng)結(jié)束。在批式培養(yǎng)中細胞平和地通過靜態(tài)延遲期到高速生長的對數(shù)期， 最終到達生長速率降低或終止的穩(wěn)定期。如果不經(jīng)處理，穩(wěn)定期的細胞終將死亡。在某些 體系中，終產(chǎn)物或中間產(chǎn)物產(chǎn)量中的大多數(shù)通常是由對數(shù)期的細胞產(chǎn)生的。在其它體系中 可獲得穩(wěn)定期或者對數(shù)后期的產(chǎn)量。標準批式體系的一個變型是補料批式體系。對于GF0R修飾的、可利用木糖的運 動發(fā)酵單胞菌，補料批式培養(yǎng)過程也是適用的，它包括一個典型的批式體系，只是在培養(yǎng)過 程中將底物以增量形式加入。當(dāng)分解代謝抑制會抑制細胞的代謝并且希望培養(yǎng)基中只有 有限量的底物時可使用補料批式體系。在補料批式體系中測定實際底物濃度是困難的， 因此可基于諸如PH以及廢氣例如C02分壓這樣的可測定因素的改變來進行估算。批式及 補料批式培養(yǎng)方法在本領(lǐng)域中是常見的并且是周知的，可在Biotechnology :A Textbook of IndustrialMicrobiology, Crueger, Crueger, and Brock, Second Edition(1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA, or Deshpande, Mukund V. , Appl. Biochem. Biotechnol. ,36,227, (1992)中找到示例，此處通過參考的方式并入本申請。商品化的乙醇生產(chǎn)也可通過持續(xù)培養(yǎng)來完成。持續(xù)培養(yǎng)是開放體系，其中向生物 反應(yīng)器中持續(xù)加入給定的培養(yǎng)基，并同時移走等量的條件培養(yǎng)基。持續(xù)培養(yǎng)通常使細胞維 持在一個恒定的高液相密度，其中細胞主要處于對數(shù)期生長之中。或者，可通過固定細胞來 實現(xiàn)持續(xù)培養(yǎng)，其中持續(xù)加入碳源和營養(yǎng)物，并從細胞團中持續(xù)移走有價值的產(chǎn)物、副產(chǎn)物 或廢物?？墒褂迷S多由本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的天然和/或合成材料組成的固相支持物來進 行細胞固定。持續(xù)或半持續(xù)培養(yǎng)允許調(diào)節(jié)可影響細胞生長或終產(chǎn)物濃度的某個因素或多個因 素。例如，某個方法可以以固定速率來維持，諸如碳源或氮源水平這樣的限制性養(yǎng)分，同時 調(diào)整所有其它參數(shù)。在其它體系中，當(dāng)通過培養(yǎng)基濁度來測定的細胞濃度保持恒定時，可持 續(xù)改變許多影響生長的因素。持續(xù)體系試圖維持穩(wěn)定狀態(tài)的生長條件，從而由于移走培養(yǎng) 基造成的細胞損失與培養(yǎng)基中細胞生長速率是相平衡的。在持續(xù)培養(yǎng)過程中調(diào)節(jié)養(yǎng)分及生 長因素從而使產(chǎn)物形成速率最大化的方法以及技術(shù)在工業(yè)微生物領(lǐng)域是周知的，Brock,同 上，詳細描述了多種方法。特別適合乙醇生產(chǎn)的發(fā)酵形式如下所述。在搖瓶的半復(fù)合培養(yǎng)基中，于約30°C 到約37°C以約150rpm的速度在定軌搖床中培養(yǎng)所需的GF0R修飾的、可利用木糖的運動 發(fā)酵單胞菌菌株，然后轉(zhuǎn)移到含有相似培養(yǎng)基的10L種子發(fā)酵罐中。在種子發(fā)酵罐中無氧 培養(yǎng)種子培養(yǎng)物直至0D_在3到6之間，此時將其轉(zhuǎn)移到產(chǎn)物發(fā)酵罐，在這里對發(fā)酵參數(shù)進行優(yōu)化以生產(chǎn)乙醇。從種子罐中轉(zhuǎn)入到的產(chǎn)物罐中典型的接種物體積范圍從約2%到約20% ν/ν。典型的發(fā)酵培養(yǎng)基含有諸如磷酸鉀(1. 0-10. Og/Ι)、硫酸銨(0-2. Og/Ι)、硫酸鎂 (0-5. Og/Ι)、復(fù)合氮源，例如酵母提取物或大豆堿性產(chǎn)物(0-10g/l)這樣的基本培養(yǎng)基組 分。在培養(yǎng)基中存在終濃度為約5mM的山梨糖醇或甘露醇。將提供碳源的包括木糖及至少 一種其它糖類，譬如葡萄糖(或蔗糖)在內(nèi)的混合糖類，持續(xù)加入到培養(yǎng)罐中彌補最初批次 碳源(50-200g/l)的損耗以最大化乙醇產(chǎn)率及滴度。可動態(tài)調(diào)節(jié)碳源補給速率，以確保培 養(yǎng)物不會過量累積葡萄糖，這會導(dǎo)致諸如乙酸這樣的有毒副產(chǎn)物的增加。為了從所利用的 底物來實現(xiàn)乙醇產(chǎn)量的最大化，生物量生長受批式起始時或發(fā)酵過程中加入的磷酸鹽的量 的控制。使用苛性溶液(譬如氫氧化銨、氫氧化鉀或氫氧化鈉)及硫酸或磷酸將PH值控制 在5. 0-6.0。將發(fā)酵溫度控制在30°C-35°C。為了使泡沫最小化，如有需要則向罐中加入防 沫劑(任何種類——基于硅樹脂、基于有機物等)?？蛇x擇性地使用諸如卡那霉素這樣的抗 生素——菌株中存在該種抗生素的抗性基因，以使污染最小化。任何上述條件及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的這些條件的其它改變，均是由可利用木糖 的重組發(fā)酵單胞菌菌株來生產(chǎn)乙醇的合適條件。實施例本發(fā)明通過以下實施例進行進一步詳細說明。應(yīng)理解這些描述本發(fā)明的優(yōu)選實施 方案的實施例僅起示例性作用。通過以上討論及這些實施例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可了解本 發(fā)明的基本特征，而且在不偏離其主旨和范圍的情況下，可對本發(fā)明進行各種改變和修改 以使其滿足不同用途和情形。常規(guī)方法此處所用的標準重組DNA和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，在Sambrook，J.， Fritsch,Ε. F. and Maniatis,Τ· ,Molecular Cloning :A Laboratory Manual,2nd ed. ,Cold Spring Harbor Laboratory :ColdSpring Harbor, NY(1989)(在下文中為“Maniatis，，)； and by Silhavy, T. J. , Bennan,M. L. and Enquist, L. W. ,Experiments with GeneFusions, Cold Spring Harbor Laboratory :Cold Spring Harbor, NY(1984) ；and by Ausubel, F. M. et al·,Current Protocols in MolecularBiology,published by Greene Publishing Assoc. and ffiley-Interscience, Hoboken, NJ(1987)中有描述?？s寫的含義如下”kb”是指千堿基，“bp”是指堿基對，“nt”是指核苷酸，”hr”是 指小時，“min”是指分鐘，"sec"是指秒，“d”是指天，“L”是指升，“ml”是指毫升，“ μ L”是 指微升，“ μ g”是指微克，“ng”是指納克，“mM”是指毫摩爾，“ μ Μ”是指微摩爾，“nm”是指納 米，“ymol”是指微摩爾，“pmol”是指皮摩爾，“Cm”是指氯霉素，"Cnf “是指氯霉素抗性， “Cms”是指氯霉素敏感，“Sf “是指壯觀霉素抗性，“Sps”是指壯觀霉素敏感，“XI”是木糖異 構(gòu)酶，“XK”是木酮糖激酶，“TAL”是轉(zhuǎn)醛醇酶，“TKT”是轉(zhuǎn)酮醇酶，“EFT”是指經(jīng)過的發(fā)酵時 間，“冊”是指含10g/L酵母提取物及2g/L KH2PO4的豐富培養(yǎng)基，“匪”是指含10g/L酵母提 取物、5g/L 胰蛋白胨、2. 5g/L (NH4)2SO4 和 0. 2g/L KH2PO4 的接合培養(yǎng)基(mating medium)。制備用于酶活測定的發(fā)酵單胞菌的無細胞提取物將細胞在50ml RM+2%葡萄糖中，30°C培養(yǎng)過夜至OD6tltl為1. 0-1. 2。于4500rpm， 4°C離心10分鐘收獲細胞。除去上清，并用25ml冰冷的超聲緩沖液(IOmM Tris, pH 7. 6， IOmM MgCl2)洗滌細胞沉淀，然后在4500rpm離心10分鐘。將細胞沉淀重懸在2. 0-2. 5ml補加ImM 二硫蘇糖醇的超聲緩沖液中。以每份500 μ 1的量在Eppendorf離心機中于4°C離心1分鐘。除去大部分上清液，剩余約10-20 μ 1以防止沉淀干燥。將細胞冷凍并儲存 在_80°C，以備檢測。在檢測前，將細胞融化，并用500 μ 1補加ImM 二硫蘇糖醇的超聲緩沖 液重懸。將混合物用Branson超聲儀450在62%占空比(duty cycle)，輸出控制為2的條 件下超聲2次，每次45秒，在兩次超聲之間保持樣品冷凍3-5分鐘。將樣品用Beckman離 心機，于14，000rpm，4°C離心60分鐘。將上清轉(zhuǎn)移到新管中，并保持在4°C。使用Pierce BCA檢測法測定蛋白濃度。通常首先進行轉(zhuǎn)酮醇酶(TKT)檢測，因為該酶比其它酶更不穩(wěn)定。TKT檢測的圖如 圖3A所示。在微孔板檢測中，于30°C下，將20μ 1無細胞提取物加入到各孔中、包含下述組分 的反應(yīng)混合物中，所述反應(yīng)混合物包括以下終濃度的組分0. 37mM NADP、50mM TrisHCl pH 7. 5,8. 4mM Mg Cl2,0. ImM TPP (焦磷酸硫胺素氯化物)、0· 6福E4P (赤蘚糖-4-磷酸)、4mM BHP (β羥基丙酮酸)、4U/ml PGI (磷酸葡萄糖異構(gòu)酶)、及4U/ml G6PD (葡萄糖-6-磷酸脫 氫酶)。在微孔板讀數(shù)儀上讀取A34(i3-5分鐘。TKT活性計算如下1單位相當(dāng)于在30°C下形成1 μ mol D-果糖_6_磷酸/分鐘。U(微摩爾/分鐘)=斜率(dA340/分鐘)*反應(yīng)體積(μ L)/6220/0. 55cm(NADP — NADPH的摩爾數(shù)是在Icm比色皿中每摩爾每L 6220A340)。(微孔板中每孔200 μ 1 光程長(pathlength) = 0. 55cm)比活性(ymole/min-mg) = μ mole/min/蛋白濃度(mg)轉(zhuǎn)醛醇酶(TAL)檢測的基礎(chǔ)如圖3B所示。在微孔板檢測中，在30°C下，將20 μ 1 無細胞提取物加入到各孔中、包含下述組分的反應(yīng)混合物中，所述反應(yīng)混合物包括以下終 濃度的組分0. 38mMNADH、87mM 三乙醇胺、17mM EDTA、33mM F6P(果糖-6-磷酸)、1. 2mM E4P (赤蘚糖-4-磷酸)、2. OU/ml GDH (甘油-3-磷酸脫氫酶)和20U/ml TPI (丙糖磷酸異 構(gòu)酶)。將板溫育5分鐘。然后讀取~4(|3-5分鐘。TAL活性計算如下1單位相當(dāng)于在30°C 下每分鐘形成lymol D-甘油醛。U (微摩爾/分鐘)=斜率(dA340/分鐘)*反應(yīng)體積(μ L) /6220/0. 55cm(NADH — NAD的摩爾數(shù)是在Icm比色皿中每摩爾每L 6220A340)。(微孔板中每孔200μ 1光程長=0. 55cm)比活性(μ mole/min-mg) = μ mole/min/蛋白木糖異構(gòu)酶(XI)檢測的基礎(chǔ)如圖3C所示。在微孔板檢測中，在30°C下，將20 μ 1 無細胞提取物加入到各孔中、包含下述組分的反應(yīng)混合物中，所述反應(yīng)混合物包括以下終 濃度的組分0. 256mMNADH、50mM木糖、IOmM MgSO4、IOmM三乙醇胺和lU/ml SDH (山梨糖醇 脫氫酶)。在微孔板讀數(shù)儀上讀取^4(|3-5分鐘。XI活性計算如下1單位相當(dāng)于在30°C 下每分鐘形成lymol D-木酮糖。U(微摩爾/分鐘)=斜率(dA34(/分鐘)*反應(yīng)體積 (μ L)/6220/0. 55cm(NADHP — NAD的摩爾數(shù)是在Icm比色皿中每摩爾每L 6220A340)。(微孔板中每孔200μ 1光程長=0. 55cm)比活性(μ mole/min-mg) = μ mole/min/蛋白濃度(mg)木酮糖激酶(XK)檢測的基礎(chǔ)如圖3D所示。在微孔板檢測中，在30°C下，將20 μ 1無細胞提取物加入到各孔中、包含下述組分的反應(yīng)混合物中，所述反應(yīng)混合物包括以下 終濃度的組分0. 2mM NADH、50mM Tris HCl pH 7. 5,2. Omm MgCl2_6H20、2. OM ATP 0. 2M PEP (磷酸烯醇式丙酮酸)、8. 5mM D-木酮糖、5U/ml PK (丙酮酸激酶)和5U/ml LDH(乳酸 脫氫酶)。在微孔板讀數(shù)儀上讀取A34(i3-5分鐘。XI活性計算如下
1單位相當(dāng)于在30°C下每分鐘1 μ mol D-木酮糖轉(zhuǎn)變?yōu)镈-木酮糖_5_磷酸。U (微摩爾/分鐘)=斜率(dA340/分鐘)*反應(yīng)體積(μ L) /6220/0. 55cm(NADH — NAD的摩爾數(shù)是在Icm比色皿中每摩爾每L 6220A340)。(微孔板中每孔200μ 1光程長=0. 55cm)比活性(ymole/min-mg)= μ mole/min/蛋白濃度(mg)HPLC 方法用Agilent 1100 系列 HPLC 和 Agilent ChemStation 軟件進行 LC3D 分析。柱 子用的是帶有 BioRad Micro-Guard Cartridge Cation-H(125_0129)的 BioRad Aminex HPX-87H(HPLC有機分析柱125-0140)。操作條件如下流速 0. 6mL/min溶劑(XOlNH2SO4停止時間 25min注射體積 5yL自動進樣溫度控制@10°C或4°C柱溫55 °C檢測器折射系數(shù)(40°C)使用外部標準校準曲線實施例1構(gòu)建可發(fā)酵木糖的運動發(fā)酵單胞菌菌株ZTO58通過一系列轉(zhuǎn)座事件將兩個包含編碼木糖異構(gòu)酶、木酮糖激酶、轉(zhuǎn)醛醇酶和轉(zhuǎn)酮 醇酶的四個木糖利用基因的操縱子PgapXylAB和Pgaptaltkt整合到ZWl (ATCC#31821)基因組 中，然后在含木糖的選擇培養(yǎng)基上適應(yīng)而構(gòu)建ZW658。如美國專利申請20030162271所述， 以前已通過向運動發(fā)酵單胞菌5C的基因組進行同源重組及轉(zhuǎn)座方法而整合了兩個操縱子 PgapxylAxylB和Pen。taltkt及選擇性抗生素標記，然后通過適應(yīng)和NTG突變構(gòu)建了命名為8b 的、可發(fā)酵木糖的運動發(fā)酵單胞菌。在制備ZW658時，使用了轉(zhuǎn)座(Epicentre' s EZ::Tn 體外轉(zhuǎn)座系統(tǒng))，因為該方法相對于位點特異的同源重組的優(yōu)勢在于，整合位點具有多種選 擇，而且插入頻率相對較高。將編碼木糖利用的酶的四個基因排列并克隆在兩個獨立的操 縱子PgapXylAB和Pyaptaltkt中以用于整合。將抗生素抗性標記——旁側(cè)為兩個Pl噬菌體 Cre重組酶識別序列(IoxP)的氯霉素抗性(Cnf)基因克隆到每個操縱子中用于整合子的篩 選。兩個操縱子的整合通過Pgaptaltkt，然后是PyapXylAB的兩步連續(xù)方式完成。在兩個整 合事件中均使用Cm抗性選擇，因為它可通過質(zhì)粒上的Cre重組酶的表達，然后在每次整合 后通過消除質(zhì)粒而除去。該過程可允許用相同的抗生素標記進行多次篩選。更重要的是， 它允許去除引入的用于篩選整合的操縱子的抗生素標記。該過程消除了抗生素抗性基因?qū)?商用發(fā)酵菌株的負面影響。構(gòu)建用于轉(zhuǎn)座的PM0DPgaptaltkfCm如美國專利申請20030162271 (本文實施例9)所述，從pUCtaltkt (美國專利申請20030162271)中通過Bglll/Xbal消化分離出2. 2kb含大腸桿菌轉(zhuǎn)酮醇酶(tkt)編碼區(qū)的 DNA 片段，并克隆到用 BamHl/Xbal 消化的 pMOD (Epicentre Biotechnologies,Madison, WI) 載體中，得到pMODtkt。通過將運動發(fā)酵單胞菌gap基因的啟動子區(qū)(Pgap ；甘油醛-3-磷 酸脫氫酶)與大腸桿菌轉(zhuǎn)醛醇酶編碼區(qū)(tal)進行如下融合而得到命名為Pgaptal的PCR 片段。用描述在US 5514583(實施例3)中的構(gòu)建體pZB4通過引物SEQ ID NOs :1和2擴 增Pgap片段。pZB4含有Pgap-XylA/XylB操縱子和PEN<rtal/tkt操縱子。tal編碼區(qū)片段用 引物SEQ ID NOs 3和4從pZB4擴增。以Pgap和tal片段為模板，通過引物SEQ ID NOs 5 和6擴增Pgaptal片段。該片段用Xbal消化并克隆到質(zhì)粒pMODtkt的tkt編碼區(qū)上游。用 Cmlox (F, sf i)和 Cmlox (R，sf i)引物(SEQ ID NOs :7 和 8)，以 pZB186 為模板，通過 PCR 產(chǎn) 生IoxP Cm片段。pZB186是運動發(fā)酵單胞菌天然質(zhì)粒和pACYC184的組合，如US514583 (實 施例 3)和 Zhang et al. ((1995) Science 267:240-243)所述。最后，將 loxP::Cm PCR 片 段插入到含Pgaptaltkt的質(zhì)粒的Sfil位點，形成整合型質(zhì)粒pM0DPgaptaltktCm(圖4)。在 該質(zhì)粒中，PgaptaltktloXP: :Cm片段插入到pMOD載體的兩個嵌合末端(轉(zhuǎn)座酶結(jié)合位點)。 pM0DPgaptaltktCm質(zhì)粒的完整核苷酸序列如SEQ ID NO :9所示。pM0DPgaptaltktCm 在 ZWl中的轉(zhuǎn)座和轉(zhuǎn)化由于質(zhì)粒pMOD是基于pUC的載體，因此在發(fā)酵單胞菌中是非復(fù)制型載體。將質(zhì)粒 PM0DPgaptaltktCm用轉(zhuǎn)座酶在存在Mg2+時，室溫下處理1小時，并通過電穿孔轉(zhuǎn)化ZWl細胞 (使用BioRad GenePulser，設(shè)置為200ohms，25 μ F和16kV/cm)。將電穿孔的細胞在含IOg/ L酵母提取物、5g/L胰蛋白胨、2. 5g/L (NH4)2SO4^O. 2g/LK2HP04)，并補加50g/L葡萄糖和ImM MgSO4的結(jié)合培養(yǎng)基(MM)中，30°C溫育6小時。將轉(zhuǎn)化混合物涂布在補加50g/L葡萄糖和 120 μ g/mL氯霉素，并含15g/L Bacto瓊脂的匪瓊脂平板上，在30°C厭氧培養(yǎng)。約2天后 可見轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)座頻率約為3x107 μ g DNA。共獲得39個Cnf轉(zhuǎn)化子克隆。挑取21個克隆，并進一步通過PCR和酶活性檢測法 進行分析。用引物SEQ ID NOs 10和11通過PCR驗證在轉(zhuǎn)化子中確實存在含tal和tkt 編碼區(qū)的3kb DNA片段。用來自21個整合子克隆的質(zhì)粒DNA進行回復(fù)轉(zhuǎn)化，沒有在大腸桿 菌中產(chǎn)生回復(fù)轉(zhuǎn)化子，這表明tal和tkt整合到ZWl的基因組中。用修改的微孔板方法對 這些整合子檢測其轉(zhuǎn)醛醇酶和轉(zhuǎn)酮醇酶活性(一般方法)。用Pierce BCA蛋白檢測法測 定蛋白濃度。將轉(zhuǎn)化子在含2% (w/v)葡萄糖，并補加120 μ g/ml氯霉素的RM培養(yǎng)基，在 50ml錐形離心管中30°C培養(yǎng)。對照菌株8b與ZWl進行同樣培養(yǎng)(ZWl用補加2%葡萄糖的 RM)用于酶活性檢測。當(dāng)OD6tltl達到1. O時收獲細胞。將細胞洗滌1次并重懸在超聲緩沖液 (IOmM Tris-HCl, pH 7. 6和IOmM MgCl2)中。酶活性檢測如美國專利申請20030162271所 述。單位定義為mole/min-mg。除1株外，所有樣品均具有轉(zhuǎn)醛醇酶和轉(zhuǎn)酮醇酶活性。用tkt探針對用Pstl消化的、選擇的整合子基因組和質(zhì)粒DNA進行Southern雜 交。ZWl DNA不與tkt探針雜交。在所有整合子基因組DNA樣品中可見1條共同的1.5kb 帶，它是tkt的Pstl位點和tal的Pstl位點之間預(yù)期的DNA片段。第二個可見的高分子 量(6kb或更大)的帶是獨立株系T2、T3、T4和T5特有的，表明在每個株系中具有獨立的基 因組整合位點。有趣的是，Τ5的質(zhì)粒和基因組DNA均與tkt探針雜交，表明在Τ5的天然質(zhì) 粒中也整合了 Pgaptaltkt。選擇這4個菌株(T2、T3、T4和T5)進行進一步的Cre處理，以 除去Cnf標記。Cre處理以從tal tkt整合子中除去Cnf標記
為了從染色體中除去Cnf，用pZB 188/Spec-Cre轉(zhuǎn)化T2、T3、T4和T5。該質(zhì)粒是 發(fā)酵單胞菌-大腸桿菌穿梭載體 pZB188 [Zhang et al. (1995) Science 267 240-243 ；US 5514583]的衍生物，其包含Cre重組酶表達盒。除了用壯觀霉素抗性基因代替卡那霉素抗 性基因，pZB188/Spec-Cre與實施例10中描述的Cre表達載體(pZB188/Kan_Cre)相同。在 含2%葡萄糖和200 μ g/ml壯觀霉素的MM瓊脂培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子。將Splr抗性克隆挑取 到補加2%葡萄糖和200 μ g/ml壯觀霉素的RM瓊脂平板上，RM瓊脂平板補加2%葡萄糖和 120 μ g/mL Cm。挑取的克隆100%是Cms，這表明通過Cre高效去除Cnf。將SplrCms轉(zhuǎn)化子培 養(yǎng)在補加2%葡萄糖的RM中，37°C進行2到5次轉(zhuǎn)移，以去除pZB188aadACreF。在每次轉(zhuǎn) 移中，將細胞稀釋并鋪在補加2%葡萄糖的RM瓊脂平板上，以挑取到有或無200μ g/ml Sp 的相同培養(yǎng)基的其它平板上。通過PCR分析Sps克隆，以確定pZBlSSaadACreF丟失。消除 質(zhì)粒的整合子后代命名為T2C、T3C、T4C和T5C。為了檢測這些轉(zhuǎn)座整合子是否是穩(wěn)定的， 將這4個菌株培養(yǎng)在補加2%葡萄糖的RM中，然后轉(zhuǎn)移到IOml相同培養(yǎng)基中，37°C平行培 養(yǎng)2個檢測管。將細胞每天進行轉(zhuǎn)移，共進行10天，或約100代。在第1次和第10次轉(zhuǎn)移 后將克隆稀釋并鋪在RMG平板上進行克隆分離。共12個來自每個菌株每次轉(zhuǎn)移的克隆通 過5' Pgap和3' tkt引物(SEQ ID NOs 1和11)進行的檢測Pgaptaltkt存在的克隆PCR檢 測為陽性。也檢測了第1次和第10次轉(zhuǎn)移后的分離株的轉(zhuǎn)醛醇酶和轉(zhuǎn)酮醇酶活性(如一 般方法所述)。所有這4個整合子在非選擇性培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)移100代后均具有相似的TAL和 TKT活性水平，這表明這些整合子是遺傳穩(wěn)定的。 構(gòu)建用于轉(zhuǎn)座的pM0DPgapxylABCm下一步是進一步將PgapxyIABloxP Cm操縱子整合到ZWl Pgaptaltkt整合 子(T2C、T3C、T4C和T5C)中?；谫|(zhì)粒pMODPgaptaltktCm(圖4)構(gòu)建整合型質(zhì)粒 pM0DPgapxylABCm(圖5)。通過Sacl/Sfil消化除去PgaptaltktDNA片段。通過連接引入含 Sacl、Notl和Sfil限制性位點的接頭片段。然后將從pZB4(US 5514583)分離的PgapXylAB 的Notl片段克隆到接頭的Notl位點。木糖異構(gòu)酶(XI)由xylA編碼，木酮糖激酶(XK)由 xylB編碼。pM0DPgapxylABCm質(zhì)粒的完整序列如SEQ ID N0:12所示。pM0DPgapxyIABCm 在 T2C、T3C、T4C 和 T5C 中的轉(zhuǎn)座和轉(zhuǎn)化通過與PgaptaltktCm整合相似的方法，用轉(zhuǎn)座酶處理的pM0DPgapXylABCm(如上所 述)轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)座T2C、T3C、T4C和T5C。在2次轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)座實驗中通過Cm篩選后獲得6個 整合子(T3CCmXl、T3CCmX2、T3CCmX3、T4CCmXl、T5CCmXl、T5CCmX2)。所有整合子均通過 PCR 用兩組引物SEQ ID NOs :13和14及SEQ IDNOs 15和16驗證xylAB的存在，除了 T2CcmXl 和T2CcmX6用引物SEQ ID NOs 13和14沒有檢測到PCR片段。對包括2個PCR陰性的株系在內(nèi)的整合子均檢測XI、XK、TAL和TKT活性(一般方 法)。如圖6和7所示的結(jié)果表明，6個xylAB整合子T3CCmXl、T3CCmX2、T3CCmX3、T4CCmXl、 T5CCmXl和T5CCmX2均具有XI、XK、TAL和TKT活性。與陰性親本對照(圖6)相比較，XI禾口 XK活性是新獲得的。TAL和TKT活性維持在親本對照水平。所有這些結(jié)果表明產(chǎn)生了蛋白 并具有功能。酶活性水平具有差異，TI和XK活性與用相同質(zhì)粒轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)座的ZWl的整合 子的活性相似。XI、XK、TAL和TKT的活性水平比菌株8b的活性低。通過Southern雜交驗證xylAB操縱子的整合。將6個株系的基因組和質(zhì)粒DNA 用Sphl消化，并與地高辛標記的xylB探針雜交。在所有基因組DNA樣品中均存在一條約3kb的共同條帶，它是由xylB的Sphl位點和pMOD載體臨近克隆位點的另一個Sphl位點 產(chǎn)生的，另外，基因組DNA樣品中更高分子量的雜交帶表明PgapXylAB操縱子在染色體上有 4個整合位點。T3CCmXl和T3CCmX2具有相同的整合位點，T3CCmX3和T4CCmXl可能具有相 同的整合位點，T5CCmXl和T5CCmX2每個具有單獨的整合位點。用PstI消化相同的DNA，然 后用tkt探針進行Southern雜交，表明每個整合子均具有與其各自親本相同的雜交模式。Zffl :PgaptaltktPgapxylAB Cm整合子在木糖培養(yǎng)基上的適應(yīng) 盡管存在所有四種木糖利用的酶活性，但以前的觀察(美國專利申請 20030162271)表明整合子可能不立即在木糖上生長。在木糖上的生長可通過在木糖培養(yǎng)基 (或者在試管中，或者在平板上)上延長培養(yǎng)而發(fā)生，這個過程稱為適應(yīng)。將菌株進行如下適應(yīng)。將ZWl::PgaptaltktPgapXylABCm整合子菌株接種到含 RMX(含 10g/l 酵母提取物、2g/l KH2P04、20g/l 或2% (w/v)木糖)及RMGX(含有0. 025% (w/ ν)葡萄糖和4% (w/v)木糖的)的試管或平板上。低水平的葡萄糖用于支持最初的生長，以 增加在適應(yīng)中的突變機會。在至少5次培養(yǎng)基和平板的木糖適應(yīng)試驗中有1次是成功的。 在30°C厭氧培養(yǎng)10天后，用T3CCmXl和T3CCmX2細胞鋪板的MMGX上分別可見17和19個克 隆?？寺≡谄桨迳陷^小，而且看起來不健康(透明)。將12個克隆(4個來自T3CCmXl平板 T3CCmXll、T3CCmX12、T3CCmX13 和 T3CCmX110 ；8 個來自 T3CCmX2 平板T3CCmX24、T3CCmX25、 T3CCmX26、T3CCmX27、T3CCmX28、T3CCmX29、T3CCmX211 和 T3CCmX212)接種到 RMGCml20 中， 并轉(zhuǎn)移到3ml RMX中進行進一步適應(yīng)，以獲得能在木糖上快速生長的株系。在含3ml RMX的試管中的整合子的適應(yīng)在30°C進行。不斷用Spectronic 601分 光光度計監(jiān)測OD6tltl。當(dāng)達到中期生長階段(mid-logphase)時，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到新鮮RMX試 管中。該過程進行7次轉(zhuǎn)移。在轉(zhuǎn)移后生長速度和最終ODs (非線性讀數(shù))均有提高。在第6次轉(zhuǎn)移時，將培養(yǎng)物在RMX平板上劃線以分離單克隆。有3個整合子 T3CCmX13、T3CCmX26和T3CCmX27在RMX劃線平板上長的比其它更快，它們在表中和以下討 論中被稱為X13、X26和X27。為了篩選最好的木糖生長株，分別將TX13、X26和Χ27的4個 大(L1-4)和4個小(S1-4)克隆在RMX試管中篩選和培養(yǎng)，對其生長、糖利用和乙醇的產(chǎn)生 進行監(jiān)測。將克隆在30°C培養(yǎng)過夜，然后接種0D_ = 0.05到2個3ml RMX試管中。X27在 RMG中比其它培養(yǎng)物生長更慢，因此在6. 5小時后再次接種。69小時(對X27為62. 5小時) 后，對樣品進行HPLC分析(一般方法)。圖8列出培養(yǎng)物在69小時(對所有X27培養(yǎng)物為 62. 5小時)后培養(yǎng)物的平均乙醇產(chǎn)量(理論產(chǎn)量的％)和木糖利用(％)。大克隆和小克隆 之間沒有顯著差異。雖然X27在木糖上的性能比X26好，但它在葡萄糖上生長更慢。因此， 選擇最好的株系X13(X13L3)和X26(X26L1)的大克隆在pH控制的發(fā)酵中進行進一步評估。 在37°C，在RMG(6%葡萄糖)、RMX(6%木糖)和RMGX(8% 4%;葡萄糖木糖)中對菌株 X13L3和X26L1及對照菌株8b進行發(fā)酵。生長在RMG(6%)和RMGX(8% 4% )中的X13L3 和X26L1對葡萄糖的發(fā)酵進行的較快。X13L3和X26L1在RMGX(8% 4%)中對木糖的發(fā)酵 均比菌株8b更慢。另外，在37°C，在RMX(6% )中，X13L3和X26L1的生長均發(fā)生長時間延遲。 在冊乂(6%)發(fā)酵中有幾個分離株乂1313 413(3和乂13 1^發(fā)生回復(fù)。對這些分離株和原始菌株 X13a(X13L3的分離株)如本實施例前述進行Cre處理，以從ZWl :PgaptaltktPgapxylABCm菌 株中除去Cnf標記。得到的Cre處理的無Cnf的整合子命名為X13aC、X13bC、X13cC、X13FLC 和X26C。整合子通過在RMX(5% )中，37°C的系列轉(zhuǎn)移而在木糖培養(yǎng)基中的適應(yīng)
如前所述，最初ZWl: :PgaptaltktPgapxylABCm菌株在RMX中，在30°C的適應(yīng)極大提 高了菌株在這些條件下的生長。但適應(yīng)的菌株在RMX(6%)中，在37°C生長和發(fā)酵時有長時 間延遲。為了進一步提高整合子在包括更高糖濃度和溫度的優(yōu)選過程條件下的木糖發(fā)酵， 在RMX(5%)中，在37°C繼續(xù)進行演化或適應(yīng)過程。進行系列轉(zhuǎn)移并篩選生長株。在本過程 中所用的整合子包括X13aC、X13bC、X13cC、X26C和X13FLC。這5個菌株在轉(zhuǎn)移到RMX (5 % ) 中，在37°C進行另外5到16次轉(zhuǎn)移前，在RMX中30°C培養(yǎng)并進行6次轉(zhuǎn)移。在所有轉(zhuǎn)移中 和轉(zhuǎn)移后，將培養(yǎng)物在RMX平板上劃線，并在37°C培養(yǎng)以分離單克隆。將大克隆在RMX平板 上進一步劃線3到4次，并在37°C培養(yǎng)，以純化克隆。最后將大克隆在RMX(5% )，37°C培養(yǎng) 進行篩選。對來自RMX (5% )培養(yǎng)基，37°C適應(yīng)的菌株的評估 最初將系列轉(zhuǎn)移后適應(yīng)的18個分離克隆在RMX(5% )試管中，在37°C進行檢測。 選擇12個菌株進行第二次試管評估。在所有評估中均包括菌株8b進行比較。將18個克 隆在RMG中，37°C培養(yǎng)過夜，離心，并將細胞接種到4ml RMX(5% )中，37°C，在試管中靜置培 養(yǎng)以進行第一次評估?；谏L((0D_，非線性)和終點HPLC結(jié)果(低殘留木糖和高產(chǎn)量 乙醇)，篩選12個菌株進行第二次評估。第二次評估的目標之一是檢測這些菌株在木糖上生長和木糖利用能力的穩(wěn)定性。 所有這12個菌株均進行穩(wěn)定性研究，以檢測適應(yīng)的菌株是否在非選擇培養(yǎng)基上在37°C系 列轉(zhuǎn)移50代后是穩(wěn)定的。將RMG(5%)轉(zhuǎn)移前后的培養(yǎng)物接種到RMX(5% )試管中，37°C 培養(yǎng)進行評估。通過在Spectronic 601分光光度計直接讀取試管來監(jiān)測非線性O(shè)Ds。在 RMG培養(yǎng)50代前和后在RMX (5 % )中第70個小時生長的ODs描繪在圖9中。結(jié)果表明多 數(shù)菌株在RMG中37°C培養(yǎng)50代后仍是穩(wěn)定的。也通過HPLC分析終點(靜止期)上清的木 糖和乙醇濃度。在這些培養(yǎng)物中的低殘留木糖和高乙醇濃度支持菌株在木糖上很好生長和 發(fā)酵的事實?；谝陨显嚬茉u估結(jié)果(低殘留木糖，高乙醇濃度和更高0D)和以下通過高濃度 葡萄糖和/或木糖(大于20% )及葡萄糖和木糖與乙酸鹽的混合物的微滴定板生長篩選 在高糖和有乙酸鹽時生長更好的菌株，例如命名為ZW658的菌株#26，它具有最好的綜合性 能。實施例2^h 37°CX寸用提高Jl多的If株的發(fā)Hi平估以下實施例描述木糖利用提高的發(fā)酵單胞菌菌株ZW658在模擬預(yù)期的生物量水 解產(chǎn)物的糖濃度和乙酸鹽水平的發(fā)酵條件下的發(fā)酵性能。將菌株ZW658接種到含分別補加 10%葡萄糖(RMG10% )、8%木糖(RMX8% )、10%葡萄糖木糖(RMGX10% 8% )和 10% 葡萄糖+8%木糖+0.6%乙酸鹽(RMGXAc 10% 8% 0.6% )的RM培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中。所有 的發(fā)酵在含300ml培養(yǎng)基的Sixfors中，150rpm，pH5. 5，37°C進行。對發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基 過夜排除氮氣，并在接種前停止。在發(fā)酵時不排除氮氣。用于發(fā)酵的接種物是通過將工作 儲液在RMG5%中復(fù)蘇后，用RMGX(10%，4%)，在燒瓶中(150rpm) 37°C培養(yǎng)而制備的。菌株 8b在相同條件下作為對照。如圖10所示，ZW658與8b相比較，在RMGlO%中長的更慢(A 和B)，在RMX8%中與8b生長的速率相同(C和D)。盡管生長速度較慢，但圖10表明ZW658 的乙醇產(chǎn)量(93% )與8b在葡萄糖培養(yǎng)基的終點發(fā)酵時相同。在RMX8%培養(yǎng)基中，ZW658的乙醇產(chǎn)量(0. 46g乙醇/g糖)高于8b (0. 44g乙醇/g糖)。在RMX8 %中，ZW658比8b多 產(chǎn)生4g/l乙醇。有趣的是，在RMX8%的發(fā)酵終點，ZW658不產(chǎn)生任何木糖醇，而8b產(chǎn)生低 水平木糖醇(0. 7g/l)。如圖11的數(shù)據(jù)表明ZW658比8b在發(fā)酵含(C、D)和不含(A、B)乙 酸鹽(acetate)的10%葡萄糖+8%木糖中發(fā)酵的更好，具有更多的葡萄糖和木糖消耗、更 少的木糖醇產(chǎn)量和更多的乙醇產(chǎn)量。對兩個菌株在RMG10% X8%中，37°C，pH5.5時，在發(fā) 酵終點大部分葡萄糖均被利用，而大部分木糖仍殘留，盡管ZW658比8b多利用了約8g/l木 糖。在RMG10% X8%中，37°C，pH5. 5發(fā)酵，在發(fā)酵終點ZW658的木糖醇產(chǎn)量(4. 9g/l)顯著 低于8b(8.2g/l)。在存在乙酸鹽(6g/l)時，兩個菌株的細胞生長均顯著降低，從而在葡萄 糖和木糖中均表現(xiàn)出較差的發(fā)酵性能，雖然ZW658在更多的葡萄糖和木糖消耗、更少的木 糖醇產(chǎn)量和更多的乙醇產(chǎn)量上表現(xiàn)出略好的發(fā)酵性能。不象在RMX8%中一樣，兩個菌株在 有或無乙酸鹽的RMGlO % X8%中均產(chǎn)生副產(chǎn)物木糖醇，雖然與8b相比較，ZW658產(chǎn)生更少 的木糖醇。兩個菌株的發(fā)酵性能總結(jié)在表1中?？偟膩碚f，ZW658比8b在純的糖發(fā)酵中表 現(xiàn)更好。如實施例1所述，ZW658沒有抗生素選擇標記，這對商業(yè)應(yīng)用的發(fā)酵微生物是一個 有價值的特性。 表1. ZW658和8b乙醇產(chǎn)生的發(fā)酵性能總結(jié).
8b (GIuXyIAc) 0.46 0.67 48 136 ZW658 (Glu Xyl Ac)_047_1 4_50_90CPI是細胞產(chǎn)率系數(shù)g乙醇/g細胞干重實施例3制備自殺型構(gòu)建體用于在ZWl和ZTO58中進行葡萄糖_果糖氧化還原酶(GFOR) 基因的插入失活用于在ZWl和ZW658中敲除編碼葡萄糖-果糖氧化還原酶基因的自殺型構(gòu)建 體(〃 GF0RSp-9ffff")來源于另一個以前通過宿主介導(dǎo)的雙交換同源重組，并以壯觀霉 素抗性為選擇性標記對運動發(fā)酵單胞菌D-乳酸脫氫酶基因插入失活的自殺型構(gòu)建體 (“pLDHSp-9ffff〃)。pLDHSp-9ffff也來源于多種以前產(chǎn)生的構(gòu)建體。下面對所有這些構(gòu)建 體的最初前體是質(zhì)粒載體pNEB193(NEB#N3051S ；New EnglandBiolabs)。選擇該質(zhì)粒是因 為它可在大腸桿菌中復(fù)制，但不能在運動發(fā)酵單胞菌中復(fù)制。所有參與產(chǎn)生GFOR敲除構(gòu)建 體的步驟和中間體從質(zhì)粒PNEB193開始按時間順序進行描述。pLDH193 的構(gòu)建將pNEB 193用Sbfl和Ascl雙消化，用于插入到如下所述的DNA片段中。這兩個限制性位點是唯一的，位于質(zhì)粒的多克隆區(qū)。用Qiagen' s QIAQuick純化試劑盒(貨號 #28104)根據(jù)說明書純化Sbfl/Ascl-線性化的pNEB193質(zhì)粒DNA片段。克隆到pNEB193中 的DNA片段是從用Qiagen' s Blood & Cell Culture Maxi試劑盒(貨號#13362)分離的 菌株ZW1的運動發(fā)酵單胞菌基因組DNA通過PCR擴增獲得的長2268bp的片段。用于該片 段PCR擴增的合成寡核苷酸是引物1和2 引物 1(SEQ ID NO :17)CTACTCATTTcctRcaRRTGGTAACTCATTGCGCGCTC引物 2(SEQ ID NO :18)CATCTTACTrrcrcrccAAAAATCTGCGGCTGACATAC引物1 (正向引物)的下劃線堿基與GenBank登錄號AE008692的核苷酸 1262739-1262720在編碼磷酸甘油酸變位酶(pgm)的開放閱讀框的3’末端雜交，而小寫字 母對應(yīng)于添加到引物5’末端的Sbfl位點。引物2(反向引物)的下劃線堿基與GenBank 登錄號AE008692的核苷酸1260490-1260472雜交，其正處于編碼乙醇脫氫酶(adhl)的開 放閱讀框的上游，而小寫字母對應(yīng)于添加到引物5’末端的Ascl位點。因此，作為PCR擴增 靶的2268bp DNA片段由以下元件組成，起始于Sbfl位點，終止于Ascl位點(a)pgm基因 3’末端；(b)編碼D-乳酸脫氫酶的完整的ldh基因，和(c)adhl基因的5’非編碼區(qū)。用 Sbfl和Ascl切割PCR產(chǎn)物，將得到的DNA片段連接到前述Sbfl/Ascl-線性化的pNEB 193 載體中。用連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM 110，并將轉(zhuǎn)化的細胞涂布在含氨芐青霉素 (100ug/ml)的LB培養(yǎng)基上。最初用重懸克隆和引物1和2通過PCR( “克隆PCR”)來鑒 定含具有正確大小插入的質(zhì)粒的氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化子。然后用Sbfl和Ascl限制性消化 分析來驗證陽性克隆，并對用氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化子進行克隆PCR產(chǎn)生的2268bp片段進行 DNA序列分析。選擇進行進一步操作的質(zhì)粒以下命名為PLDH193。pLDHTcl39#7 的構(gòu)建質(zhì)粒pLDH193具有唯一的Ncol位點，臨近于ldh開放閱讀框的中部。該位點 用于插入賦予四環(huán)素抗性的DNA片段。本操作所用的四環(huán)素抗性盒(IV-盒)以質(zhì)粒 pACYC 184 (GenBank登錄號X06403)為DNA模板，引物3和4為PCR引物，通過PCR產(chǎn)生。引物 3(SEQ ID N0 :19)ACTCATTTccatRRCGATCGCACTATRCRRccRcAATGTAGCACCTGAAGTCAGCC引物 4(SEQ ID NO :20)ATCTCACTccatRRCCGGCCAACTAttaattaaGAATTGATTGGCTCCAATTCTTG引物3(正向引物)的粗體下劃線堿基與四環(huán)素抗性基因上游雜交。引物3的5’ 末端也具有3個限制性位點(Ncol、AsiSl和Notl)。Ncol位點是小寫字母。AsiSl位點 是細下劃線。Notl位點是斜體小寫字母。引物4(反向引物)的粗體下劃線堿基與四環(huán)素 抗性基因終止密碼子下游雜交，該引物也具有添加到其5’末端的3個限制性位點(Ncol、 Fsel和Pacl)。與上面標記相同，Ncol位點是小寫字母，F(xiàn)sel位點是細下劃線，Pad位點 是斜體小寫字母。用Ncol切割通過引物3和4產(chǎn)生的1448bp的IV-盒，并通過制備型凝 膠電泳進行純化。然后將得到的DNA片段連接到質(zhì)粒PLDH193的ldh開放閱讀框的唯一的 Ncol位點中。為了使沒有插入片段的載體的自環(huán)化可能性最小，在連接前將Ncol-消化的 PNEB193用小牛腸堿性磷酸酶進行去磷酸化。將連接反應(yīng)混合物引入到大腸桿菌JM110中，并將轉(zhuǎn)化的細胞涂布含20ii g/ml四環(huán)素的LB平板。用Ncol、AsiSl、Notl、Fsel和Pacl限 制性消化分析來鑒定含具有正確大小插入的質(zhì)粒的四環(huán)素抗性轉(zhuǎn)化子，并用合適的引物通 過PCR分析來驗證IV-盒的方向。篩選進行進一步操作的質(zhì)粒(pLDHTc 139#7)的環(huán)狀圖 譜如圖12所示。在此處未描述的實驗中，該自殺型構(gòu)建體用于在ZW1中通過宿主介導(dǎo)的、雙 交換同源重組，并在四環(huán)素上生長作為篩選而進行D-乳酸脫氫酶基因的插入失活(即“破 壞”或“敲除”)。pLDHTc 139#7-9ffff 的構(gòu)建已證明pLDHTcl39#7可在ZW1中用于“敲除”D_乳酸脫氫酶基因，因此下一步是 修飾該構(gòu)建體，使其可在基因破壞后，通過Cre重組酶從染色體中除去篩選標記。為了達到 該目標，利用IV-盒旁側(cè)的4個限制性位點，即5’末端的AsiSl和Notl和3’末端的Pacl 和Fsel將兩個野生型loxP位點(Lee and Saito, 1998)添加到pLDHTcl39#7中。在用兩 個酶切割構(gòu)建體并純化得到的大DNA片段后，第一個loxP位點插入到質(zhì)粒pLDHTcl39#7的 AsiSl和Notl位點之間。插入到該位置的loxP位點用兩個合成的、5’末端磷酸化的寡核 苷酸5和6 (SEQID NOs 21和22)產(chǎn)生。寡核苷酸5(SEQ ID NO 21)；cgcATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATgc寡核苷酸6(SEQ ID NO 22)ggccgcATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATgcgat這些寡核苷酸相互補，退火后形成全長雙鏈野生型loxP位點，在兩端有單鏈突 出，從而使DNA片段連接到pLDHTcl39#7的AsiSl和Notl位點。寡核苷酸的大寫字母對應(yīng) 于全長野生型loxP位點，而小寫字母表示用于連接雙鏈DNA片段到pLDHTcl39#7的AsiSl 和Notl位點的核苷酸。用連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B，并在含20y g/ml四環(huán)素的LB平板上涂布 轉(zhuǎn)化細胞。通過限制性消化分析、克隆PCR和相關(guān)區(qū)域的DNA序列分析來鑒定含具有正確 插入到pLDHTcl39#7的AsiSl和Notl位點的loxP位點的質(zhì)粒的四環(huán)素抗性轉(zhuǎn)化子。選擇 進行進一步操作的質(zhì)粒以下命名為pLDHTcl39#7-9W。然后在用酶切割質(zhì)粒并純化得到的大載體片段后，將第二個野生型loxP位點插 入到pLDHTc 139#7_9W的IV-盒另一端的Pacl和Fsel位點之間。插入到該位置的loxP位 點用兩個合成的、5，末端磷酸化的寡核苷酸7和8(SEQ ID NOs 23和24)產(chǎn)生。寡核苷酸7(SEQ ID NO 23)taaATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATggccgg寡核苷酸8(SEQ ID NO 24)ccATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATttaat寡核苷酸7和8相互互補，退火后形成全長雙鏈野生型loxP位點，在兩端有單鏈 突出，從而使DNA片段連接到pLDHTc 139#7-9W的Pacl和Fsel位點。寡核苷酸的大寫字母 對應(yīng)于全長野生型loxP位點，而小寫字母表示用于連接雙鏈DNA片段到pLDHTc 139#7-9W 的Pacl和Fsel位點的核苷酸。用連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B，并在含20 u g/ml四環(huán)素的LB平板上涂布 轉(zhuǎn)化細胞。通過限制性消化分析、克隆PCR和相關(guān)區(qū)域的DNA序列分析來鑒定含具有正確插入到pLDHTcl39#7-9W的Pacl和Fsel位點的loxP位點的質(zhì)粒的四環(huán)素抗性轉(zhuǎn)化子。選 擇進行進一步操作的質(zhì)粒以下命名為pLDHTcl39#7-9ffff。該構(gòu)建體的環(huán)狀圖譜如圖12所不。pLDHSp-9ffff 的構(gòu)建pLDHSp-9ffff與pLDHTcl39#7-9ffff相同，但后一個構(gòu)建體的四環(huán)素抗性盒被賦予壯 觀霉素抗性的DNA片段(即Spec-盒)代替。后者以質(zhì)粒pHP15578(Cahoon et al，2003) 為模板，用引物9和10通過PCR產(chǎn)生。PHP15578含Sped-盒及其啟動子的完整核苷酸序 列，它基于轉(zhuǎn)座子Tn7編碼3' (9)-0-核苷酸轉(zhuǎn)移酶的aadA基因的公開序列(GenBank登 錄號 X03403)。引物 9(SEQ ID NO :25)ATAAAAgcggccgcAGCACAGGATGA引物 10(SEQ ID NO :26)GGCGttaattaaGGCAGGTCAGCAAG引物9(正向引物)的下劃線堿基與Spec1-盒啟動子上游(GenBank登錄號 X03043 nts6-17)雜交，而小寫字母對應(yīng)于添加到引物5，末端的Notl位點。引物10(反 向引物)的下劃線堿基與Sped-盒終止密碼子下游約130堿基處(GenBank登錄號X03043 ntsl006-1019)雜交，而小寫字母對應(yīng)于添加到引物5，末端的Pacl位點。將1040bp PCR-產(chǎn)生的Sped-盒用Notl和Pacl雙消化，通過瓊脂糖凝膠電泳純化DNA片段。將質(zhì)粒 pLDHTcl39#7-9ffff也用相同的兩個限制性酶切割以除去IV-盒，并將得到的大載體片段通 過瓊脂糖凝膠電泳純化。然后將兩個目的DNA片段連接在一起，并將轉(zhuǎn)化反應(yīng)混合物通過 電穿孔引入大腸桿菌DH10B中。將轉(zhuǎn)化子涂布在含壯觀霉素(200i!g/ml)的LB培養(yǎng)基上， 并在37°C培養(yǎng)。通過Notl和Pacl的限制性消化分析鑒定含具有正確大小插入片段的質(zhì) 粒的壯觀霉素抗性轉(zhuǎn)化子，選擇進一步操作的質(zhì)粒以下命名為pLDHSp-9ffff ；該構(gòu)建體的環(huán) 狀圖譜如圖12所示。在此處未描述的實驗中，在ZW1中用pLDHSp-9ffff通過對壯觀霉素抗 性為選擇標記敲除D-乳酸脫氫酶基因。用自殺型構(gòu)建體進行的基因失活通過宿主介導(dǎo)的 雙交換同源重組發(fā)生(W0 01/83784A2)，這使得旁側(cè)為兩個野生型loxP位點的ldh開放閱 讀框中部插入選擇性標記(Sped-盒)。雙交換事件通過pLDHSp-9ffff中Sped-盒旁側(cè)的 兩個DNA片段定位于ldh基因。這些片段其中之一(以下指5，ldh旁側(cè)DNA)在Sped-盒 上游，位于Sbfl和AsiSl位點之間。這一約1100bp的DNA片段的核苷酸序列與編碼pgm 基因3，末端及l(fā)dh開放閱讀框約前一半的ZW1染色體DNA相同。另一 DNA片段(以下指 3' ldh旁側(cè)DNA)位于Fsel和Ascl位點之間的Sped-盒的反向末端。3' ldh旁側(cè)DNA 的核苷酸序列(也為約1100bp)與編碼ldh基因另一半和部分adhl基因5'非翻譯區(qū)的染 色體DNA相同。當(dāng)5'和3' ldh旁側(cè)DNA片段與其染色體互補部分相互作用并進行同源 重組時發(fā)生雙交換事件。該現(xiàn)象基本不可逆，完全由宿主酶系統(tǒng)介導(dǎo)，可通過在開放閱讀框 中間插入Sped-盒而使染色體ldh基因失活。由于構(gòu)建體不能在運動發(fā)酵單胞菌中復(fù)制， 使其成為自殺型構(gòu)建體，因此用pLDHSp-9ffff產(chǎn)生穩(wěn)定的壯觀霉素抗性克隆的唯一方法是 通過同源重組發(fā)生的雙交換事件(除了在極低頻率發(fā)生的自發(fā)藥物抗性突變體)。需要注 意的是通過雙交換事件插入到染色體中的Sped-盒仍然夾在存在于自殺型構(gòu)建體中的兩 個野生型loxP位點之間。由于這種安排易于通過實施例10所述的Cre表達載體從D-乳酸脫氫酶基因中除去選擇標記，但不重新激活該基因。pGF0RSp-9ffff 的構(gòu)建將pLDHSp-9ffff在如下所述的2步流程中轉(zhuǎn)變?yōu)橛糜谶\動發(fā)酵單胞菌葡萄糖-果 糖氧化還原酶(GF0R)基因失活的自殺型構(gòu)建體。第一步是除去3' ldh旁側(cè)DNA，并用將 質(zhì)粒定位到編碼GF0R的染色體基因的類似DNA片段代替。后一個DNA片段(以下稱為 3' GF0R旁側(cè)DNA)以ZW1基因組DNA為模板，用引物11和12為PCR引物通過PCR產(chǎn)生。引物 11(SEQ ID NO :27)CTACTCATRRCCRRCCTCAGAACGATCCTGCACAGC引物 12(SEQ ID NO :28)CATCTTACTrrcrcrccGGACGAGGTTCATCATCAGG引物11 (正向引物)的下劃線堿基與對應(yīng)于GF0R開放閱讀框中部的GenBank登 錄號為AE008692的核苷酸684324-684305雜交，而小寫字母對應(yīng)于添加于引物5，末端的 Fsel位點。引物12 (反向引物)的下劃線堿基與對應(yīng)于GF0R終止密碼子下游約625bp的 GenBank登錄號為AE008692的核苷酸683124-683143雜交，而小寫字母對應(yīng)于添加到引物 5’末端的Ascl位點。用Fsel和Ascl切割1234bp PCR片段。也用相同的限制性酶切割 pLDHSp-9ffff,以除去3' ldh旁側(cè)DNA，并通過瓊脂糖凝膠電泳純化該操作中獲得的大載體 片段。然后將PCR-產(chǎn)生的3' GF0R旁側(cè)DNA連接在上述凝膠純化的大載體片段的Fsel 和Ascl位點，并將一份連接反應(yīng)混合物通過電穿孔轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH10B中。將轉(zhuǎn)化的細 胞涂布在含200 u g/ml壯觀霉素的LB培養(yǎng)基上，并將平板在37°C培養(yǎng)。通過克隆PCR和 Fsel和Ascl的限制性消化分析鑒定含具有正確大小插入片段的質(zhì)粒的壯觀霉素抗性轉(zhuǎn)化 子，選擇進一步操作的質(zhì)粒以下命名為pLDH/GF0RSp-9ffff。下一步是從pLDH/GF0RSp-9ffff中除去5 ‘ ldh旁側(cè)DNA，并用5 ‘ GF0R旁側(cè)DNA替 代，從而在選擇破壞GF0R開放閱讀框的染色體靶處發(fā)生雙交換事件。以ZW1基因組DNA為 模板，引物13和14為PCR引物，通過PCR產(chǎn)生5' GF0R旁側(cè)DNA片段。引物 13(SEQ ID NO :29) CTACTCATatgcatGTCCAGAAAAGACAGCATTCC引物 14(SEQ ID NO 30)CATCTTACTgcgatcgcTGCACGGTTCATTGGAT引物13(正向引物)的下劃線堿基與對應(yīng)于GF0R起始密碼子上游約520bp的 GenBank登錄號為AE008692的核苷酸685584-685564雜交，而小寫字母對應(yīng)于添加到引物 5’末端的Nsil位點。引物14(反向引物)的下劃線堿基與對應(yīng)于臨近GF0R開放閱讀框中 部及引物11結(jié)合位點上游的、GenBank登錄號為AE008692的核苷酸684396-684415雜交， 而小寫字母對應(yīng)于添加到引物5’末端的AsiSl位點。用Nsil和AsiSl切割1217bp PCR產(chǎn) 物，也用Sbf 1和AsiSl雙消化pLDH/GF0RSp-9ffff，以除去5 ‘ ldh旁側(cè)DNA ；并通過瓊脂糖凝 膠電泳純化該操作中獲得的大載體片段。然后將PCR產(chǎn)生的5' GF0R旁側(cè)DNA連接在上述 凝膠純化的大載體片段的Sbfl和AsiSl位點間，并將一份連接反應(yīng)混合物通過電穿孔轉(zhuǎn)化 到大腸桿菌SCSI 10 (它是dcnT和danT)中，以獲得非甲基化的質(zhì)粒DNA進行ZW1和ZW658的 后續(xù)轉(zhuǎn)化，在以下實施例5和7中詳細描述。值得注意的是將非甲基化質(zhì)粒DNA用于來源于 ZW4的運動發(fā)酵單胞菌的轉(zhuǎn)化對成功非常關(guān)鍵，因為從野生型大腸桿菌菌株，例如DH10B中分離的甲基化質(zhì)粒DNA易于被宿主的限制/修飾系統(tǒng)破壞(如US 6566107B1所述)。另外 值得注意的是Nsil和Sbfl具有互補的粘性末端，但當(dāng)它們連接后，則兩個位點均被破壞。 將轉(zhuǎn)化子涂布在含lOOy g/ml壯觀霉素的LB培養(yǎng)基上，并將平板在37°C培養(yǎng)。通過克隆 PCR和限制性消化分析鑒定含具有正確大小插入片段的質(zhì)粒的壯觀霉素抗性轉(zhuǎn)化子。得到 的用于在ZW1和ZW658中敲除GF0R基因的自殺型構(gòu)建體以下命名為pGF0RSp-9ffff。該質(zhì)粒 的環(huán)狀圖譜如圖12所示，其完整核苷酸序列如SEQ ID N0:31中所示。需要注意的是該自 殺型構(gòu)建體和運動發(fā)酵單胞菌染色體GR0R基因之間的雙交換事件會導(dǎo)致插入兩個野生型 loxP位點旁側(cè)的Sped-盒，與上述pLDH-Spec-9ffff的情況類似。實施例4牛成針對運動發(fā)酵單胞菌的大腸桿菌木糖異構(gòu)酶表汰載體如下所述，以大腸桿菌/運動發(fā)酵單胞菌穿梭載體(PZB188)為起始材料構(gòu)建在運 動發(fā)酵單胞菌中表達大腸桿菌木糖異構(gòu)酶的質(zhì)粒構(gòu)建體(pZB188/Kan-XylA)(圖13)。參與 構(gòu)建pZB188的步驟描述在US 5，514，583中。簡言之，該7008bp質(zhì)?？稍诖竽c桿菌和運動 發(fā)酵單胞菌中復(fù)制，因為它具有兩個不同的復(fù)制原點，分別針對每個細菌種類。PZB188也 包含賦予四環(huán)素抗性的DNA片段(即IV-盒)。構(gòu)建pZB188/Kan-XylA的第一步是從pZB 188中除去IV-盒，并用賦予卡那霉素抗性的DNA片段(即Kan1-盒)代替。為了從pZB188 中除去IV-盒，將質(zhì)粒用Xbal和BssHll切割，并通過瓊脂糖凝膠電泳純化得到的大載體片 段。以質(zhì)粒pET-24a(NOVagen)為模板，通過引物15和16進行PCR擴增以產(chǎn)生Karf-盒。 pET-24a含有Karf基因的完整開放閱讀框及其相關(guān)啟動子。引物 15(SEQ ID NO 32) :GCtctagaGCAGCAGATTACGCGC引物 16 (SEQ ID NO 33) :ACATTGgcgcgcTTAGAAAAACTCATC弓丨物15(正向引物)的下劃線堿基與對應(yīng)于pET_24a的Karf基因起始密碼子上 游約160bp處雜交，而小寫字母對應(yīng)于添加到引物5’末端的Xbal位點。引物16 (反向引 物)的下劃線堿基與對應(yīng)于Karf基因包括終止密碼子的開放閱讀框另一端雜交，而小寫字 母對應(yīng)于添加到引物5，末端的BssHll位點。用Xbal和Bsshll切割991bp PCR產(chǎn)生的 Kanr-盒，并通過瓊脂糖凝膠電泳進行純化。然后通過標準連接反應(yīng)將得到的DNA片段插入到上述PZB188DNA片段的Xbal和 BssHll位點。通過電穿孔將轉(zhuǎn)化反應(yīng)混合物引入大腸桿菌DH10B中，將細胞涂布在含卡那 霉素(50i!g/ml)的LB培養(yǎng)基上；并在37°C培養(yǎng)。從卡那霉素抗性轉(zhuǎn)化子中分離質(zhì)粒DNA， 并將得到的構(gòu)建體以下命名為pZB188/Kan ；該穿梭載體的環(huán)狀圖譜如圖13所示。在下一步中，將大腸桿菌木糖異構(gòu)酶表達盒插入到用Ncol和Acll雙酶切的質(zhì)粒 pZB188/Kan的Ncol和Acll位點之間，通過瓊脂糖凝膠電泳純化的大載體片段。作為大腸 桿菌木糖異構(gòu)酶表達盒的約2KbpDNA片段來源于用Ncol和Clal切割并通過瓊脂糖凝膠電 泳純化相關(guān)DNA片段的質(zhì)粒pZB4。質(zhì)粒pZB4在US 5514583中有詳細描述，大腸桿菌表達 盒PgapxylA(SEQ ID NO 34)的示意圖如圖13框出的圖譜所示。Ncol和Clal位點分別位于大腸桿菌木糖異構(gòu)酶表達盒的5'和3'末端。如US 5514583所述，該片段包含強的組成型運動發(fā)酵單胞菌甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAP)啟動子， 它是恰好與編碼木糖異構(gòu)酶的大腸桿菌xylA基因的完整開放閱讀框融合在一起的。它在 緊鄰木糖異構(gòu)酶終止密碼子處也包含小的莖環(huán)區(qū)。通過標準連接反應(yīng)將大腸桿菌木糖異構(gòu)
28酶表達盒插入到pZB188/Kan的Ncol和Acll位點之間。需要注意的是Clal和Acll產(chǎn)生 互補的“粘性末端”，但它們連接后則兩個位點均被破壞。然后將連接反應(yīng)混合物通過電穿 孔轉(zhuǎn)化到大腸桿菌SSC110(dGnT，dam!中，以獲得非甲基化質(zhì)粒DNA進行以下實施例6所 述的運動發(fā)酵單胞菌的轉(zhuǎn)化，并將轉(zhuǎn)化的細胞涂布在含卡那霉素(50i!g/ml)的LB培養(yǎng)基 上，37°C培養(yǎng)。通過限制性消化分析和克隆PCR鑒定含具有正確大小插入片段的質(zhì)粒的卡 那霉素抗性轉(zhuǎn)化子。用于在運動發(fā)酵單胞菌中表達大腸桿菌木糖異構(gòu)酶的質(zhì)粒以下命名為 “pZB188/Kan-XylA”，該構(gòu)建體的環(huán)狀圖譜如圖13所示。實施例5產(chǎn)牛ZW1GF0R敲除突變體為了在ZW1 (衍生ZW658的野生型菌株)中除去GF0R酶活性，使用了在實施例3中 詳細描述的自殺型構(gòu)建體pGF0RSp-9ffff。將非復(fù)制型質(zhì)粒DNA通過電穿孔引入到細菌宿主 中，基本如US 5514583所述。簡言之，DNA轉(zhuǎn)化反應(yīng)包括50 yl含約101CI細胞/ml的10% (v/v)甘油和約0. 9ug如實施例3所述從大腸桿菌SSC110分離的非甲基化質(zhì)粒DNA。對照 反應(yīng)進行相同處理，只是不加入任何質(zhì)粒DNA。電穿孔儀設(shè)置為16kv/cm、200 Q、25 y F，電 轉(zhuǎn)杯的缺口寬度為0. 1cm。電穿孔后，將轉(zhuǎn)化反應(yīng)物用1. 0ml MMG培養(yǎng)基(50g/L葡萄糖、 10g/L 酵母提取物、5g/L 胰蛋白胨、2. 5g/L(NH4)2S04、0. 2g/L K2HP04 和 ImM MgS04)稀釋，并 將細胞在30°C復(fù)蘇約5小時。然后在無菌1. 5-ml離心管中通過室溫下離心(13，000X g， 5min)收獲細胞，并小心除去上清。將細胞沉淀重懸在150 u 1液體MMG培養(yǎng)基中，用50和 100 u 1細胞懸浮液涂布含1. 5%瓊脂和200 u g/ml壯觀霉素的MMG培養(yǎng)基上。將平板在厭 氧培養(yǎng)箱30°C培養(yǎng)，在2到3天后在實驗平板上出現(xiàn)50到150個克隆。這時在對照平板上 沒有壯觀霉素抗性克隆，雖然在另外48小時培養(yǎng)時間后會出現(xiàn)少許克隆。選擇從轉(zhuǎn)化中得 到的2個具有GF0R敲除構(gòu)建體的壯觀霉素抗性克隆用于以下進一步的操作。以前用運動發(fā)酵單胞菌和與pGF0RSp-9ffff類似的自殺型構(gòu)建體進行的實驗表明， 最初染色體和質(zhì)粒DNA的整合是在兩個靶位點之一的單交換事件，單交換事件最后發(fā)展為 雙交換事件。雙交換事件的轉(zhuǎn)變通常在含針對自殺型構(gòu)建體的選擇性試劑的液體培養(yǎng)基中 進行一系列轉(zhuǎn)移后很快發(fā)生。為了利于兩個選擇的ZW1轉(zhuǎn)化子發(fā)生由GF0R敲除構(gòu)建體介 導(dǎo)的雙交換事件，將細胞接種到10ml含100g/L葡萄糖和200 u g/ml壯觀霉素的RM培養(yǎng)基 (10g/L酵母提取物和2g/LKH2P04)中。在30°C培養(yǎng)24小時后，兩個培養(yǎng)物均達到靜止期。 然后，用10 yl第一代培養(yǎng)物接種10ml相同的生長培養(yǎng)基，在30°C培養(yǎng)24小時后，兩個培 養(yǎng)物也均達到靜止期。最后，用10 yl第二代培養(yǎng)物接種10ml相同的生長培養(yǎng)基，并在30°C 再培養(yǎng)24小時。在液體培養(yǎng)基中進行最后一次轉(zhuǎn)移后，將第三代培養(yǎng)物稀釋并涂布在含壯 觀霉素(200 y g/ml)的MMG培養(yǎng)基上以獲得單克隆，平板在30°C厭氧條件下培養(yǎng)48小時。用3對不同的引物通過克隆PCR實驗驗證雙交換事件確實發(fā)生。第一對PCR引 物僅擴增自殺型構(gòu)建體的5' GF0R旁側(cè)DNA與其染色體互補區(qū)進行單交換事件而產(chǎn)生正 確大小的DNA片段。同樣，第二對PCR引物僅擴增自殺型構(gòu)建體的3' GF0R旁側(cè)DNA與其 染色體互補區(qū)進行單交換事件而產(chǎn)生正確大小的DNA片段。最后，第三對PCR引物僅擴增 發(fā)生雙交換事件，并排除單和雙交換事件混合群體而產(chǎn)生正確大小的DNA片段。用于本分 析中的兩個壯觀霉素抗性克隆來源于兩個不同的具有自殺型構(gòu)建體的ZW1電穿孔反應(yīng)的 原始轉(zhuǎn)化子，在液體培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)移3次，涂布以獲得上述單克隆，本實驗的對照是親本菌株ZW1。由于兩個轉(zhuǎn)化子用3對不同的引物對均產(chǎn)生陽性結(jié)果，因此只選擇其中一個進行以下 分析。該菌株(ZW1GF0R敲除突變體)以下命名為ZW1-AGF0R。實施例6在牛理條件下葡萄糖_果糖氧化還原酶是木糖醇形成的主要貢獻者用ZW1GF0R敲除突變體(ZW1_ A GF0R)檢測假說在利用木糖的運動發(fā)酵單胞菌重 組菌株中木糖醇的形成至少部分由周質(zhì)空間的酶GF0R，或其也具有酶活性的更大分子量的 胞質(zhì)前體介導(dǎo)(Loos etal.，同上)。如實施例2(圖11)所示，木糖醇是利用木糖的菌株8b 和ZW658的主要副產(chǎn)物，但它僅在生長培養(yǎng)基中存在木糖時形成。雖然野生型運動發(fā)酵單 胞菌菌株，例如CP4具有可直接還原木糖為木糖醇的NADPH依賴的醛糖還原酶(Feldmarm et al,同上)，但可能在生長培養(yǎng)基中含有木糖或葡萄糖和木糖混合物時，GF0R也在體內(nèi)參 與木糖醇的形成，如圖表II和III所示。但對這些發(fā)生的任何一個反應(yīng)，酶都需要接近木酮 糖，因為該化合物是GF0R介導(dǎo)的木糖醇產(chǎn)生的專性(obligatory)電子接納體，如體外GF0R 酶性狀檢測(Zachariou and Scopes,同上)和用粗無細胞提取物進行的實驗(Danielson 同上)所示。在構(gòu)建的利用木糖生長的運動發(fā)酵單胞菌中，木糖醇合成必需的木酮糖可通 過催化木糖代謝(圖1)第一個步驟的木糖異構(gòu)酶產(chǎn)生，該酶在野生型菌株，例如ZW1中不 存在。為了檢測在生長培養(yǎng)基中存在木糖和葡萄糖時GF0R產(chǎn)生木糖醇的可能性，將如 實施例4所述的大腸桿菌木糖異構(gòu)酶表達載體(pZB188/Kan-XylA)導(dǎo)入ZW1和ZW1-AGF0R 中。其策略是在不能利用這些糖生長的兩個菌株中提供從木糖轉(zhuǎn)變?yōu)槟就堑耐緩?，并測 定GF0R是否可產(chǎn)生木糖醇。用于轉(zhuǎn)化的電穿孔流程基本如實施例5所述，但在復(fù)蘇階段后 將轉(zhuǎn)化的細胞涂布在含300 u g/ml卡那霉素的MMG培養(yǎng)基上。將ZW1和ZW1- A GF0R也用 與pZB188/Kan-XylA相同但不含大腸桿菌木糖異構(gòu)酶表達盒的pZB188/Kan(圖13)轉(zhuǎn)化， 作為本實驗的對照。通過克隆PCR鑒定含pZB188/Kan-XylA或?qū)φ召|(zhì)粒的卡那霉素抗性 克隆，并隨機選擇每個轉(zhuǎn)化反應(yīng)的代表性克隆進行如圖14所示的實驗。這4個含質(zhì)粒的 菌株以下命名為 ZW1 (pZB188/Kan)、Zffl (pZB188/Kan-XylA)、Zff 1- A GF0R (pZB188/Kan)和 Zffl-AGF0R(pZB 188/Kan-XylA)。將在30°C下，過夜培養(yǎng)物培養(yǎng)在含5ml 60g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物、10g/L KH2P04、2g/L(NH4)2S04、lg/L MgS02(7H20)和 300 u g/ml 卡那霉素的 15ml 帶蓋試管中。然后 用每份過夜培養(yǎng)物接種含相同生長培養(yǎng)基，存在或不存在20g/L木糖的20ml培養(yǎng)物(在 50-ml帶蓋試管中)中。在30°C輕輕振蕩培養(yǎng)，最初0D_值為 0. 1。培養(yǎng)0、24、48和120 小時后除去1.0ml培養(yǎng)物，用具有折光率檢測器(Hewlett-Packard，Palo Alto, CA)的HP 1100進行HPLC分析，以檢測發(fā)酵液中存在的木糖、木酮糖和木糖醇濃度。在進行HPLC分析 前，通過離心除去細胞，并將上清通過0. 22 y m醋酸纖維素Spin-X離心管過濾器(Costar， catalog number 8160)以除去小顆粒。在 AminexHPX_87H 柱(Bio-Rad)上，在 55°C，無梯 度條件下以流速0. 6ml/min, 0. 01N H2S04為流動相分離化合物。用已知濃度的標準品定量 目標峰，所有結(jié)果表示為g/L。結(jié)果表明，當(dāng)具有“空”載體的對照菌株ZW1 (pZB188/Kan)在存在葡萄糖和木糖的 條件下進行培養(yǎng)時，在120小時培養(yǎng)時間后，生長培養(yǎng)基中僅有小量木糖醇積累(圖14A)。 該菌株木糖醇的最大量為<0.5g/L。相反，當(dāng)ZWl(pZB188/Kan)生長在相同濃度的葡萄糖但沒有木糖的條件下，則沒有木糖醇產(chǎn)生，對其它3個菌株也是這樣。因此，只有在存在葡 萄糖和木糖時進行的實驗如圖14所示。顯然，大腸桿菌木糖異構(gòu)酶在ZW1中的表達極大增 加了發(fā)酵液中木糖醇的量，到120小時，Zffl (pZB188/Kan-XylA)比ZW1 (pZB188/Kan)多產(chǎn) 生5倍的該化合物(圖14B)。如預(yù)期一樣，木糖異構(gòu)酶在ZW1中的表達也導(dǎo)致木酮糖的產(chǎn) 生，因為木糖異構(gòu)酶催化木糖到木酮糖的異構(gòu)化。需注意的是在本實驗中，加到生長培養(yǎng)基 中約16%的總木糖轉(zhuǎn)變?yōu)槟就腔蚰咎谴肌Ａ硗庵档米⒁獾氖窃谶@兩個化合物之間存在明 顯的前體/產(chǎn)物的關(guān)系(木酮糖降低，則木糖醇增加)，這與在培養(yǎng)基中存在葡萄糖和木糖 時，GF0R在生理條件下可將木酮糖轉(zhuǎn)變?yōu)槟咎谴嫉募僬f相一致。與ZW1相似，ZW1-AGF0R在沒有木糖異構(gòu)酶表達載體時產(chǎn)生極少的木糖醇(圖 14C)。在這些條件下形成的小量木糖醇可能來自NADPH依賴的醛糖還原酶，如Feldmarm et al. (1992同上)所述。令人驚訝的是，與用ZW1 (pZB188/Kan-XylA)獲得的結(jié)果相比 較，當(dāng)木糖異構(gòu)酶在ZW1GF0R敲除突變體中表達時，沒有額外的木糖醇產(chǎn)生(圖14D)。 Zffl-AGF0R(pZB 188/Kan-XylA)確實產(chǎn)生了大量木酮糖，形成的該化合物的量與由相應(yīng) ZW1菌株(即ZW1 (pZB188/Kan-XylA)產(chǎn)生的木酮糖和木糖醇的總量一樣。這些實驗清楚表 明，當(dāng)酶接近木酮糖時，GF0R在體內(nèi)參與木糖醇的形成，這種情況在葡萄糖和木糖混合物中 培養(yǎng)的、利用木糖的運動發(fā)酵單胞菌重組菌株中確實發(fā)生。這些結(jié)果進一步表明當(dāng)運動發(fā) 酵單胞菌重組菌株在含木糖的培養(yǎng)基生長時，NADPH-依賴的醛糖還原酶對木糖醇的產(chǎn)生不 具有重要作用，這與文獻(Feldmarm et al，同上；Kim et al，同上)的預(yù)期相矛盾。實施例7ZW658GF0R敲除突變體的產(chǎn)生及該菌株不產(chǎn)生功能性GF0R酶的驗證在ZW658中，在存在葡萄糖和木糖醇時，在生理條件下，編碼如實施例6所述的、參 與運動發(fā)酵單胞菌中木糖醇形成的GF0R基因通過自殺型構(gòu)建體pGF0RSp-9ffff(如實施例3 所述)進行插入失活。該流程中的所有步驟與實施例5中所述的ZW1GF0R敲除突變體相同， 包括用3組PCR引物驗證雙交換事件。選擇進行進一步所述實驗的ZW658敲除突變體以下 命名為ZW800。為了驗證ZW800不產(chǎn)生在生理反應(yīng)中由GF0R催化的、從葡萄糖和果糖產(chǎn)生山梨糖 醇的酶，進行了以下實驗。將1. 5毫升ZW800和親本ZW658培養(yǎng)物在30°C，在10ml帶蓋試 管中的含75g/L葡萄糖、25g/L木糖、10g/L酵母提取物、2g/L KH2P04和lg/L MgS04的液體 培養(yǎng)基中培養(yǎng)到早期靜止期。當(dāng)培養(yǎng)物達到0D_約5. 5時，通過離心收獲細胞，仔細除去上 清并拋棄。然后將細胞沉淀重懸在5ml含以下組分的新鮮生長培養(yǎng)基中110g/L葡萄糖、 110g/L果糖、10g/L酵母提取物、2g/L KH2P04、lg/L MgS04和4g/L KHC03。以上所有步驟在 無菌條件下進行，生長培養(yǎng)基的最初PH在細胞重懸前用濃磷酸調(diào)整到5. 8。然后將得到的 培養(yǎng)物在30°C培養(yǎng)，并輕輕振蕩(150rpm)，在如表2所示的時間點除去樣品，并用如實施例 6所述的相同流程進行發(fā)酵液的HPLC分析。本實驗的目標峰是葡萄糖、果糖、山梨糖醇和乙 醇，用已知量的標準品計算離心除去細胞后它們在發(fā)酵液中的濃度；表2的所有濃度表示 為 g/L0表2ZW658和ZW800中山梨糖醇的產(chǎn)生——體外測定 如表2所示，ZW658培養(yǎng)物在23小時后消耗了幾乎所有葡萄糖和約一半的果糖， 并產(chǎn)生相當(dāng)量的山梨糖醇和乙醇為主要產(chǎn)物；后兩個化合物的值在第一個時間點分別為 45. 99g/L和49. 36g/L。因此，在ZW658培養(yǎng)物中，最初的果糖有40%以上通過GF0R轉(zhuǎn)變?yōu)?山梨糖醇。顯著不同的是，在23小時培養(yǎng)后，在ZW800培養(yǎng)物的發(fā)酵液中沒有檢測到山梨 糖醇，而葡萄糖和果糖幾乎定量轉(zhuǎn)變?yōu)橐掖?，這與消耗每克糖產(chǎn)生0. 51克乙醇的理論值相 近。值得注意的是在另外24小時培養(yǎng)后，ZW658培養(yǎng)物中的山梨糖醇的量沒有進一步增加。 這與預(yù)期相符，因為幾乎所有的葡萄糖已在早期被消耗，而用果糖進行GF0R反應(yīng)沒有電子 供體。有趣的是，在47小時的時間點，ZW800培養(yǎng)物的發(fā)酵液中有小量山梨糖醇(10.21g/ L)，這可能是由NADPH依賴的醛糖還原酶(Feldmarm et al.，同上)或其它仍未闡明的酶產(chǎn) 生。但上述結(jié)果表明插入到ZW800中的GF0R開放閱讀框中部的Sped-盒即使不完全，也 極大地破壞了 GF0R酶活性。該結(jié)論的進一步支持來自用ZW1、ZW658和ZW800制備的無細胞提取物的體外實 驗。其目標是確定是否ZW658可在沒有添加其它的底物或輔因子的情況下將木糖轉(zhuǎn)變?yōu)槟?糖醇，并研究是否ZW800由于GF0R失活而喪失進行該反應(yīng)的能力。用運動發(fā)酵單胞菌無細 胞提取物中GF0R介導(dǎo)的木糖醇產(chǎn)生有3個條件1)可還原GF0R緊密結(jié)合輔因子的糖電子 供體，例如葡萄糖或木糖，2)木酮糖作為電子接納體，因為它是酶實際將其還原為木糖醇的 化合物，及3)功能性GF0R酶。如果不向反應(yīng)混合物中加入木酮糖，則無細胞提取物也必需 含有木糖異構(gòu)酶將木糖轉(zhuǎn)變?yōu)槟就恰Ｓ?00ml在33 °C，培養(yǎng)在含10g/L酵母提取物、2g/L KH2P04和50g/L葡萄糖的 250ml錐形瓶中的培養(yǎng)物制備無細胞提取物。在0D_為2-3時通過離心收獲細胞，并用冰 50mM Tris-HCl (pH 7. 0)，1. OmM MgCl2，ImM 二硫蘇糖醇洗滌2次。將最終沉淀重懸在1. 0ml 相同緩沖液中，并通過超聲破碎細胞。通過4°C離心(16，000x g,60min)除去細胞碎片，并 立即用無細胞提取物進行如下所述的木糖醇產(chǎn)生的檢測。在聚丙烯微離心管中進行500 yl 反應(yīng)，管中含具有以下終濃度的組分50mM Tris-HCl (pH 7. 0), 1. OmM MgCl2，ImM 二硫蘇糖 醇，66mM木糖和0. 32-0. 35mg無細胞提取物蛋白；通過BCA蛋白檢測法(Pierce)測定蛋白 濃度，以牛血清白蛋白為標準。在40°C溫育15小時后，用終濃度為30mM新戊酸終止反應(yīng)，并 取一份用SH1011柱(Showdex)進行HPLC分析，以0. 01N硫酸為流動相。柱溫維持在50°C，
32流速為l.Oml/min。本實驗對照不加入無細胞提取物，但其它處理相同。如表3所示，當(dāng)將ZW1無細胞提取物加入到反應(yīng)混合物中，在15小時的溫育時 間內(nèi)木糖不能轉(zhuǎn)變?yōu)槟就腔蚰咎谴?。如已提及的，該結(jié)果與預(yù)期相符，因為與ZW658和 ZW800相比較而言，ZW1是野生型菌株，不表達大腸桿菌木糖異構(gòu)酶。相反，當(dāng)使用ZW658無 細胞提取物時則產(chǎn)生大量木酮糖和木糖醇，因為它含有這兩種化合物形成所必需的酶。在 這種情況下，約8%最初的66mM木糖用于木糖醇的產(chǎn)生，因為當(dāng)加入到反應(yīng)混合物中的木 糖為GFOR的唯一底物時，每產(chǎn)生1個分子木糖醇需消耗兩分子木糖。最后，最重要的是， ZW800無細胞提取物僅能將木糖轉(zhuǎn)變?yōu)槟就?，因為雖然它含有木糖異構(gòu)酶活性，但它缺失 GFOR酶活性。這些結(jié)果進一步表明，ZW800不產(chǎn)生功能性GFOR酶，而且進一步證明該蛋白 以木糖為電子供體，將木酮糖還原為木糖醇，如以前用加入了純化的木糖異構(gòu)酶的野生型 無細胞提取物所示的結(jié)果一樣(Danielson同上)。表3. GF0R介導(dǎo)的、由木糖生成木糖醇也需要木酮糖——體外測定 實施例8在濃縮的葡萄糖和木糖混合物中山梨糖醇是ZW800生長所必需的檢測ZW800在濃縮的葡萄糖和木糖混合物中產(chǎn)生乙醇的發(fā)酵性能。該實驗在 PH-控制的發(fā)酵罐中進行，使用總糖為97g/L或188g/L，葡萄糖和木糖的固定比例為 5 4。將ZW658和ZW800的種子培養(yǎng)物在含75g/L葡萄糖、25g/L木糖、10g/L酵母提取 物、10g/L KH2P04,2g/L(NH4)2S04 ^P lg/LMgS04的液體培養(yǎng)基的搖瓶中，37°C下培養(yǎng)；最初pH 用4N K0H調(diào)整為5. 5。當(dāng)0D_達到 5. 0時，用50ml種子培養(yǎng)物接種含450ml生長培養(yǎng) 基的 1 升發(fā)酵罐(BIOSTAT B-DCU system, Sartorius BBISystem Inc.，Bethlehem, Pennsylvania, USA)。最終 500ml 培養(yǎng)物含 5g/L 酵母提取物、2g/L KH2P04、2g/L (NH4) 2S04、 lg/L MgS04及低濃度糖(54g/L 43g/L木糖)或高濃度糖(104g/L葡萄糖、84g/L木糖)。 在33°C培養(yǎng)，通過自動加入4N K0H維持pH5. 5?；旌纤俣仍O(shè)置為150rpm。在多個時間點， 取出1份發(fā)酵液用與實施例6所述相同流程和條件進行HPLC分析。本實驗的目標化合物 是葡萄糖、木糖和乙醇，用已知濃度的標準品定量色譜峰。也用設(shè)定光密度為600nm的分光 光度計通過以下濁度變化監(jiān)測細胞生長，并將得到的0D_做圖。如圖15所示，當(dāng)發(fā)酵罐含低濃度糖(54g/L葡萄糖、43g/L木糖)時，GF0R失活對 生長、糖消耗或乙醇滴度沒有影響。但如圖16所示，當(dāng)總糖濃度增加約2倍時，則發(fā)酵性能 有很大差異。ZW658的延遲期約30小時，這對利用木糖的運動發(fā)酵單胞菌重組菌株從葡萄糖和木糖稀釋混合物轉(zhuǎn)移到總糖超過180g/L的相同糖的濃縮混合物時是典型現(xiàn)象。在延 遲期后，細胞開始生長并消耗培養(yǎng)物中的所有葡萄糖和約75%木糖，因此得到最終乙醇滴 度為 73g/L(圖16A)。相比之下，ZW800培養(yǎng)物甚至在130小時培養(yǎng)時間后不從延遲期復(fù) 蘇(圖16B)，該結(jié)果在兩個獨立的情況下獲得。如圖15所示，由于ZW800在葡萄糖和木糖稀釋混合物中生長很好，因此該菌株不 能在高糖混合物中復(fù)蘇可能與滲透壓力相關(guān)。當(dāng)野生型運動發(fā)酵單胞菌轉(zhuǎn)移到葡萄糖和果 糖混合物，或通過轉(zhuǎn)化酶可產(chǎn)生葡萄糖和果糖的高濃度蔗糖中時，GF0R確實通過產(chǎn)生山梨 糖醇而在維持滲透平衡方面具有重要作用(Loos et al.，同上)。由GF0R在周質(zhì)空間產(chǎn)生 的山梨糖醇逆濃度梯度進入細胞內(nèi)，由于不進行進一步代謝而高水平積累。從而消除跨質(zhì) 膜的滲透壓差異，并保持滲透平衡(Wiegert et al.，同上)。但GF0R介導(dǎo)的山梨糖醇產(chǎn)生 的前提是同時存在葡萄糖和果糖，在缺少果糖的培養(yǎng)基中不發(fā)生該反應(yīng)。由于山梨糖醇是 GF0R的生理性重要的產(chǎn)物，但該酶在ZW800中失活，因此在以下實驗中檢測了向濃縮的葡 萄糖和木糖混合物中增加山梨糖醇的效果。在高濃度混合物中培養(yǎng) 70小時后(時間點由圖16的垂直箭頭指定)，從發(fā)酵 罐中除去5份4. 5ml延遲的(stalled) ZW800培養(yǎng)物并轉(zhuǎn)移到15ml帶蓋的試管中。然后向 4個試管補加0-20mM山梨糖醇(終濃度)，而且在所有情況下，將培養(yǎng)物的總體積用去離子 水調(diào)整為5.0ml ；本實驗所用的山梨糖醇儲液也由水配制。當(dāng)向10%稀釋的生長培養(yǎng)基中 加入水和山梨糖醇時，對第五個培養(yǎng)物不做任何添加，作為對照。然后將所有培養(yǎng)物在33°C 輕輕振蕩(200rpm)培養(yǎng)，并用分光光度計監(jiān)測生長。如圖17所示，當(dāng)向生長培養(yǎng)基中加入 山梨糖醇后，細胞幾乎立即開始生長，甚至在最低檢測濃度時(5mM)也是如此。而且發(fā)現(xiàn)不 加入山梨糖醇，但用水將培養(yǎng)物稀釋10%，將總糖濃度從188g/L降低到169g/L時也刺激生 長。但山梨糖醇對生長的刺激作用大大強于稀釋的作用。通過山梨糖醇得到的ZW800生長的拯救(rescue)完全在意料之外，因為ZW658在 葡萄糖和果糖混合物，而沒有已知來源的果糖中從延遲期復(fù)蘇，并生長很好。由于后一化合 物是GF0R介導(dǎo)的山梨糖醇產(chǎn)生的專性電子接納體，GF0R在含高濃度葡萄糖和木糖的培養(yǎng) 基中能合成山梨糖醇或在滲透平衡方面起重要作用并不明顯。因此不能表明山梨糖醇是 ZW658或ZW800在濃縮的葡萄糖和木糖混合物中的生長的重要因子。實施例9GF0R失活可在處理相關(guān)條件(process relevant conditions)下提高從木糖到乙
醇的產(chǎn)量對ZW658和ZW800在濃縮的葡萄糖和木糖混合物中的發(fā)酵性能在處理相關(guān)條件下 以并行方式進行比較，以測定GF0R失活是否是有利的或有害的代謝工程策略。由于在這些 實驗中使用高濃度葡萄糖和木糖，因此向培養(yǎng)基中加入山梨糖醇以使ZW800生長。在此處 未描述的實驗中，也發(fā)現(xiàn)山梨糖醇消除了 ZW658的延遲期。因此，對生長培養(yǎng)基補充山梨糖 醇可提供理想的在處理相關(guān)條件下來比較這兩個菌株的方式。用兩種總糖濃度，存在和不存在乙酸鹽下，將ZW658和ZW800在6個不同條件下 進行比較，對更濃縮的糖混合物，檢測了兩種不同的緩沖能力。這些實驗用20ml培養(yǎng)物在 30°C，在50ml試管中輕輕振蕩(150rpm)培養(yǎng)進行。不控制pH，但最初生長培養(yǎng)基中的pH 用濃磷酸在用種子培養(yǎng)物接種前調(diào)整到5. 8?；旧L培養(yǎng)基含10g/L酵母提取物、2g/LKH2P04、lg/L MgS04、5mM 山梨糖醇和或者 4g/L(圖 18 和 19)或者 8g/L(圖 20)KHC03。所有 以上和以下的值是加入種子培養(yǎng)物后的終濃度。用KHC03增加生長培養(yǎng)基的緩沖能力，以 使在細菌生長時通常發(fā)生的PH降低最小。所有這些實驗的碳源是兩種不同總糖濃度的葡 萄糖和木糖混合物，其與預(yù)處理的玉米秸水解物中的這兩種糖的比例相似。葡萄糖和木糖 的最初濃度分別為或者92g/L和82g/L(圖18)或者107g/L和96g/L(圖19和20)。其中 也存在6g/L of乙酸鹽(預(yù)處理玉米秸水解物中存在的抑制劑)。將種子培養(yǎng)物在30°C， 在含75g/L葡萄糖、25g/L木糖、10g/L酵母提取物、2g/L KH2P04、lg/L MgS04的液體培養(yǎng)基 中培養(yǎng)到0D_為 5. 0，并用1/10體積接種實驗培養(yǎng)物。在不同時間點，除去1份發(fā)酵液 如前實施例6所述進行HPLC分析。本實驗的目標化合物是葡萄糖、木糖、乙醇和木糖醇，所 有的值以g/L計。由于實際上所有的葡萄糖在第一個采樣時間點均被消耗，因此該糖的值 不在圖中畫出。從如圖18-20所示的實驗表明，ZW800在所有檢測的條件下均優(yōu)于ZW658，根據(jù)兩 個不同的標準進行判定(a)在實驗過程中消耗的木糖的總量，及(b)達到的最大乙醇滴 度。而且從該數(shù)據(jù)也表明，當(dāng)遇到最脅迫的條件(即所有的葡萄糖被消耗完，而且乙醇濃度 開始達到毒性水平)時，GF0R失活起到極大的有利作用。事實上，當(dāng)生長培養(yǎng)基中存在將 產(chǎn)生額外的脅迫的、抑制濃度的乙酸鹽時觀察到兩個菌株最大的差異。在三組實驗條件下， ZW800在存在乙酸鹽時的乙醇滴度平均增加量是10. 2%，其值在4. 4%到13. 7%。ZW800 在三個實驗中，在沒有乙酸鹽時產(chǎn)生的乙醇也比ZW658多，在這種情況下的平均增加量是 3. 2%。與預(yù)期一樣，ZW658將木糖轉(zhuǎn)變?yōu)榇罅康牟黄谕母碑a(chǎn)物木糖醇，當(dāng)條件最脅迫(即 在發(fā)酵最后階段，當(dāng)生長培養(yǎng)基中存在乙酸鹽時)時，該化合物達到最高水平。例如，在如 圖18-20所示的有乙酸鹽的實驗中，ZW658將消耗的總木糖的8. 1%、8.3%和9. 9%轉(zhuǎn)變?yōu)?木糖醇。相反，ZW800培養(yǎng)物在任何檢測條件下都沒有木糖醇的產(chǎn)生。這些結(jié)果清楚地表 明，GF0R失活利于在處理相關(guān)條件下代謝木糖產(chǎn)生乙醇，特別是在存在抑制濃度的乙酸鹽 時。如圖18和19所示的試管實驗進行了兩次，確實獲得相同的結(jié)果。另一個用ZW800和ZW658在pH控制的發(fā)酵罐中，在含乙酸鹽的濃縮葡萄糖和木糖 混合物中進行了并行實驗。由運動發(fā)酵單胞菌產(chǎn)生的代謝副產(chǎn)物例如有機酸和二氧化碳 降低生長培養(yǎng)基的PH，這可增加乙酸和乙酸鹽的比例，而已知質(zhì)子化物質(zhì)是實際上抑制細 菌生長的化合物(Kim et al, (2000)Applied Biochemistry and Biotechnology,84-86 357-370)。因此，在大規(guī)模發(fā)酵中，pH是非常重要的，因為pH從5. 8降低到5.0將使乙酸 的濃度增加5倍。將ZW800和ZW658種子培養(yǎng)物在搖瓶中，37 °C，在含75g/L葡萄糖、25g/L木糖、 10g/L酵母提取物、10g/L KH2P04、2g/L(NH4)2S04* lg/L MgS04的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)；起始 pH用4N K0H調(diào)整為5. 5。當(dāng)0D_達到 5. 0時，用50ml種子培養(yǎng)物接種到含450ml生長 培養(yǎng)基的 1 升發(fā)酵罐(BI0STAT0 B-DCU system, Sartorius BBISystem Inc.，Bethlehem, Pennsylvania, USA)中。最終500ml培養(yǎng)物含92g/L葡萄糖、97g/L木糖、lOg/L酵母提取 物、2g/L KH2P04、10mM山梨糖醇和7. 2g/L乙酸鹽。在33°C培養(yǎng)，通過自動加入4N K0H維 持pH在5. 5，混合速度為150rpm。在不同時間點，取出1份發(fā)酵液用實施例6所述相同流 程對其進行HPLC分析。本實驗的目標化合物是葡萄糖、木糖、乙醇和木糖醇，也對細胞生長 (0D_)進行監(jiān)測。圖21所示的是用ZW800培養(yǎng)物的整個時間段的發(fā)酵罐運行的參數(shù)，表4總結(jié)了兩個菌株木糖、乙醇和木糖醇的終點值。表4. ZW800和ZW658在pH控制的發(fā)酵罐中的木糖、乙醇和木糖醇的終點值 與有乙酸鹽的試管結(jié)果(圖18-20)相同，ZW800比ZW658在pH_控制的發(fā)酵罐中 多消耗14%的木糖，而且多產(chǎn)生9. 6%的乙醇(圖21)。由于ZW800不產(chǎn)生任何可檢測到 的木糖醇，因此該菌株乙醇的產(chǎn)量高約5%。相比之下，木糖醇在ZW658發(fā)酵液中的終濃度 為3. 92g/L，代表在實驗過程中消耗的總木糖的約6. 5 %。這些實驗對GF0R失活可通過去 除木糖醇形成而提高由木糖產(chǎn)生的乙醇產(chǎn)量提供了另外的證據(jù)。如已知的，不期望的副產(chǎn) 物木糖醇以至少兩個不同的方式干擾木糖代謝并抑制細菌生長，其導(dǎo)致低水平的ATP。因 此，當(dāng)GF0R產(chǎn)生木糖醇時，它降低了運動發(fā)酵單胞菌應(yīng)對所有其它通常在從木質(zhì)纖維素貯 存物發(fā)酵產(chǎn)生乙醇的過程中遇到的能量消耗脅迫的能力。與ZW658相比，由于ZW800不需 要與木糖醇相關(guān)的脅迫相競爭，因此它可在發(fā)酵后期階段產(chǎn)生最高水平脅迫時消耗更多的 木糖，產(chǎn)生更多的ATP和更多的乙醇。實施例10從ZW800中去除選擇性標記及獲得的菌株ZW801-4的特征Cre表達構(gòu)建體 pZB188~Kan/Cre 的產(chǎn)生如實施例3所述，插入到ZW800的GF0R開放閱讀框中的Sped盒夾在兩個 野生型loxP位點之間。這種排列易于從染色體中通過Cre重組酶(Sternberg and Hamilton (1981)J. Mol. Biol. 150 467-486 ；Leeand Saito 同上，Trinh et al (2000) Journal of Immunological Methods244(2) :185_193)除去選擇性標記。但為了達到該目 的，首先需要產(chǎn)生可在運動發(fā)酵單胞菌中復(fù)制的Cre表達載體(圖22)。Cre表達載體的前 體是如實施例4詳細描述的pZB188/Kan。簡言之，pZB188/Kan是可在大腸桿菌和運動發(fā)酵 單胞菌中復(fù)制的穿梭載體，因為它具有兩個細菌種的復(fù)制原點。它也含有賦予卡那霉素抗 性的DNA片段(即Kar/盒)。用Ncol和Notl對pZB 188/Kan進行雙消化，并通過瓊脂糖 凝膠電泳純化大載體片段。下一步是通過PCR用引物17和18產(chǎn)生Cre表達盒。擴增Cre 表達盒所用的DNA模板是含噬菌體PICre重組酶整個基因及其啟動子的質(zhì)粒(Sternberg et al (1986) J. Mol. Biol. 187(2) :197_212)。引物 17(SEQ ID NO :35)CTACTCATccatRRCATCTTGAGCTTGAGAAAAACC引物 18(SEQ ID NO :36)CATCTTACTrcrrccrcTTAATGGCTAATCGCCATCTTC
引物17 (正向引物)的下劃線堿基與對應(yīng)于Cre起始密碼子上游200bp處GenBank 登錄號為X03453的序列的nt 286-307雜交，而小寫字母對應(yīng)于添加到引物5，末端的Ncol 位點。引物18 (反向引物)的下劃線堿基與Cre開放閱讀框另一端GenBank登錄號為X03453 的序列的nt 1523-1503結(jié)合，而小寫字母對應(yīng)于添加到引物5’末端的Notl位點。用Ncol 和Notl雙消化1238bp PCR產(chǎn)物，并通過瓊脂糖凝膠電泳純化得到的含Cre重組酶完整開 放閱讀框及其推測的啟動子的DNA片段(Sternberg et al，1986同上)。然后通過標準連 接反應(yīng)將Cre-表達盒插入到上述pZB188/Kan DNA片段的Ncol和Notl位點。將連接反 應(yīng)混合物電轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH10B，并將轉(zhuǎn)化的細胞涂布在含卡那霉素(50i!g/ml)的LB培 養(yǎng)基上；37°C培養(yǎng)。從卡那霉素抗性轉(zhuǎn)化子中分離質(zhì)粒DNA，然后將該制備物導(dǎo)入大腸桿菌 JM110(dCm_，dam_)以獲得非甲基化的質(zhì)粒DNA進行后續(xù)的運動發(fā)酵單胞菌轉(zhuǎn)化(參見以下 描述)。Cre表達載體pZB188/Kan-Cre的質(zhì)粒圖譜如圖22所示。Cre處理以從ZW800染色體中除去選擇性標記并消除Cre表達載體噬菌體P1的Cre重組酶(Cre)可識別特異的34bp的DNA序列——“l(fā)oxP位點”， 該位點在8bp的非對稱核心旁側(cè)含有兩個13bp反向重復(fù)(Sternberg and Hamilton, 1981， 同上；Lee and Saito，同上；Trinh et al，同上)。Cre也可以切割任何位于兩個相同的loxP 位點之間的干擾DNA片段，而且切割反應(yīng)非常快。為了從GF0R開放閱讀框中除去Sped盒， 將 Cre 表達載體(pZB188/Kan-Cre)導(dǎo)入 ZW800 中。轉(zhuǎn)化流程基本如實施例5所述，但在復(fù)蘇階段后，將細胞涂布在含350 u g/ml作為 Cre表達載體選擇試劑的卡那霉素MMG培養(yǎng)基上。從該過程復(fù)蘇的原代轉(zhuǎn)化子對壯觀霉素 不再有抗性，因為通過Cre從染色體除去的Sped盒是在運動發(fā)酵單胞菌中不能復(fù)制的環(huán) 狀DNA片段。在30°C，在厭氧條件下培養(yǎng)48小時后，將兩個Kan7Specs原代轉(zhuǎn)化子進行Cre 質(zhì)粒消除過程。雖然PZBISS/Kan-Cre可在運動發(fā)酵單胞菌中復(fù)制，但在不合卡那霉素的培 養(yǎng)基上培養(yǎng)細胞很容易使該質(zhì)粒丟失。為了在本發(fā)明中消除Cre表達載體，將細胞在升高 的溫度(37°C )下，在不含卡那霉素的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)；每隔24-36小時將細胞轉(zhuǎn)移到含 相同組分的新鮮生長培養(yǎng)基中。在進行至少50代后，在MMG平板上分離單克隆，并從兩個 原始的原代轉(zhuǎn)化子中隨機選擇5個克隆進行進一步分析。與預(yù)期一致，這些克隆都不能在 含卡那霉素(350 y g/ml)或壯觀霉素(200 y g/ml)的MMG平板上生長。雖然不能在卡那霉 素上生長是質(zhì)粒消除過程成功的很好提示，但該結(jié)論也用與Cre表達盒雜交的引物通過克 隆PCR進行驗證?；谶@些實驗，選擇3個Cre處理的、質(zhì)粒消除的ZW800衍生物進行進一 步分析，這些菌株以下命名為ZW801-4、ZW801-5和ZW801-6。為了研究這些菌株在葡萄糖和木糖濃縮混合物中，在存在抑制濃度的乙酸鹽時表 現(xiàn)如何，進行了搖瓶實驗。在本分析中也包括ZW658和ZW800。將種子培養(yǎng)物在30°C，在含 75g/L葡萄糖、25g/L木糖、10g/L酵母提取物、2g/L KH2P04、lg/L MgS04的液體培養(yǎng)基中培 養(yǎng)至0D_ 3. 0，用10%接種物作為15ml的實驗培養(yǎng)物。將后者在50ml試管中，在30°C 振蕩(150rpm)培養(yǎng)。生長培養(yǎng)基含10g/L酵母提取物、2g/L KH2P04、lg/L MgS04、5mM山梨 糖醇、40mMKHC03、95g/L葡萄糖、90g/L木糖和7. 7g/L乙酸鹽；最初pH用濃磷酸調(diào)整為5. 8。 在不同時間點，除去1份培養(yǎng)物進行如前實施例6所述的發(fā)酵液HPLC分析。本實驗的目標 化合物是葡萄糖、木糖、乙醇和木糖醇，所有值以g/L計。如表5所示，ZW658產(chǎn)生66. 35g/L乙醇，并留下40. 6g/L殘余的木糖。ZW658由于具有功能性GF0R酶，因此也產(chǎn)生3. 19g/L不期望的副產(chǎn)物木糖醇。與以前其它并行實驗所 觀察到的一樣，ZW800比ZW658多消耗17%的木糖，多產(chǎn)生6. 2%的乙醇，而且不產(chǎn)生任何 可檢測的木糖醇。雖然用ZW801-4和ZW801-6獲得的結(jié)果略好一些，但這些差異可能在實 驗誤差范圍內(nèi)，不是統(tǒng)計學(xué)顯著的。本實驗中觀察到的ZW801-5相對較差的性能難以理解， 不再進一步研究?；谶@些結(jié)果，選擇菌株ZW801-4進行進一步分析。表5. ZW658、ZW800、ZW801-4、ZW801-4 和 ZW801-5 在高糖醋酸下的搖瓶實驗為了驗證搖瓶實驗表明ZW 801-4至少與ZW800表現(xiàn)一樣的結(jié)果，將這兩個菌株在 PH控制的條件下進行比較。將種子培養(yǎng)物在30。C，在含75g/L葡萄糖、25g/L木糖、10g/L酵 母提取物、2g/L KH2P04、lg/L MgS04的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。當(dāng)0D6(1(1達到 4. 6時，用17ml種子 培養(yǎng)物接種含153ml生長培養(yǎng)基的pH控制的生物反應(yīng)器中。最終170ml培養(yǎng)物中含105g/ L葡萄糖、100g/L木糖、10g/L酵母提取物、2g/LKH2P04、lg/L MgS04、5mM山梨糖醇和7. 2g/L 乙酸鹽。在33°C培養(yǎng)，通過自動加入4N K0H將pH維持在5. 5 ；攪拌速度為 150rpm。在不 同時間點，從生物反應(yīng)器中取出1份培養(yǎng)物進行如上所述的發(fā)酵液HPLC分析，并對0D,進 行監(jiān)測。在這些實驗條件下，ZW800和ZW 801-4的生長曲線幾乎重疊(圖23A)。葡萄糖和 木糖消耗的時間段也基本上一樣，而且兩個菌株產(chǎn)生具有相同動力學(xué)的相同量的乙醇(圖 23B)。另外，這兩個菌株均不產(chǎn)生任何可檢測的木糖醇。基于這些結(jié)果，我們認為從GF0R開 放閱讀框中除去Sped-盒不能使GF0R酶活性恢復(fù)或部分恢復(fù)，而且該操作對發(fā)酵性能沒 有壞的影響。雖然ZW800和ZW801-4都比具有功能性GF0R酶的親本菌株(ZW658)表現(xiàn)好， 但優(yōu)選的用于商業(yè)用途的菌株是ZW801-4，因為它不含有對抗生素賦予抗性的外源基因。來自ZW801-4的基因組DNA的序列分析提供了確實發(fā)生正確的Cre切除事件的明 確證據(jù)。ZW801-4中被破壞的GF0R開放閱讀框的完整核苷酸序列(從原始起始密碼子到原 始終止密碼子)如SEQ IDN0 37所示，圖24所示的是翻譯的突變序列與野生型GF0R蛋白 的比對；后者由GenBank登錄號AE008692的核苷酸683751-685052的反向互補序列編碼。 與預(yù)期一樣，Specr盒的Cre切割在GF0R開放閱讀框中間留下1個野生型loxP位點，該插 入事件產(chǎn)生成熟前截短蛋白的同框終止密碼子；“l(fā)ox瘢痕”由灰色高亮殘基表示。作為自 殺型構(gòu)建體設(shè)計的結(jié)果，突變的核苷酸序列也在相同位置缺失 72bp的原始野生型GF0R 核苷酸序列。
權(quán)利要求
能夠利用木糖產(chǎn)生乙醇的重組發(fā)酵單胞菌(Zymomonas)菌株，其包含至少一種可降低葡萄糖-果糖氧化還原酶活性的遺傳修飾。
2.權(quán)利要求1所述的重組發(fā)酵單胞菌菌株，其中，降低葡萄糖_果糖氧化還原酶活性的 遺傳修飾選自插入、缺失、突變、共抑制和反義RNA表達。
3.權(quán)利要求1所述的重組發(fā)酵單胞菌菌株，其中降低葡萄糖_果糖氧化還原酶活性的 遺傳修飾是通過同源重組引入到所述菌株的葡萄糖_果糖氧化還原酶基因中的插入。
4.權(quán)利要求1所述的發(fā)酵單胞菌菌株，其為選自ZW800、ZW801-4和ZW801-6的菌株。
5.權(quán)利要求1所述的發(fā)酵單胞菌菌株，其中，與沒有通過遺傳修飾降低葡萄糖_果糖氧 化還原酶活性的菌株相比，所述菌株產(chǎn)生更少量的木糖醇。
6.權(quán)利要求5所述的發(fā)酵單胞菌菌株，其中，所述菌株基本上不產(chǎn)生木糖醇。
7.生產(chǎn)能夠利用木糖來產(chǎn)生乙醇、且具有降低的GF0R活性的發(fā)酵單胞菌菌株的方法， 包括a)提供能夠在合適條件下利用木糖產(chǎn)生乙醇的重組發(fā)酵單胞菌菌株；及 b)向(a)中的、能夠利用木糖產(chǎn)生乙醇的重組發(fā)酵單胞菌菌株中引入至少一種遺傳修 飾，所述修飾可降低葡萄糖_果糖氧化還原酶活性。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中，(a)中的、能夠利用木糖產(chǎn)生乙醇的重組發(fā)酵單胞菌 菌株選自ATCC31821/pZB5、運動發(fā)酵單胞菌(Z. mobilis) 8b、ZW658、ZM4 (pZB5)和運動發(fā)酵 單胞菌CP4:pZB5。
9.權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述的遺傳修飾選自插入、缺失、突變、共抑制和反義 RNA表達。
全文摘要
通過對葡萄糖-果糖氧化還原酶基因進行遺傳修飾以降低GFOR酶表達活性，從而構(gòu)建了可利用木糖的發(fā)酵單胞菌。該工程菌表現(xiàn)為降低木糖代謝中有害副產(chǎn)物木糖醇的產(chǎn)量。它也可在處理相關(guān)的條件下，在混合糖發(fā)酵過程中消耗更多的木糖，產(chǎn)生更多的乙醇。
文檔編號C12P7/10GK101861385SQ200780036026
公開日2010年10月13日 申請日期2007年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月28日
發(fā)明者C·M·麥卡欽, M·張, P·V·維塔寧, Y·-C·仇 申請人:納幕爾杜邦公司;可持續(xù)能源聯(lián)盟有限責(zé)任公司