一種納米非病毒基因輸送體系及其應用
【專利說明】-種納米非病毒基因輸送體系及其應用
[0001] 本發(fā)明是申請?zhí)枮镃N 201010292778.6的發(fā)明專利申請的分案申請。
技術領域
[0002] 本發(fā)明屬于生物技術領域;更具體地，本發(fā)明設及一種納米非病毒基因輸送體系 及其應用。
【背景技術】
[0003] 骨髓間充質(zhì)干細胞在骨組織工程中具有十分重要的地位，是骨組織工程中種子細 胞的主要來源。而滑膜細胞和軟骨細胞則在骨關節(jié)炎的發(fā)生和進程中扮演著十分重要的角 色，它們也常常被作為基因治療的祀細胞。然而，運些骨關節(jié)相關細胞目前存在著基因轉(zhuǎn)染 效率低下的問題，運成為了技術進步的瓶頸，大大限制了臨床基因治療的開展。
[0004] 基因治療是指運用基因工程技術將外源基因?qū)牖颊呒毎麅?nèi)，W糾正或補償致病 基因引起的疾病。將外源基因?qū)爰毎麅?nèi)必須借助一定的技術方法。目前基因轉(zhuǎn)染的方法 主要可W分為Ξ大類，一類是生物學方法，一類是物理方法，還有一類是化學方法。生物學 方法主要是指運用病毒作為載體將外源基因?qū)爰毎募夹g。目前研究最多的病毒載體是 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，慢病毒載體，腺病毒載體，腺病毒相關病毒載體，單純瘤疹病毒載體等。物 理方法主要是指運用物理手段將外源基因?qū)爰毎募夹g。目前常用的方法有顯微注射， 電擊穿膜，壓力滲透，超聲噴霧，粒子轟擊等方法?；瘜W方法則是指利用化學試劑將外源基 因?qū)爰毎募夹g。目前較常用的轉(zhuǎn)染試劑是W陽離子脂質(zhì)體為母體材料的一系列衍生 物。另外利用聚乙締亞胺(polyeth^enimine，陽I)和殼聚糖(化itosan)為母體材料的一系 列衍生物也有很多的報導?；瘜W轉(zhuǎn)染試劑種類繁多，考慮到轉(zhuǎn)染效率、毒性等問題，不同的 細胞所使用的化學轉(zhuǎn)染試劑是不同的。因此，對于特定的細胞，需要找到最為合適的化學轉(zhuǎn) 染試劑。
[0005] 上述Ξ類方法，彼此各有優(yōu)缺點，實驗者往往會根據(jù)不同的需求而使用不同的方 法將外源基因?qū)爰毎?。在使用不同的導入方法時，主要需要考慮到W下運些因素：安全 性，有效性，可操作性W及成本因素。比如在生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物的時候，往往會通過顯微注射 的方法將外源基因?qū)胧芫鸭毎?，或者精子和卵母細胞。但是運種方法需要實驗操作人 員有很強的操作經(jīng)驗和熟練的操作技術，另外顯微注射方法對儀器的要求也比較高，運對 于一般的細胞轉(zhuǎn)染是不適合的。
[0006] 基因載體是攜帶外源基因?qū)爰毎麅?nèi)的載體系統(tǒng)，一般可W分為病毒載體和非病 毒載體兩大類。運兩類載體有各自的優(yōu)缺點。病毒載體往往具有一定的免疫原性，細胞毒 性，隨機整合到宿主細胞基因組所引起的致癌作用，制備較為復雜等缺點，同時其具有較為 廣譜的宿主細胞，對于原代細胞有著較高的轉(zhuǎn)染效率，運是非病毒載體所難W企及的。而非 病毒載體有著較好的生物相容性和較低的細胞毒性，免疫原性也幾乎沒有。但它在不同祀 細胞上的轉(zhuǎn)染效率有著巨大的差異。運種差異主要體現(xiàn)為在原代細胞上相對較低的轉(zhuǎn)染效 率，運在一定程度上制約了其在臨床上的運用。理想的基因載體應該是低毒、高效、低成本 又可操作。
[0007] 非病毒基因載體的低細胞毒性、低免疫原性和較好的生物相容性一直被認為有望 取代病毒載體。但是較之病毒基因載體，較低的轉(zhuǎn)染效率一直是困擾其應用的巨大障礙。需 要通過化學修飾等方法來提高非病毒基因載體的轉(zhuǎn)染效率。
[0008] 非病毒基因載體根據(jù)母體材料的不同可分為兩個大類，一類是陽離子脂質(zhì)體及其 衍生物，另一類是陽離子聚合物及其衍生物。陽離子脂質(zhì)體主要有Lipo2000，F(xiàn)ugene6等，它 們在體外對于一些細胞系往往具有穩(wěn)定而且較高的轉(zhuǎn)染效率，運也是它們其中一些能夠成 為商品化轉(zhuǎn)染試劑的一大原因。但是，陽離子脂質(zhì)體對于一些原代細胞較低的轉(zhuǎn)染效率確 實制約了其在某些領域的運用。另外，在體內(nèi)運用陽離子脂質(zhì)體進行基因治療時，陽離子脂 質(zhì)體往往會被血液中的血清白蛋白凝聚并且沉淀下來，從而大大降低了其轉(zhuǎn)染效率。
[0009] 影響非病毒基因載體轉(zhuǎn)染效率的因素有很多，可W從材料學角度和生物學角度分 別進行討論和分析。
[0010] 理想的非病毒基因載體首先要能夠在生理pH和生理離子濃度條件下有較好的溶 解性。其次它與質(zhì)粒應有較好的復合能力，形成的復合物應具有較為合適的粒徑和表面電 位。有文獻報導認為，粒徑小于200WI1的粒子一般通過網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞作用進入細胞， 而粒徑介于200μπι-500Μ?的粒子一般通過細胞質(zhì)囊微膜介導的內(nèi)吞作用進入細胞。運兩種 不同的內(nèi)吞方式會直接導致復合物進入細胞后的不同命運。前者，通過網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi) 吞作用，復合物必須經(jīng)過溶酶體才能進入細胞質(zhì)，而后者則可W不通過溶酶體而直接進入 細胞質(zhì)。對于復合物的表面電位，目前認為帶有少量的表面電荷（lOmV左右)是比較理想的。 因為過高的表面電荷很容易在體內(nèi)的血液循環(huán)過程中與血清白蛋白發(fā)生凝聚，而過低的表 面電荷則不利于細胞表面的帶有負電荷的膜蛋白吸附運些復合物。復合物的粒徑和表面電 位在很大程度上又與非病毒載體材料與外源基因的比例，即氮憐比（N/P)有關。有些情況 下，復合物的形狀也會影響到轉(zhuǎn)染效率。
[0011] 在很多研究中發(fā)現(xiàn)，相同的非病毒基因載體在不同種類的細胞中往往會有顯著不 同的轉(zhuǎn)染效率。運些不同，首先體現(xiàn)在非病毒基因載體對于各種細胞的細胞毒性是不同的， 其次每一種細胞自身的生理特性也各有差異。
[0012] 綜上，對于不同的細胞，選擇的非病毒載體往往是不同的，本領域需要針對骨關節(jié) 相關細胞進行研究，W開發(fā)出合適它們的轉(zhuǎn)染試劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明的目的在于提供一種納米非病毒基因輸送體系及其應用。
[0014] 在本發(fā)明的第一方面，提供一種將外源基因轉(zhuǎn)染入骨關節(jié)相關細胞中的方法，包 括：
[0015] (1)將表達所述外源基因的表達體系與基因輸送體系混合，獲得轉(zhuǎn)染液；
[0016] (2)將轉(zhuǎn)染液加入到骨關節(jié)相關細胞中，從而外源基因被轉(zhuǎn)染入細胞中；
[0017] 所述的基因輸送體系是低分子量（分子量小于2000Da;較佳地分子量在400- 1500化之間；更佳地在500-1000化之間；更佳地在500-800之間；最佳地分子量為600Da)的 聚乙締亞胺與環(huán)糊精的復合物。
[0018] 在一個優(yōu)選例中，所述的表達所述外源基因的表達體系與基因輸送體系形成復合 物，培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基，得到轉(zhuǎn)染液。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述的基因輸送體系具有式I結(jié)構(gòu)的復合物，
[0020]
[0021] 其中，mi為8-50(較佳地是5-40;更佳地是5-25)的正整數(shù)，m2為4-25(較佳地是5- 20;更佳地是5-15)的正整數(shù)，η為10-20(較佳地是10-18;更佳地是14-18)的正整數(shù);且mi: m2 二 2:1〇
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述的骨關節(jié)相關細胞選自：滑膜細胞，軟骨細胞，骨髓間充質(zhì) 干細胞(BMSC)。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述的骨關節(jié)相關細胞是骨髓間充質(zhì)干細胞。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，所述外源基因的表達體系與基因輸送體系混合的方法為:將含 有基因輸送體系的水溶液與含有表達所述外源基因的表達體系的水溶液混合，使得基因輸 送體系中的有效氮與外源基因中的有效憐的比例(N/P)為20-35。
[0025] 在另一優(yōu)選例中，基因輸送體系中的氮與外源基因中的憐的比例為20-30。
[0026] 在另一優(yōu)選例中，相對于骨髓間充質(zhì)干細胞或滑膜細胞，基因輸送體系中的有效 氮與外源基因中的有效憐的比例(N/P)為25-35(較佳地為28-32,最佳地為30)。
[0027] 在另一優(yōu)選例中，相對于軟骨細胞，基因輸送體系中的有效氮與外源基因中的有 效憐的比例(N/P)為20-30 (較佳地為22-27，最佳地為25)。
[0028] 在本發(fā)明的另一方面，提供了式I結(jié)構(gòu)的復合物的用途，用于制備將外源基因轉(zhuǎn)染 入骨關節(jié)相關細胞中的試劑。
[0029]
[0030] 其中，虹為8-50的正整數(shù)，m2為4-25的正整數(shù)，η為10-20的正整數(shù);且mi: m2 = 2:1。
[0031] 在另一優(yōu)選例中，所述的骨關節(jié)相關細胞選自：滑膜細胞，軟骨細胞，骨髓間充質(zhì) 干細胞。
[0032] 在另一優(yōu)選例中，所述的骨關節(jié)相關細胞為骨髓間充質(zhì)干細胞。
[0033] 本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領域的技術人員而言是顯而易見 的。
【附圖說明】
[0034] 圖1、非病毒載體陽l6〇〇-CyD對于BMSC的細胞毒性。
[0035] A: PE16〇〇-Cy D、陽I -2 5kDa作用地的細胞毒性；
[0036] B:PEl6〇〇-CyD、陽 I-25kDa 作用 2地的細胞毒性。
[0037] 圖2、非病毒載體PEI6日日-CyD對于原代滑膜細胞的細胞毒性。
[003引 A:PEl600-CyD、陽I-25kDa作用地的細胞毒性；
[0039] B: PE16〇〇-Cy D、陽 I -2 5kDa作用 2地的細胞毒性。
[0040] 圖3、非病毒載體PEl6〇〇-CyD對于原代軟骨細胞的細胞毒性。
[0041 ] A: PE16〇〇-Cy D、陽I -2 5kDa作用地的細胞毒性；
[0042] B: PE16〇〇-Cy D、陽 I -2 5kDa作用 2地的細胞毒性。
[00創(chuàng)圖4、非病毒載體陽16日日-CyD對于BMSC的轉(zhuǎn)染效率。
[0044] A:巧光顯微鏡下BMSC轉(zhuǎn)染效果