一種基于人源骨架蛋白Fn3制備腦鈉肽前體抗原替代物方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種表達(dá)、分離純化人源Fn3展示抗原腦鈉肽前體N端(NT-proBNP)線(xiàn)性表位的方法，可以簡(jiǎn)單、快速、高效制備具有和腦鈉肽前體的抗原性相當(dāng)?shù)娜诤系鞍祝茨X鈉肽前體抗原替代物。為高效低成本制備具有腦鈉肽前體抗原性的標(biāo)準(zhǔn)品奠定基礎(chǔ)。
【背景技術(shù)】
[0002]在ELISA檢測(cè)試劑盒制備過(guò)程中，需要相應(yīng)的抗原作為標(biāo)準(zhǔn)品。其中，蛋白質(zhì)類(lèi)抗原占有很大的比例。如何高效生產(chǎn)蛋白質(zhì)類(lèi)抗原蛋白，是該類(lèi)產(chǎn)品的一個(gè)技術(shù)關(guān)鍵。本發(fā)明采用人源骨架蛋白Fn3展示蛋白質(zhì)類(lèi)抗原線(xiàn)性表位，嘗試建立一個(gè)利用大腸桿菌高效生產(chǎn)蛋白質(zhì)類(lèi)線(xiàn)性表位的通用的平臺(tái)。
[0003]骨架蛋白是一類(lèi)構(gòu)成蛋白質(zhì)骨架部分的能夠耐受多個(gè)氨基酸插入、缺失或替換而保持其折疊和三級(jí)結(jié)構(gòu)不變的蛋白質(zhì)骨架。來(lái)源于一些蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)域。該類(lèi)蛋白具有高度穩(wěn)定性和可溶性，易于在大腸桿菌種高水平表達(dá)。其中研究非常深入的人纖維連接蛋白III型結(jié)構(gòu)域(Fn3)是一種骨架蛋白。Fn3包含94個(gè)氨基酸殘基，分子量13.8kD，不含半胱氨酸和二硫鍵，由四條β-折疊和一條α-螺旋組成。Fn3具有非常高的熱穩(wěn)定性，Tm值高達(dá)87 0C，其熱變性過(guò)程完全可逆。除此之外，F(xiàn)n3能夠耐受高濃度的尿素;且在室溫條件下，PH值在2-11.3的范圍內(nèi)仍然能保持蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象。這個(gè)蛋白非常適合作為融合蛋白在大腸桿菌種表達(dá)純化。
[0004]抗原表位(antigenic epitope)，簡(jiǎn)稱(chēng)“表位”，也稱(chēng)為“抗原決定簇”(antigenicdeterminant)，是指抗原表面上決定抗原特異性的化學(xué)基團(tuán)?？乖砦豢杀幻庖呦到y(tǒng)(尤其是抗體、B細(xì)胞或者T細(xì)胞)所識(shí)別?？贵w中能識(shí)別抗原表位的區(qū)域叫做“互補(bǔ)位”或“抗體決定簇”。通?？乖砦皇侵竿鈦?lái)蛋白質(zhì)等物質(zhì)的其中一部分序列。蛋白質(zhì)抗原的表位根據(jù)它們的結(jié)構(gòu)以及與互補(bǔ)位的交互作用，被分為構(gòu)象表位和線(xiàn)性表位這兩種類(lèi)型。其中線(xiàn)性表位是由一段連續(xù)的抗原氨基酸序列構(gòu)成，與抗原的結(jié)合作用的基礎(chǔ)是其一級(jí)結(jié)構(gòu)，是蛋白質(zhì)抗原性的基礎(chǔ)，抗體的特異性是針對(duì)表位的。由于表位一般僅由幾個(gè)到十幾個(gè)氨基酸組成，合成單獨(dú)的抗原表位肽由于其分子較小，極難表達(dá)純化。
[0005]本發(fā)明采用人源骨架蛋白Fn3展示腦鈉肽前體抗原表位，通過(guò)該途徑解決一些抗原在大腸桿菌種表達(dá)困難或抗原不穩(wěn)定的問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)只表達(dá)骨架蛋白所展示抗原的一個(gè)或多個(gè)表位，就可以生產(chǎn)具有和抗原蛋白具有等效的高穩(wěn)定的抗原蛋白替代物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明建立基于人源Fn3展示抗原腦鈉肽前體N端(NT-proBNP)線(xiàn)性表位來(lái)制備腦鈉肽前體抗原替代物的方法，可以簡(jiǎn)單、快速、高效制備具有和腦鈉肽前體的抗原性相當(dāng)?shù)娜诤系鞍?，即腦鈉肽前體抗原替代物。為高效低成本制備具有腦鈉肽前體抗原性的標(biāo)準(zhǔn)品奠定基礎(chǔ)。
[0007]選取編碼能與抗腦鈉肽前體抗體結(jié)合的抗原表位核苷酸序列置換骨架蛋白Fn3的編碼FG區(qū)的核苷酸序列，利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)制備和腦鈉肽前體N端(NT-proBNP)的抗原性相當(dāng)?shù)娜诤系鞍住?br>[0008]一種基于人源骨架蛋白Fn3制備腦鈉肽前體抗原替代物方法，包括以下步驟:
[0009 ] 1、骨架蛋白Fn3展示NT-proBNP線(xiàn)性表位重組蛋白表達(dá)載體構(gòu)建:
[0010](I)根據(jù)Fn3骨架蛋白晶體結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)展示表位位置。根據(jù)模建結(jié)果，將NT-proBNP線(xiàn)性表位設(shè)計(jì)在Fn3骨架蛋白的FG區(qū)，將能與抗腦鈉肽前體抗體結(jié)合的抗原表位核苷酸序列置換骨架蛋白Fn3的編碼FG區(qū)的核苷酸序列，構(gòu)成骨架蛋白Fn3與NT-proBNP線(xiàn)性表位融合基因，合成Fn3展示NT-proBNP線(xiàn)性表位的基因片段，在融合基因下游融合編碼6個(gè)組氨酸的分離純化標(biāo)簽(His-tag)，便于分離純化:采用人纖維連接蛋白III型結(jié)構(gòu)域(Fn3)蛋白為模式基因，在基因的5'末端引入編碼6個(gè)組氨酸殘基，在FG loop區(qū)引入NT-proBNP編碼表位的短肽序列CTGGAAACCTCGGGCCTGCAGGAACAACGT，以上設(shè)計(jì)合成的基因編碼Fn3展示NT-proBNP 線(xiàn)性表位重組蛋白 ，命名為 Fn3-epitope。
[0011](2)將以上融合基因構(gòu)建到大腸桿菌胞內(nèi)表達(dá)載體上，融合的重組蛋白將在大腸桿菌胞內(nèi)表達(dá):將上述設(shè)計(jì)合成的基因，用Nco I和Hind III構(gòu)建到大腸桿菌表達(dá)載體pET28a( + )上，得到重組載體 pET28-Fn3_epitope。
[0012]2、將構(gòu)建的重組蛋白基因質(zhì)胞內(nèi)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌工程菌株，篩選得到陽(yáng)性克隆，此陽(yáng)性克隆表達(dá)的重組蛋白就展示有線(xiàn)性抗原表位。將鑒定過(guò)的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行自誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)表達(dá)3-6小時(shí)，培養(yǎng)基中添加與表達(dá)載體所帶抗性基因相應(yīng)的抗生素。
[0013]將構(gòu)建的表達(dá)載體電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株BL21(DE3)，然后將轉(zhuǎn)化子接種到10毫升含有Kan(濃度為每毫升LB培養(yǎng)基含50微克卡那霉素)的LB培養(yǎng)基中，過(guò)夜培養(yǎng)。次日，以I: 100接種到500毫升含有Kan(濃度為每毫升LB培養(yǎng)基含50微克卡那霉素)LB培養(yǎng)基的2升三角瓶中，200rpm、37 °C培養(yǎng)，直至OD6qq達(dá)到0.6。然后，在25-35 °C、200rpm條件下添加I毫摩爾的的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)3小時(shí)，在此過(guò)程，在大腸桿菌胞內(nèi)表達(dá)重組蛋白IB培養(yǎng)基的配方如下:胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L，酵母提取物(Yeast extract)5g/L，氯化鈉(NaCl) 10g/L。
[0014]3、收集菌體，提取可溶蛋白，用親和層析方法，分離純化重組蛋白，該蛋白即為包含有線(xiàn)性抗原表位的融合蛋白:用鎳柱純化His-Tag的重組蛋白，純化的重組蛋白Fn3-epitope0
[0015]本發(fā)明所述的抗原表位展示方法還具有廣泛的潛在應(yīng)用領(lǐng)域，如可用于展示某抗原分子上的某一表位，這種展示有外源抗原表位的重組蛋白，可作為某抗原的替代物直接用于免疫動(dòng)物，制備針對(duì)該表位的抗體，如果制備的抗體能特異性識(shí)別相應(yīng)的抗原，則通過(guò)這種技術(shù)就實(shí)現(xiàn)了在無(wú)相應(yīng)抗原的情況下制備了該抗原的抗體。本發(fā)明所述的抗原表位展示方法也可用于蛋白質(zhì)表位疫苗的制備。例如，利用該表位展示方法展示病原微生物或腫瘤抗原的中和性抗原表位，這種展示有中和性抗原表位的重組蛋白可直接作為疫苗，用于免疫動(dòng)物，讓動(dòng)物產(chǎn)生針對(duì)中和性表位的抗體，從而在體內(nèi)清除相應(yīng)的病原微生物或抑制腫瘤的生長(zhǎng)。
[0016]本發(fā)明的有益效果是，可以簡(jiǎn)單、快速、高效表達(dá)具有和腦鈉肽前體N端的抗原性相當(dāng)?shù)娜诤系鞍?。為高效低成本制備具有腦鈉肽前體抗原性的標(biāo)準(zhǔn)品奠定基礎(chǔ)。
【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1是本發(fā)明的Fn3_epitope基因結(jié)構(gòu)圖；
[0018]圖2是本發(fā)明的pET28-Fn3-epitope的載體結(jié)構(gòu)圖；
[0019]圖3是本發(fā)明的重組Fn3_epitope蛋白分離純化圖，其中:1、2、3分別是實(shí)施例分離純化的Fn3-epitope重組蛋白，Μ.標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)；
[0020]圖4重組Fn3-epitope蛋白與鼠源抗NT-proBNP13-20氨基酸殘基的單克隆抗體13G12結(jié)合能力分析。
【具體實(shí)施方式】
[0021]下面結(jié)合附圖及【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不影響本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0022]實(shí)施例一
[0023]1、本實(shí)施例采用人纖維連接蛋白III型結(jié)構(gòu)域(Fn3)蛋白為模式基因(EMBL登入號(hào)碼AJ320527) ο在基因的5'末端引入編碼6個(gè)組氨酸殘基，在FG loop區(qū)引入NT-proBNP編碼表位的短肽序列(CTGGAAACCTCGGGCCTGCAGGAACAACGT，編碼 NT-proBNP 的 12-21 氨基酸殘基LETSGLQEQR)，融合基因結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。
[0024]將序列表[001]所示的人纖維連接蛋白III型結(jié)構(gòu)域(Fn3)與NT-proBNP融合基因表達(dá)框序列合成后(南京金斯瑞生物科技有限公司)，用Nco I和Hind III構(gòu)建到大腸桿菌表達(dá)載體pET28a (+)上，得到重組載體pET28-Fn3_ep i tope，載體結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖2。
[0025]2、將構(gòu)建的表達(dá)載體電擊轉(zhuǎn)化BL21(DE3)大腸桿菌菌株，然后將轉(zhuǎn)化子接種到10毫升含有Kan(濃度為每毫升LB培養(yǎng)基含50微克卡那霉素)的LB培養(yǎng)基中，過(guò)夜培養(yǎng)。次日，以1:100接種到500毫升含有Kan(50微克每毫升)LB培養(yǎng)基的2升三角瓶中，200rpm、37°C培養(yǎng)，直至OD6qq達(dá)到0.6。然后，在25°C、200rpm條件下添加I毫摩爾的的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)3小時(shí)，在此過(guò)程，在大腸桿菌胞內(nèi)表達(dá)重組蛋白。LB培養(yǎng)基的配方如下:胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L，酵母提取物(Yeast extract)5g/L，氯化鈉(NaCl) 10g/L。
[0026]3、通過(guò)常規(guī)方法制備可溶蛋白，用鎳柱純化His-Tag的重組蛋白，純化的重組蛋白Fn3_epitope 如圖 3所示。
[0027]4、將步驟3獲得的重組蛋白Fn3-epit0pe通過(guò)ELISA方法測(cè)定免疫血清的效價(jià)。重組Fn3_epi tope蛋白經(jīng)逐級(jí)稀釋后包被96孔酶標(biāo)板，經(jīng)過(guò)封閉液后封閉后，加入HyTest公司生產(chǎn)的鼠源抗NT-proBNP13-20氨基酸殘基的單克隆抗體13G12(1:2500稀釋)，用血清白蛋白作空白對(duì)照。二抗為辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG抗體(I: 4000)，底物為T(mén)M