專利名稱：人源抗人催乳素受體抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)和生物制品領(lǐng)域，具體涉及一種人源抗催乳素受體抗體 (hPRLR-Fab)及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
抗體在疾病的診斷、治療和預(yù)防中發(fā)揮著重要的作用，目前在世界范圍內(nèi)，抗體藥物已占整個臨床使用的生物藥品的30%，其中單克隆抗體因具有靶向特異性的優(yōu)點(diǎn)，作為治療性抗體表現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用前景，已逐步發(fā)展為一大類獨(dú)立醫(yī)藥產(chǎn)品[1]。目前研制的單克隆抗體多為鼠源性，而鼠源性單抗作為異源性蛋白在人體內(nèi)可誘發(fā)抗鼠抗體(Human Anti-Mouse Antibody,HAMA)的產(chǎn)生，使其在臨床治療中的應(yīng)用受到了極大的限制，所以只有將其人源化，才能有效地應(yīng)用于臨床治療。近年來，人源化抗體和全人源化抗體的出現(xiàn)，為治療性抗體在臨床上的廣泛應(yīng)用帶來了希望，特別是伴隨著一系列重大生物技術(shù)的發(fā)展，制備全人源化抗體在腫瘤治療中已顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢。目前轉(zhuǎn)基因小鼠和抗體庫技術(shù)是制備全人源抗體兩個重要的技術(shù)手段[2’3]。其中利用噬菌體抗體庫技術(shù)，通過鏈更替將鼠單抗Fab片段轉(zhuǎn)換成完全人源化抗體，這種形式的抗體由于有100%的人抗體序列，因此從根本上克服了 HAMA反應(yīng)的出現(xiàn)。同時(shí)與傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)相比，噬菌體抗體庫技術(shù)集抗體篩選、特異性鑒定和親和力成熟于一體，可實(shí)現(xiàn)繞過動物免疫制備單克隆抗體，具有簡便易行、篩選容量大、過程短、利于基因工程改造和生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)。因而噬菌體抗體庫技術(shù)是目前抗體人源化改造和功能性抗體篩選的最理想的方式。乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，雖然乳腺癌的手術(shù)、放療、化療和內(nèi)分泌治療取得了很大的進(jìn)展，但對于進(jìn)展期和轉(zhuǎn)移的乳腺癌卻仍無有效的治療手段。多年來，人們一直在探索應(yīng)用免疫學(xué)的方法來治療乳腺癌，但直到1998年，美國FDA批準(zhǔn)針對乳腺癌基因過表達(dá)產(chǎn)物HER2受體的人源化單克隆抗體Herceptin用于乳腺癌的臨床治療，人們才真正看到了生物免疫治療乳腺癌的曙光。由于乳腺癌的病因?qū)W尚不十分清楚，遺傳、激素、免疫與各種環(huán)境因素相互作用，均可能與乳腺癌變的演進(jìn)過程有關(guān)，但值得重視的是，乳腺是主要性激素與眾多細(xì)胞因子反應(yīng)的組織器官，在乳腺細(xì)胞中，激素、受體、細(xì)胞因子及其相關(guān)基因產(chǎn)物組成一個復(fù)雜的免疫內(nèi)分泌調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，表明了乳腺癌也是一個激素依賴性腫瘤，激素通過與其特異性受體的結(jié)合而行使功能，如雌激素、孕激素和催乳素等M，其中引人關(guān)注的是人催乳素(human prolactin, hPRL)，hPRL不僅可以通過內(nèi)分泌機(jī)制影響乳腺細(xì)胞生長、發(fā)育分化，還可作為乳腺所產(chǎn)生、釋放的細(xì)胞因子，以旁分泌和自分泌方式調(diào)節(jié)乳腺細(xì)胞的反應(yīng)，hPRL作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制是通過位于細(xì)胞膜上的人催乳素受體(human prolactin receptor,hPRLR)來完成。在乳腺組織中，hPRLR基因的表達(dá)水平對細(xì)胞增殖起著重要的作用，hPRLR表達(dá)水平的上調(diào)，將引起錯誤的級聯(lián)反應(yīng)，造成乳腺細(xì)胞的異常增生， 進(jìn)而誘發(fā)乳腺癌發(fā)生。因此，有效拮抗hPRLR與hPRL的結(jié)合或利用高表達(dá)的hPRLR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑為乳腺癌的生物免疫治療提供了一種新的策略。
隨著分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和免疫學(xué)研究的進(jìn)展，特別是噬菌體抗體庫技術(shù)的出現(xiàn)使人源化抗體的制備產(chǎn)生了突破性進(jìn)展，對于乳腺癌的生物免疫治療具有極其重要的應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明通過獲得人源抗hPRLR抗體，并由此構(gòu)建乳腺癌患者的人源IgGFab噬菌體抗體庫，既可滿足高通量篩選乳腺癌患者高表達(dá)的靶蛋白的單克隆抗體的需要，從而為乳腺癌的分子免疫治療提供新的作用靶點(diǎn)和抗體藥物候選靶標(biāo)分子，還為治療以hPRLR為靶向分子的抗乳腺癌生物免疫治療提供了有效途徑。參考文獻(xiàn)[l]Hudson PJ, Souriau C. Engineering antibodies. Nature Medicine,2003,9 129-134.[2]ffinter G,Griffiths AD,Hawkins RE,Hoogenboom HR. Making antibodies by phage display technology. Annu Rev Immunol. . 1994 ； 12 :433-455.[3] Tomizuka K, Shinohara Τ, Yoshida H, Uej ima H, Ohguma A, Tanaka S, Sato K, Oshimura M, Ishida I.Double trans—chromosomic mice !maintenance of two individual human chromosome fragments containing Ig heavy and kappa loci and expression of fully human antibodies. Proc Natl Acad Sci USA. . 2000,97 :722-727.[4]Martin A M, Weber B L. Genetic and hormonal risk factors in breast cancer[J], J Natl Cancer Inst，2000，92 :1126—1135.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供以人催乳素受體(hPRLR)為靶向分子的抗乳腺癌全人源化抗體，該抗體能夠用于高表達(dá)hPRLR的乳腺癌患者的生物免疫治療。本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供上述人源抗人催乳素受體抗體在制備治療人乳腺癌腫瘤上的生物免疫制劑中的應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下一種人源抗人催乳素受體抗體，其特征在于，它包括重鏈Fd段可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中，所述重鏈Fd段可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID No. 4所示。上述人源抗人催乳素受體抗體的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。其中，所述的編碼基因如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 3所示。上述人源抗人催乳素受體抗體在制備治療人乳腺癌藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的人源抗人催乳素受體抗體采用如下思路獲得首先建立人乳腺癌IgG Fab噬菌體抗體庫，然后篩選特異性抗體，并應(yīng)用噬菌體表面展示表達(dá)技術(shù)直接獲得謎底單克隆抗體，本抗體庫可獲得其他高親和力的特異性目的抗體，用此方法制備的抗hPRLR抗體從根本上克服了 HAMA反應(yīng)。具體的步驟如下(1)淋巴細(xì)胞的分離純化從乳腺癌患者的外周血中分離淋巴細(xì)胞，提取總RNA， 通過RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA ；(2)PCR擴(kuò)增Fab抗體輕鏈基因以cDNA為模板，用一組幾乎覆蓋人免疫球蛋白 G(IgG)全部輕鏈可變區(qū)編碼序列的特異性引物分別擴(kuò)增人免疫球蛋白的輕鏈基因，得到幾乎覆蓋人免疫球蛋白G(IgG)的完整κ鏈和λ鏈的輕鏈基因；
(3) PCR擴(kuò)增Fab抗體重鏈基因以cDNA為模板，用一組特異性引物分別擴(kuò)增人免疫球蛋白的Fd重鏈基因，得到人免疫球蛋白G(IgG)的重鏈Fd部分Vh和ChI基因片段；(4)Fd段和輕鏈基因的克隆及噬菌體抗體庫的建立建庫時(shí)采取先克隆輕鏈基因，后重鏈基因，將噬菌體載體pCom3XSS和PCR產(chǎn)物的酶切片段在高濃度連接酶作用下連接；經(jīng)過多輪的抗原親和吸附、洗脫、擴(kuò)增，最終篩選出抗原特異的抗體克隆，然后轉(zhuǎn)化宿主使目標(biāo)抗體表達(dá)，構(gòu)建大容量Fab噬菌體抗體庫，并檢測庫容量和對抗體庫進(jìn)行質(zhì)量鑒定。(5)利用所構(gòu)建的人乳腺癌IgG Fab噬菌體抗體庫富集篩選全人源抗hPRLR抗體。步驟(1)中，所提取的總RNA來源于40名臨床確診為乳腺癌患者的外周血分離的淋巴細(xì)胞，患者年齡分布為20 60歲。步驟(4)中，所述Fd段和輕鏈基因的克隆及Fab噬菌體抗體庫的建立方法為采用先克隆輕鏈基因后重鏈基因的策略，通過重疊PCR得到了具有良好多樣性的針對乳腺癌患者的Fab片段，再將Fab片段和質(zhì)粒pComb3XSS用Sfi I酶切，在高濃度連接酶作用下噬菌體載體pCom3XSS與PCR產(chǎn)物的酶切片段連接，電轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞后將轉(zhuǎn)化菌均勻涂布于 100 μ g/ml含氨芐青霉素的LB平板，收集所有克隆的質(zhì)粒DNA，即構(gòu)建得庫容為1 X IO9的人乳腺癌IgGFab噬菌體抗體庫。步驟(5)中，所述利用構(gòu)建的人乳腺癌IgG Fab噬菌體抗體庫富集篩選全人源抗 hPRLR抗體的方法如下1、抗hPRLR抗體磁珠活化細(xì)胞液相篩選經(jīng)過數(shù)輪細(xì)胞篩選并富集的噬菌體抗體庫，與磁珠偶聯(lián)的hPRLR抗原孵育，篩選高特異性的目的抗體；II、Fab抗體可溶性表達(dá)、鑒定富集篩選后的陽性克隆，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞使目標(biāo)抗體表達(dá)；III、抗體的分離、純化和鑒定采用親和層析獲得高純度、高免疫生物活性的抗體蛋白；對純化抗體的特異性、生物活性及功能進(jìn)行鑒定。本發(fā)明所用的載體不限于特定的載體，只要它能夠與所述基因重組，形成適宜表達(dá)的重組質(zhì)粒即可，優(yōu)選載體為噬菌體載體。實(shí)施實(shí)例中，本發(fā)明采用一種噬菌體載體質(zhì)粒 pCOmb3XSS，可以插入編碼人免疫球蛋白G(IgG)的輕鏈基因及重鏈Fd段基因。本發(fā)明所用的宿主細(xì)胞不受特別的限制，可選自大腸桿菌、酵母或真核細(xì)胞，優(yōu)選大腸桿菌XLl-Blue為感受態(tài)細(xì)胞。有益效果本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)勢本發(fā)明以DNA重組技術(shù)從臨床確診為乳腺癌患者的外周血中擴(kuò)增出人免疫球蛋白G(IgG)輕鏈及重鏈Fdg Vh片段，分別插入噬菌體載體pCOmb3XSS相應(yīng)位置，構(gòu)建出天然人源抗乳腺癌IgG Fab噬菌體抗體庫；與其他方法構(gòu)建的噬菌體抗體庫相比，該方法建立的噬菌體抗體庫是一種應(yīng)用單載體構(gòu)建的天然人源 Ig Fab噬菌體抗體庫，適用于高通量篩選乳腺癌患者高表達(dá)的靶蛋白的全人源抗體，應(yīng)用針對性強(qiáng)，并具有高容量、高多樣性的特點(diǎn)；此外，利用該庫篩選獲得的以hPRLR為靶向分子的抗乳腺癌全人源化抗體為乳腺癌的生物免疫治療提供了一種新的抗體藥物的候選靶標(biāo)分子。


圖1 :6對重鏈Fd段可變區(qū)基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。其中，M為IOObp Ladder DNAMarker ；1 6分別為以6對引物擴(kuò)增重鏈Fd可變區(qū)基因的產(chǎn)物(1 =VhI ；2 :VH2 ；3 :VH3 ；4 :VH4 ；5 :VH5 ；6 :VH6)。圖2 :4對輕鏈Vd基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果。其中，M為IOObp Ladder DNAMarker ； 1 4分別為以4對引物擴(kuò)增輕鏈κ基因的產(chǎn)物(1 :Vlk 1 ；2 :Vlk 2 ；3 :Vlk 3 ；4 =Vlκ 4) 0圖3 :9對輕鏈\λ基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果。其中，M為IOObp Ladder DNAMarker ； 1 9分別為9對引物擴(kuò)增輕鏈λ基因的產(chǎn)物(1 =VlA 1 ；2 :VlA2 ；3 :VLA3 ；4 :VLA4 ；5 VlA 5 ；6 =VlA 6 ；7 =VlA 7 ；8 :VL λ 8 ;9 :VL λ 9)。圖 4 =Fab 基因的 PCR 結(jié)果。其中，M 為 IOObp LadderDNAMarker ；1 =Fab ；2 輕鏈； 3 重鏈Fd段；4 輕鏈恒定區(qū)；5 重鏈恒定區(qū)；6 輕鏈可變區(qū)；7 重鏈可變區(qū)。圖5 :pcomb3XSS質(zhì)粒載體圖。圖6 抗hPRLR抗體陽性克隆表達(dá)特異抗體蛋白Western-blot鑒定結(jié)果。
具體實(shí)施例方式根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的具體的技術(shù)路線及其結(jié)果僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。實(shí)施例1 人外周血淋巴細(xì)胞分離及總RNA提取分批采集2 40份年齡分布為20 60歲、臨床確診為乳腺癌患者的抗凝外周血各anl，分別以淋巴細(xì)胞分離液分離獲得外周血淋巴細(xì)胞后混合，以滅菌PBS洗滌后重懸細(xì)胞，總RNA提純試劑盒提取外周血淋巴細(xì)胞總RNA。實(shí)施例2 人免疫球蛋白G (IgG)輕鏈及重鏈Fd段基因的擴(kuò)增先將淋巴細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以一組幾乎覆蓋人免疫球蛋白G (IgG)輕鏈或重鏈Fd段Vh和ChI基因片段可變區(qū)與恒定區(qū)編碼序列的特異性引物，對上述反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行PCR以分別擴(kuò)增人免疫球蛋白G(IgG)，分別用4對κ鏈基因引物、9對λ鏈基因引物和6對重鏈基因引物，擴(kuò)增可變區(qū)。擴(kuò)增條件為94°C 5min，94°C 1 anin，50 60°C 1 2min,72°C 1 2min，共30個循環(huán)，最終延長為72°C IOmin0 PCR產(chǎn)物經(jīng)2. 0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。6對重鏈可變區(qū)基因的擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示，各組均呈現(xiàn)清晰的目的條帶；4對輕鏈κ基因的擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示，各組均在350bp出現(xiàn)清晰的目的條帶；9對輕鏈λ基因的擴(kuò)增結(jié)果如圖3所示，各組均在350bp出現(xiàn)清晰的目的條帶。上述采用的一組覆蓋人免疫球蛋白G(IgG)的重鏈Fd段VH和CH1基因片段可變區(qū)和恒定區(qū)的特異性引物如下所示 擴(kuò)增重鏈Fd段基因可變區(qū)的正向引物
HFabVHl-F :GCTGCCCAACCAGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG HFabVH2-F GCTGCCCAACCAGCCATGGCCCAGATCACCTTGAAGGAGTCTGG HFabVH35-F :GCTGCCCAACCAGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGGTGSAGTCTGG HFabVH3a-F GCTGCCCAACCAGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGKTGGAGTCTG HFabVH4-F GCTGCCCAACCAGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG HfabVH4a-F GCTGCCCAACCAGCCATGGCCCAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGG 擴(kuò)增重鏈Fd段基因可變區(qū)的反向引物
HFabVHJa-B CGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCC
HFabVHJb-B CGATGGGCCCTTGGTGGAGGCWGRGGAGACGGTGACCAGGGTBCC擴(kuò)增重鏈Fd段基因恒定區(qū)的正向引物HIgGCHl-F GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTC擴(kuò)增重鏈Fd段基因恒定區(qū)的反向引物dpseq :AGAAGCGTAGTCCGGAACGTC擴(kuò)增重鏈Fd段基因的正向引物L(fēng)ead VH GCTGCCCAACCAGCCATGGCC擴(kuò)增重鏈Fd段基因的反向引物dpseq :AGAAGCGTAGTCCGGAACGTC上述序列中，R= A or G, K = G or T, S = C or G, W = A or T, B = C or G orT。實(shí)施例3 天然人源抗乳腺癌IgG Fab噬菌體抗體庫的構(gòu)建采用先克隆輕鏈基因后重鏈基因的策略，通過重疊PCR得到了具有良好多樣性的針對乳腺癌患者的Fab片段(圖4)，F(xiàn)ab長度為1600bp左右，重鏈Fd段及輕鏈基因約750bp 左右，輕鏈、重鏈的可變區(qū)、恒定區(qū)均為350bp左右。再將Fab片段和質(zhì)粒pComb3XSS用Sfi I酶切，在高濃度連接酶作用下PCR產(chǎn)物的酶切片段與噬菌體載體pCom3XSS(由kripps Institute饋贈，圖幻連接，電轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞后將轉(zhuǎn)化菌均勻涂布于100 μ g/ml含氨芐青霉素的LB平板，收集所有克隆的質(zhì)粒DNA， 即構(gòu)建得庫容為IXlO9的人乳腺癌IgG Fab噬菌體抗體庫。實(shí)施例4 天然人源抗乳腺癌IgG Fab噬菌體抗體庫的鑒定及多樣性分析抗體庫DNA分三次轉(zhuǎn)化XLl-Blue感受態(tài)細(xì)胞，隨機(jī)挑取克隆，并將其中20株提取質(zhì)粒DNA，Sfi I的酶切分別獲得輕鏈、重鏈基因片段，送hvitrogen(上海英濰捷生物技術(shù)公司)以ABI 3730DNA測序儀測定核苷酸序列并推算氨基酸序列，測序結(jié)果均可找到 Sfi I酶切位點(diǎn)及恒定區(qū)序列，并利用Ig BLAST數(shù)據(jù)庫(http://WWW. ncbi. nlm. nih. gov/ igblast/)分析抗體基因的同源家族信息。其中20株中有2個序列相同，說明PCR產(chǎn)物!^ab 多樣性在90%左右，多樣性較好。實(shí)施例5 抗hPRLR噬菌體抗體的篩選、鑒定以hPRLR胞外區(qū)為固相抗原對Fab噬菌體抗體庫進(jìn)行六輪篩選，噬菌體抗體收獲率由第1輪的5X 10_6增到第6輪的1. 2X 10_3，提高了 240倍(如表1所示)，從而獲得了 hPRLR胞外區(qū)結(jié)合較緊密的噬菌體克隆。表1噬菌體抗體庫的富集篩選
權(quán)利要求
1.一種人源抗人催乳素受體抗體，其特征在于，它包括重鏈Fd段可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中，所述重鏈Fd段可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID No. 4所示。
2.權(quán)利要求1所述抗體的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于，所述的編碼基因如SEQID No. 1和 SEQ ID No. 3 所示。
4.權(quán)利要求1所述的人源抗人催乳素受體抗體在制備治療人乳腺癌藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明一種人源抗人催乳素受體抗體，它包括重鏈Fd段可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中，所述重鏈Fd段可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。本發(fā)明還公開了編碼上述抗體的基因及上述抗體在制備治療人乳腺癌藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明獲得了一株具有高特異性和高親和力的全人源抗hPRLR抗體，在乳腺癌的生物免疫治療中具有潛在的應(yīng)用前景。
文檔編號A61P35/00GK102250244SQ20111018918
公開日2011年11月23日 申請日期2011年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月7日
發(fā)明者姚俊, 曹新, 魏欽俊, 魯雅潔 申請人:南京醫(yī)科大學(xué)