專利名稱：包含大蒜油、大蒜總多糖和大蒜總皂苷的組合物的抗癌用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種包含大蒜脂溶性成分和大蒜水溶性成分組成的組合物，具體地說，涉及包含大蒜油、大蒜總多糖和大蒜總皂苷的組合物在制備抗腫瘤藥物和保健品中的應(yīng) 用，以及該組合物的制備方法。
背景技術(shù)：
腫瘤是當(dāng)今社會危害人類健康的重大疾病之一，已成為僅次于心腦血管疾病的世界第二大死因疾病。惡性腫瘤治療方案一般為在手術(shù)后配合放化療治療，但化療藥物具有一定的毒副作用，中藥抗腫瘤藥具有獨特的優(yōu)勢，具有祛邪、扶正或增效、減毒的作用，所以中藥抗腫瘤藥物一直是研究的熱點。大蒜防癌抗癌的歷史悠久，其主要成分有含硫有機化合物、氨基酸類、酶類、糖類、脂類、皂苷類、維生素和微量元素等?，F(xiàn)代藥理研究表明，大蒜有抗菌、消炎、降血脂、降血壓、抗血栓、抗腫瘤、抗衰老、抗氧化以及增強機體免疫力等多種功效。一、大蒜主要成分的防癌抗癌作用綜述大蒜屬于免疫激發(fā)型中草藥，可誘生干擾素，抑制腫瘤壞死因子的生成，降低致癌物作用，提高人體免疫功能，在惡性腫瘤的防治方面有著廣闊的開發(fā)前景。下面對大蒜油及其主要成分二烯丙基三硫(也稱作大蒜素)和二烯丙基二硫以及大蒜多糖、大蒜皂苷的作用進行詳細分析I、免疫作用大蒜具有很好的免疫調(diào)節(jié)作用，可增加實驗動物的脾臟重量，增加吞噬細胞和T淋巴細胞數(shù)量，增強吞噬細胞的吞噬能力，提高淋巴細胞轉(zhuǎn)化率。其活性成分大蒜提取物可以促進T淋巴細胞的增殖，提高NK細胞的活性，促進IL-2、TNF、IFN等細胞因子的釋放，從而加強免疫系統(tǒng)的防御和監(jiān)視功能。特別地，大蒜中含有的大蒜素還能提高腫瘤患者的細胞免疫功能。2、預(yù)防及治療腫瘤的作用從大蒜中提取的大蒜油含有的烯丙基硫化物有抑制人類多種腫瘤生長的作用。具體而言，烯丙基硫化物中的二烯丙基三硫(DATS，合成品即大蒜素)，是大蒜油的中的主要成分之一，在油中含量最高。大蒜素能阻斷致癌物的合成，抑制致癌物的活化和抗突變、抗畸變；還對腫瘤細胞有直接殺傷作用，能夠抑制癌細胞生長、調(diào)節(jié)細胞周期、促進癌細胞凋亡。烯丙基硫化物中的二烯丙基二硫(DADS)是大蒜油的中的另一個主要成分，在油中含量居第二，目前已發(fā)現(xiàn)，它能抑制多種人腫瘤細胞生長。此外，大蒜中的螺留皂苷eruboside-B具有與甘草次酸相似的體內(nèi)抗腫瘤作用，對若干細胞系具有細胞毒作用，例如BC1、LuUCol2、KB、KB-V。大蒜多糖還能減輕腫瘤藥物阿霉素(adriamycin，ADR)對心臟的毒性。3、抗氧化作用由于多種氧化物都是癌癥的誘導(dǎo)因子，因此目前研究認(rèn)為，抗氧化物對抗癌有一定功效，已經(jīng)證明大蒜中的一些組分有很強的抗氧化作用，從而有助于其抗癌作用。此外，大蒜多糖具有清除超氧陰離子自由基和羥基自由基的能力，且在較高濃度下強于大蒜素，而大蒜素的還原能力則強于大蒜多糖。綜上所述，目前對大蒜中的大蒜油及其主要成分預(yù)防和抗腫瘤的作用有詳細報道，對大蒜素、大蒜多糖的抗氧化作用、大蒜皂苷的單體抗腫瘤作用以及大蒜多糖的減毒作用也有報道，但是并沒有將三者組合協(xié)同進行抗腫瘤的研究報道。二、大蒜主要成分的制備方法綜述專利200610135316. 7涉及大蒜總皂苷(大蒜甙)與大蒜生物活性成分組合物的提取工藝及其用途，該技術(shù)的主要存在的問題為沒有說明所含皂苷、生物活性成分是怎樣鑒別的及其含量測定方法。另有多篇專利涉及大蒜多糖(如專利2007100171321、CN1239719 和 200310117625. 8)和大蒜精油(專利 200310117624. 3、200610033685)的提取 方法。但是，現(xiàn)有技術(shù)大多只涉及單獨提取利用大蒜中的大蒜油、大蒜阜苷或大蒜多糖。實際上，大蒜中含有多種活性成分，主要分為脂溶性成分和水溶性成分兩類。脂溶性成分主要是大蒜油，含量為0. 2%左右，水溶性成分氨基酸、蛋白質(zhì)、多糖、皂苷、維生素、微量元素等，含量為25%左右。然而在目前的大蒜藥品和保健品中，還沒有聯(lián)合制備大蒜脂溶性成分和水溶性成分的先例，也沒有將上述成分組合在一起，以充分發(fā)揮大蒜的藥用或保健價值的
女口
廣叩o

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種包含大蒜油、大蒜總多糖和大蒜總皂苷的組合物的抗癌用途，本發(fā)明的另一個目的是提供所述包含大蒜油、大蒜總多糖和大蒜總皂苷的組合物及其制備方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的—方面，本發(fā)明提供了一種包含大蒜油、大蒜總多糖和大蒜總阜苷的組合物在制備用于預(yù)防和/或治療癌癥的藥物、保健品和/或食品中的應(yīng)用。進一步，所述大蒜油的主要成分包括二烯丙基三硫、二烯丙基二硫、二烯丙基一硫、甲基稀丙基二硫和甲基稀丙基_■硫等；所述大蒜總多糖為雜多糖，其水解后的成分包括果糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖和甘露糖；所述大蒜總皂苷的主要成分為甾體阜苷，其包括呋留阜苷、螺留阜苷，其中，所述呋留阜苷包括proto-eruboside-B、proto-iso-eruboside-B、sativoside-Bl 和 proto-desgalactotigonin,所述螺留阜苷包括eruboside_B、iso-eruboside-B、sativoside-C、sativoside-Rl、sativoside_R2、sativoside_B2、sativoside_B3、sativoside_B4 和 sativoside_B5 等，總之大蒜中共含有25種皂苷單體。進一步，所述癌癥選自胃癌、直/結(jié)腸癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌、鼻咽癌、肝癌、骨癌、食道癌、乳腺癌、宮頸癌、胰腺癌、腦瘤、皮膚癌、白血病、淋巴癌和黑色素瘤等癌癥。進一步，所述藥物選自以下劑型注射劑、片齊IJ、顆粒齊IJ、膠囊齊IJ、軟膠囊齊IJ、滴丸、口服液、膜劑、散劑、外用膏劑、栓劑和丸劑等劑型。進一步，所述組合物中大蒜油、大蒜總多糖、大蒜總皂苷的比例以重量計為I : 2. 5 : I. 25 I : 200 : 50。
另一方面，本發(fā)明提供了一種制備包含大蒜油、大蒜總多糖和大蒜總皂苷的組合物的方法，其包括以下步驟I)根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)(專利ZL200510083951. 0)提供的方法進行大蒜雙提，得大蒜油、藥液和藥渣，藥液保留；2)大蒜油采用無水硫酸鈉脫水，得純大蒜油，再經(jīng)環(huán)糊精包合，得大蒜油的包合物；3)藥渣水提，得水提液；4)將步驟I)所得藥液和步驟3)所得水提液合并，減壓回收水，濃縮，濃縮液加乙醇醇沉，過夜，離心，得沉淀和上清液(即藥液I);5)將步驟4)所得沉淀干燥，得淺黃色大蒜總多糖；或溶解步驟4)所得沉淀，離心，上清液過樹脂柱，流出液減壓濃縮，干燥，得黃白色大蒜總多糖； 6)將步驟3)水提后的藥渣淋干，加乙醇回流提取，得藥液II ；7)合并步驟4)所得藥液I和步驟6)所得藥液II，減壓回收乙醇至無醇味，加水稀釋，離心，得上清藥液III ;8)步驟7)所得藥液III過大孔樹脂，依次水洗和/或乙醇洗，收集洗脫液，減壓回收乙醇至無醇味，干燥，得棕色或深黃色大蒜總皂苷；9)將步驟I)所得大蒜油或步驟2)所得大蒜油包合物、步驟5)所得大蒜總多糖和步驟8)所得大蒜總阜苷組合得到包含大蒜油、大蒜總多糖和大蒜總阜苷的組合物。此外，根據(jù)不同的劑型，形成不同的處方(處方中包括三個有效部位的比例要求和適當(dāng)?shù)妮o料)，可以得到包含大蒜油、大蒜總多糖和大蒜總皂苷的組合物的不同制劑。進一步，步驟I)中，所述雙提為將大蒜粉碎，加水保溫酶解，水蒸氣蒸餾提取，進行1_3次，每次加3_9倍水，每次0. 5_2h。進一步，步驟2)中，所述大蒜油包合的具體步驟為大蒜油用65%-95% (體積比)乙醇按I : 5-1 15(mL/mL)的比例溶解，在25-45 °C超聲池中，以環(huán)糊精包合0. 5-1. 5h;優(yōu)選地，所述環(huán)糊精包括a-環(huán)糊精、￠-環(huán)糊精、羥乙基-￠-環(huán)糊精、羥丙基-￠-環(huán)糊精、￠-環(huán)糊精甲基化衍生物和支鏈環(huán)糊精等，環(huán)糊精的濃度為10% (質(zhì)量體積比)，大蒜油環(huán)糊精以重量計為I : 6_1 : 12。進一步，步驟3)中，所述水提為1-2次,每次加3-9倍水,每次0. 5_2h。進一步，步驟4)中，所述減壓回收是在溫度不高于80°C下進行的；所述濃縮液，以大蒜(g):藥液(mL)為單位計，濃度為I : 0.8-1. 2，使藥液在60°C下的相對密度為
0.9-1. 10 ;所述乙醇在濃縮液中的含量為75-85% (體積比)。進一步，步驟5)中，所述溶解沉淀的溶劑為熱的去離子水；所述樹脂為D316、HPD300L、D900、D318或D941型樹脂，優(yōu)選為D941或D900型樹脂；所述減壓濃縮是在溫度不高于80°C下進行的；所述干燥為減壓干燥、噴霧干燥或冷凍干燥，優(yōu)選地，所述減壓干燥溫度不高于60°C，所述噴霧干燥的預(yù)熱器溫度為280°C，其干燥室溫度為120°C，所述冷凍干燥的冷肼溫度為_50°C，其干燥溫度為25°C。進一步，步驟6)中，所述回流提取的具體步驟為加3-5倍(質(zhì)量比)95% (體積比)乙醇回流，提取1-2次，每次0. 5-1. 5小時。進一步，所述步驟7)包括，合并藥液1、11，減壓回收至無醇味，使其25°C時相對密度為I. 00-1. 10，加水稀釋，加水量為藥材重量的0. 5-0. 9倍，離心，得上清藥液。進一步，步驟8)中，將藥液III過大孔樹脂，所述樹脂優(yōu)選為DM-130、AB_8或HPD100，按照樹脂與生藥重量比計，上樣量為I : 0.8-1. 1，依次水洗4-6BV(Bed Volume，床體積)和/或30 % (體積比)乙醇洗2-5BV，70 % -95% (體積比)乙醇洗4-6BV，收集水洗后乙醇洗脫液，或30% (體積比)乙醇洗脫后的乙醇洗脫液，在溫度<70°C下減壓回收乙醇至無醇味，減壓干燥、噴霧干燥或冷凍干燥，所述減壓干燥溫度不高于60°C，噴霧干燥干燥室溫度不超過120°C，冷凍干燥冷肼溫度低于_50°C。再一方面，本發(fā)明提供了一種根據(jù)所述的方法制備的包含大蒜油、大蒜總多糖和 大蒜總皂苷的組合物。進一步，所述組合物中大蒜油、大蒜總多糖、大蒜總皂苷的比例以重量計為I : 2. 5 : I. 25 I : 200 : 50。更進一步，所述大蒜油的主要成分包括二烯丙基三硫、二烯丙基二硫、二烯丙基一硫、甲基稀丙基二硫和甲基稀丙基_■硫等；所述大蒜總多糖為雜多糖，其水解后的成分包括果糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖和甘露糖；所述大蒜總皂苷的主要成分為甾體阜苷，其包括呋留阜苷、螺留阜苷，其中，所述呋留阜苷包括proto-eruboside-B、proto-iso-eruboside-B、sativoside-Bl 和 proto-desgalactotigonin,所述螺留阜苷包括eruboside_B、iso-eruboside-B、sativoside-C、sativoside-Rl、sativoside_R2、sativoside_B2、sativoside_B3、sativoside_B4 和 sativoside_B5 等。再進一步，所述大蒜油中二烯丙基二硫和二烯丙基三硫的總含量不低于50%，大蒜油包合物中，大蒜油的利用率不低于93% ;所述大蒜總多糖中大蒜總多糖含量以葡萄糖標(biāo)定不低于45%，大蒜總多糖水解后，各單糖含量總和不低于50 %，所述大蒜總皂苷中，總阜苷含量以阜苷單體proto-iso-eruboside-B(C57H96O3tl)為對照品標(biāo)定不低于40%。本發(fā)明提供的包含大蒜油、大蒜總多糖和大蒜總皂苷的組合物及其制備方法的有益效果如下本發(fā)明提供的包含大蒜油、大蒜總多糖和大蒜總皂苷的組合物填補了大蒜脂溶性和水溶性活性成分在抗腫瘤防治領(lǐng)域聯(lián)合應(yīng)用方面的空白，充分利用大蒜提取大蒜油之后的藥渣，所得到的組合物使大蒜水溶性、脂溶性有效成分防癌抗癌的活性得到充分的發(fā)揮，產(chǎn)品具有顯著的抗腫瘤活性，可以達到扶正祛邪、增效減毒的作用，可以制成抗腫瘤藥物、保健品和食品，并且安全低毒，應(yīng)用前景廣闊。本發(fā)明提供的制備包含大蒜油、大蒜總多糖、大蒜總皂苷的組合物的方法以鮮大蒜為原料，在提取大蒜油的同時，提取分離到大蒜總多糖和大蒜總皂苷，經(jīng)純化后將它們組合，具有操作簡單、產(chǎn)品質(zhì)量可控、適于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點。


以下，結(jié)合附圖來詳細說明本發(fā)明的實施方案，其中圖I為實施例2的二烯丙基二硫化物標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y =477. 1029x-2. 2526，相關(guān)系數(shù):0. 9999，線性范圍:0. 368 ~ 7. 36 u g)；圖2為實施例2的二烯丙基三硫化物標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y =796. 9455x-4. 3282，相關(guān)系數(shù):0. 9999，線性范圍:0. 2288 4. 576 u g)；
圖3為實施例3的大蒜皂苷對照品與樣品顯色后全波長掃描圖；圖4為實施例3的大蒜皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y = 0. 012x+0. 002，相關(guān)系數(shù):0. 9995，線性范圍19. 44 58. 32 u g)；圖5為實施例4的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y = 12. 97x-0. 078，相關(guān)系數(shù):0. 9990，線性范圍17. 8 71. g)；圖6為實施例4的標(biāo)準(zhǔn)溶液離子色譜譜圖；圖7為實施例4的樣品離子色譜譜圖。
具體實施例方式下面結(jié)合具體的實施例，并參照數(shù)據(jù)進一步詳細描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。在以下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時標(biāo)明，其后所用相同試劑如無特殊說明，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。實施例I :制備包含大蒜油、大蒜總多糖和大蒜總皂苷的組合物大蒜15kg帶皮粉碎成直徑為3 5_左右的顆粒，置多功能提取罐內(nèi)，加7倍量水提取2h，得揮發(fā)油、藥液和藥渣。收集揮發(fā)油器內(nèi)的揮發(fā)油用Na2SO4脫水，得大蒜揮發(fā)油30. 9mL(出油率0. 206%，大蒜油中二烯丙基二硫和二烯丙基三硫的含量總和為52. 60% )0藥液保留。蒜渣加5倍量水，提取I小時，將得到的藥液和上述提油得到的藥液合并，減壓回收水(溫度< 80°C )，濃縮I : I (70°C相對密度I. 05)，濃縮液加乙醇醇沉，使含醇量達到85% (體積比)，放置過夜，離心，得沉淀和藥液I，沉淀減壓干燥(溫度<60°C)，得乳白色大蒜多糖2. 24kg (出膏率14. 93%，總多糖以葡萄為對照品計算含量為61% )。藥渣淋干，加3倍95% (體積比)乙醇回流3次，每次I小時，得藥液II，合并藥液
1、11，減壓回收乙醇(溫度<70°C)至無醇味(25°C，相對密度I. 05)，加水稀釋至提取藥材的0. 8倍(12000mL)，離心，上清液過HPD100大孔樹脂，上樣量I I. 1,30% (體積比)乙醇洗4BV，95% (體積比)乙醇洗4BV，收集洗脫液，減壓回收乙醇至無醇味(溫度<70°C)，減壓干燥(溫度< 60°C )，得棕色大蒜總皂苷提取物I. 56kg(按生品計算，大蒜總皂苷出膏率為10. 38%，提取物中總皂苷含量以皂苷單體proto-iso-eruboside-B(C57H9603Q)為對照品標(biāo)定為42% )。取上述大蒜油包合物、大蒜總多糖、大蒜總阜昔進行組方I、組合物顆粒制劑的制備顆粒處方組成大蒜油lmL環(huán)糊精包合物9. 95g，大蒜總多糖45g，大蒜總皂苷17. 5g，糊精適量，阿斯巴甜適量；制備混勻，95% (體積比)的乙醇做潤濕劑，制粒，減壓干燥(溫度< 50°C )，共制成顆粒IOOOg,得大蒜油、大蒜總多糖、大蒜總阜苷組合物顆粒,每克顆粒含大蒜油Img,大蒜總多糖45mg,大蒜總阜苷17. 5mg。2、組合物乳劑的制備乳劑處方組成大蒜油lg，大蒜總多糖35g,大蒜總阜苷17. 5g,吐溫-80 lg ；、
制備研勻，加蒸餾水至IOOOmL,制成大蒜油、大蒜總多糖、大蒜總皂苷組合物乳齊U，每毫升乳劑含大蒜油Img,大蒜多糖35mg,大蒜總阜苷17. 5mg。實施例2 :大蒜油的質(zhì)量控制(參照專利ZL200510083951. 0)本實施例采用液相色譜法測定大蒜油中二烯丙基三硫和二烯丙基二硫的含量，測定方法為I、儀器和材料
高效液相色譜儀=HPllOO液相色譜儀(包括四元泵、二極管陣列檢測器、自動進樣器、HP化學(xué)工作站)?；瘜W(xué)試劑甲醇、甲酸為色譜純，水為雙蒸水，其余試劑均為分析純。對照品二烯丙基二硫化物、二烯丙基三硫化物自制，純度均在98%以上。2、色譜條件色譜柱為Zorbax extend C18 柱(4. 6X 250_ 5 U m);流動相為甲醇-0. 17% (體積比)甲酸溶液(80 20);流速=ImL min-1 ;檢測波長240nm ;柱溫35°C。3、對照品的制備精密稱取二烯丙基二硫化物30. 44mg, 二烯丙基三硫化物對照品32. 12mg置于50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋到刻度，搖勻；分別精密吸取0. 6088mg -mr1的二烯丙基二硫化物溶液和0. 6424mg -m^1的二烯丙基三硫化物溶液各I. OmL于IOmL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得0. 06088mg ^mL-1的二烯丙基二硫化物和0. 06424mg ^mL-1的二烯丙基三硫化物混合溶液。4、樣品溶液的制備取實施例I制得的大蒜油樣品約2mg，精密稱定，置于5mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。5、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制對照品溶液分別進樣2、4、8、12、16、20和40 ii L，按上述色譜條件測定峰面積積分值，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，對照品進樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程如圖I和2所示。6、樣品測定分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各IOy L，注入高效液相色譜儀，測定，即得。大蒜油中二烯丙基二硫、二烯丙基三硫的含量分別為20. 33%和39. 06%，二者總和為59. 39%。實施例3 :大蒜總皂苷的質(zhì)量控制本實施例采用紫外-可見分光光度儀測定大蒜總皂苷的含量，因目前國內(nèi)外大蒜皂苷類化合物無對照品銷售，本發(fā)明人從大蒜總皂苷中分離到一個皂苷單體proto-iso-eruboside-B,以此為對照品，采用紫外可見分光光度法，以硫酸_甲醇為顯色齊U，建立了大蒜總皂苷含量測定方法，使產(chǎn)品質(zhì)量得到控制。經(jīng)方法學(xué)驗證，該方法準(zhǔn)確可靠，穩(wěn)定性(RSD%= I. 1%)、精密度(RSD%= 1.0%)、重復(fù)性(RSD%= I. 52% )均良好，加樣回收率為102. 59% (RSD/ = I. 4%,n = 6。經(jīng)該方法檢測，在本發(fā)明的大蒜總皂苷中，阜苷含量以proto-iso-eruboside-B計不低于40%,具體測定方法如下I、儀器與試劑
8453紫外-可見分光光度計(美國，安捷倫)；HW SYll-K數(shù)顯恒溫水浴鍋(北京市長風(fēng)儀器儀表公司)；CX-250超聲波清洗機(天海雙龍醫(yī)療設(shè)備有限公司)；天平(德國賽多利斯，P225D);濃硫酸和95% (體積比)乙醇(均為分析純，北京化工廠)；Proto-iso-eruboside-B (簡稱PIEB)(供含量測定用，實驗室自制，經(jīng)核磁共振光譜氫譜(1H-NMR)、碳譜(13C-NMR)及質(zhì)譜(MS)測試鑒定其結(jié)構(gòu)，HPLC歸一化法測試純度> 98% )。2、對照品溶液的制備精密稱取大蒜總皂苷樣品(60目，38#柱樣品批號20101129) IOmg置25mL量瓶中，加入甲醇超聲30min至樣品完全溶解，定容，過濾即得。3、樣品溶液的制備

精密稱取實施例I制得的大蒜皂苷樣品3. 64mg至IOmL容量瓶中，加入甲醇至樣品完全溶解，定容即得。4、顯色方法及測定波長的選擇精密吸取0. 5mL對照品溶液和0. 5mL供試品溶液，置于IOmL具塞試管中，80°C水浴揮干后，加入硫酸-甲醇(7 3)5mL，搖勻，90°C水浴反應(yīng)60min，取出后冰水浴lOmin，以相應(yīng)溶劑為空白，測定樣品吸光度，如圖3所示，對照品與樣品顯色后全波長掃描圖均在326nm處有最大吸收。5、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密吸取對照品(0.324mg/mL)，稀釋 1/10，精密吸取 0. 6mL、0. 8mL、l. OmLU. 2mL和I. 4mL至具塞試管中，80°C水浴揮干后，加入70% (體積比)硫酸-甲醇5mL，置于60°C水浴加熱60min,取出后冰水浴IOmin,室溫放置15min后，以相應(yīng)溶液為空白，測定326nm下吸光度。以對照品的含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，進行線性回歸，如圖4所示，計算標(biāo)準(zhǔn)曲線為y = 0. 012x+0. 002，相關(guān)系數(shù)為0. 9995，表明對照品在19. 44 58. 32 y g范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。6、樣品測定分別精密量取對照品溶液和樣品溶液各I. OmL，分置于具塞試管中，80°C水浴揮干溶劑，各加入70% (體積比)硫酸-甲醇5mL密塞，搖勻，于60°C水浴下反應(yīng)60min，取出后冰浴IOmin,室溫放置15min后，以相應(yīng)溶液為空白，于326nm波長下測定其吸光度。7、測定結(jié)果大蒜總皂苷的含量為42. 00%。實施例4 :大蒜總多糖的質(zhì)量控制I、儀器與試劑8453紫外-可見分光光度計(美國，安捷倫)、Hf SYll-K數(shù)顯恒溫水浴鍋(北京市長風(fēng)儀器儀表公司)、CX-250超聲波清洗機(天海雙龍醫(yī)療設(shè)備有限公司)；天平(德國賽多利斯，P225D);苯酚(分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠)，濃硫酸(分析純，北京化工廠)，95% (體積比)乙醇(分析純，北京化工廠)，D-無水葡萄糖對照品(供含量測定用，中國藥品生物制品檢定所，批號110833-200503)。2、樣品測定(I)對照品溶液制備精密稱取無水葡萄糖對照品約12mg，置于25mL量瓶中，加蒸餾水溶解并定容，即得。
(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密量取對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL分別置于25mL量瓶中，蒸餾水定容。分別精密量取上述對照品溶液5份各ImL于IOmL具塞試管中，分別加5% (質(zhì)量體積比)苯酚溶液I. OmL，搖勻后加入濃硫酸5. OmL，搖勻后沸水浴lOmin，取出置于冰水浴中冷卻放置至室溫。以試劑空白為參比在485nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖5所示。(3)樣品溶液的制備精密稱取實施例I制得的多糖樣品約30mg，置于IOmL離心管中，加80% (體積比)乙醇溶液8mL,超聲振蕩60min, 3000rpm離心15min,棄去上清液，殘渣用80% (體積比)乙醇洗滌2 3次，加入8mL沸水于離心管中，超聲60min溶液樣品，冷卻后轉(zhuǎn)移至IOmL量瓶中，少量蒸餾水洗滌離心管，洗滌液合并至量瓶中，蒸餾水定容至10mL。搖勻過濾，取續(xù)濾液lmL，至25mL量瓶中，加水定容，即為供試樣品溶液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項下操作，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算供試品中多糖含量。3、測定結(jié)果
樣品中以葡萄糖計多糖含量為48. 45% (n = 2)。實施例5 :采用離子色譜(ICS 3000)測定大蒜總多糖水解后單糖的含暈I、儀器與試劑色譜柱CarboPacPA20 分析柱，150*3mm，S/N 002823 ；CarboPac PA20 保護柱，50*3mm, S/N 002652檢測器脈沖安培檢測器，Au電極，S/N 0050150糖四電位波形淋洗液組成及流速EG產(chǎn)生ImMKOH，0. 45mL/min自動進樣，IOuL2、實驗方法取實施例I制得的樣品IOmgJ 2mL濃度為2moL/L三氟乙酸溶液，密閉后80°C下水解4小時。放至室溫后，靜置I小時，精密量取上清液lmL，置于50mL茄形瓶中，50°C減壓蒸干。殘余物加50mL去離子水，超聲IOmin溶解后過0.22 濾膜及RP柱，進樣分析。上述溶液再稀釋10倍，供測定含量。3、測定結(jié)果實驗結(jié)果如表I所示。表I離子色譜(ICS 3000)測定大蒜總多糖水解單糖結(jié)果
單樣品杲糖* 葡萄糖*阿拉伯糖半乳糖木糖甘露糖合計糖 I 49.46% 7.20% 0.11% 0.13% 0.18% 0.13% 57.21%含 2 48.37% 4.09% 0.43% 0.60% 0.14% 0.10% 53.73%量 3 50.30% 4.58% 0.45% 0.77% 0.19% 0.13% 56.29%*其中葡萄糖和果糖含量為稀釋10倍的結(jié)果實施例6 :大蒜有效部位對大鼠脾淋巴細胞增殖影響的WST檢測I、材料(I)受試藥物實施例I制得的大蒜不同部位提取物1#(大蒜油)、2#(大蒜總多糖)、5# (大蒜總皂苷)、2#+5# (大蒜總皂苷和大蒜總多糖提取分離后按I : I混合樣品)(2+5) # (大蒜總多糖和大蒜總皂苷未經(jīng)分離樣品)，由中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所制備并提供，上述樣品以DMSO(二甲基亞砜)溶解，實驗前配制；陽性藥物ConA(ConcanavalinA,刀豆球蛋白 A, Sigma 公司);(2)動物SD大鼠，雄性，體重(180±10)g，清潔級動物，實驗動物室提供；(3)試劑淋巴細胞分離液(Sigma公司)、RPMI1640培養(yǎng)基(GIBC0公司)、胎牛血清(GIBC0公司)、DMSO (Sigma)等，購自北京奧信拓普科技有限公司；快速細胞增殖檢測試劑盒(Bio-Vision 公司);(4)儀器全自動酶標(biāo)儀，Thermo MK-3 ；C02培養(yǎng)箱，Revco 300T ;倒置顯微鏡，0LYMPUS-IMT-2 ;潔凈工作臺，BCN-1360B型，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；微量移液器，德國Eppendorf ;臺式高速離心機TDL-40B型，上海安亭科學(xué)儀器廠；電子分析天平，CP64上海奧豪斯公司。 2、方法麻醉SD大鼠，取出脾臟，將脾剪碎成單細胞(取上清液)緩慢加入預(yù)先已加入淋巴細胞分離液的離心管中，脾懸液與分離液的比例為I : I。在4°C下以2000r/min離心20min，液相分為三層，用微量進樣器抽取中層淋巴細胞放入無菌的離心管中，用PBS(Phosphate Buffered Saline,憐酸鹽緩沖液)洗漆2次，每次均以2000r/min離心lOmin，棄上清液，用少量RPIM1640培養(yǎng)液(含10%血清)打散，用血細胞計數(shù)板統(tǒng)計調(diào)節(jié)細胞初始濃度至I X 106/mL,取100 ii L加入96孔培養(yǎng)板，于37°C的5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。將實施例I制得的不同質(zhì)量濃度的藥物1#、2#、5#、2#+5#、(2+5)#和陽性藥物各 IOOii L 加入實驗孔，使終濃度分別 I. 25,0. 625,0. 3125,0. 156,0. 078,0. 039,0. 0195、0. 0098和0. 005mg/mL，并同時設(shè)立空白對照組和陽性對照組，空白對照組加入100 y L無菌生理鹽水，在陽性藥物對照組中加入100 i! L的ConA (終濃度為5 u g/mL)，每一濃度設(shè)3個復(fù)孔，培養(yǎng)48或72h。每孔加入5mg/mL的WST溶液(按照快速細胞增殖檢測試劑盒說明書配制，即把5毫升電子耦合試劑加入到WST-I粉末中，完全溶解)20 ii L，繼續(xù)培養(yǎng)4h，在酶標(biāo)儀于450nm波長讀取各孔吸光度(A)，以A值反映淋巴細胞增殖率，結(jié)果見表2。3、實驗結(jié)果從表2可見，與對照組比較，大蒜總多糖、大蒜總皂苷的組合物(2+5) #、2#+5#對大鼠T淋巴細胞增殖具有明顯的促進作用(p< 0.01)，其中(2+5)#促增殖作用更為明顯(p<0.001)。結(jié)果表明，(2+5)#和(2#+5#)樣品對大鼠T淋巴細胞增殖具有明顯的促進作用。表2大蒜成分對大鼠脾淋巴細胞增殖(A)影響的WST檢測
A 值0.625mg/mL0.156mg/mL0.039mg/mL0.0098mg/mL
~1#(大蒜油)0. 398 + 0. 004 0. 404 + 0. 019 0. 399 + 0. 013 0. 395 + 0. 005
2#(大蒜總多糖) 0. 383 + 0. 004 0. 409 + 0. 018 0. 411 + 0. 006 0. 401 + 0. 0055#(大蒜總皂苷) 0. 576 + 0. 029 0. 451+0. 017 0. 425 + 0. 005 0. 414 + 0. 005~(2+5)#~0.637 + 0.009**0.660 + 0.021** ~O. 644 ± O. 062** ~O. 466 + 0. 025*
2#+5#O. 591 + 0.015*0.462 + 0.013* 0.465 + 0.003*0.456 + 0.014*
ContO. 427 + 0. 008
ConA(5u g/mL)O. 603 + 0. 054注與對照組比** :p < O. 001，* :p < O. 01實施例7 :包含大蒜油、大蒜總皂苷和大蒜總多糖的組合物對腫瘤細胞生長抑制作用的研究I、材料(I)受試藥物與陽性藥物受試藥物實施例I制得的大蒜不同部位提取物1#(大蒜油)、2#(大蒜總多糖)、5#(大蒜總皂苷)由中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所制備并提供。2#以DMEM (Dulbecco; s Modified Eagle Medium)溶解，1#、5# 先以 DMSO 溶解，再用 DMEM 溶解后，以O(shè). 22 μ m的過濾器過濾,分裝_20°C保存。陽性藥順鉬由齊魯制藥有限公司生產(chǎn)(批號905011CF)。(2)胃癌細胞株MKN45細胞購于北京協(xié)和細胞資源中心；AGS、HGC_27細胞購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所。(3)試劑=RPMI 1640 培養(yǎng)基(GIBC0 公司 lot8109038) ;DMEM、Ham，s F12 培養(yǎng)基(Thermo 公司);胎牛血清(GIBC016000 公司);胰蛋白酶(Solarbio 公司)；MTT (Sigma)；DMSO(Sigma)等，購自北京奧信拓普科技有限公司。(4)儀器全自動酶標(biāo)儀，Thermo MK-3 ；C02培養(yǎng)箱，Revco 300T ;倒置顯微鏡，0LYMPUS-IMT-2 ;潔凈工作臺BCN-1360B型，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；微量移液器，德國Eppendorf ;臺式高速離心機TDL-40B型，上海安亭科學(xué)儀器廠；電子分析天平，CP64上海奧豪斯公司。2、實驗方法(I)細胞培養(yǎng)方法MKN45細胞用含10% (體積比)新生牛血清的1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)、AGS用含10% (體積比)新生牛血清的Ham’s F12培養(yǎng)、HGC-27細胞用含10% (體積比)新生牛血清的DMEM培養(yǎng)，(培養(yǎng)液中含有NaHC03. 2g，100U/mL青霉素，100 μ g/mL鏈霉素)，在37°C的5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞覆蓋率80 90%以上時傳代，選取生長狀態(tài)良好的細胞用于實驗研究。(2)MTT法(張均田主編，現(xiàn)代藥理實驗方案，北京醫(yī)科大學(xué)中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版，1998年10月北京第一次印刷，P819)測定大蒜不同部位提取成分對胃癌細胞增殖的抑制并測定藥物半數(shù)抑制濃度(IC50) 收集對數(shù)生長期MKN45、AGS、HGC-27細胞，以2 X IO4/孔的密度加入96孔板，每孔100 μ L。將不同質(zhì)量濃度的藥物各100 μ L加入實驗孔，1#的終濃度分別為2. 5、I. 25、O.625,0.3125,0.156,0.078,0. 0395,0. 0198,0. 0099,0. 0049,0. 00248,0. 00124,0. 00064、O. 00032、0· 00016mg/mL，2#、5# 的終濃度分別 10、5、2· 5、I. 25、0· 625、0· 3125、0·156、O. 078,0. 0395,0. 0198,0. 0099,0. 0049mg/mL，并同時設(shè)立空白對照、陰性對照組和陽性對
照組，陰性對照孔接種等量細胞，并加入含終濃度為0.1% (體積比)的DMSO的完全培養(yǎng)液；空白孔不接種細胞，只加入等量完全培養(yǎng)液；順鉬作為陽性對照組，其劑量按臨床用量換算，終質(zhì)量濃度為 25、12. 5,6. 25,3. 125、I. 56,0. 78,0. 04,0. 02 μ g/mL。每一濃度設(shè) 3 個復(fù)孔，培養(yǎng) 48h。每孔加入 5mg/mL 的 MTT 溶液(四氮唑(3-(4, 5-dimethylthbm) l-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide,以 PBS 稀釋成 5mg/mL) 10 μ L,繼續(xù)培養(yǎng) 4h,去上清，每孔加入200yL的DMS0，震蕩溶解lOmin，室溫下放置lOmin，在酶標(biāo)儀570nm處測光密度(OD)值，計算細胞抑制率，繪制細胞增殖抑制曲線并測定藥物半數(shù)抑制濃度(IC50)。計算細胞抑制率的公式細胞抑制率(％ )=(陰性對照組OD值-實驗藥物組OD值)/(陰性對照組OD值-空白組OD值)X 100% ;以藥物濃度為 橫坐標(biāo)、存活率為縱坐標(biāo)繪制濃度效應(yīng)曲線，求出回歸方程，得出抑制50%細胞生長的濃度(IC50)，實驗結(jié)果見表3-7。表3大蒜有效部位對人胃癌MKN45細胞殺傷作用的半數(shù)殺傷濃度(IC50)
藥物分組IC50(mg/mL)~
1#(G0/ 大蒜油)O. 026
2#(TPG/大蒜總多糖) Γ665#(TSG/大蒜總皂苷) 0 37結(jié)果表明，1#、5#樣品對腫瘤細胞的殺傷作用較強。表4大蒜有效部位對人胃癌MKN45細胞增殖的影響(抑制率％ )
抑制率(％ )lOmg/mL2. 5mg/mL0.625mg/mL
~1#(G0)89Γθ89 3τΓβ
2# (TPG)7δΤ2iH3 Γ9
5#(TSG) Γδ100.0θ Τθ結(jié)果表明，5#、1#樣品對腫瘤的抑制作用較強。表5大蒜有效部位對MKN45、AGS、HGC、HeLa、!fepG2細胞殺傷作用的半數(shù)殺傷濃度(IC50)的對比
權(quán)利要求
1.一種包含大蒜油、大蒜總多糖和大蒜總皂苷的組合物在制備用于預(yù)防和/或治療癌癥的藥物、保健品和/或食品中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，所述組合物中大蒜油、大蒜總多糖、大蒜總皂苷的比例以重量計為I : 2. 5 : I. 25 I : 200 : 50。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的應(yīng)用，其特征在于 所述大蒜油的主要成分包括二烯丙基三硫、二烯丙基二硫、二烯丙基一硫、甲基烯丙基二硫和甲基稀丙基_■硫； 所述大蒜總多糖為雜多糖，其水解后的成分包括果糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖和甘露糖； 所述大蒜總皂苷的主要成分為留體皂苷，其包括呋留皂苷、螺留皂苷，其中，所述呋留阜苷包括proto-eruboside-B> proto-iso-eruboside-B、sativoside—Bl 和proto-desgalactotigonin,所述螺留阜苷包括eruboside_B、iso-eruboside-B、sativoside—C、 sativoside—Rl、 sativoside_R2、 sativoside_B2、 sativoside_B3、sativoside-B4 和 sativoside_B50
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，所述癌癥選自胃癌、直/結(jié)腸癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌、鼻咽癌、肝癌、骨癌、食道癌、乳腺癌、宮頸癌、胰腺癌、腦瘤、皮膚癌、白血病、淋巴癌和黑色素瘤。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物選自以下劑型注射劑、片劑、顆粒劑、膠囊劑、軟膠囊劑、滴丸、口服液、膜劑、散劑、外用膏劑、栓劑和丸劑。
6.一種制備包含大蒜油、大蒜總多糖和大蒜總皂苷的組合物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟 1)大蒜雙提，得大蒜油、藥液和藥渣，藥液保留； 2)大蒜油采用無水硫酸鈉脫水，得純大蒜油，再經(jīng)環(huán)糊精包合，得大蒜油的包合物； 3)藥渣水提，得水提液； 4)將步驟I)所得藥液和步驟3)所得水提液合并，減壓回收水，濃縮，濃縮液加乙醇醇沉，過夜，離心，得沉淀和上清液(即藥液I)； 5)將步驟4)所得沉淀干燥，得淺黃色大蒜總多糖；或溶解步驟4)所得沉淀，離心，上清液過樹脂柱，流出液減壓濃縮，干燥，得黃白色大蒜總多糖； 6)將步驟3)水提后的藥渣淋干，加乙醇回流提取，得藥液II； 7)合并步驟4)所得藥液I和步驟6)所得藥液II，減壓回收乙醇至無醇味，加水稀釋，離心，得上清藥液III ; 8)步驟7)所得藥液III過大孔樹脂，依次水洗和/或乙醇洗，收集洗脫液，減壓回收乙醇至無醇味，干燥，得棕色或深黃色大蒜總皂苷； 9)將步驟I)所得大蒜油或步驟2)所得大蒜油包合物、步驟5)所得大蒜總多糖和步驟8)所得大蒜總阜苷組合，得到包含大蒜油、大蒜總多糖和大蒜總阜苷的組合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于 步驟I)中，所述雙提為將大蒜粉碎，加水保溫酶解，水蒸氣蒸餾提取，進行1-3次，每次加3-9倍水，每次0. 5-2h ； 步驟2)中，所述大蒜油包合的具體步驟為大蒜油用65%-95% (體積比)乙醇按I 5-1 15(mL/mL)的比例溶解，在25-45°C超聲池中，以環(huán)糊精包合0. 5-1. 5h ;優(yōu)選地，所述環(huán)糊精包括a -環(huán)糊精、P -環(huán)糊精、羥乙基-P -環(huán)糊精、羥丙基-P -環(huán)糊精、P -環(huán)糊精甲基化衍生物和支鏈環(huán)糊精，環(huán)糊精的濃度為10% (質(zhì)量體積比)，大蒜油環(huán)糊精以重量計為I : 6-1 : 12 ; 步驟3)中，所述水提為1-2次，每次加3-9倍水，每次0. 5-2h ； 步驟4)中，所述減壓回收是在溫度不高于80°C下進行的；所述濃縮液，以大蒜(g)藥液(mL)為單位計，濃度為I : 0. 8-1. 2，使藥液在60°C下的相對密度為0. 9-1. 10 ;所述乙醇在濃縮液中的含量為75-85% (體積比)； 步驟5)中，所述溶解沉淀的溶劑為熱的去離子水；所述樹脂為D316、HPD300L、D900、D318或D941型樹脂，優(yōu)選為D941或D900型樹脂；所述減壓濃縮是在溫度不高于80°C下進行的；所述干燥為減壓干燥、噴霧干燥或冷凍干燥，優(yōu)選地，所述減壓干燥溫度不高于60°C，所述噴霧干燥的預(yù)熱器溫度為280°C，其干燥室溫度為120°C，所述冷凍干燥的冷肼溫度為_50°C，其干燥溫度為25°C ； 步驟6)中，所述回流提取的具體步驟為加3-5倍(質(zhì)量比)95% (體積比)乙醇回流，提取1-2次，每次0. 5-1. 5小時； 步驟7)包括，合并藥液1、11，減壓回收至無醇味，使其25°C時相對密度為1.00-1. 10，加水稀釋，加水量為藥材重量的0. 5-0. 9倍，離心，得上清藥液；且 步驟8)中，將藥液III過苯乙烯型大孔樹脂，所述樹脂優(yōu)選為DM-130、AB-8或HPD100，按照樹脂與生藥重量比計，上樣量為I : 0.8-1. 1，依次水洗4-6BV和/或30% (體積比)乙醇洗2-5BV，70 % -95% (體積比)乙醇洗4-6BV，收集水洗后乙醇洗脫液，或30 % (體積比)乙醇洗脫后的乙醇洗脫液，在溫度< 70°C下減壓回收乙醇至無醇味，減壓干燥、噴霧干燥或冷凍干燥，所述減壓干燥溫度不高于60°C，噴霧干燥干燥室溫度不超過120°C，冷凍干燥冷肼溫度低于_50°C。
8.—種根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法制備的包含大蒜油、大蒜總多糖和大蒜總阜苷的組合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其特征在于，所述組合物中大蒜油、大蒜總多糖、大蒜總皂苷的比例以重量計為I : 2. 5 : I. 25 I : 200 : 50。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的組合物，其特征在于，所述大蒜油主要的成分包括~■稀丙基二硫、_■稀丙基_■硫、_■稀丙基一硫、甲基稀丙基二硫和甲基稀丙基_■硫；所述大蒜總多糖為雜多糖，其水解后的成分包括果糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖和甘露糖；所述大蒜總皂苷的主要成分為留體皂苷，其包括呋留皂苷、螺留皂苷，其中，所述呋留阜苷包括proto-eruboside-B> proto-iso-eruboside-B、sativoside—Bl和 proto-desgalactotigonin,所述螺留阜苷包括eruboside_B、iso-eruboside-B、sativoside—C、 sativoside—Rl、 sativoside_R2、 sativoside_B2、 sativoside_B3、sativoside-B4 和 sativoside-B 5 等。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的組合物，其特征在于，所述大蒜油中二烯丙基二硫和二烯丙基三硫的總含量不低于50%，大蒜油包合物中，大蒜油的利用率不低于93%;所述大蒜總多糖中大蒜總多糖含量以葡萄糖標(biāo)定不低于45%，大蒜總多糖水解后，各單糖含量的總和不低于50% ;所述大蒜總阜苷中，總阜苷含量以阜苷單體proto-iso-eruboside-B為對照品標(biāo)定不低于 40%。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種大蒜油、大蒜總多糖、大蒜總皂苷為原料組成的組合物，該組合物集大蒜水溶性、脂溶性有效成分于一體，使大蒜防癌抗癌的活性得到充分的發(fā)揮，該組合物具有良好的抗腫瘤活性，具有扶正祛邪、減毒的作用，應(yīng)用前景廣闊，可制成療效顯著且毒副作用小的腫瘤防治藥物或保健品。本發(fā)明還提供了制備所述組合物的方法，將大蒜經(jīng)雙提，得大蒜油；藥渣經(jīng)水提醇沉，得大蒜總多糖；藥渣經(jīng)醇提，過大孔樹脂純化，得大蒜總皂苷。該制備方法操作簡單，充分利用大蒜原料的每一部分，成本低廉，質(zhì)量可控，能夠產(chǎn)業(yè)化。
文檔編號A61P35/00GK102652792SQ201110053280
公開日2012年9月5日 申請日期2011年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月4日
發(fā)明者劉麗梅, 劉梅潔, 李玉梅, 柏冬, 王瑞海, 鞠大宏 申請人:中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所