專利名稱：含佐劑疫苗制劑的制作方法
含佐劑疫苗制劑本發(fā)明涉及含佐劑疫苗(adjuvanted vaccine)制劑,尤其是能夠增強粘膜免疫應答的流感疫苗，例如在鼻內或肌內遞送后。季節(jié)性流感仍然是全世界死亡率和發(fā)病率的主要原因之一。每年進行疫苗接種是預防和控制流感感染的最有效對策。季節(jié)性流感疫苗是基于對下一季節(jié)流行病的預期株的預測而制備的。也有一些不預防感染本身的腸胃外注射的疫苗，其能夠減少感染后的嚴重性和復雜性。腸胃外的疫苗能夠誘導在血清中中和IgG抗體，但是它們不能誘導在粘膜的表面起作用的分泌型IgA抗體。相比之下，鼻內(i. η.)疫苗可誘導全身性免疫應答和粘膜免疫應答。在粘膜的膜表面上的分泌型IgA抗體對于預防感染是十分有效的，因為它們在病原體附著到上皮細胞表面(其是流感病毒感染的第一個靶點)之前在粘膜的膜表面上起作用。此外，血清IgG抗體針對漂移病毒株(drifted viral strain)不是那么有效，因為它們與分泌型IgA抗體相比具有更高的特異性。分泌型IgA抗體針對流感病毒的變異株具有交叉保護的作用。IgA的交叉反應作用的精確機制仍然是未知的，但是該現(xiàn)象在預防感染中是很大的優(yōu)勢。流感顯示出改變其兩種主要膜蛋白，血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)的 抗原特性的非凡能力。這通過在遠離于人類人群中建立的適應性免疫應答的連續(xù)選擇而發(fā)生。由于該病毒的高突變率，特定的疫苗制劑通常只在約一年內有作用。世界衛(wèi)生組織每年整理疫苗的目錄，以包括最有可能在第二年發(fā)起攻擊的病毒株?，F(xiàn)今，常規(guī)疫苗是由三種滅活的流感病毒(兩種A-株和一種B株)所構成的疫苗。每年基于由WHO預期會在即將到來的流感季節(jié)中流行的流感株而重新配制這種三價流感疫苗。例如，在2007-2008年，該每年更新的三價流感疫苗由來自流感H3N2、HlNl和B流感病毒的血凝素(HA)表面糖蛋白組分組成。疫苗i.n.遞送的其他優(yōu)勢在于，疫苗的遞送不需要受過訓練的衛(wèi)生保健人員來進行疫苗的給藥，這使得這種類型的疫苗適于患有針恐怖癥(needle-phobia)的人群并且防止針刺損傷問題的發(fā)生。而且，有報道稱粘膜免疫系統(tǒng)在生命中發(fā)育較早且不受老化的影響(McElhaney JE. Vaccine 2005 Jul 8; 23Suppl I: S10-25; Szewczuk MR et al. AnnN Y Acad Sci 1983 Jun 30;409:333-44)。因此，例如鼻內流感免疫的伴生優(yōu)勢在于，它能夠在所有年齡段中潛在提供有效免疫，并且能夠用于大規(guī)模疫苗接種。人們已經對經由鼻或口咽途徑對抗流感以及利用滅活流感抗原的免疫法的各種概念進行了研究以作為對于皮下或肌肉注射免疫的更少使用針的其他選擇方案。對于支持更少地使用針的方法的試驗數(shù)據(jù)已經在動物模型中產生。由動物數(shù)據(jù)支持的利用滅活的流感抗原(如化學滅活整個病毒粒子，或進一步處理的病毒組分如裂解病毒，或純化的表面抗原血細胞凝集素(HA)和/或神經氨酸酶(NA)處理)經鼻內途徑用于免疫的構思包括與滅活的流感抗原聯(lián)合使用佐劑或免疫刺激物，或需要多疫苗接種。佐劑是增強與其混合的抗原的免疫原性的任何物質。在人類中，經由鼻內途徑抗流感的成功疫苗接種僅報道了( a)活(冷適應株)流感疫苗(FluMist , Medlmmune Vaccines Inc)、(b)用大腸桿菌(E. coli)的不耐熱毒素(heatlabile toxin)作為佐劑的類病毒體(virosomal)流感疫苗(NasalFlu, Berna BiotechLtd)或(c)利用大量抗原病且重復接種。雖然活疫苗能夠誘導令人滿意的免疫反應，但它們作為活病毒的特定性質會引起另外的安全考慮，并且可能會由于要求在上呼吸道附近發(fā)生病毒復制而誘導副作用。此外，其所要求的存儲條件正在限制這些產品的商品化。大腸桿菌HLT作為佐劑的鼻內流感疫苗的使用與面癱(貝爾麻痹)之間的密切聯(lián)系導致HLT作為佐劑的類病毒體疫苗退出市場。目前，活的減弱的流感病毒疫苗(LAIV)已上市以用于i.n.給藥。LAIV疫苗已經顯示出既誘導全身免疫反應又誘導粘膜免疫反應。然而，F(xiàn)DA批準LAIV疫苗僅用于年齡為2-49歲的人，而不能用于高危人群(老年人、兒童以及長期患病的患者)(美國國家疾病控制與予頁防中心(Centers for Disease Control and Prevention)http://www. cdc.gov/flu/professionals/vaccination/pdf/targetpopchart.pdf ；Belshe RB et al. Vaccine 2008 Sep 12;26Suppl 4:D10_6)。然而，大部分上市銷售的流感疫苗是滅活疫苗，其可安全地經由i. η.途徑給予全部人群。這些疫苗的缺點是，它們在經由該途徑給藥時較表現(xiàn)出弱的免疫原性(Vaccine 2007 Jul 20; 25 (29) : 5367-73;Eyles et al. , BioDrugs 2000Jan;13(I):35-59)。為了增加免疫原性，滅活流感疫苗需要佐劑以在經由i.n.途徑給藥時加強免疫反應。目前用于i.n.免疫法的若干佐劑正在開發(fā)之中，如病毒樣顆粒(MatassovD et al.Viral Immunol 2007Sep;20 (3):441-52), ISCOMS (Sjolander S etal. Vaccine 2001 Jul I6; I9 (28_29) : 4072_80)、脂類、核酸類(Joseph et al. Vaccine2006 May I; 24 (18) : 3990-4006)、以及細菌組分(Haan et al. Vaccine 2001 Apr6; 19 (20-22) : 2898-907; Plante et al. Vaccine 2001 0ctl2; 20 (1—2) : 218—25)。然而，許多佐劑系統(tǒng)的發(fā)展受到安全性和管理問題的妨礙。例如，有效的細菌佐劑如LT (大腸桿菌的不耐熱毒素)已在人類中表現(xiàn)出嚴重的副作用(Mutsch et al. N Engl J Med 2004 Feb26; 350 (9) : 896-903)。已建議用于流感疫苗的含鋁鹽佐劑在生產時不僅需要額外的混合步驟從而減慢總體生產，而且包含這些鹽還與各種問題相關。例如，它們的不溶性意味著吸附的抗原從混懸劑中沉降，因此從大量疫苗制備單個劑量時就需要加倍小心。此外，抗原與鹽結合使最終的疫苗質量控制變得更為復雜。尤其是，對流感疫苗的一些效能測試基于需要非結合抗原的體外免疫測定，即吸附至佐劑意味著不能使用這些測試。最近，更多地關注于免疫應答的表型即Thl、Th2或均衡應答。經由i. η.途徑給予的亞單位疫苗以及許多鼻佐劑如殼聚糖、ISC0MS、脂類以及LT誘導混合的Thl/Th2型應答。然而，認為Thl應答要優(yōu)于Th2或混合應答，因為它I)導致更好保護而免受感染；且2)通過分泌INF-γ而有助于病毒中和作用。此外，自然感染也誘導Thl型應答。另外，在粘膜膜表面上的分泌型IgA抗體對于預防感染是十分有效的，重要的是，分泌型IgA抗體對流感病毒的變異株具有交叉保護的作用，而且該粘膜免疫系統(tǒng)在生命中發(fā)育較早且不受年齡增加的影響。因此，對于對人類有效、安全且易于被管理機構批準的佐劑有明確的需求。優(yōu)選地，能夠誘導粘膜免疫應答如分泌型IgA抗體和/或偏向Thl型免疫的應答的疫苗是合乎需要的。因此本發(fā)明的目的在于提供另外的且改進的含佐劑流感疫苗(用于大范圍流行和大范圍流行之間)，優(yōu)選適合于鼻內和/或肌內給藥的疫苗。另一個目標在于提供用于便于制造且符合成本低廉的每年再配制的流感疫苗的靈活方法。人們發(fā)現(xiàn)，以上目標可以通過將抗原與獲自革蘭氏陽性細菌的滅活的肽聚糖顆粒共配制而得到滿足。該顆粒不僅高效增強鼻內給予亞單位疫苗的免疫原性，而且還誘導分泌型IgA并將應答從均衡免疫應答調整到偏向Thl的免疫應答。與僅用亞單位流感病毒的常規(guī)肌內免疫相比，鼻內遞送誘導與其相當?shù)娜硇悦庖咭约吧踔脸壍恼衬ず图毎閷У拿庖摺？梢酝ㄟ^簡單混合抗原和細菌顆粒實現(xiàn)保護效應。因此，本發(fā)明涉及含佐劑疫苗制劑，包含(i)獲自革蘭氏陽性細菌的肽聚糖微粒，和(ii)至少一種抗原或其抗原制劑，其抗原或抗原制劑不是融合的或者是相反地共價連接于蛋白質的肽聚糖結合部分?？砂魏我阎幕蛏杏?待發(fā)現(xiàn)的保護性抗原或其抗原片段，例如病毒、細菌、寄生或酵母來源。在一種實施方式中，抗原是病毒抗原，如乙型肝炎表面抗原或流感病毒抗原。在另外的實施方式中，該制劑包含細菌抗原，優(yōu)選至少兩種細菌蛋白質抗原或其抗原制劑，其抗原或抗原制劑不是融合的或者是相反地共價連接于蛋白質的肽聚糖結合部分?？砂魏我阎幕蛏杏写l(fā)現(xiàn)的兩種或多種蛋白質抗原或其抗原片段的保護性組合，如肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)抗原 PpmA、SlrA、IgAl 蛋白酶、PspA、CbpA> PdBD或其它的組合,或鼠疫耶爾森氏菌屬(Yersinia pestis)抗原LcrV、FI、FliC的組合，或III型分泌途徑抗原如LcrV、IpaB和D、SipB和D、鼠傷寒沙門菌(Salmonellatyphimurium)、小腸結腸炎耶爾森菌(Yersinia enterocolitica)、志賀菌屬(Shigella))的YopD的組合，或腸毒素大腸桿菌(enterotoxic Escherichia coli,ETEC)的LT和ST抗原的組合或其他細菌蛋白質抗原的組合。一方面，本發(fā)明提供包含PspAXbpA和/或PdBD的保護性制劑。特別令人感興趣的是本發(fā)明的肺炎球菌三價疫苗制劑，其中細菌蛋白質抗原是PspAXbpA和PdBD。在與獲自革蘭氏陽性細菌的肽聚糖微粒混合后，發(fā)現(xiàn)該3種抗原的混合劑在感染肺炎鏈球菌的鼻內激發(fā)小鼠模型中提供了很好的保護。出人意料的是，在混合之后的保護活性比在抗原經由融合結合于蛋白質肽聚糖結合部分時更高(參見本文中下文的實施例12和圖16)。并且，抗原的特定組合表現(xiàn)出對于保護活性的關聯(lián)性，因為在與結合的抗原相比，與混合肽聚糖顆粒時包含抗原PpmA、IgAl蛋白酶、PspA、CbpA和PsaA的五價制劑是相對低的。參見實施例13和圖17。在另外的實施方式中，該制劑包含至少一種寄生抗原或其抗原制劑，其抗原或抗原制劑不是融合的或者是相反地共價連接于蛋白質的肽聚糖結合部分?？砂魏我阎幕蛏杏写l(fā)現(xiàn)的保護性寄生抗原或其抗原片段，如惡性痕原蟲(Plasmodium falciparum)的環(huán)子孢子表面抗原或裂殖子表面抗原。示例性的保護性真菌抗原包括球孢菌屬(Coccidioides ssp)的抗原。適合的酵母抗原是假絲酵母(Candida ssp)的抗原。還提供了含佐劑疫苗制劑，包含獲自革蘭氏陽性細菌的肽聚糖微粒和至少一種多糖抗原或其抗原制劑，其抗原或抗原制劑不是融合的或者是相反地共價連接于蛋白質的肽聚糖結合部分。可包含任何已知的或尚有待發(fā)現(xiàn)的保護性多糖抗原或其抗原片段，如肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenza)、腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitides)、金色葡萄球菌莢膜多糖或其他多糖。在一種優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明提供了含佐劑流感疫苗制劑，包含(i )獲自革蘭氏陽性細菌的肽聚糖微粒，和(ii)至少一種流感病毒抗原或其抗原制劑，其抗原或抗原制劑不是融合的或者是相反地共價連接于蛋白質的肽聚糖結合部分。在另外的實施方式中，本發(fā)明提供了含佐劑乙型肝炎疫苗制劑，包含(i)獲自革蘭氏陽性細菌的肽聚糖微粒，和(ii)至少一種乙型肝炎病毒抗原(例如病毒的包膜蛋白，如乙型肝炎表面抗原(HBsAg))或其抗原制劑，其抗原或抗原制劑不是融合的或者是相反地共價連接于蛋白質的肽聚糖結合部分。在另外的實施方式中，本發(fā)明提供了含佐劑肺炎球菌疫苗制劑，包括(i)獲自革蘭氏陽性細菌的肽聚糖微粒，和(ii)至少一種肺炎球菌抗原，優(yōu)選PdBD，更優(yōu)選PspA、CbpA和PdBD，其抗原不是融合的或者是相反地共價連接于蛋白質的肽聚糖結合部分?？梢酝ㄟ^本領域已知的方法獲得用于根據(jù)本發(fā)明的疫苗肽聚糖微粒。參見例如WO 02/101026以及US 6，896，887，公開一種用于獲得革蘭氏陽性細菌的細胞壁物質的方法，包括用能夠去除細胞壁組分(如來自所述細胞壁物質的蛋白質、(脂)磷壁酸((Iipo)teichoic acid)或碳水化合物)的溶液處理所述細胞壁物質,其中所述細胞壁物質基本包括球形肽聚糖微粒。細胞壁物質沒有被機械破碎，以產生反映革蘭氏陽性細菌的大小與形 狀的球形肽聚糖微粒。該顆粒是無生命的，表面蛋白和細胞內的內容物被完全剝奪。然而厚的肽聚糖細胞壁被完整保留，并提供結構剛性以構成細菌形狀的約I μ m大小的肽聚糖球，其被稱為革蘭氏陽性增強子(GEM)顆粒。在粘膜佐劑發(fā)展的領域中的主要障礙是證明它們的安全性，以便獲得管理機構的批準。與用于免疫的所評價的其他佐劑和其他乳酸菌系統(tǒng)相比，在本研究中使用的顆粒是使用安全的。在顆粒生產期間，用酸處理細菌導致遺傳物質的損失。由于可避免由細菌引起的粘膜層的DNA脫落和感染問題，因此遺傳物質的損失是有利的。此外，該顆粒由用于生產奶制品并且被認為是GRAS (公認安全的)生物體的細菌產生。已經在臨床前GLP毒性研究中用兔子鼻內測試GEM顆粒，并且沒有報道不利事件。因此，可以認為GEM顆粒是用于人類粘膜應用的安全候選佐劑。在一種實施方式中，疫苗制劑包含獲自食品級細菌，優(yōu)選乳酸細菌的微粒。優(yōu)選地，微粒獲自食品級細菌乳酸乳球菌(Lactococcus lactis), 一種非病原性、非定植(non-colonizing)的革蘭氏陽性細菌。此外,乳酸乳球菌(L. lactis)被管理機構批準用于人類并且被認為是GRAS (—般認為是安全的)生物。在一種實施方式中，肽聚糖顆粒通過在酸中加熱乳酸乳球菌，接著用磷酸鹽緩沖液洗漆而產生(van Roosmalen ML et al. Methods2006 Feb;38(2):144-9)。該顆粒作為用于瘧原蟲抗原和肺炎球菌抗原的粘膜疫苗的抗原載體而被研究，因為它們具有提高的對于與包含肽聚糖結合區(qū)域的蛋白質物質結合的能力(如AcmA細胞壁結合區(qū)域或同系物(homolog)或其功能衍生物)。這些研究證明，與GEM顆粒連接并在GEM顆粒上展示的抗原比單獨抗原誘導更高的免疫應答。在本領域中一般認為，抗原在載體顆粒上的固定和最優(yōu)表面展示對于佐劑效應而言是重要的。本發(fā)明的研究出人意料地顯示，不同于抗原結合至顆粒的早期研究，肽聚糖顆粒與(一種或多種)抗原的簡單混合顯著地增強了抗原的免疫原性。而且，在某些情況下，在與顆?；旌虾螅c連接/固定至顆粒上相比，可以實現(xiàn)更好的保護活性。如本文中使用的表達“其抗原或抗原制劑不是融合的或者是相反地共價連接于蛋白質的肽聚糖結合部分”意在將本發(fā)明與現(xiàn)有技術區(qū)分開，在現(xiàn)有技術中抗原部分通過融合或者通過將抗原連接在也被稱為“蛋白質錨”或“錨蛋白(Protan)” (PA)的蛋白質物質上而連接于肽聚糖微粒，其典型地包括AcmA細胞壁結合區(qū)域或同系物或其功能衍生物的至少一個重復，但優(yōu)選兩個或三個重復序列。例如，EP 1395648公開了用于將AcmA型蛋白質錨融合物結合至微生物的細胞壁物質的方法。WO 2007/011216涉及負載有抗原的載體復合物，其包含至少一種連接于免疫原性載體的雙功能多肽，所述雙功能多肽包含肽聚糖結合區(qū)域(PBD)，多肽通過該肽聚糖結合區(qū)域連接于所述載體、融合至結合于至少一種感興趣抗原的抗原結合區(qū)域(ABD)。在一種優(yōu)選實施方式中，抗原是流感病毒抗原。如本文中下文所示，出人意料地發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的基于GEM的i.n.流感疫苗引起了朝向Thl表型的應答偏移(responsebias)。人們發(fā)現(xiàn)，鼻內給予用GEM顆粒作為佐劑的亞單位疫苗(其與疫苗簡單混合)能夠用于初期強化免疫策略以誘導保護水平的HI效價(>2log5. 3，)，其被認為是重要的保護性關聯(lián)。此外，基于GEM的i.n.流感疫苗 在致命激發(fā)之后是完全保護性的。此外，血清IgG結果明確強調GEM顆粒增強i.n.給藥的流感亞單位疫苗的免疫原性。除了重要的血清應答之夕卜，GEM作為佐劑的i. η.疫苗引起強烈的粘膜免疫應答，即在呼吸道粘膜中分泌slgA。在鼻黏膜中誘導的SlgA的顯著性水平顯示GEM顆粒充當鼻黏膜中的免疫增強劑。鼻黏膜的免疫系統(tǒng)由鼻相關的淋巴組織(NALT)組成。在NALT中，抗原被M細胞攝取，然后呈遞給抗原呈遞細胞，其又將抗原片段呈遞至下面的B細胞和T細胞。這種事件的級聯(lián)對于針對流感病毒的初期先天性免疫應答和適應性免疫應答是必需的。我們的結果顯示，與GEM顆?；旌系牧鞲袉挝恍鸵呙绲膇. η.免疫比僅用疫苗的i. m.和i. η.免疫誘導鼻黏膜中的更高slgA水平。在NALT中slgA抗體的誘導可能是由于與存在于GEM顆粒中的肽聚糖的TLR-2 (Toll樣受體)的相互作用，正如已知在體外研究中GEM顆粒起到TLR-2激動劑的作用。而且，已知GEM顆粒能在體外激活樹突細胞和巨噬細胞的成熟(Audouy SA, et al. Vaccine 2007Mar22; 25 (13) : 2497-506)。因此，TLR-2的激活和樹突細胞的成熟都可有助于更強的粘膜免疫應答。最近，更加強調免疫應答的表型即Thl、Th2或均衡應答。認為Thl應答優(yōu)于Th2或混合應答，因為它I)引起更好的保護以避免感染；2)在病毒中通過分泌INF-Y而幫助中和。此外，自然感染也誘導Thl型應答。然而，經由i.n.途徑給藥的亞單位疫苗以及許多鼻佐劑如殼聚糖、ISC0MS、脂類和LT，誘導混合的Thl/Th2型應答。相比之下，根據(jù)本發(fā)明的i.n.流感疫苗誘導朝向Thl型的應答偏移。因此，GEM顆粒將應答從均衡應答調整到Thl偏移應答。而且，與必須是預先配制的大部分其他佐劑系統(tǒng)相比，本文中提供的疫苗制劑更加便于生產。用于這些實驗的制劑通過將GEM顆粒與常規(guī)的亞單位疫苗混合而制備。GEM顆粒能在無菌的條件下被大量生產，并且能夠在環(huán)境溫度中長期儲存。配制和給藥的方便使i. n. GEM流感亞單位疫苗成為有希望的用于流行和傳染疫情免疫的候選物。如在實施例I至8中所證明的，本發(fā)明發(fā)明人示出了，與僅用亞單位流感疫苗的i.m.免疫相比，用GEM顆粒作為佐劑的i.n.流感疫苗誘導可比得上全身性免疫的以及更強的粘膜和細胞介導的免疫。尤其是，在第一次強化免疫接種之后，與僅用亞單位流感疫苗i.m.免疫相比，誘導可比得上由HI效價所測量的免疫保護水平。重要地，它誘導更高的slgA水平，其在上呼吸道的流感感染期間是第一道防線。此外，它引起認為能夠提供超級保護的偏移的Thl型免疫應答。另外，顯示了這些免疫應答提供對用基于GEM的鼻內流感疫苗免疫的小鼠的完全保護。實施例7 (圖9和圖10)示出了口服給予流感疫苗組合物的效能。實施例8 (圖11)顯示，肌內給予基于GEM的流感疫苗能夠用于在呼吸道或其他粘膜層的粘膜內層中引起高的slgA水平。此外，肌內途徑能夠用于與GEM顆?；旌系牧鞲幸呙?，以顯著增加普通肌內基準疫苗(benchmark vaccine)的潛能,或以顯著方式(圖12)減少抗原數(shù)量(抗原劑量節(jié)約)?？梢哉J為GEM顆粒對于i.n.、i.m.、或者口服遞送的流感疫苗是安全且有效的佐劑。其他適合的病毒抗原包括呼吸道合胞病毒(RSV)蛋白，例如RSV融合(F)、和附著(G)糖蛋白或其相應部分或組合，如嵌合FG蛋白(J Virol. 1991July; 65 (7) : 3789-3796)。RSV感染已成文長期且有害的全球性問題，包括美國、歐洲、澳大利亞和日本。在早產兒、幼兒和老年人中，以及對于有較弱免疫系統(tǒng)的所有個體而言確實是特別麻煩的。據(jù)估計，約三分之二的I歲以下的兒童，以及幾乎所有的I至4歲之間的兒童都被RSV感染過至少一次，大多數(shù)在無需醫(yī)學關注的情況下恢復。然而，其中的5-10%存在持續(xù)很長時間的嚴重感染，這被認為是誘發(fā)哮鳴和哮喘樣癥狀的因素。待與肽聚糖顆?；旌系钠渌信d趣的抗原包括人類免疫缺陷病毒(HIV)蛋白，尤其是暴露在HIV信封樣gpl20、gpl40或gpl60表面上的糖蛋白。Gpl20對病毒進入細胞是至關重要的，因為它在尋找用于進入的特異細胞表面受體方面發(fā)揮關鍵作用。
本文中提供的含佐劑流感疫苗制劑包含至少一種流感病毒抗原或其抗原制劑。例如，它包含流感蛋白或其片段和/或包含流感蛋白或其片段的融合蛋白(假如它未融合到肽聚糖結合區(qū)域)。本發(fā)明的異源性蛋白可包括感興趣的任何流感抗原，包括血細胞凝集素抗原(HA)、神經醇胺酶抗原(NA)或它們的組合。優(yōu)選地，流感抗原是表面抗原，即不是結構抗原，如流感基質蛋白2 (M2e)的胞外域。在一種實施方式中，流感抗原不是M2e。在一個具體的方面，流感疫苗制劑包含作為流感抗原的HA和/或NA。各種不同的流感HA和NA蛋白(例如來自不同亞型、或病毒株或隔離群(isolate))的氨基酸序列在本領域中是已知的，并且可在公共數(shù)據(jù)庫如GenBank中獲得。優(yōu)選地，該疫苗制劑包括至少一種HA亞型。用于疫苗的流感病毒株隨季節(jié)改變。在當前的流行爆發(fā)期間，疫苗通常包括兩種A型流感株(H1N1和H3N2)和一種B型流感株，且三價疫苗是典型的。本發(fā)明還可以使用來自流行株的病毒如新的“豬流感(swine flu)”或“墨西哥流感(Mexican flu)"Hl或其他的流行株(即對于疫苗接受者和一般人群是天然免疫的株)，如H2、H5、H7或H9亞型株(尤其是A型流感病毒)，并且流行株的流感疫苗可以是單價的，或可以基于由流行株補充的常規(guī)三價疫苗。然而，根據(jù)季節(jié)以及包含在疫苗中的抗原的性質，本發(fā)明可預防一種或多種HA亞型 HI、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15 或 H16。例如，在一種實施方式中，i. η.疫苗制劑包含每種流感株I至15 μ g之間的ΗΑ。在一個具體方面，疫苗制劑包括來自至少二種流感病毒株、至少一種與流行爆發(fā)有關或有可能與流行爆發(fā)有關的株的流感抗原或其抗原制劑。疫苗制劑中存在的肽聚糖顆粒的量，優(yōu)選足以在初次強化免疫策略中誘導保護水平的血細胞凝集素抑制(HI)效價的量。例如，根據(jù)本發(fā)明的疫苗制劑可包括每微克流感病毒抗原O. OOlmg至Img,優(yōu)選O. Olmg至O. Img的微粒(干重)。用于人類使用的示例性i.n.疫苗制劑包括0. 3mg-2. 5mg的GEMs (干重)、3 X 1-15 μ g的三價HA (卵、細胞、重組體)或 O. 1-15 μ g 的單價體 HA (流行的)、0. 05-0. 15M 的 PBS (pH6_8)。本發(fā)明的鼻疫苗組合物能夠根據(jù)給藥方法配制為液體或粉劑型組合物，尤其是，氣霧劑、滴劑、吸入劑或吹入劑(insufflation)，且粉劑或微球體是優(yōu)選的。用于滴鼻劑的組合物可包括一種或多種可接受的賦形劑，如抗菌劑、粘度調節(jié)劑、滲透調節(jié)劑以及緩沖齊U。然而，本發(fā)明不限于鼻疫苗制劑。出人意料地發(fā)現(xiàn)GEMs的加入賦予i.m. HA疫苗有效性。這能帶來劑量節(jié)約策略。參見實施例8和9，圖12。因此，本發(fā)明還提供了包含肽聚糖微粒和(常規(guī))肌內HA疫苗制劑的組合物。此外，與GEMs混合的流感HA在口服給予后產生保護性血清HI效價(實施例7，圖9和圖10)。本發(fā)明另外的方面涉及包括本文中所公開的疫苗制劑的容器。在一種實施方式中，它是鼻內給藥裝置，以氣霧劑或滴劑遞送系統(tǒng)(鼻內噴霧劑)形式遞送的裝置，可選地備有使用說明書。仍然進一步地，本發(fā)明提供了用于預防對象的流感感染或疾病的方法，該方法包括給予對象如在本文上文所描述的疫苗制劑。因為其安全性，該疫苗制劑尤其適用于人類高危人群。例如，本發(fā)明因此提供了方便、安全和可靠的方法，用于預防老年人、年齡可達2歲(2歲以下)的兒童或長期患病的患者的流感感染或疾病。預防性方法可包括鼻內、口服、肌內給予該疫苗制劑，優(yōu)選鼻內給藥。其非常方便地使用給藥裝置，例如以氣霧劑或滴劑遞送系統(tǒng)形式的給藥裝置。疫苗的給藥量由能夠有效誘導免疫應答的量來確定。例如，對人給予疫苗的頻率是到每天I次至幾次，而劑量是1-250 μ g，且優(yōu)選2-50 μ g0根據(jù)本發(fā)明制備的疫苗可用于治療兒童和成人。流感疫苗目前被推薦用于從6個月年齡起的兒童和成人免疫。因此，患者可以小于I歲、1-5歲、5-15歲、15-55歲、或至少55歲。接受疫苗的優(yōu)選患者是老年人(例如> 50歲，> 60歲，且優(yōu)選> 65歲)、年輕人(例如< 5歲)、住院患者、醫(yī)療保健工作者、武裝服務和軍事人員、孕婦、長期病患者、免疫缺陷患者、在接受疫苗之前7天內接受抗病毒化合物(如奧塞米韋或扎那米韋化合物，例如見下面的奧塞米韋磷酸鹽)的患者、具有蛋變態(tài)反應的人和/或出國旅行的人。應理解，疫苗不是僅僅適合于這些組，而是，在人群中可更普遍地使用。對于流行株，所有年齡段的給予是優(yōu)選的。此外，提供用于制備流感疫苗制劑的方法包括在本發(fā)明的范圍內，該方法包括(a)提供獲自革蘭氏陽性細菌的肽聚糖微粒；(b)提供至少一種流感抗原或其抗原制劑；以及(C)混合微粒和(一種或多種)抗原的步驟。可以利用在本領域中本身已知的方法來實施步驟(a)和(b)。因為步驟(b)不需要將抗原融合或連接至肽聚糖結合區(qū)域，如錨蛋白，本發(fā)明的方法比現(xiàn)有技術方法更方便和具有經濟吸引力，在現(xiàn)有技術的方法中必須首先使抗原改性(例如通過融合至蛋白的連接體部分)以結合于肽聚糖微粒。相對而言，能夠利用這樣的常規(guī)亞單位疫苗來實現(xiàn)本發(fā)明。因此，本發(fā)明還涉及獲自革蘭氏陽性細菌的肽聚糖微粒作為流感疫苗制劑中的佐劑的應用，所述制劑包含不是融合的或者是相反地共價連接于蛋白質肽聚糖結合部分的流感病毒抗原。


圖I :在用PBS或HA+不同量的GEM顆粒(以mg干重表示)免疫三次的小鼠中以μ g/ml表示的HA抗原(H1N1A/北京)特異總血清IgG。誤差條表示平均標準誤差(SEM)。圖2 :在不同HA組即i. n. HA+GEM或i. m. HA在第一次免疫后在第14天、第28天和第42天(分別第I次、第2次和第3次免疫)的HA抗原(H1N1A/北京)特異性總血清IgG、稀釋滴度的比較分析。誤差條表示SEM。圖3 :被免疫三次的小鼠的血清的HA抗原(H3N2A/威斯康星(H3N2A/Wisconsin))特異性HI效價。A.不同HA組即i. m.、i. η.和i. n. +GEM在第一次免疫后在第O天、第28天和第42天的HI效價的比較分析。B.三個HA組即i.m.、i.n.、i. n+GEM之間在第一次免疫后在第42天的HI效價比較分析。在柱上方的數(shù)值表明每組的應答數(shù)。誤差條表示SEM。圖4:用HA i.m.、i.n.、或i. n+GEM免疫的小鼠的鼻(a)或肺灌洗(b)的HA抗原(H3N2A/威斯康星)特異性IgA效價。在柱上方的數(shù)值表明每組的應答數(shù)。誤差條表示SEM。圖5 :用HA i. m.、i. η.或i. n+GEM免疫的小鼠的血清的HA抗原(H3N2A/威斯康星)特異性IgG亞型效價。確定IgGl (A)、IgG2a (b)和IgG2b (C)效價。星號的意思是對于指示的比較P-值〈O. 05。誤差條表示SEM。圖6 :細胞介導的免疫應答由確定用HA i.m.、i.n.或i. n+GEM免疫的小鼠中的 細胞因子釋放曲線即IL-4 (a), IFNy (b)而確定。星號的意思是對于指示的比較P-值〈0.05。誤差條表示SEM。圖7 :激發(fā)后的生存率(％)。用每次劑量5μ gHA以及免疫的動物，且含GEM疫苗每劑量補充O. 3mg GEM。動物在最后的加強免疫后激發(fā)3周并且跟蹤觀察14天。五個疫苗組之間的比較分析。圖8 :在激發(fā)后肺的病毒效價(A/Puerto Rico/8/34 [PR8]，TCID50 [組織培養(yǎng)感染劑量])(每克肺組織)。激發(fā)4天后分離肺。五組之間的比較分析。平均標準誤差(SEM)用誤差條表示。圖9 :用口服HA或口服HA+GEM流感疫苗免疫的小鼠的亞單位抗原(A/廣島[H3N2])特異血清HI效價。將小鼠用每劑量20 μ gHA免疫三次。GEM疫苗含有每劑量O. 3mgGEM。*表明p〈0. 05。在2Log5. 3上方的效價是保護性的。平均標準誤差(SEM)用誤差條表
/Jn ο圖10 :用口服HA或口服HA+GEM流感疫苗免疫的小鼠的腸(灰色柱)和鼻灌洗(黑色柱)中的亞單位抗原(A/廣島[H3N2])特異性slgA效價。在柱上方的數(shù)值指示每次分析的動物數(shù)的應答數(shù)。平均標準誤差(SEM)用誤差條表示。圖11 :用固定量的 HA (5 μ gB/Shangdong/7/97)，(含有或不含有 O. 3mg GEMs)鼻內(圖表A)或肌肉內(圖B)免疫三次(間隔14天)的雌性小鼠的鼻內或陰道洗滌的HA特異性IgA效價。在最后的免疫后的兩周取洗滌樣品。平均標準誤差(SEM)用誤差條表示。圖12 :用 PBS (模擬)、不含 GEMs 的 I μ gHA (A/PuertoRico/8/34)或用 GEM 配制的O. 04 μ gHA (少25倍的抗原)免疫兩次的小鼠的肺病毒效價。在給予最后劑量的兩周后，將小鼠用鼠適應的A/PuertoRico/8/34激發(fā)。激發(fā)后五天，將動物處死，分離肺并均質化，并且通過在MDCK細胞上的最終效價測定病毒效價。平均標準誤差(SEM)用誤差條表示。圖13 :用單獨 HBsAg (i.n·)、+GEM (i. η·)或 VaxPro (i.m.)免疫三次的 C57BL6小鼠的血清中HBsAg抗原特異性IgG稀釋滴度。誤差條表示SEM。圖14 :用HBsAg+GEM (i. η·)或VaxPro (i.m.)免疫三次的C57BL6小鼠的鼻和陰道灌洗的HBsAg抗原特異性slgA效價。誤差條表示SEM。圖15 :作為用僅 HBsAg (i.n. )、+GEM (i.n.)或 VaxPro (i.m.)免疫三次的 Wistar大鼠的mIU/ml而測量的HBsAg抗原特異性血清應答。認為> 10mIU/ml的水平是保護性的。誤差條表不SEM。圖16 :激發(fā)后的存活時間(天)。所有的組的試驗材料是鼻內(i.n.)給予。用PBS(模擬免疫)、與GEM混合的肺炎球菌P3蛋白(PspA、CbpA、PdBD) (GEM+P3)或與GEM結合的P3蛋白(GEM-P3)免疫小鼠。兩種疫苗都包含5 μ g的每種抗原。每個符號代表I只動物。水平線表示均值。圖17 :用PBS (模擬免疫)、與P5蛋白混合的GEM (GEM+P5)或與P5蛋白結合的GEM (GEM-P5)免疫的小鼠在用病毒性肺炎鏈球菌(virul ent S. pneumonia)D39 (血清型2)鼻內激發(fā)40hrs后的健康狀態(tài)。疫苗包含O. 5yg IgAlprt>3 μ g PsaA>l. 5 μ g CbpA>2 μ gPpmA>2 μ g PspA和0. 3mg GEM。激發(fā)40h后的健康狀態(tài)是對于疫苗保護性(protectivity)的度量。實驗部分材料與方法從蛋中獲取的A/威斯康星(H3N2)株的流感單價亞單位疫苗和從蛋中獲取的A/北京(HlNl)裂解病毒疫苗用于該研究。利用單輻射免疫擴散試驗來確定疫苗中的血細胞凝集素(HA)的濃度。從多形漢森酵母(Hansenula polymorpha)分離的重組HBsAg (ad/ay)用于該研究。來自Sanofi Pasteur/MSD的HBVaxPro用作基準HBsAg疫苗(40 μ g/ml )。如以前所描述的生產 GEM 顆粒(Van Roosmalen et al. , Methods 2006，F(xiàn)eb; 38 (2) : 144-9)。I. I免疫和激發(fā)根據(jù)由荷蘭動物保護法案提供的方針評價和批準動物實驗。Balb/c、C57BL6小鼠(6-8周)和Wistar Unilever大鼠(10周)購自Harlan,荷蘭。CD I小鼠購自CharlesRiver，德國。每組小鼠5-10只動物。大鼠每組由4只動物組成。所有小鼠組在第O天用初始免疫接種免疫，病在第14天和第28天用5 μ g的HA強化免疫兩次，或在第O天以及在第10天和第20天用5 μ g的HBsAg兩次強化免疫。在吸入麻醉劑(異氟烷/O2)的情況下用通過兩個鼻孔各給予10 μ I疫苗而完成鼻內小鼠免疫。大鼠組在第O天用初始免疫接種免疫，并在第10天和第20天用25 μ g的HBsAg強化免疫兩次大鼠，以與小鼠的類似方式用30μ I的疫苗進行鼻內大鼠免疫。肌內小鼠組在吸入麻醉劑(異氟烷/O2)的情況下，在大腿后側肌肉注射50 μ I的疫苗。肌內大鼠組通過兩個后腿肌肉各注射200 μ I疫苗。在第二次強化免疫兩周后將小鼠和大鼠處死。在將動物處死后，獲取Balb/c小鼠的脾，并隨后在4° C存儲于含有5%FCS、1%青霉素/鏈霉素和50μΜβ-巰基乙醇的補充頂DM Glutamax培養(yǎng)基中。小鼠的口服給予進行3次，即在第O天、第14和第28天。簡言之，含有或不含有O. 3mg GEM顆粒的20 μ g亞單位疫苗以200 μ I的碳酸氫鈉溶液灌胃給予(3. 2%w/v)。利用不銹鋼給料針在沒有麻醉的情況下進行口服給予。在激發(fā)實驗中，用流感HA疫苗免疫的小鼠在最后一次強化免疫3周后用100嗤斑形成單位(PFU)的株A/Puerto Rico/8/34 (高劑量,每組9只動物)或66PFU的株A/PuertoRico/8/34 (低劑量，每組4只動物)鼻內激發(fā)(40 μ L)。在動物經O2/異氟烷的輕微麻醉下實施激發(fā)病毒的鼻內給予。接受低劑量的動物在激發(fā)4 (天)后處死，并分離出肺以用于利用體外基于細胞的試驗測定肺中的病毒載量。簡言之，MDCK細胞與病毒稀釋液一起在培養(yǎng)箱(37° C, 5% CO2)培養(yǎng)I小時并隨后用PBS洗滌一次。將包含胰酶(100 μ I培養(yǎng)基含有7.5 μ g/ml的TPCK胰酶)的新鮮培養(yǎng)基加入到孔中。細胞在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(37° C，5% CO2)后，之后將上清與50 μ I 1% (經洗滌的)豚鼠紅細胞一起轉移至圓底平板(Costar)?；旌衔镌谑覝嘏囵B(yǎng)2小時，并觀察血細胞凝集。仍然出示血細胞凝集的最高稀釋的倒數(shù)即為效價。追蹤觀察接受高劑量動物的臨床跡象直至激發(fā)后第14天并處死，除非動物由于不能承受痛苦(人道終止一天內體重減輕10%或多天內體重減輕15%,合并有倦怠、毛色毛躁并垂死)而被提前處死。對于肺炎球菌免疫⑶I小鼠，在第O天、第14天和第28天接受鼻內O. 01ml( IOyL)的劑量。肌內組在第O天、第14天和第28天接受在后肢的大腿肌內注射(左腿、右腿和左腿交替進行)的O. 04mL (40 μ L)的劑量。在最后一次強化免疫三周后，用I X IO6CFU的肺炎鏈球菌株TIGR4激發(fā)小鼠。在小鼠吸入麻醉劑(異氟烷)而處于輕微麻醉狀態(tài)時，以50 μ L的接種物經鼻內弓I入肺炎雙球菌。密集監(jiān)控感染后的小鼠，并基于健康狀態(tài)、體重和體溫的情況對它們進行評分。在激發(fā)40小時后測定血液中的細菌數(shù)，并將患病和需要被處死(人 道終止)的小鼠以及在它們的血液中含有超過5. 4Χ 103CFU/mL的小鼠處死。剩余的小鼠在它們患病或在研究結束時處死(激發(fā)14天后)。I. 2血清收集和粘膜的洗滌在實驗期間在每種疫苗給予之前抽取血樣三次，并且最后一次抽血在最后一次強化給予后的第14天的終點進行。將血液在1200x g離心5分鐘以獲得血清，并隨后將樣品儲存在-20° C，直至進一步的分析。通過用1ml PBS沖洗鼻咽而獲得鼻洗滌物(補充有蛋白酶抑制劑混合劑)。通過用100 μ I的PBS (補充有蛋白酶抑制劑混合劑)沖洗陰道而獲得陰道洗滌物。抽出IOOy I等分試樣并通過使用附有黃色的200 μ I的尖端的移液管再插入九次。將洗滌液轉移到干凈的小瓶中并于-20° C儲存。通過利用帶有硅酮尖端的I. 2_X38mm的柔性特氟隆(聚四氟乙烯樹脂)給料針經由胃后的切口插入十二指腸進行腸洗滌。在灌洗前，用結扎線閉合回腸之前的空腸。接著，將Iml注射器連接于進料針，并通過用Iml的PBS反復沖洗十二指腸/空腸來進行灌洗。在采集每個樣品之后，立即將灌洗液與10μ I的儲存液(補充有蛋白酶抑制劑混合劑)混合，并將灌洗液保存在冰上，直到進一步的制備。將灌洗樣品以11，OOOXg離心15分鐘，然后收集上清并于4° C儲存直到進一步的分析。I. 3ELISA利用ELISA測試來測定對HA抗原的抗體應答以測定血清IgG、IgGU IgG2a和IgG2b、粘膜分泌的slgA的稀釋滴度，或確定HA特異性IgG的量。對于稀釋滴度，以200ngHA/孔孵育平板。在用HA的孵育過夜后，用3%的牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich，荷蘭)封閉平板。然后，洗滌平板并與連續(xù)稀釋的血清和粘膜樣品一起在37° C孵育1.5h。接著，洗滌平板，并與直接抗鼠IgG、IgGU IgG2a、IgG2b和IgA的辣根過氧化物酶結合的山羊抗體(Southern Biotech, Birmingham, AL,美國)一起孵育。最后，加入底物溶液(在50mM的磷酸鹽緩沖液(pH 5. 6)中 0. 02% 的 I, 2-苯二胺-二鹽酸鹽(1，2-phenyllendiamin-dihydrochlorid)，含有0. 006%的H2O2),并在室溫在暗處孵育平板30分鐘。通過加入2M的H2SO4終止反應，并利用 Benchmark Microplate 酶標儀(BioRad, Hercules, CA)讀取在 490nm 處的吸光度。所報告的效價是在背景校正之后對應于A490 ^ 0. 2的計算的樣品稀釋度的倒數(shù)。
為了確定HA特異性血清IgG的量，用200ng/100l·! I/孔的HlNlA/北京以及用于校正曲線的抗-鼠IgG涂覆微量滴定平板(microtiter well plates)。在4° C的孵育過夜之后，用涂覆緩沖液(O. 5M碳酸鹽-碳酸氫鹽，pH 9. 6-9. 8)洗滌平板2次。用Protifar Plus(在涂覆緩沖液中，2. 5%)在4° C進行封閉45分鐘。在用涂覆緩沖液以及PBS/0. 05%Tween20洗滌平板四次后，將血清和用于校正曲線的(鼠IgGl)加入到孔中。將連續(xù)稀釋的血清和校正曲線(鼠IgGl)在4° C孵育I. 5小時。隨后，用PBS/TWeen20洗滌平板三次。將辣根過氧化物酶結合的免疫球蛋白(ITK, Southern Biotech)在PBS/Tween20中以1:5000稀釋，加入到孔中并在4° C孵育I小時。用PBS/TWeen20洗滌平板三次并用水洗滌一次后，利用底物溶液(O. 02%,在50mM磷酸鹽緩沖液pH 5. 6中的1，2-苯二胺-二鹽酸鹽，含有O. 006%的H2O2)將平板染色30分鐘。用2M H2SO4終止顯色反應。在493nm處進行測量。利用ELISA測試來測定對HBsAg抗原的血清抗體反應以確定IgG稀釋滴度。為此目的，將涂覆有在PBS中的ZygAil HBsAg的ELISA平板，以50 μ I/孔加入并在37° C孵育I小時。用洗滌緩沖液(PBS/0. l%tWeen20)洗滌平板6χ。用封閉緩沖液(PBS/1%BSA)以200 μ I/孔封閉平板，并在37° C孵育I小時。血清樣品在封閉緩沖液中連續(xù)稀釋并以50 μ I/孔加入，然后在37° C孵育I小時。用洗滌緩沖液洗滌平板6χ。結合于堿性磷 酸酶(Southern Biotech)的山羊抗大鼠IgG用作二抗(在封閉緩沖液中以1:3000稀釋)并以50μ I/孔加入，然后在37° C孵育I小時。用洗滌緩沖液(PBS/0. 1%吐溫20)洗滌平板6χ。底物緩沖液(IOmM 二乙醇胺/0. 5mM MgC12，pH9. 5)中的對硝基苯磷酸二鈉鹽(p-Nitrophenyl Phosphate Disodium Salt) (Calbiochem)用于檢測，并在 405nm 處完成測量。滴度表示為稀釋滴度，其被定義為示出免疫前標準OD兩倍的稀釋度。利用ELISA試驗來確定HBsAg-特異性粘膜分泌的slgA，以測定IgG稀釋滴度。為此目的，像之前一樣，涂覆、洗滌以及封閉ELISA平板。在緩沖液中連續(xù)稀釋粘膜灌洗液。以50 μ I/孔加入并在37° C孵育I小時。用洗滌緩沖液洗滌平板6χ。結合于辣根過氧化物酶(Nordic Immunology)的在封閉緩沖液中以1:1000稀釋的山羊抗大鼠IgA用作二抗并以50 μ I/孔加入，然后在37° C孵育I小時。用洗滌緩沖液(PBS/0. l%tWeen20)洗滌平板6x。將 TMB (3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺，sigma，Lot 055K8208)溶于 Iml DMSO 中，并加入9ml 0. 05M的磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液(pH 5. 0)用于檢測。在使用之前，向每IOml底物緩沖液溶液加入2 μ I 30%的過氧化氫。用2Μ H2SO4終止顯色反應，并在450nm下完成測量。滴度表示為稀釋滴度，定義為顯示三倍于背景OD (涂覆有與封閉緩沖液一起孵育的HBsAg)的稀釋度。I. 4血細胞凝集抑制(HI)測試如前文所描述的，測定血清的HI效價[35]。簡言之，將血清在56° C滅活30分鐘。為了減少非特異性HA血細胞凝集，向滅活的血清中加入25%的高嶺土混懸液。在1200x g離心后，將50 μ I上清平行兩份轉移到96孔圓底平板(Greiner，Alphen a/d Ri jn，荷蘭)中，并在PBS中連續(xù)稀釋兩倍。然后，將4血細胞凝集單位(HAU)的A/威斯康星(A/Wisconsin)流感滅活病毒的加入到每個孔中，并將平板在室溫孵育40分鐘。最后，將50μ1 1%的豚鼠紅細胞(RBC)加入到每個孔中，并在室溫孵育2h。將能夠防止血細胞凝集的最高稀釋度評價為HI效價。 I. 5利用Abbott AxSYM體系測定HBsAg-特異性Ig效價
通過AxSYM AUSUB測試在Abbott AxSYM系統(tǒng)上完成以mIU/ml表示的抗HBsAg抗體的定量測定。該測試是微粒EIA (microparticle EIA),利用在作為固相的顆粒上的重組HBsAg (ad/ay)以及結合于作為結合物的重組HBsAg的生物素。在下一步中，結合有堿性磷酸酶的抗生物素與抗原夾心(antigen sandwich)結合。將反應混合物轉移至微粒不可逆地結合的惰性玻璃纖維基質上。甲基傘形酮磷酸酯(methylumbelliferyl phosphate)用作底物，并用儀器讀取最終產物甲基傘形酮的熒光。1.6Elispot (酶聯(lián)免疫斑點測定)
如較早描述的進行Elispot 測試(Amorij JP et al. Vaccine 2007 Dec21;26(1) :67-76)。簡言之，將 96 孔微孔滴定板(Greiner，Alphen a/d Rijn，荷蘭)用抗鼠干擾素-Y (IFN-Y )和白細胞介素-4 (IL-4) (BD, Pharmingen, Erembodegem,比利時)在4° C孵育過夜。在用PBS/Tween (sigma-Aldrich，荷蘭)洗滌平板三次后，將它們在37° C封閉(PBS+4%BSA) I小時，向平板中加入以IX IO6/孔濃度的脾細胞，含有或不含有作為刺激多肽的亞單位疫苗。在37° C、5% CO2孵育過夜之后，將細胞用冷水裂解。接著，用PBS/Tween洗滌平板五次，并在PBS+2%BSA中用以O. 125 μ g/ml濃度的生物素化抗鼠IFN-Y和IL-4抗體(BD Pharmingen)孵育。在洗滌后，在37° C用鏈霉親和素堿性磷酸酶(Streptavidin alkaline phophatase) (BD Pharmingen)孵育平板 I 小時。最后，在用PBS/Tween洗滌三次并用PBS洗滌兩次后，利用由lmg/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(5_bromo-4-chloro-3-indoIyIphophate)>O. 92%w/v 的 2-氨基-2-甲基-I-丙醇、O. 08 μ 1/ml的TritonX-405、lM的MgCl2和6mg/ml的瓊脂糖組成的底物溶液顯影斑點。使用Elispot讀數(shù)器(A. EL. VIS Elispot讀數(shù)器)對斑點進行計數(shù)。I. 7統(tǒng)計分析使用學生-t檢驗或非參數(shù)ANOVA檢驗進行統(tǒng)計分析，以p〈0. 05作為最低顯著水平。除非另外指出，結果以均值土平均標準誤差(SEM)表示。實施例I鼻內HA疫苗中GEMs的佐劑效應在鼻內小鼠模型中通過向HA加入不同量的GEM顆粒(0、0. 03、O. I和O. 3mg干重)來評價對于鼻內HA (5 μ gHINIA/北京)的全身性血清抗體應答的增強。小鼠接受三次疫苗給藥，每次間隔兩周，并在最后一次強化免疫兩周后分析血清樣品。圖I示出了通過鼻內途徑給藥的不含佐劑的HA僅引起低水平的全身性IgG抗體(5. O μ g/ml)。少量GEM顆粒(O. 03mg)的加入已通過因子4使該水平增加。向大約每ml 67 μ g的HA特異性IgG加入
0.Img GEM顆粒獲得最佳的增強，通過加入更多的GEM顆粒不會使該增強得到進一步的增力口。這些結果明確顯示，與流感HA混合的GEM顆粒以劑量依賴的方式增強抗原特異性免疫應答。實施例2與肌內HA相比，與HA混合的鼻內GEM在鼻內HA+GEM疫苗與傳統(tǒng)方式HA疫苗(即不含佐劑的HA通過肌內途徑給予)之間進行比較。小鼠接受三次給藥的i.n. HA (5 μ gHINI A/北京)+GEM (0.15mg干重)或
1.m.HA (5 μ g)，并且給藥之間間隔兩周。用每次免疫兩周后取得的樣品測量HA特異性血清IgG效價，以比較鼻內和肌內疫苗的免疫應答的數(shù)量級以及動力學。圖2明確示出了數(shù)量級和動力學都類似于i. m. HA疫苗。在各自給予之后，i. η.和i. m.疫苗的應答之間沒有統(tǒng)計學顯著性差異(每個P值>0. 05 )。
實施例3與HA混合的鼻內GEM引起保護性應答流感疫苗的保護能力由測量的HI效價來確定。對于所有小鼠，在用i.n.HA(5μ gH3N2A/威斯康星)、HA+GEM (O. 3mg干重)、i. m. HA的第I次和第2次強化免疫后，測定HI效價。圖3示出了常規(guī)i. m.疫苗和含GEM佐劑的i. η.疫苗都在第I次強化免疫后達到可比得上的在2Ioge以上的HI效價(ρ=0. 2062)。這些效價在兩種情況下都增加到在兩種治療間沒有顯著性差異的2log7和2IogS之間的值(ρ=0. 7611)。用單獨的亞單位疫苗i. η.免疫誘導低HI效價，即使在兩次強化免疫后也是如此。此外，只有50%的動物在用i. η.亞單位疫苗免疫后發(fā)生應答，而在另兩種疫苗組中所有動物均發(fā)生應答。由于認為2log5. 3以上的HI效價在人類中是具有保護性的，因此這些結果表明，對于i. n. GEM為佐劑的流感疫苗而言單次強化就足以實現(xiàn)保護性免疫。該結果證明，與僅用亞單位疫苗i.n.和i.m.免疫相比，含有GEM顆粒的亞單位疫苗制劑誘導強烈的全身性免疫應答。實施例4與HA混合的鼻內GEM的粘膜免疫應答 據(jù)先前報道，i.n.免疫可誘導呼吸道(即流感病毒的入口)的局部粘膜免疫。粘膜免疫的激活以潛在的B細胞和T細胞為主，并在粘膜部位引起slgA的分泌。因此，在小鼠的鼻和肺灌洗液中測定流感特異性slgA效價(圖4)。i.m.免疫在鼻和肺灌洗液中引起的slgA水平在大部分小鼠中低于檢測限(只有八分之一的小鼠在鼻灌洗液中顯示應答)。同樣，僅用亞單位疫苗的i.n.免疫在肺和鼻灌洗液中產生低slgA效價(3/8應答)。相比之下，用HA+GEM的i. η.免疫在所有小鼠的鼻和肺灌洗液中均誘導高slgA效價?？傊?，用HA+GEM的i. η.免疫在上呼吸道和下呼吸道均可誘導強烈的粘膜免疫應答。實施例5與HA混合的鼻內GEM的免疫應答表型為了評價應答表型即T-helper 1/T-helper 2之比(Thl/Th2)，測定IgG亞型、IFN-Y 和 IL-4 應答。IgG亞型分布(圖5)顯示，僅用亞單位疫苗的i.n.免疫誘導低IgGl、IgG2a和IgG2b應答。如先前報道的[35，36]，用亞單位疫苗的i.m.免疫誘導高IgGl應答，但幾乎沒有I gG2a和I gG2b應答，這表明免疫應答朝向Th2應答偏移。與i. m.免疫相比，用HA+GEM的i. η.免疫誘導顯著更高的 IgG2a (p=0. 042)和 IgG2b (p=0. 030)和更低的 IgGl (p=0. 0135)應答。這些結果表明由i.n HA+GEM疫苗產生的抗體應答與常規(guī)i. m.疫苗相比，顯著更偏向于Thl表型。通過測定免疫小鼠的產生抗原特異性IFN- Y和IL-4的脾細胞來進一步評價免疫應答的類型(圖6)。用亞單位疫苗的i.m.免疫引起比IFN-Y產生細胞更多數(shù)量的產生IL-4的細胞，這再次表明Th2應答是占優(yōu)勢的。用亞單位疫苗的i.n.免疫產生更少數(shù)量的產生IL-4的細胞，但產生顯著更多的產生IFN-Y的細胞(圖6)，從而引起均衡的Thl/Th2應答。產生IFN-γT的細胞的增加在用HA+GEM i.n.免疫后甚至明顯是更顯著的(p=0. 0373)，這表明免疫應答從均衡Thl/Th2轉移到Thl占優(yōu)勢的應答。 實施例6與HA混合的鼻內GEM在致死激發(fā)模型中的保護在致死激發(fā)模型中評價用i. n. HA+GEM產生的免疫應答的保護能力。用PBS(假免
疫(mock immunization))或單獨用 HA (2 次)、HA+GEM (2 次)或用 HA+GEM (3 次)i. η.免疫小鼠。與肌內給予的HA基準疫苗一起進行比較。在該實驗中的HA來源于PR8株(H1N1)。在將GEM加入到疫苗中的情況下，劑量是每劑量5 μ gHA和每劑量O. 3mg GEM。以2周的間隔給予疫苗。在最后一次強化免疫3周后，用致死量的PR8進行致命激發(fā)。觀察了對于組HA+GEM (i.n. 2 次；9/9 存活)、HA+GEM (i.n. 3 次；9/9 存活)、以及 HA 基準對照(i. m. ；9/9存活)針對激發(fā)的保護[圖7]。(這些組內的所有動物在激發(fā)后均未顯示出臨床跡象(無倦怠、毛色毛躁或駝背姿勢)，并存活至第14天，直到實驗結束。保護與無體重減輕相關(未示出)。相對而言，在組HA i. η.和PBS (假免疫，陰性對照)中的大多數(shù)動物分別從第3天和第4天起顯示出嚴重的體重減輕，并且由于嚴重的臨床癥狀(重量< 85%、倦怠、毛色毛躁、駝背姿勢)在激發(fā)后的第5天至第8天后被安樂死。測定激發(fā)4天后的肺中的病毒效價證明，用HA+GEM的i. η.免疫(2或3次)與PBS陰性對照相比引起在激發(fā)4天后的肺中的病毒效價減少約1，000至10，000倍(圖8)。在單獨i. η.施加HA時，觀察到在激發(fā)后非常有限的病毒效價減少(減少4倍)，這證明了需要GEM的佐劑性質以提供保護。與基準陽性對照組(HA，i. m)相比，HA+GEM的免疫(2次和3 次)引起在肺中約20至100倍的病毒效價提高。病毒效價的減少能夠導致該病毒脫落減少，并且被認為是提供群體保護(herd protection)的重要因素。作為在實施例4和5中證明的呼吸道粘膜內層局部出現(xiàn)IgA和/或由i. n. HA+GEM疫苗產生的更好均衡的Thl/Th2類型免疫應答能夠解釋觀察到的與i.m.基準疫苗相比的保護優(yōu)勢。實施例7與GEM混合的口服HA引起保護性應答口服途徑給藥因為其方便性，對于疫苗是有吸引力的，但因為滅活或降低抗原而常常缺乏有效性。已知口服給予不含佐劑的HA不足以引起保護性血清HI應答和/或粘膜IgA應答。在小鼠模型中分析在口服免疫(orogastric immunization)中添加GEM至HA的效果。使用H3N2 A/廣島(H3N2 A/Hiroshima)亞單位抗原HA (20 μ g/劑量)。HA+GEM疫苗另外包含每劑量0. 3mg的GEM。將小鼠以兩周的間隔免疫三次，并分析最后一次免疫兩周后的樣品。測定血清HI效價以比較免疫的保護能力。如圖9所示，用HA+GEM疫苗的口服免疫誘導比不含GEM顆粒的口服免疫顯著更高(p〈0. 05)的HI效價。在口服HA+GEM組中，HI效價達到2log7以上,這顯著高于2log5. 3的保護性截止水平(cut-off level)。此外，口服HA+GEM能夠在胃腸道(圖10)中使粘膜IgA有相當水平的升高(圖10)。出人意料的是，在大部分動物中還引起呼吸道中的強力局部IgA應答。這些結果表明，與GEM混合的口服流感HA疫苗還引起保護性全身性免疫應答，并且此外引起有效的粘I吳應答，包括在呼吸道中。實施例8與GEM混合的肌內HA引起在粘膜表面的局部應答腸胃外疫苗通常不引起粘膜分泌的IgA的產生。在肌內免疫小鼠的粘膜樣品的分析中，我們出人意料地發(fā)現(xiàn)，接受HA+GEM的小鼠在幾個粘膜組織(如鼻、肺和陰道)處分泌局U IgA0將雌性小鼠用固定量的HA (5 μ gB/Shangdong/7/97)(含或不含0. 3mg GEMs)鼻內或肌內免疫三次(間隔14天)。在最后免疫一次兩周后，進行鼻和陰道洗滌并通過特異性ELISA測試測定IgA效價。圖11中的數(shù)據(jù)示出，HA+GEM的鼻內給予有效地誘導局部IgA應答，以鼻洗滌液中的IgA效價作為證明。IgA效價也被遠距離地誘導，以陰道洗滌液中顯現(xiàn)的IgA效價作為證明。如所預期的，單獨肌內給予HA不能誘導有關的局部IgA應答。出人意料的是，肌內給予HA+GEM在鼻和陰道中都誘導有關的IgA效價，而效能接近于在鼻內給予后所達到的。因此，HA+GEM的肌內給予能夠用于誘導粘膜免疫應答。實施例9與GEM混合的HA的肌肉內給予支持顯著的劑量節(jié)約為了確定肌內GEM+HA引起的免疫應答是否可用于流感HA抗原的劑量節(jié)約(dosesparing)，將小鼠用 PBS (假處理)、不含 GEMs 的 I μ gHA (A/PuertoRico/8/34)或用 GEM (每劑量O. 3mg)配制的O. 04 μ gHA (少25倍的抗原)免疫兩次。在給予最后劑量的兩周后，用小鼠適應的A/PuertoRico/8/34激發(fā)小鼠。激發(fā)五天后，將動物處死，分離肺并均質化，然后通過在MDCK細胞上的終點滴定測定病毒效價。 圖12，圖A示出了與假處理的動物相比，用I μ gHA肌內免疫動物提供多于一個log的受感染動物的肺中的病毒載量減少。然而，HA+GEM提供對抗受感染動物的肺中流感病毒的復制的完全保護，以肺效價的完全沒有為證明。這些結果證明，i.m.HA+GEM疫苗與基準i. m. HA相比的優(yōu)越性。在包含僅O. 04 μ g HA (少25倍的抗原)的HA+GEM制劑中達到與對于基準i.m.相同水平的保護，如圖12的圖表B所示的，表明可以通過配制含GEMs的肌內流感疫苗而實現(xiàn)顯著的抗原節(jié)約。實施例10 :鼻內基于GEM的乙型肝炎疫苗在小鼠中引起強烈的全身性IgG和局部IgA應答。用包含HBsAg抗原的基于GEM的乙型肝炎疫苗免疫成年C57BL6小鼠。在該情況下，將HBsAg[5 μ g]與GEM顆粒[O. 15mg干重]混合。還使用等量的不含GEM的HBsAg用于比較。疫苗通過鼻內途徑給予。用鋁(Alum)作為佐劑的商品化H印B疫苗VaxPro作為基準疫苗經皮下給予。在完全免疫(3次劑量，以10天間隔給予)后測量血清IgG。圖13明確示出了 GEM顆粒在鼻內疫苗中的佐劑效應。在鼻內給予單獨HBsAg時，沒有可測量的HBsAg特異性血清IgG應答。相比之下，HBsAg+GEM以4. 2的稀釋滴度引起劇烈的HBsAg特異性血清IgG應答。鼻內GEM-HBsAg疫苗引起與通過皮下途徑給予的基準疫苗類似的HBsAg特異性 IgG (p=0. 2290)。粘膜免疫的激活引起在粘膜部位分泌slgA。在該實驗中，在免疫部位(鼻)的洗滌液和遠距離粘膜部位(陰道)的洗滌液中測定HBsAg特異性slgA的局部分泌。圖14明確示出了僅使用i.n. HBsAg+GEM疫苗來產生slgA應答，而不是用i.m. VaxPro疫苗。
i.n. HBsAg+GEM疫苗甚至在遠距離粘膜部位(如陰道)也能產生slgA的分泌。實施例11 :大鼠模型中鼻內GEM-HBsAg乙型肝炎疫苗引起血清抗體的保護水平通過將HBsAg抗原(25 μ g)與GEMs (O. 4mg)混合來制備含佐劑的乙型肝炎疫苗。為了比較，制備單獨HBsAg抗原(25 μ g)和與Alum —起制備的包含相同抗原的基準疫苗(VaxPro)。完全免疫由以10天間隔的三次疫苗給予組成。在最后一次強化14天后收集最后的血清。鼻內給予GEM-HBsAg和HBsAg。通過肌內途徑給予VaxPro。對于乙型肝炎疫苗，已知相關的保護。認為血清高于10mIU/ml的抗體水平是保護性的，并常規(guī)作為對于保護的替代指標。分析完全免疫的大鼠(每組4只Wistar大鼠)的血清，用于以每ml毫國際單位(mIU/ml)表示的HBsAg特異性抗體水平。圖15概述了結果。鼻內HBsAg根本不引起應答。在HBsAg與肽聚糖微粒一起配制時，通過鼻內途徑獲得高且保護水平的抗體應答(mIU/ml彡10)。保護水平類似于通過肌內途徑給予的基準疫苗VaxPiO (p=0. 7715)。實施例10和11的結果一致證明，盡管抗原不積極結合GEM顆粒，但在鼻內基于GEM的乙型肝炎HBsAg疫苗中喚起強烈的全身性抗體和局部抗體應答。實施例12基于三價體肺炎球菌蛋白質的GEM疫苗的保護性在GEM或者與蛋白混合或結合至蛋白質而配制的鼻內基于肺炎球菌蛋白質的疫苗之間進行比較。三種保守的(conserved)肺炎球菌蛋白(PspA、CbpA> PdBD)用于三價疫苗、GEM+P3 (混合)和GEM-P3 (結合)。將小鼠用這些疫苗或作為陰性對照的PBS (假免 疫)以給藥之間間隔10天免疫三次。每種基于GEM的疫苗包含每劑量5 μ g的每種抗原和
0.3mgGEM。在最后一次的強化免疫三周之后，將小鼠用致死量的鼻內肺炎鏈球菌TIGR4(血清型4)激發(fā)。未保護的小鼠在激發(fā)后72h之內死亡。激發(fā)后，跟蹤觀察小鼠14天?；谌说赖慕K止(激發(fā)48h后每ml血液>5. 4X IO3菌落形成單位(cfu)、重量< 85%、倦怠、毛色毛糙、駝背)或在研究的終點，對小鼠實施安樂死。假免疫的小鼠均未存活。出人意料地發(fā)現(xiàn)用GEM+P3 (混合)疫苗免疫的組(50%)與用GEM-P3 (結合)疫苗免疫的組(20%)相比，顯示出更好的存活(參見圖16)。這些結果明確顯示，這些蛋白質與GEM顆?；旌蠒r，含有P3蛋白質的GEM疫苗是更有效的。實施例13五價的基于肺炎球菌蛋白的GEM疫苗的有效性在GEM或者與蛋白混合或結合至蛋白質而配制的鼻內基于肺炎球菌蛋白質的疫苗之間進行比較。五種保守的肺炎球菌蛋白(PspA、PsaA、CbpA、PpmA、IgAlprt)用于五價疫苗、GEM+P3 (混合)和GEM-P3 (結合)將小鼠用這些疫苗或作為陰性對照的PBS (假免疫)以給藥之間間隔10天免疫三次。每種基于GEM的疫苗包含每劑量O. 5μ g IgAlprt,3 μ gPsaA,
1.5 μ g CbpA、2 μ g PpmA、2 μ gPspA和O. 3mg GEM。在最后一次強化免疫三周之后,將小鼠用致死量的鼻內肺炎鏈球菌D39 (血清型2)激發(fā)。未保護的小鼠在激發(fā)后72h之內死亡?；谂R床癥狀(倦怠、毛色毛躁、駝背)獲得激發(fā)40h后的健康狀態(tài)，并將其作為終點以測量疫苗的保護能力。圖17顯示在用GEM-P5 (結合)疫苗免疫的組中，10只小鼠中的8只保持完全健康，而這對于GEM+P5 (混合)疫苗(5/10)(保持完全健康的)是較少的，且對于陰性對照(1/10)(保持完全健康的)是非常少的。這些結果明確顯示，這些蛋白質與GEM顆粒結合時，含有P5蛋白質的GEM疫苗是更有效的。
權利要求
1.一種含佐劑流感疫苗制劑，包含(i)獲自革蘭氏陽性細菌的肽聚糖微粒，和(ii)至少一種流感病毒抗原或其抗原制劑，其抗原或抗原制劑不是融合的或者是相反地共價連接于蛋白質的肽聚糖結合部分。
2.根據(jù)權利要求I所述的疫苗制劑，包含血細胞凝集素抗原(HA)、神經醇胺酶抗原(NA)或它們的組合。
3.根據(jù)權利要求I或2所述的疫苗制劑，包含來自至少兩種流感病毒株的流感抗原或其抗原制劑，至少一種病毒株與流行爆發(fā)有關或具有與流行爆發(fā)有關的可能性。
4.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的疫苗制劑，其中，所述疫苗制劑含有每種流感株I 至 15 μ g 的 HA。
5.一種含佐劑肺炎球菌疫苗制劑，包含(i)獲自革蘭氏陽性細菌的肽聚糖微粒，和(ii)至少一種肺炎球菌的抗原或其抗原制劑，其抗原或抗原制劑不是融合的或者是相反地共價連接于蛋白質的肽聚糖結合部分。
6.根據(jù)權利要求5所述的疫苗制劑，包含PspA、CbpA和/或PdBD。
7.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的疫苗制劑，其中，所述微粒獲自食品級的細菌，優(yōu)選乳酸細菌，更優(yōu)選乳酸乳球菌(L. lactis)。
8.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的疫苗制劑，包含每微克抗原O.Ol至O. I毫克的微粒(干重)。
9.一種鼻內給藥裝置，包括根據(jù)權利要求I至8中任一項所述的疫苗制劑。
10.根據(jù)權利要求9的給藥裝置，其為氣霧劑或滴劑遞送系統(tǒng)的形式。
11.獲自革蘭氏陽性細菌的肽聚糖微粒作為佐劑在制備流感疫苗制劑中的應用，所述制劑包含不是融合的或者是相反地共價連接于蛋白質的肽聚糖結合部分的流感病毒抗原。
12.根據(jù)權利要求11所述的應用，其為鼻內的、肌內的或口服疫苗制劑。
13.根據(jù)權利要求11或12所述的應用，其中，配制所述疫苗制劑用于人類高危人群。
14.根據(jù)權利要求13所述的應用，其中，配制所述疫苗用于老年人、可達2歲的兒童和/或長期患病的患者。
15.一種用于預防對象中流感感染或疾病的方法，所述方法包括向所述對象給予根據(jù)權利要求1-4所述的疫苗。
16.根據(jù)權利要求15所述的方法，其中疫苗遞送是鼻內或肌內遞送。
17.根據(jù)權利要求16所述的方法，其中，通過給藥裝置鼻內遞送疫苗，優(yōu)選其中所述給藥裝置是以氣霧劑或滴劑遞送系統(tǒng)的形式遞送。
全文摘要
本發(fā)明涉及含佐劑疫苗制劑，尤其是用于鼻內遞送的流感疫苗。提供了含佐劑流感疫苗制劑，包含(i)獲自革蘭氏陽性細菌的肽聚糖微粒，和(ii)至少一種流感病毒抗原或其抗原制劑，其抗原或抗原制劑不是融合的或者是相反地共價連接于蛋白質的肽聚糖結合部分。
文檔編號A61K39/09GK102648001SQ201080055048
公開日2012年8月22日 申請日期2010年10月1日 優(yōu)先權日2009年10月2日
發(fā)明者戈韋爾特·約翰·施奧藤, 科內利斯·約翰內斯·林豪特施 申請人:繆科西斯私人有限公司