專利名稱：抗革蘭氏陰性菌劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對(duì)革蘭氏陰性菌感染病的預(yù)防/治療有效的藥劑。更具體而言，涉及可以通過抑制存在于革蘭氏陰性菌的外膜中的^eT復(fù)合體的形成，對(duì)革蘭氏陰性菌發(fā)揮殺菌作用、增殖抑制作用和/或藥劑排出抑制作用的藥劑。
背景技術(shù)：
多藥耐性的綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)和鮑氏不動(dòng)桿菌 (Acinetobacter baumarmii)等革蘭氏陰性菌是醫(yī)院內(nèi)感染病的主要病原菌，有時(shí)對(duì)免疫力低下的患者引起嚴(yán)重的病態(tài)。由于這些細(xì)菌表現(xiàn)出多藥耐性，其感染病難以治療，并成為大的問題。革蘭氏陰性菌具備內(nèi)膜和外膜這2層膜，抗生素為了有效作用，必須通過革蘭氏陰性菌的復(fù)雜的膜結(jié)構(gòu)到達(dá)細(xì)胞內(nèi)部。然而，考慮由于藥劑修飾酶、外膜的通透性低下、靶的變化、藥劑排出泵對(duì)藥劑的排出，抗生素的效果低下，獲得多藥耐性。
多藥排出泵對(duì)綠膿桿菌獲得多藥耐性具有重大貢獻(xiàn)。該泵利用能量將進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部的藥劑主動(dòng)運(yùn)輸、排出到細(xì)胞外。多藥排出泵分為幾個(gè)家族，其中，已知排出多種抗生素的RND (耐藥結(jié)節(jié)分化)家族的泵由3種亞基組成。綠膿桿菌中存在多數(shù)的RND型泵，其中主要的泵是MexAB-OprM泵。
本發(fā)明人著眼于綠膿桿菌的MexAB-OprM泵，開發(fā)出通過改變構(gòu)成該多藥排出泵的亞基OprM的氨基酸序列而抑制綠膿桿菌的藥劑排出泵功能并增強(qiáng)抗生素藥效的方法， 并提出了發(fā)揮所述效果的藥劑和篩選所述藥劑的方法(專利文獻(xiàn)1)。然而，靶序列中一旦發(fā)生突變，則所述方法可能失效。
另一方面，對(duì)包括綠膿桿菌和大腸桿菌等的革蘭氏陰性菌的研究正在進(jìn)展中，已知^eT復(fù)合體是β -桶狀蛋白(形成外膜的孔的蛋白質(zhì))生物合成所必需的(非專利文獻(xiàn) 1)，并且也闡明了所述^eT復(fù)合體的立體結(jié)構(gòu)(非專利文獻(xiàn)2)。^eT通過與YfgL、YfiO, NlpB和SmpA的4個(gè)蛋白質(zhì)形成復(fù)合體而負(fù)責(zé)外膜蛋白質(zhì)(OMP)的生物合成。換言之，認(rèn)為如果抑制^eT復(fù)合體的形成，則可以阻止包括藥劑排出泵的OMP向外膜的運(yùn)輸。
現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1 國際公開第W02007/091395號(hào)小冊(cè)子。
非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn) 1 :Seokhee Kim 等，Science，第 317 卷，第 961-964 頁(2007) 非專利文獻(xiàn) 2 :Rajeev Misra, ACS Chemical Biology，第 2 卷，第 649-651 頁(2007)。發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的課題考慮到上述情況，本發(fā)明提供了通過抑制革蘭氏陰性菌的外膜中的^eT復(fù)合體的形成，阻斷對(duì)細(xì)菌生存必需的外膜蛋白質(zhì)(OMP)的運(yùn)輸?shù)姆椒?，及用于該方法的藥劑，其目的是從根本上解決革蘭氏陰性菌的多藥耐性的問題。
解決課題的手段因此，本發(fā)明提供了抗革蘭氏陰性菌劑，其特征是通過抑制^eT復(fù)合體的形成，對(duì)革蘭氏陰性菌發(fā)揮殺菌作用、增殖抑制作用和/或藥劑排出抑制作用。
發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明，由于在存在和/或不存在傳統(tǒng)的抗生素的情況下抑制革蘭氏陰性菌的 YaeT復(fù)合體形成并由此對(duì)革蘭氏陰性菌發(fā)揮殺菌作用、增殖抑制作用和/或藥劑排出抑制作用，因此從根本上解決了外膜蛋白質(zhì)突變引起的多藥耐性的問題。


圖1 說明革蘭氏陰性菌的外膜和內(nèi)膜以及^eT復(fù)合體與外膜蛋白質(zhì)之間的關(guān)系的模式圖(引用自非專利文獻(xiàn)1)。
圖2 比較各種革蘭氏陰性菌的YfgL與^eT的結(jié)合部位的氨基酸序列的圖。
圖3 比較各種革蘭氏陰性菌的YfiO的保守區(qū)域的氨基酸序列的圖。
圖4 顯示LTLR和LTLR-NH2對(duì)PAOl株的殺菌作用的濃度依賴性的圖。
圖5 在存在及不存在LTLR-NH2 (5 mM)的情況下，nalB株對(duì)OFLX的易感性變化的圖。
圖6 在存在及不存在LTLR-NH2 (5 mM)的情況下，nalB株對(duì)AZT的易感性變化的圖。
圖7 在存在及不存在FIRL-NH2 (1. 5 mM)的情況下，nalB株對(duì)OFLX的易感性變化的圖。
圖8 顯示在角膜潰瘍模型(實(shí)施例7)中細(xì)菌數(shù)變化的圖。
圖9 顯示在角膜潰瘍模型(實(shí)施例7)中12小時(shí)后角膜外觀的照片。
圖10 顯示在角膜潰瘍模型(實(shí)施例7)中M小時(shí)后角膜外觀的照片。
圖11 顯示在角膜潰瘍模型(實(shí)施例7)中臨床分?jǐn)?shù)變化的圖。
圖12 顯示在肺炎模型(實(shí)施例8)中細(xì)菌數(shù)變化的圖。
圖13 顯示在肺炎模型(實(shí)施例8)中細(xì)菌數(shù)變化的圖。具體實(shí)施方案
如上所述，本發(fā)明的抗革蘭氏陰性菌劑的特征是通過抑制^eT復(fù)合體的形成，發(fā)揮對(duì)革蘭氏陰性菌的殺菌作用、增殖抑制作用和/或藥劑排出抑制作用。
本發(fā)明中的術(shù)語“革蘭氏陰性菌”以一般所使用的含義應(yīng)用。即，是在革蘭氏染色中龍膽紫染色為脫色的細(xì)菌的總稱。代表性的革蘭氏陰性菌包括大腸桿菌(Escherichia coli)、沙門氏菌屬(salmonella)、假單胞菌屬(pseudomonas)、螺桿菌屬(Helicobacter) 等變形菌(proteobacteria)和藍(lán)細(xì)菌(cyanobacteria)。與醫(yī)學(xué)相關(guān)分類時(shí)，桿菌可列舉引起呼吸系統(tǒng)損傷的綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、流感嗜血桿菌(hemophilus influenzae)等，引起泌尿系統(tǒng)障礙的大腸桿菌、奇異變形菌(Proteus mirabilis)等，引起消化系統(tǒng)障礙的幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)、格特納桿菌(Bacillus Gaertner) 等，球菌可列舉腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)、粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)>i#^^7^|if (Neisseria gonorrhoea)等。
革蘭氏陰性菌中的^eT復(fù)合體是在膜蛋白^eT中裝配YfgL、Yfi0、NlpB和SmpA的4個(gè)蛋白質(zhì)構(gòu)成的。其中，YaeT復(fù)合體為了進(jìn)行OMP生物合成，必須與YfgI^P YfiO結(jié)合，通過抑制它們與^eT的結(jié)合而不能生物合成0ΜΡ。
因此，本發(fā)明的第一種方案是以抑制^eT與YfgL的結(jié)合為特征的抗革蘭氏陰性菌劑。
在研究該方案的藥劑中，本發(fā)明人比較了各種革蘭氏陰性菌的YfgL與^eT的結(jié)合部位的氨基酸序列(參考圖2)，研究了高度保守的區(qū)域。在圖2中，用框圍住的區(qū)域表示高度保守的氨基酸殘基，其中，以“A”顯示的區(qū)域的氨基酸序列為基礎(chǔ)，合成了各種肽分子， 確認(rèn)其作用。
其結(jié)果是，在使用包含氨基酸序列“LTLR”的肽分子的情況下，發(fā)現(xiàn)其可以與^eT 和YfgL的結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)，有效抑制它們的結(jié)合。因而，本發(fā)明的抗革蘭氏陰性菌劑優(yōu)選是包含至少由LTLR組成的氨基酸序列的肽。
其次，本發(fā)明的第二種方案著眼于抑制^eT和YfiO的結(jié)合。圖3比較了各種革蘭氏陰性菌的YfiO的氨基酸序列。在高度保守的區(qū)域中，發(fā)現(xiàn)具有氨基酸序列“FIRLHP” 的肽分子與^eT和YfiO的結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)，可以有效抑制它們的結(jié)合。確認(rèn)的是，所述肽分子即使不全部含有氨基酸序列“FIRLHP”也是有效的，只要含有其一部分氨基酸序列“FIRL”或 “IRLH”。因而，本發(fā)明的抗革蘭氏陰性菌劑優(yōu)選是包含至少由FIRL或IRLH組成的氨基酸序列的肽，特別優(yōu)選是包含至少由FIRLHP組成的氨基酸序列的肽。
此外，上述肽分子也可以進(jìn)行化學(xué)修飾。例如，C末端酰胺化的肽分子比未修飾的肽分子的殺菌作用顯著升高。本發(fā)明人認(rèn)為可能是由于酰胺基消除了 C末端的負(fù)電荷，從而提高了膜通透性的結(jié)果。
然而，相反的是，N末端乙酰化的上述肽分子的殺菌作用下降。
因而，本發(fā)明的抗革蘭氏陰性菌劑優(yōu)選是C末端酰胺化的上述肽分子。
作為本發(fā)明的靶的^eT與YfgL和YfiO的相互作用部位存在于細(xì)菌外膜和內(nèi)膜之間的周質(zhì)中(參見圖1)。因而，為了使本發(fā)明的藥劑(肽分子)從外部到達(dá)作用部位，必須通過夕卜膜。
特別是在未修飾的情況下，為了在實(shí)用濃度下發(fā)揮有效性，優(yōu)選同時(shí)施用提高外膜通透性的藥劑。
具有提高外膜通透性作用的藥劑沒有特殊的限定，可列舉具有細(xì)胞膜變性作用的抗生素。具體而言是多粘菌素B、粘菌素等。
另一方面，在C末端酰胺化的肽分子的情況下，由于如上所述C末端的負(fù)電荷消失，考慮其自身就可以通過外膜。實(shí)際上，已確認(rèn)在同時(shí)施用不是多粘菌素B的不具有膜變性作用的抗生素噻肟單酰胺菌素(β內(nèi)酰胺劑)的情況下，細(xì)菌的存活率也下降。
S卩，在使用本發(fā)明的酰胺化肽分子的情況下，即使不同時(shí)施用具有膜變性作用的抗生素，也認(rèn)為所述肽分子通過外膜到達(dá)^eT復(fù)合體形成部位，抑制外膜蛋白質(zhì)的生物合成。因而，例如，在同時(shí)施用不具有膜變性作用的抗生素的情況下，認(rèn)為通過本發(fā)明的酰胺化肽分子的作用使膜脆弱化，導(dǎo)致對(duì)抗生素易感，產(chǎn)生殺菌效果。
因而，本發(fā)明的第三種方案是治療革蘭氏陰性菌感染病的藥劑，其特征是含有本發(fā)明的抗革蘭氏陰性菌劑(修飾/未修飾的)和抗生素(不論有無膜變性作用)。
對(duì)于不具有膜變性作用的抗生素沒有特殊的限制，可以使用傳統(tǒng)上普通使用的抗生素。可列舉例如頭孢菌素類抗生素的頭孢氨芐、頭孢噻肟等，氟喹諾酮類抗生素的氧氟沙星、環(huán)丙沙星等，氨基糖苷類抗生素的阿米卡星等，碳青霉烯類抗生素的美羅培南等。實(shí)施例
列舉以下具體實(shí)例進(jìn)一步詳細(xì)地說明本發(fā)明，但本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。
在以下所示的實(shí)施例中，革蘭氏陰性菌(綠膿桿菌或大腸桿菌)的活菌數(shù)測(cè)定方法如下。
將37°C下培養(yǎng)過夜的細(xì)菌的一部分添加到新鮮的MH培養(yǎng)基中，在相同的溫度下繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)菌濁度(在600 nm下的吸光度)達(dá)到0. 7-0. 8時(shí)，將其菌液添加到MH培養(yǎng)基中，配制成100-200倍稀釋的菌液，供實(shí)驗(yàn)用。
加入菌液60-80 μ L和肽等溶液制成最終100 μ L的溶液，將該溶液在37°C下一邊攪拌一邊培養(yǎng)一定時(shí)間(3小時(shí))。培養(yǎng)后，用PBS溶液稀釋菌液，將所述稀釋液接種到MH瓊脂平板上，37°C培養(yǎng)過夜。第二天，計(jì)數(shù)平板上生長(zhǎng)的菌落數(shù)，求得活菌數(shù)。
實(shí)施例1在上述實(shí)驗(yàn)體系中，加入多粘菌素B (最終濃度為0.4μ g /mL)(該濃度不影響綠膿桿菌的存活)，培養(yǎng)綠膿桿菌(PA01株)。此時(shí)，在進(jìn)一步添加各種濃度的肽LTLR (具有亮氨酸-蘇氨酸-亮氨酸-精氨酸序列的、由4個(gè)氨基酸殘基組成的肽)的條件下培養(yǎng)。在各個(gè)條件下，測(cè)量綠膿桿菌的活菌數(shù)，與未添加肽時(shí)的活菌數(shù)相比，測(cè)量添加肽使活菌數(shù)有何種改變。結(jié)果如圖4(A)的線圖所示。
在存在0. 4 μ g /mL多粘菌素B的情況下，綠膿桿菌的存活率依賴于肽LTLR的濃度減少，在添加2.5 mM LTLR進(jìn)行培養(yǎng)的情況下，綠膿桿菌的存活率幾乎變?yōu)?%。
比較例1將實(shí)施例1中的肽LTLR的第4個(gè)氨基酸(R)替換為谷氨酸(E)，合成肽LTLE，在與實(shí)施例1相同的條件下，測(cè)量添加2. 5 mM LTLE的活菌數(shù)的變化。結(jié)果沒有觀察到綠膿桿菌存活率減少。因而，提示實(shí)施例1中觀察到的抗菌作用是氨基酸序列(LTLR)特異性的。
比較例2使實(shí)施例1中的肽LTLR的氨基酸序列隨機(jī)化，合成肽LRTL，在與實(shí)施例1相同的條件下，測(cè)量添加2. 5 mM LRTL的活菌數(shù)的變化。結(jié)果沒有觀察到綠膿桿菌存活率減少。因而， 提示實(shí)施例1中觀察到的抗菌作用是氨基酸序列(LTLR)特異性的。
實(shí)施例2使用臨床分離株(綠膿桿菌M、42、83、88和92)、nalB株(高表達(dá)藥劑排出泵 MexAB-OprM的高度多藥耐性株)和nfxC株(高表達(dá)藥劑排出泵MexEF-OprN的高度多藥耐性株)代替實(shí)施例1中使用的PAOl株(標(biāo)準(zhǔn)株)綠膿桿菌，測(cè)量LTLR對(duì)它們的作用。在該實(shí)驗(yàn)中，研究多粘菌素B的最終濃度為0. 2 μ g /mL、添加3 mM LTLR下的存活率的改變。其結(jié)果如下表1所示。
表1
權(quán)利要求
1.抗革蘭氏陰性菌劑，其特征是通過抑制^eT復(fù)合體的形成，對(duì)革蘭氏陰性菌發(fā)揮殺菌作用、增殖抑制作用和/或藥劑排出抑制作用。
2.權(quán)利要求1記載的抗革蘭氏陰性菌劑，其特征是抑制^eT和TfgL的結(jié)合。
3.權(quán)利要求2記載的抗革蘭氏陰性菌劑，其為包含至少由LTLR組成的氨基酸序列的肽分子。
4.權(quán)利要求1記載的抗革蘭氏陰性菌劑，其特征是抑制^eT和YfiO的結(jié)合。
5.權(quán)利要求4記載的抗革蘭氏陰性菌劑，其為包含至少由FIRL或IRLH組成的氨基酸序列的肽分子。
6.權(quán)利要求5記載的抗革蘭氏陰性菌劑，其為包含至少由FIRLHP組成的氨基酸序列的肽分子。
7.權(quán)利要求3、5或6記載的抗革蘭氏陰性菌劑，其特征是所述肽分子的C末端被酰胺化。
8.治療革蘭氏陰性菌感染病的藥劑，其特征是含有權(quán)利要求1-7的任一項(xiàng)記載的抗革蘭氏陰性菌劑和抗生素。
全文摘要
本發(fā)明提供了通過抑制革蘭氏陰性菌的外膜中的YaeT復(fù)合體的形成，阻斷對(duì)細(xì)菌生存必需的外膜蛋白質(zhì)(OMP)的生物合成的方法，及用于該方法的藥劑，其目的是從根本上解決革蘭氏陰性菌的多藥耐性的問題。本發(fā)明提供了抗革蘭氏陰性菌劑，其特征是通過抑制YaeT復(fù)合體的形成，對(duì)革蘭氏陰性菌發(fā)揮殺菌作用、增殖抑制作用和/或藥劑排出抑制作用。該抗革蘭氏陰性菌劑優(yōu)選是包含至少由LTLR組成的氨基酸序列的肽分子、或包含至少由FIRL組成的氨基酸序列的肽分子。
文檔編號(hào)A61K45/06GK102481369SQ20108002646
公開日2012年5月30日 申請(qǐng)日期2010年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月16日
發(fā)明者光永滋樹, 豬子英俊, 良原榮策 申請(qǐng)人:東海大學(xué)