專利名稱：革蘭氏陰性菌滅活疫苗、其制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種能誘導(dǎo)細菌產(chǎn)生毒素的抗生素，尤其涉及氨芐青霉素鈉在誘導(dǎo)革蘭氏陰性菌產(chǎn)生類志賀變異體二型毒素中的應(yīng)用，還涉及由此制備得到的滅活疫苗及其制備方法，更涉及一種仔豬水腫病滅活疫苗的制備方法，本發(fā)明屬于畜牧獸醫(yī)技術(shù)領(lǐng)域領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
常規(guī)疫苗在生產(chǎn)過程中其抗原的主要來源為菌體抗原，因此菌體用量大且副反應(yīng)發(fā)生率高，但免疫保護率不高。研究發(fā)現(xiàn)，疫苗中含有一定的類毒素抗原，能夠與菌體抗原協(xié)同作用能較好地提高疫苗免疫效果。類志賀變異體二型毒素是革蘭氏陰性菌培養(yǎng)中產(chǎn)生一種外毒素，主要存在于培養(yǎng)基中和細胞外膜內(nèi)，是一種蛋白毒素，是該細菌的主要毒力因子之一，戊二醛能將其完全脫毒，變成類毒素，因而具有較好的免疫原性。氨芐青霉素鈉別名氨芐西林鈉；氨芐青霉素；安比西林鈉；氨芐青。為廣譜半合成青霉素，本發(fā)明通過實驗證明該抗生素具有刺激細菌產(chǎn)生毒素的作用。戊二醛，帶有刺激性氣味的無色透明油狀液體，溶于熱水。對細菌有較好的殺滅作用，對該毒素均有較好脫毒作用，將毒素變?yōu)轭惗舅乇景l(fā)明屬于畜牧獸醫(yī)技術(shù)領(lǐng)域。臨床選取具有產(chǎn)毒素基因的標準菌株，培養(yǎng)中培養(yǎng)基中加適量氨芐青霉素，使其大量產(chǎn)生水腫毒素，經(jīng)戊二醛溶液滅活脫毒制備疫苗，疫苗較常規(guī)疫苗除菌體抗原外，還含有一定的類毒素抗原。疫苗分別免疫免疫小鼠和仔豬，評價其免疫原性及安全性。試驗表明，該疫苗可有效預(yù)防豬水腫病的發(fā)生，安全性和免疫原性可靠，免疫保護率達80%以上。高疫苗安全性和免疫效力如何？迄今為止，尚沒有任何文獻對此進行披露。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過實驗證明氨芐青霉素鈉具有刺激細菌產(chǎn)生毒素的作用，尤其是能夠誘導(dǎo)革蘭氏陰性菌產(chǎn)生類志賀變異體二型毒素，因此本發(fā)明的目的之一是提供氨芐青霉素鈉在誘導(dǎo)革蘭氏陰性菌產(chǎn)生類志賀變異體二型毒素中的應(yīng)用，在本發(fā)明的一個具體實施例中，所述革蘭氏陰性菌為致仔豬水腫病大腸桿菌。本發(fā)明還進一步提供了氨芐青霉素鈉在制備革蘭氏陰性菌滅活疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的之二是提供一種革蘭氏陰性菌滅活疫苗的制備方法，本發(fā)明的一種革蘭氏陰性菌滅活疫苗的制備方法，其特征在于將單株或多株革蘭氏陰性菌分別接種于含氨芐青霉素鈉的營養(yǎng)肉湯中，培養(yǎng)，經(jīng)純粹檢查合格后作為制苗用菌液，菌液經(jīng)滅活后制備成單價或多價滅活疫苗，優(yōu)選的，所述培養(yǎng)基中含有的氨芐青霉素鈉的濃度為5μ g/ml。本發(fā)明所述的方法，其特征在于具體的，包括以下步驟(1) 一級菌種繁殖將單株或多株凍干革蘭氏陰性菌菌種分別接種營養(yǎng)肉湯，36 37°C培養(yǎng)16-20小時后，用劃線分別接種于麥康凱瓊脂平板，置36 37°C培養(yǎng)16 20小時，在低倍鏡下，分別選取菌落5-10個混合接種于營養(yǎng)肉湯，然后分別接種于營養(yǎng)瓊脂斜面，置36 37°C培養(yǎng)16 20小時，用營養(yǎng)肉湯分別洗下菌種加10% (w/w)甘油，_20°C保存，使用期不超過6個月或斜面培養(yǎng)物置2 8°C保存，不超過1個月，純粹檢驗合格，作為一級種子；(2) 二級菌種繁殖取一級種子分別接種于營養(yǎng)肉湯，置36 37°C震蕩培養(yǎng)16 20小時，取樣作純粹檢查，純粹檢查合格后，置2 8 °C保存；(3)菌液培養(yǎng)用玻瓶或生物發(fā)酵罐通氣培養(yǎng)，將二級菌種分別接種于含5 μ g/ml氨芐青霉素鈉的營養(yǎng)肉湯，37°C培養(yǎng)16 18h，經(jīng)純粹檢查合格后作為制苗用菌液；(4)菌液滅活得到的菌液以總量0. 4% (w/w)加入戊二醛溶液，經(jīng)37°C滅活48小時；所述的菌液為一種革蘭氏陰性菌菌液或多種革蘭氏陰性菌菌液的混合物，按活菌計數(shù)，將各菌株菌液按111比例混合；(5)疫苗的制備在檢驗合格的滅活菌液中加入終濃度為20% (w/w)的氫氧化鋁凝膠和0. 005%(w/w)的硫柳汞防腐，制備濃縮滅活疫苗，按滅活前活菌數(shù)計算，制備濃縮滅活疫苗含單株菌數(shù)均不低于100 Xl 08CFU/ml。在本發(fā)明的一個具體實施例中，所述的革蘭氏陰性菌為致仔豬水腫病大腸桿菌。本發(fā)明的目的之三是提供由以上任一所述的方法制備得到的革蘭氏陰性菌滅活疫苗。在本發(fā)明的一個具體實施例中，所述的疫苗為仔豬水腫病滅活疫苗，更優(yōu)選的所述的疫苗為仔豬水腫病多價滅活疫苗。本發(fā)明的目的之四是提供所述的滅活疫苗在制備治療由感染革蘭氏陰性菌引起的疾病藥物中的應(yīng)用。及所述的滅活疫苗在制備治療豬水腫病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種能夠有效提高細菌發(fā)酵培養(yǎng)時，產(chǎn)生大量水腫毒素的抗生素，該抗生素為氨芐青霉素鈉；本發(fā)明通過將氨芐青霉素鈉應(yīng)用于細菌發(fā)酵培養(yǎng)中，提高了細菌產(chǎn)毒素量，增加疫苗含類毒素含量，優(yōu)選的該抗生素最小抑菌濃度為5 μ g/ml。本發(fā)明通過試驗發(fā)現(xiàn)，氨芐青霉素添加到培養(yǎng)基中，培養(yǎng)致豬水腫病大腸桿菌時能顯著提高水腫毒素的量，水腫毒素為該病原的主要致病因子之一，該毒素脫毒后成為類毒素，具有免疫原性；現(xiàn)銷售的疫苗多為全菌滅活疫苗，免疫原性不盡理想，疫苗添加抗類毒素成分能顯著提高一秒的免疫效力。同時對疫苗的安全性不受影響。為了達到更好的免疫保護效果，將抗生素加入到培養(yǎng)基中至每毫升疫苗中含有氨芐青霉素那5 μ g/ml ；該毒素用戊二醛脫毒徹底，優(yōu)選戊二醛最小滅活濃度為0. 4% (w/w)。本發(fā)明以小鼠和仔豬為實驗?zāi)Ｐ?，觀察此生產(chǎn)工藝制備的疫苗對小鼠和仔豬安全性和免疫效力，并確定氨芐青霉素鈉在培養(yǎng)集中在最佳添加量，以及滅活劑戊二醛的最佳滅活脫毒條件。本發(fā)明中所述的疫苗優(yōu)選具有產(chǎn)毒素基因的標準大腸桿菌，更優(yōu)選為仔豬水腫病多價滅活疫苗。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。實施例1仔豬水腫病多價滅活疫苗制備一、試驗材料1.生產(chǎn)菌種豬大腸桿菌C83684、C83905、C83903株，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。2.培養(yǎng)基營養(yǎng)瓊脂平板和營養(yǎng)肉湯按《獸藥典》附錄方法制備。3.麥康凱瓊脂購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；硫柳汞鈉鹽購自中國第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物研究室；氨芐青霉素鈉購自哈藥集團制藥總廠。4.氫氧化鋁凝膠可按常規(guī)方法制備或從市面上購買得到，本實施例中氫氧化鋁凝膠由哈藥集團生物疫苗有限公司自制。具體的，可按照以下方法制備得到取5000g的明礬加入到30000ml的蒸餾水中，煮沸，充分攪動使其完全溶解，靜置沉淀過夜，吸取上清液轉(zhuǎn)入另一容器內(nèi)，將上清液加熱至80°C，緩慢攪拌，邊攪拌邊加入氨水約2000ml，直至充分反應(yīng)成粘稠的氫氧化鋁膠凝膠后，將凝膠轉(zhuǎn)入到帆布袋中，過濾去除水分后，再加入生理鹽水至帆布袋容積的3/4處，使其充分混勻，如此反復(fù)洗滌6次，收獲氫氧化鋁膠凝膠。按中華人民共和國獸藥典三部2010版附錄34頁進行檢驗合格后，置2-6°C保存?zhèn)溆?。二、制備方?1) 一級菌種繁殖將凍干菌種接種營養(yǎng)肉湯，37°C培養(yǎng)18小時后，用劃線接種于麥康凱瓊脂平板，置37°C培養(yǎng)18小時，在低倍鏡下，選取菌落5-10個混合接種于營養(yǎng)肉湯，然后接種于營養(yǎng)瓊脂斜面，置37°C培養(yǎng)18小時，用營養(yǎng)肉湯洗下加10% (w/w)甘油，-20°C保存，使用期不超過6個月或斜面培養(yǎng)物置4°C保存，不超過1個月，純粹檢驗合格，作為一級種子。在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上每月繼代1次，不超過5代。(2) 二級菌種繁殖取一級種子接種于營養(yǎng)肉湯，置37°C震蕩培養(yǎng)18小時，取樣作純粹檢查，應(yīng)純粹，置4°C保存，使用期不超過3日。(3)菌液培養(yǎng)用玻瓶(或生物發(fā)酵罐)通氣培養(yǎng)，將二級菌種接種于含5 μ g/ml氨芐青霉素鈉的營養(yǎng)肉湯，37°C培養(yǎng)18h，經(jīng)純粹檢查合格后作為制苗用菌液。豬大腸桿菌C83684、C83905、C83903株分別按照步驟(1)-(3)進行菌液的制備。(4)菌液滅活
取檢驗合格的豬大腸桿菌培養(yǎng)物活菌計數(shù)，將各菌株菌液按1 1 1比例混合后，以總量0.4% (w/w)加入戊二醛溶液，經(jīng)37°C滅活48小時，其間每間隔2h攪拌1次，然后取滅活菌液接種營養(yǎng)瓊脂平板，每個樣品接種3個平板，每個平板接種0. anl，置37°C培養(yǎng)48小時，檢查有無細菌生長。(5)疫苗的制備在檢驗合格的滅活菌液中加入終濃度為的20% (w/w)氫氧化鋁凝膠和0. 005%(w/w)的硫柳汞防腐，制備濃縮滅活疫苗含單株菌數(shù)均不低于100X 108CFU/ml (按滅活前活菌數(shù)計算)。三、疫苗對小鼠安全性的觀察選取16-18g清潔級小鼠30只(由哈藥集團生物疫苗有限公司實驗動物中心提供。)，隨機分成3組，10只/組，實驗分組情況見表1所示；常規(guī)疫苗組和注射本發(fā)明制備得到的疫苗組(簡稱本發(fā)明疫苗組)皮下注射疫苗0. 2ml/只；同時設(shè)立生理鹽水對照組，0. 2ml/只。觀察7d，記錄注苗反應(yīng)和臨床表現(xiàn)，結(jié)果見表2表1實驗分組情況
權(quán)利要求
1.氨芐青霉素鈉在誘導(dǎo)革蘭氏陰性菌產(chǎn)生類志賀變異體二型毒素中的應(yīng)用，優(yōu)選的所述革蘭氏陰性菌為致仔豬水腫病大腸桿菌。
2.氨芐青霉素鈉在制備革蘭氏陰性菌滅活疫苗中的應(yīng)用。
3.一種革蘭氏陰性菌滅活疫苗的制備方法，其特征在于將單株或多株革蘭氏陰性菌分別接種于含氨芐青霉素鈉的營養(yǎng)肉湯中，培養(yǎng)，經(jīng)純粹檢查合格后作為制苗用菌液，菌液經(jīng)滅活后制備成單價或多價滅活疫苗，優(yōu)選的，所述培養(yǎng)基中含有的氨芐青霉素鈉的濃度為5 μ g/ml0
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于具體的，包括以下步驟(1)一級菌種繁殖將單株或多株凍干革蘭氏陰性菌菌種分別接種營養(yǎng)肉湯，36 37°C培養(yǎng)16-20小時后，用劃線分別接種于麥康凱瓊脂平板，置36 37°C培養(yǎng)16 20小時，在低倍鏡下，分別選取菌落5-10個混合接種于營養(yǎng)肉湯，然后分別接種于營養(yǎng)瓊脂斜面，置36 37°C培養(yǎng)16 20小時，用營養(yǎng)肉湯分別洗下菌種加10% (w/w)甘油，_20°C保存，使用期不超過6個月或斜面培養(yǎng)物置2 8°C保存，不超過1個月，純粹檢驗合格，作為一級種子；(2)二級菌種繁殖取一級種子分別接種于營養(yǎng)肉湯，置36 37°C震蕩培養(yǎng)16 20小時，取樣作純粹檢查，純粹檢查合格后，置2 8°C保存；(3)菌液培養(yǎng)用玻瓶或生物發(fā)酵罐通氣培養(yǎng)，將二級菌種分別接種于含5 μ g/ml氨芐青霉素鈉的營養(yǎng)肉湯，37°C培養(yǎng)16 18h，經(jīng)純粹檢查合格后作為制苗用菌液；(4)菌液滅活得到的菌液以總量0.4% (w/w)加入戊二醛溶液，經(jīng)37°C滅活48小時；所述的菌液為單株革蘭氏陰性菌菌液或多株革蘭氏陰性菌菌液的混合物，按活菌計數(shù)，將各菌株菌液按1:1:1比例混合；(5)疫苗的制備在檢驗合格的滅活菌液中加入終濃度為20% (w/w)的氫氧化鋁凝膠和0.005% (w/w)的硫柳汞防腐，制備濃縮滅活疫苗，按滅活前活菌數(shù)計算，制備濃縮滅活疫苗含單株菌數(shù)均不低于 100X 108CFU/ml。
5.如權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于所述的革蘭氏陰性菌為致仔豬水腫病大腸桿菌。
6.由權(quán)利要求3-5任一項所述的方法制備得到的革蘭氏陰性菌滅活疫苗。
7.如權(quán)利要求6所述的滅活疫苗，其特征在于所述的疫苗為仔豬水腫病滅活疫苗。
8.如權(quán)利要求7所述的滅活疫苗，所述的疫苗為仔豬水腫病多價滅活疫苗。
9.權(quán)利要求6所述的滅活疫苗在制備治療由感染革蘭氏陰性菌引起的疾病藥物中的 應(yīng)用。
10.權(quán)利要求7或8所述的滅活疫苗在制備治療豬水腫病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種革蘭氏陰性菌滅活疫苗、其制備方法及應(yīng)用，特別涉及仔豬水腫病滅活疫苗、及其制備方法和應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)在制備過程中加適量氨芐青霉素鈉，能夠誘導(dǎo)類志賀毒素變異體二型毒素大量產(chǎn)生，使疫苗中含有一定類毒素抗原成分。本發(fā)明以仔豬為檢驗?zāi)Ｐ驮u價疫苗的安全性和免疫效力，觀察此制備方法應(yīng)用于疫苗后該疫苗安全性和免疫效力的影響，并確定了氨芐青霉素鈉在菌液培養(yǎng)中添加量，即將該抗生素加入到培養(yǎng)基中至每毫升菌液中含有氨芐青霉素鈉濃度為5μg/ml時，能夠刺激該菌產(chǎn)生足夠的毒素抗原，并不影響細菌繁殖，培養(yǎng)物種既含有毒素抗原又含有足夠量的菌體抗原，能夠有效提高疫苗中類毒素含量，保障疫苗免疫效果。
文檔編號A61K39/108GK102382872SQ20111032769
公開日2012年3月21日 申請日期2011年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月25日
發(fā)明者孟福強, 曲海波, 王 華, 白同臣, 趙輝 申請人:哈藥集團生物疫苗有限公司