專利名稱：新穎的翻譯后纖維蛋白原變體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分子生物學領域，具體地，涉及通過重組方法制備的人纖維蛋白原的新穎的翻譯后變體的提供。本發(fā)明也涉及與這些新穎的變體有關的方法和應用。
背景技術：
纖維蛋白原(關鍵性的結(jié)構血漿蛋白之一)是一種340-kDa糖蛋白，如Doolittle 等人所描述(Doolittle RF, Spraggon G, Everse SJ. Three-dimensional structural studies on fragments of fibrinogen and fibrin (纖維蛋白原和纖維蛋白的片段的三維結(jié)構研究).Curr Opin Struct Biol.(結(jié)構生物學當前進展)(1998) 8 :792-798)。脊椎動物纖維蛋白原分子由3對不同的鏈(α2、β2和Υ2鏈)組成，其中一對中的2個成員是相同的。對于人纖維蛋白原，還原的Αα-、Ββ-和^鏈具有大約65，000、55，000和47，000 的分子量。
_4] mm&i^-^^mmm, (FReDs)纖維蛋白原參與凝血，被凝血酶活化，以裝配成纖維蛋白凝塊。2X3鏈的N-端結(jié)合，以形成稱作二硫化物結(jié)(disulfide knot)的球形排列。纖維蛋白原鏈的C-端以球形結(jié)構域作為末端，它們不是完全相同的。Y鏈的C-端球形結(jié)構域(C-Y)會二聚體化，并結(jié)合α鏈的N-端結(jié)構域的GI^R基序，而β鏈的N-端結(jié)構域的GHR基序結(jié)合另一個β鏈的 C端球形結(jié)構域(C-β)，從而導致網(wǎng)絡形成。在血管損傷以后，纖維蛋白原被凝血酶裂解， 以形成纖維蛋白，所述纖維蛋白是血塊的最豐富的組分。另外，纖維蛋白原和纖維蛋白的不同裂解產(chǎn)物會調(diào)節(jié)細胞粘附和擴散，顯示出血管收縮劑和趨化活性，且是幾種細胞類型的促分裂原。以前描述的一個或多個纖維蛋白原基因中的突變會導致幾種病癥，包括纖維蛋白原缺乏血癥(afibrinogenemia)、異常纖維蛋白原血癥(dysfibrinogenemia)、低異常纖維蛋白原血癥(hypodysfibrinogenemia)和血栓形成趨勢。已知，在人類中，纖維蛋白原存在幾個差異，這取決于遺傳因素已經(jīng)提出，多達 51%的血漿纖維蛋白原水平差異可以歸因于遺傳因素。已經(jīng)提出，在由幾個實驗室生成的纖維蛋白原蛋白序列數(shù)據(jù)和早期編碼區(qū)DNA序列數(shù)據(jù)內(nèi)或二者之間的差異，是實驗人為產(chǎn)物(罕見的或新的變體)的結(jié)果，或指示真實的、確定的多態(tài)性。Colafranceschi等人已經(jīng)使用非線性方法、再現(xiàn)量化分析，在野生型中，和在許多天然存在的或人工突變體中，研究了人纖維蛋白原的A α _、B β -和γ -鏈中的疏水性模式分布，其目的是發(fā)現(xiàn)用于區(qū)分沉默的和病理學的突變體的結(jié)構基礎(Colafranceschi M， Papi M,Giuliani A,Amiconi G,Colosimo Α. ,Pathophysiol. Haemost. Thromb.(病理生理止血和凝血)，2006，35 :417-27)。在突變是在Aa-鏈上的情況下，Colafranceschi等人是成功的，這是由于該鏈與其它2條鏈相比特有的特征。關于Aa -鏈的點突變體的有關發(fā)現(xiàn)如下(a)這類突變體的基于再現(xiàn)量化分析的分類與臨床分類一致性良好，和(b)突變的殘基在序列上的位置比它的疏水特征起更相關的作用。根據(jù)Colafranceschi等人，Aa -鏈的延長同種型的終末區(qū)(600-866殘基)中的人工點突變體與前面的(1-207)殘基的天然出血性突變體聚簇在一起。
Ajjan等人描述了纖維蛋白原Ββ鏈的C-端區(qū)域中的共有變異。根據(jù)Ajjan和他人，纖維蛋白原B β Arg448Lys是共有多態(tài)性的結(jié)果，所述共有多態(tài)性位于分子的B β -鏈的羧基端內(nèi)(Ajjan R, Lim BCB, Standeven KF, Harrand R, Dolling S, Phoenix F, Greaves R, Abou-Saleh RH, Connell S, Smith Dam, Weisel Jff, Grant PJ, Ariens RAS. Blood ( . 液)，(2008) 111 :643-649 ；Baumann RE, Henschen AH，Blood(血液)(199 82 :2117-2124 ； Carter AM, Catto AJ, Bamford JM, Grant PJ. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. (1997), 17 :589-594)。在理解先天性纖維蛋白原缺乏血癥的分子基礎方面，已經(jīng)取得了最新的進展，所述先天性纖維蛋白原缺乏血癥是一種常染色體隱性的凝固障礙，其特征在于完全缺失可檢測的纖維蛋白原。在一個非血親的瑞士家族中鑒別出了該障礙的第一個成因突變；存在纖維蛋白原α鏈(FGA α )編碼基因的大約111Λ的純合子缺失。單倍型數(shù)據(jù)提示，該缺失發(fā)生在獨特的祖先染色體上，表明FGA基因的該區(qū)域可能易于通過共同機理發(fā)生缺失。所有缺失在堿基對上是相同的，可能源自非同源的(不正常的)重組。在隨后的13位無親戚關系的先天性纖維蛋白原缺乏血癥患者的研究中，作者分析了 FGA基因，以便鑒別成因突變，并確定11-1Λ FGA缺失的普遍性。還表征了 3個移碼突變、2個無義突變和1個其它的剪接位點突變。其它研究鑒別出了 1個另外的FGA α無義突變、2個FGBi3錯義突變和1個TOy無義突變，都是在單個患者中的純合基因(Neerman-Arbez M. ,Ann N Y Acad Sci. 2001 ；936 496-508)?？傊蠖鄶?shù)患者具有FGA α基因中的截短突變，盡管憑直覺可以預測所有3個纖維蛋白原基因同等地涉入?，F(xiàn)有的知識會促進該障礙的分子診斷，允許對有此需要的家族進行產(chǎn)前診斷，并為新的治療方案(諸如基因治療)鋪設道路。以前的纖維蛋白原的基因型-表型關聯(lián)研究，已經(jīng)受到主要種族集合內(nèi)和之間的 FGB β,FGA α和TOY的基因組序列變化的不完全知識的限制。該連鎖不平衡被表征為，歐裔美籍人和非裔美籍人種群的人纖維蛋白原基因基因座之間的模式和單倍型結(jié)構。在年輕人中，纖維蛋白原多-基因座基因型表現(xiàn)得與血漿纖維蛋白原水平有關。這些關聯(lián)的具體的單核苷酸多態(tài)性和單倍型模式表現(xiàn)得隨種群和表型試驗而異。血漿纖維蛋白原濃縮物的遺傳組分的大部分似乎是由于在3個纖維蛋白原基因以外的遺傳變化。已經(jīng)提出混雜的原因和顛倒的因果關系，作為高纖維蛋白原水平和心血管疾病之間的關聯(lián)的解釋。遺傳變體可以改變纖維蛋白原特征，且不會發(fā)生這些問題。為了測定纖維蛋白原-A α (FGAaThr312Ala)和纖維蛋白原_Β β (FGB β -455G/A)中的基因型變體的纖維蛋白原血漿水平，以及這些變體是否與動脈血栓形成有關，在基于種群的病例對照研究 (包括年齡為18-50歲的女性)中測定了纖維蛋白原基因型。reBi3-455G/A變體增加了血漿纖維蛋白原水平，而FGAaThr312Ala變體降低了血漿纖維蛋白原水平，盡管是在不大的程度上。當將純合子次要等位基因與純合子主要等位基因相對比時，改變了缺血性中風的風險。FGAaThr312Ala單核苷酸多態(tài)性(SNP)與風險的降低有關，而FGB β-455G/A SNP可能已經(jīng)增加了風險。對于任一種SNP而言，沒有改變心肌梗塞的風險。使用該遺傳變化作為血漿纖維蛋白原水平改變的標志物，由此排除混雜和顛倒的因果關系，提示的結(jié)果是與對于心肌梗死而言，血漿纖維蛋白原水平可以作為缺血性中風的危險因素起更顯著的作用 (Siegerink B, Rosendaal FR, Algra A. J Thromb Haemost. (2009)7:385—90)。
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因子XIII和纖維蛋白原在凝固因子中是不常見的，因為它們都不是絲氨酸蛋白酶。纖維蛋白是血塊的主要蛋白組分，其通過連接鄰近的纖維蛋白單體的酰胺或異肽鍵被因子XIIIa穩(wěn)定化。通過蛋白和基因分析、定點誘變和χ-射線晶體學，已經(jīng)闡明了因子XIII 和纖維蛋白(原)的許多結(jié)構和功能特征。但是，仍然未解釋在不溶性纖維蛋白體內(nèi)和體外形成的復雜過程中所涉及的一些分子方面。纖維蛋白原、因子XIII和心血管病癥或其它血栓性病癥之間的關系的發(fā)現(xiàn)，已經(jīng)將許多注意集中在這兩種蛋白上。特別令人感興趣的是，因子XIII的基因中的共有變異與改變的血栓形成風險特性之間的關聯(lián)。盡管關于這些觀察存在許多爭論，最重要的是，提示了對血塊形成和治療干預的理解。已經(jīng)研究了在FXIII A亞基中的位置34處的共有多態(tài)性Val至Leu，作為血栓形成的危險決定因素。因為認為Val34Leu鄰近凝血酶切割位點，假設它會改變FXIII的功能 使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳和高效液相色譜法分析凝血酶的FXIII亞基蛋白酶解，已經(jīng)證實了與34Val相比，凝血酶會更快地且在更低的劑量裂解FXIII 34Leu。分離的活化肽的質(zhì)譜法證實了預測的單個甲基差異，并證實了凝血酶切割位點未被Val34Leu 改變?；罨尼尫诺膭恿W分析證實，凝血酶的催化效率(k(cat)/K(m))是0. 5(對于FXIII 34Leu而言)和0.2(對于34Val而言)(微摩爾/L) (-l)x sec(-l)。纖維蛋白的存在使催化效率分別增加至4.8和2.2(微摩爾/1)(-1)1 sec (-1)0盡管34Leu肽以與纖維蛋白肽 A類似的速率釋放，34Val肽比纖維蛋白肽A更緩慢地釋放，但是比纖維蛋白肽B產(chǎn)生更快速。與用34Val溫育相比，當用FXIII 34Leu溫育纖維蛋白時，γ -和α-鏈的交聯(lián)出現(xiàn)得更早。完全活化的34Leu和34Val FXIII會表現(xiàn)出類似的交聯(lián)活性。通過濁度和滲透性測量來分析使用來自FXIII 34Leu受試者的血漿制備的纖維蛋白凝塊，已經(jīng)證實了與 34Val相比減小的纖維質(zhì)量/長度比和孔隙率。通過電子顯微術，已經(jīng)證實了結(jié)構差異。這些結(jié)果證實，Val34Leu會加速凝血酶對FXIII的活化，結(jié)果表現(xiàn)成以此方式影響交聯(lián)的纖維蛋白凝塊的結(jié)構。在美國專利6，037，457中，在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中生產(chǎn)了重組纖維蛋白原。 提供了可以用于培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的哺乳動物細胞以表達纖維蛋白原的示例條件在具有附著的微載體珠子的滾瓶中，在含有血清的培養(yǎng)基中，繁殖細胞4-5周的時段，隨后在共200ml無血清的培養(yǎng)基(Dulbecco氏改良的fegle氏培養(yǎng)基/F12培養(yǎng)基，其含有IOIU青霉素/ml、 IOmg鏈霉素/ml、IOU抑酞酶/ml和各10 μ g/ml的胰島素、亞硒酸鈉和轉(zhuǎn)鐵蛋白)中在37°C 培養(yǎng)細胞3周，然后開始每4-7天收集條件培養(yǎng)基，以便開始純化過程，其中，根據(jù)美國專利 6，037，457的作者，在許多情況下，這從硫酸銨沉淀法開始。

發(fā)明內(nèi)容
US 6，037，457排它地涉及重組纖維蛋白原的提供，此外，沒有解決如在WO 2007/103447中所述的關于提供完全純的重組人翻譯后系統(tǒng)的問題。因此，US 6，037，457 既沒有涉及關于得到的纖維蛋白原之間的翻譯后差異的任何發(fā)現(xiàn)，也沒有涉及迄今未公開的翻譯后纖維蛋白原物質(zhì)的存在。本發(fā)明涉及用于制備重組人纖維蛋白原的新穎的概念和方法，其具體地涉及人纖維蛋白原的未還原的生物活性的Αα、Ββ、γ鏈中的迄今未知的可鑒別的變化的利用，所述變化由選擇用于生產(chǎn)這些纖維蛋白原鏈的重組表達系統(tǒng)引起。令人驚訝地觀察到，由HEK 細胞生產(chǎn)的纖維蛋白原可以分成至少2種不同的纖維蛋白原組成，其中所述纖維蛋白原在凝血酶-活化的聚合中表現(xiàn)出顯著的差異。根據(jù)本發(fā)明，在下述情況下，存在由此提供的2種單獨的纖維蛋白原將α、β和 Y纖維蛋白原鏈編碼基因構建進啟動子和載體系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)染進某些人細胞系中，然后收獲和分離來自這些細胞的表達產(chǎn)物。直到現(xiàn)在，發(fā)明人目前已經(jīng)成功地建立了轉(zhuǎn)染的人細胞系統(tǒng)，其能夠表達纖維蛋白原中的這些新穎的差異，所述纖維蛋白原通過某些純化方法，能夠生成至少2種(兩種) 不同的可區(qū)分的重組人纖維蛋白原，在本文中稱作F5和F6。因此，在第一個方面，本發(fā)明因此提供了用于制備纖維蛋白原的方法，所述方法包括提供用編碼單個纖維蛋白原鏈的表達載體轉(zhuǎn)染的細胞，隨后在便于所述細胞生產(chǎn)纖維蛋白原的條件下，培養(yǎng)所述細胞，隨后回收所述纖維蛋白原，并分離以至少2種翻譯后修飾的物質(zhì)形式存在的所述纖維蛋白原，所述至少2種翻譯后修飾的物質(zhì)通過在PAGE凝膠中的不同遷移模式進行區(qū)分，和/或通過凝血酶活化后的不同聚合進行區(qū)分。在一個優(yōu)選的實施方案中，得到的纖維蛋白原是人纖維蛋白原或在每個纖維蛋白原鏈中包含最多10 個氨基酸突變的人纖維蛋白原。具體地，每個α、β和γ鏈可以獨立地包含0、1、2、3、4、 5、6、7、8、9或10個單獨的氨基酸突變。使用人細胞進行制備，已經(jīng)得到了優(yōu)良的結(jié)果，所以優(yōu)選地，在第一個方面的方法中使用的轉(zhuǎn)染的細胞由人細胞組成，例如選自人細胞克隆或人細胞系。特別優(yōu)選的細胞是 HEK細胞，諸如HEI^93t和HEK293ts細胞，它們可從下述地址得到HumanZyme，2201 West Campbell Park Drive Suite 24, Chicago, IL 60612, USA。從本發(fā)明的實施例顯而易見，本發(fā)明的方法已經(jīng)導致在一類細胞中從相同的鏈編碼載體集合表達的2種重組人纖維蛋白原的分離。在本發(fā)明的第一個方面，由此優(yōu)選地，所述方法能夠?qū)⑷死w維蛋白原分離成為至少2種翻譯后修飾的形式，其中一種(冊)具有與血清纖維蛋白原類似的PAGE遷移模式和聚合特征，且其中另一種(F6)具有這樣的PAGE遷移模式其具有與CHO細胞表達的纖維蛋白原類似的聚合特征，但是在泳帶強度方面存在差異。F5和F6纖維蛋白原之間的其它區(qū)別特征是，還原的纖維蛋白原(即這樣的纖維蛋白原，其中二硫鍵已經(jīng)通過添加還原劑而去除)中的α鏈具有不同的性質(zhì)在PAGE中，F(xiàn)6泳帶是分離的且狹窄的，而F5泳帶顯得不太分離和更模糊(表明與F6相比，F(xiàn)5蛋白的帶電荷基團具有更大的分子內(nèi)變化)。還發(fā)現(xiàn)，由人細胞表達的重組纖維蛋白原F5與血漿-衍生的纖維蛋白原相比是真實類似的(authentic-like)，且比F6是更真實類似的，如在PAGE凝膠上所看到的(圖4)， 且也比CHO細胞衍生出的纖維蛋白原是更真實類似的。但是，在PAGE凝膠上，重組纖維蛋白原F6也不同于CHO細胞衍生出的纖維蛋白原。與在纖維蛋白原F5上和在CHO衍生的纖維蛋白原上觀察到的更寬的且更擴散的泳帶相比，未還原形式的重組纖維蛋白原F6顯示為更強的且更密集和分離的泳帶。與纖維蛋白原F5和CHO細胞衍生出的纖維蛋白原相比，還原的纖維蛋白原F6中的α鏈也出現(xiàn)在相對更高的濃度。最后，在已經(jīng)用凝血酶誘導(活化)以后的單個聚合模式表明，F(xiàn)5與F6和CHO細胞衍生出的纖維蛋白原相比是更真實類似的。所以，在人細胞中生產(chǎn)的重組人纖維蛋白原(且如在本發(fā)明中所述)似乎含有至少2種不同的纖維蛋白原翻譯后(PT)物質(zhì)。本文使用的“纖維蛋白原PT物質(zhì)”表示蛋白的翻譯后變體，其具有與另一種纖維蛋白原分子完全相同的氨基酸組成；所述2種物質(zhì)僅在它們的分子方面存在差異，所述差異是由于翻譯后修飾，諸如糖基化、脂質(zhì)化、磷酸化等引起的。當收獲時，鑒別出這至少2種不同的纖維蛋白原蛋白物質(zhì)，且可以分離為單獨的物質(zhì)，例如通過采用本文所述的純化方法。這可以實現(xiàn)纖維蛋白原的重組生產(chǎn)，分離不同的 PT物質(zhì)，并隨后提供含有平衡量的至少2種不同的PT物質(zhì)的纖維蛋白原制品，從而實現(xiàn)具有特定的且可再現(xiàn)的聚合特征的人纖維蛋白原組合物的生產(chǎn)。因此，在本發(fā)明的第二個方面，提供了基本上純的人纖維蛋白原制品，其不含有非-纖維蛋白原血清蛋白，且其中所述纖維蛋白原由下述物質(zhì)組成a)F5纖維蛋白原，b)F6纖維蛋白原，或c) F5和F6纖維蛋白原的混合物。預見到，如在本文中示例的重組生產(chǎn)的纖維蛋白原的情況一樣，這樣的多-PT物質(zhì)生產(chǎn)可以發(fā)生在其它轉(zhuǎn)染的細胞中以及克隆的或轉(zhuǎn)基因的動物中，使得從這樣的轉(zhuǎn)染的細胞得到的纖維蛋白原實際上是不同纖維蛋白原PT物質(zhì)的組合物一這因此也是本發(fā)明的一個方面?；蛘?，本發(fā)明提供了至少2種纖維蛋白原PT物質(zhì)的混合物，其中不同的纖維蛋白原PT物質(zhì)是從2個或更多個不同的細胞類型得到。F5和F6之間的差異不涉及上面討論的與纖維蛋白原中的病理學遺傳改變有關的異常病癥，且看起來現(xiàn)有技術尚未預料到不同的纖維蛋白原翻譯后形式分布在正常血漿中的可能性。但是，基于本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)，可以想象到，這樣的不同形式在本質(zhì)上的確存在于血漿中，這意味著血漿攜帶著以前沒有描述的纖維蛋白原異質(zhì)性。在應用于血漿纖維蛋白原的純化過程中，這些可能的血漿纖維蛋白原之一(諸如F6)可以或多或少地被滅活，或者所述PT纖維蛋白原物質(zhì)之一可以對經(jīng)常應用于血漿纖維蛋白原上的熱滅活更敏感，以便滅活病原體。與本發(fā)明的第一個方面(其提供了人纖維蛋白原的生產(chǎn)，所述人纖維蛋白原在每個纖維蛋白原鏈中具有至多10個氨基酸變化)相一致，本發(fā)明的制品也包括這樣的制品， 其中所述人纖維蛋白原在每個鏈中獨立地具有至多10個氨基酸變化(即在每個α、β和 Y鏈中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個單獨的氨基酸變化)。所以，本發(fā)明的一部分也是這樣的纖維蛋白原其包含至少一個含有氨基酸置換的纖維蛋白原鏈。例如，脯氨酸至丙氨酸置換，例如在β鏈的位置162處。在導致本發(fā)明的工作中制備的最初的重組纖維蛋白原含有在β鏈的位置162處的脯氨酸殘基，而不是丙氨酸。當由獨立的實驗室進行測試時，發(fā)現(xiàn)形成的“最初”纖維蛋白原比用作對照的“內(nèi)部黃金標準”(Calbiochem人血漿纖維蛋白原)明顯更緩慢地聚合。 當該同一個實驗室以后測試用β鏈(其中我們已經(jīng)去除了在位置162處的脯氨酸，并放入丙氨酸，并在轉(zhuǎn)染的HEK293t細胞中表達它)制備的第二種重組人纖維蛋白原時，發(fā)現(xiàn)該重組人纖維蛋白原(具有在β鏈中的位置162處替代脯氨酸的丙氨酸)表現(xiàn)出至少與“黃金標準” Calbiochem人血漿纖維蛋白原相同的聚合速度。但是，顯然，Ββ鏈中的該變化可能不一定是導致產(chǎn)生F5和F6纖維蛋白原的唯一改變，在Ββ、Αα和Υ中的其它變化可能提供形成F5和F6纖維蛋白原、或重組的F5和F6纖維蛋白原的基礎。但是，本發(fā)明的一個優(yōu)選的纖維蛋白原包含在鏈的位置162中的非-脯氨酸， 諸如在該位置的L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、甘氨酸、 L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-賴氨酸、L-亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、 L-精氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-纈氨酸、L-色氨酸和L-酪氨酸。在從HEK細胞(如本文所證實的)至PER-C6細胞或其衍生物的人細胞中，可以制備重組的F5和F6人纖維蛋白原。而且，可以用Αα、Ββ和、纖維蛋白原基因轉(zhuǎn)染任意合適的人干細胞或人前體細胞，所述基因單獨地構建進啟動子和載體系統(tǒng)中，或者所有3個基因在同一個啟動子和載體系統(tǒng)中，其中3個單獨基因中的任意其它變化構成纖維蛋白原基因。除了別的以夕卜，通過它們在PAGE凝膠中的行為，和通過它們的Aa、Ββ和γ鏈在還原條件下的特定模式，可以表征未還原的纖維蛋白原。特別值得注意的是，在F5和F6 重組人纖維蛋白原的Aa蛋白鏈中出現(xiàn)的差異。與CHO衍生的纖維蛋白原相比，Aa鏈在 PAGE凝膠上實際上也更強。測試了不同比例的α、β、Y，因為最初的研究揭示，β鏈可能是得到甚至一致地完整的纖維蛋白原的限制因素，而不是得到α-Υ “無活性的纖維蛋白原”(沒有β鏈存在的證據(jù))。因此，測試了比例1 1 1、1 2 1和1 5 1，從而提供可利用的β鏈的量相對于α和、鏈的變化。因此，在本發(fā)明中預見到，所述基因之一(即Aa基因)的分離，能夠混合F5和F6 基因(或其表達產(chǎn)物)，并使用這樣的相對混合物其中基因或表達產(chǎn)物的α、β、Y比例為2 1 1或其它比例，在Aa基因占優(yōu)勢的情況下，替代目前使用的比例1 1 1。在初步試驗中，使用1 2 1或甚至更高的β基因優(yōu)勢，例如多達1 5 1(但是，最初的發(fā)現(xiàn)似乎表明這樣的導向1 5 1對于HEK 細胞培養(yǎng)物而言是相對有毒性的)，β鏈似乎可以是限制因素，至少對于與重組纖維蛋白原的總產(chǎn)率有關的結(jié)果而言。 所以也在這里，α、β和Υ鏈之間的比例不同于1 1 1，其中β鏈的優(yōu)勢是優(yōu)選的。 在兩類情況下，當被誘導時，或甚至當與B β混合時和與、鏈蛋白混合時，得到的F5和F6 多肽可以強化或提供聚合。因而，當分部分或作為整個完整的纖維蛋白原分子提供F5和F6 纖維蛋白原時，是在本發(fā)明范圍內(nèi)的。本發(fā)明也涵蓋了新的和改進的啟動子和載體系統(tǒng)和新的HEK細胞系(來自伊利諾州芝加哥的HumanZyme Inc.的啟動子和載體和HEK細胞系)用于生產(chǎn)F5和F6纖維蛋白原分子的應用。導致Ββ鏈的氨基酸序列中的氨基酸修正的Ββ基因可以參與優(yōu)化纖維蛋白原組成，這在不同的條件下可能是最有用的，例如，當將非常可靠的纖維蛋白原用于系統(tǒng)地治療具有不同的纖維蛋白原異常(諸如異常纖維蛋白原血癥、低纖維蛋白原血癥)的患者時，以及作為嚴重出血性創(chuàng)傷患者(包括嚴重事故、災難、戰(zhàn)爭和爆炸有關的情形)的必需治療的可能的拯救生命的纖維蛋白原。購得用于制備重組纖維蛋白原的最初的人纖維蛋白原 α、β和γ基因，有關的登記號是ΝΜ_021871(對于Fb_Aa)、BC106760(對于Fb_B3)和BC021674(對于 ^_γ)。使用針對纖維蛋白原α、β、Y基因的PCR，測試了這些基因。當我們分析購得的BC106760fpr FB_B β基因時，它似乎具有在Ββ纖維蛋白原蛋白鏈的氨基酸位置162處的脯氨酸。我們?nèi)缓髮⒃谠撐恢?62處的脯氨酸改變成丙氨酸，以便制備人野生型纖維蛋白原。仍未完全確信，人纖維蛋白原β鏈是否在本質(zhì)上具有在位置162處的脯氨酸或丙氨酸，但是從已經(jīng)測試的最優(yōu)的血漿纖維蛋白原標準(Calbiochem人血漿纖維蛋白原)的觀點看，與目前的重組人纖維蛋白原相比，具有在位置162處的脯氨酸的重組人纖維蛋白原在該重組纖維蛋白原的對數(shù)更高的量表現(xiàn)出聚合，根據(jù)本發(fā)明，具有在β鏈的位置162處的丙氨酸的形式是非常優(yōu)選的。但是，其它變體聚焦于β鏈的位置162處的氨基酸變化，預見到這會產(chǎn)生改良的聚合特性。因而，在β鏈的位置162處的任意非-脯氨酸L-氨基酸殘基是與本發(fā)明有關的突變體或變體，具有這樣的突變體/變體β鏈的纖維蛋白原也是如此。因而，在位置162 處的氨基酸選自例如L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-賴氨酸、L-亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、L-精氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-纈氨酸、L-色氨酸和L-酪氨酸。也預見到，且在本發(fā)明的范圍內(nèi)，F(xiàn)5重組纖維蛋白原、或更具體地F5哺乳動物重組纖維蛋白原、或甚至更具體地F5人重組纖維蛋白原，在很大程度上可以是通常收獲的血漿纖維蛋白原之一，或者是占優(yōu)勢地收獲的血漿纖維蛋白原之一，或者可能構成類似于F5 的主要血漿纖維蛋白原。因而，F(xiàn)6纖維蛋白原可以仍然存在于許多哺乳動物(包括人類) 中，但是血漿衍生的F5纖維蛋白原和血漿衍生的F6纖維蛋白原的相對濃度可能存在差異。 血漿纖維蛋白原的聚合曲線在很大程度上類似于在本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)的F5重組人纖維蛋白原的聚合曲線。所以，如果預期F5和F6以混合物形式出現(xiàn)在血漿中，且所述血漿含有血漿F5 組分或分子的最高相對濃度，則聚合曲線會或可能傾向于接近純化的和分離的F5重組人纖維蛋白原，參照本文報道的發(fā)現(xiàn)，即當以50 50的比例混合F5重組人纖維蛋白原和F6 重組纖維蛋白原時，聚合曲線傾向于相對更接近F5(與F6相比)。使用方法本發(fā)明的方法和本發(fā)明的制品提供了纖維蛋白原，其可以用于與血漿纖維蛋白原或其它現(xiàn)有技術水平的纖維蛋白原制品通常相關的相同場合。這些場合之一是，預防或治療出血，特別是過量出血。根據(jù)本發(fā)明，將3個單獨的纖維蛋白原編碼基因例如轉(zhuǎn)染進細胞(具體地且主要地，具有人起源的那些細胞)中，以便得到形成的特定纖維蛋白原(諸如F5和F6)的人糖基化模式，這些中的任何一個可能最適用于系統(tǒng)治療，例如通過注射或輸注到人或哺乳動物中。通過本發(fā)明的纖維蛋白原的施用和活化可以靶向的疾病或病癥是通常使用纖維蛋白/纖維蛋白原進行治療的那些不同情況導致的嚴重出血，所述情況包括特征在于改變的或降低的纖維蛋白原濃度或活性的醫(yī)學病癥，以及由外科手術或由事故/損傷引起的創(chuàng)傷。另外，纖維蛋白原的過度消耗也可能導致對外源施用的需求。而且，在移植應用中和對于表面(topical)應用而言，可以使用本發(fā)明的纖維蛋白原。例如，當制備用于治療表面出血的重組纖維蛋白膠或重組組織密封劑時，例如在手術或其它干預過程中，本發(fā)明的纖維蛋白原是有用的。
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因此，在第三個方面，本發(fā)明提供了治療或預防個體的出血的方法，所述方法包括施用有效量的本發(fā)明第二個方面的制品或通過構成本發(fā)明第一個方面的方法得到的纖維蛋白原。例如，其中施用纖維蛋白原可以有效地基本上維持或恢復斷裂的/受損傷的脈管系統(tǒng)的凝血能力。在手術方法中、在急救場合或損害控制場合(諸如當給已經(jīng)受到嚴重身體創(chuàng)傷的個體提供第一線治療時，對于戰(zhàn)斗士兵、事故或恐怖行為的受害者的情況也是如此)，或在纖維蛋白原的受體正在遭受或可能開始遭受過量出血的任意其它情形下，這可以具有實際用途。例如，當個體在所述治療或預防之前遭受出血或易于出血時，所述出血由下述原因引起功能性纖維蛋白原的功能障礙或缺乏，損傷，過去的或?qū)淼氖中g治療(在預見到大量出血的情況下；一個實例是心臟手術，其中約5%，諸如心臟搭橋手術；或為了連接組織諸如血管、器官、腦組織，和連接橋連組織缺陷以修復所述缺陷)，產(chǎn)后出血，彌漫性血管內(nèi)凝血(在患者的纖維蛋白原水平降低的情況下，所述降低是由于彌漫性凝固，導致纖維蛋白裂解產(chǎn)物的形成，它們生成在纖維蛋白內(nèi)，且當血塊溶解時會發(fā)生降解，和在需要用纖維蛋白原系統(tǒng)地治療患者的情況下)，和器官移植(例如肝移植或其它器官移植，其中血漿纖維蛋白原會降低)。根據(jù)情況，可以系統(tǒng)地或局部地施用根據(jù)本發(fā)明的纖維蛋白原通常，當由上面指出的一般情況或病癥導致個體具有自體纖維蛋白原的一般損失時，系統(tǒng)給藥是優(yōu)選的；而在更受控的場合，局部(local)或表面給藥通常是優(yōu)選的，在該情況下，纖維蛋白原經(jīng)常與凝血酶或其類似物(后一個術語指示在將纖維蛋白原活化成纖維蛋白方面具有與凝血酶相同的生物活性的分子，凝血酶的類似物可以是例如人凝血酶突變體，諸如點突變形式或生物活性的凝血酶片段；也參照WO 2007/103447，其中提供了合適的凝血酶分子和它們的制備)一起施用。一個這樣的“受控的場合”是這樣的情況其中與纖維蛋白原一起施用凝血酶或其類似物，以便將器官或細胞粘合在一起，當對器官進行手術而普通手術連接不太有效時，就是這種情況(但是一般而言，在器官或各種脈管中，所述脈管諸如血管、泌尿道管、泌尿生殖管、腸和其它中空器官)。而且，與纖維蛋白原一起施用凝血酶或其類似物，以便在手術過程中，或在局部過量出血但是不需要或不可能系統(tǒng)施用纖維蛋白原的場合，實現(xiàn)止血。連接個體中的手術傷口的方法(其中施用纖維蛋白原，其任選地與凝血酶或其類似物相組合) 也是第三個方面的一部分。本發(fā)明也能夠?qū)⒓毎蚪M織移植給個體，所述方法包括給所述個體施用有效量的根據(jù)本發(fā)明第二個方面的制品或通過本發(fā)明第一個方面的方法得到的纖維蛋白原，其任選地與細胞和/或組織因子和/或凝血酶和/或凝血酶類似物的施用相組合。在這里，當必要時(例如當個體的身體不能在移植部位提供足夠的凝血酶活性時)，基本上加入凝血酶。 當在特定類型的移植中是常規(guī)的時，提供組織因子和細胞當移植細胞以便再生組織時，已知局部組織生長因子的額外加入可能是適當?shù)模Y(jié)締組織起源的細胞的加入也是如此，以便促進移植的結(jié)果。與此相關地，本發(fā)明也涉及將細胞(諸如干細胞或祖細胞或前體細胞)粘附到個體中的靶位置的方法，所述細胞會粘附在所述靶位置，以便適當?shù)仄鸸δ埽迯袜徑募毎徒M織，所述方法包括施用根據(jù)本發(fā)明的纖維蛋白原，其任選地與凝血酶或凝血酶類似物的施用相組合，此外，在必要時，并根據(jù)本領域的常見應用，施用凝血酶/凝血酶類似物。本發(fā)明第三個方面的優(yōu)選實施方案是這樣的，其中所述個體是人類。從聚合觀點看，F(xiàn)6重組纖維蛋白原優(yōu)選地用于治療患者，特別是嚴重受傷的那些患者，諸如在戰(zhàn)斗中受傷的士兵，其中患者上的多個出血部位顯示纖維蛋白原快速損失至凝血嘗試幾乎不可能的水平。由于我們發(fā)現(xiàn)F6會顯示出非常良好的快速聚合，由于F6纖維蛋白原遠遠更穩(wěn)定(不會像F5—樣快地發(fā)生降解)的事實，這使得技術人員能夠制備F6 纖維蛋白原(例如以干燥形式，諸如冷凍干燥形式)，其可以溶解于溶劑中直接帶至創(chuàng)傷位置，例如，在戰(zhàn)場上，且在F6已經(jīng)溶解后，它可以容易地系統(tǒng)性輸入，并由此升高纖維蛋白原水平，從而使否則會發(fā)生的過量出血最小化。除了上面討論的創(chuàng)傷類型以外，已經(jīng)證實，產(chǎn)后出血和心臟搭橋手術會造成過度的和危險的出血(例如，在心臟搭橋手術中，需要手術再次干預的由纖維蛋白原耗竭造成的術后出血是約5% )，所以也在這些場合中，本發(fā)明的第三個方面是適當?shù)?。在?chuàng)傷中和在這些疾病有關的或手術后有關的出血中，最重要的是，獲得纖維蛋白原諸如F6，與當前可獲得的大部分纖維蛋白原產(chǎn)品相比，其表現(xiàn)出緩慢的蛋白降解。如果在大量出血時需要在15-30分鐘內(nèi)補償2-3升，應當施用的傳統(tǒng)纖維蛋白原的冷沉淀物單位的量在大多數(shù)情況下實際上是不可能的，因為必須最可能地輸入15-25冷沉淀物單位。在這樣的情況下，根據(jù)本發(fā)明的F6纖維蛋白原制品(其不含有無活性的成分或甚至反活性的藥劑諸如纖連蛋白)會提供優(yōu)良的替代品。最后，當進行細胞移植(自體移植、同種異體移植或異種移植)時，本發(fā)明的纖維蛋白原與人或哺乳動物凝血酶(諸如在WO 2007/103447中公開的野生型或M84A突變體的重組(人)哺乳動物凝血酶)的組合，是在本發(fā)明范圍內(nèi)，以促進這樣的細胞的移植，例如， 當進行軟骨修復、骨修復、心臟細胞修復或肌肉修復時。關于劑量，在系統(tǒng)給藥的情況下，需要施用足以建立允許凝血的纖維蛋白原血清濃度的量，換而言之，要施用的量取決于治療的病癥的嚴重性；大量出血比小量出血需要更多的纖維蛋白原，等。優(yōu)選地，施用的量足以重建被認為是在正常血清濃度內(nèi)或以上的纖維蛋白原血清濃度。本發(fā)明的第四個方面涉及將細胞粘附到固體或半固體表面上的方法，其中使所述細胞和所述固體或半固體表面接觸根據(jù)本發(fā)明第二個方面的制品，或接觸通過本發(fā)明第一個方面的方法得到的纖維蛋白原。從上述內(nèi)容可以理解，本發(fā)明涉及用作藥物的本發(fā)明第二個方面的制品或通過本發(fā)明第一個方面的方法得到的纖維蛋白原。具體地，本發(fā)明涉及用于根據(jù)本發(fā)明第三個方面的方法中的本發(fā)明第二個方面的制品或通過本發(fā)明第一個方面的方法得到的纖維蛋白原。本發(fā)明的試劑盒本發(fā)明也能夠提供試劑盒，其適用于實現(xiàn)本發(fā)明的第三個和第四個方面。例如，本發(fā)明涉及一種試劑盒，其在單獨的容器或器皿中包含1)本發(fā)明第二個方面的制品或通過本發(fā)明第一個方面的方法得到的纖維蛋白原，和幻凝血酶或其類似物，以及任選的幻因子 XIII(參照下面)。特別優(yōu)選地，試劑盒的每種(優(yōu)選所有)蛋白組分中的至少一種以干燥形式提供在容器/器皿中，具體地以冷凍干燥形式，因為這會實現(xiàn)增加的穩(wěn)定性、容易運輸以及容易混合該組分和液體，以提供適用于注射或表面/局部給藥的組合物。其它內(nèi)容/用涂預見到，本發(fā)明的觀察(即相同的纖維蛋白原編碼基因?qū)е露?PT物質(zhì)纖維蛋白原的產(chǎn)生)也適用于其它動物纖維蛋白原。因此，克隆任意哺乳動物的纖維蛋白原編碼基因到合適的表達載體中，隨后轉(zhuǎn)染合適的宿主細胞(優(yōu)選與纖維蛋白原基因相同的物種起源)，并實現(xiàn)這些基因的表達，以得到至少2種纖維蛋白原PT物質(zhì)，是在本發(fā)明范圍內(nèi)的。 同樣地，克隆攜帶細胞克隆的動物(諸如哺乳動物)，所述細胞克隆也能夠生產(chǎn)兩種PT物質(zhì)諸如F5和F6 (類似于人或幾乎類似于人纖維蛋白原)，也是在本發(fā)明范圍內(nèi)。所以，無論是單獨地還是成對地生產(chǎn)F5和F6纖維蛋白原，都視作本發(fā)明的一部分?；诒景l(fā)明的發(fā)現(xiàn)預見到，也可以在諸如CHO細胞的細胞中生產(chǎn)至少兩種纖維蛋白原PT物質(zhì)(例如與重組纖維蛋白原F5和F6相對應)，盡管這樣的多PT物質(zhì)迄今為止尚未鑒別出來。實際上，根據(jù)本發(fā)明，通過仔細地檢查PAGE凝膠，至少兩種PT纖維蛋白原物質(zhì)非?？赡芤泊嬖谟诓溉閯游镅獫{(諸如人血漿)中。但是，直到現(xiàn)在，還不可能辨別和例如制備分離的F5和F6(或其它單獨的PT物質(zhì))的制品。因而，利用本發(fā)明，首次可能制備這樣的組合物其具有每種現(xiàn)有的PT纖維蛋白原物質(zhì)的確定的相對濃度，適用于特定纖維蛋白原產(chǎn)品。在本發(fā)明中，我們主要聚焦于在HEK細胞(尤其是伊利諾州芝加哥的HumanZyme 許可的HEK293t和HEK293ts細胞)中生產(chǎn)F5和F6物質(zhì)。但是，認為其它人細胞系可用于相同目的，諸如例如PER細胞，尤其是PER 6和PER C6細胞。根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)證實，由HumanZyme許可的2個啟動子和載體系統(tǒng)特別適用于轉(zhuǎn)染人細胞和適用于表達纖維蛋白原(當使用人細胞系統(tǒng)時)；但是，本發(fā)明不限于使用這些啟動子和載體系統(tǒng)，而是可以替換為本領域技術人員已知的其它可商業(yè)得到的或?qū)嶒炐缘膯幼雍洼d體系統(tǒng)。血漿凝血酶或重組哺乳動物凝血酶，或更具體地，重組人凝血酶，例如具有凝血酶野生型序列或M84A突變體重組人凝血酶序列的重組人真實類似凝血酶(參照WO 2007/103447)，可以活化本發(fā)明的纖維蛋白原和纖維蛋白原混合物。FXIII也可以在纖維蛋白原當被凝血酶裂解時可能凝結(jié)的速率中起作用，但是，關于本發(fā)明的范圍，當在重組人纖維蛋白原F5和/或F6上進行測試時，不考慮FXIII。另一方面，本發(fā)明人正在考慮，F(xiàn)XIII的可能的影響(包括與FXIII分子的可能的變化有關的影響)可能進一步幫助個體聚合和/或F5和F6纖維蛋白原的凝固作用。因此，根據(jù)本發(fā)明， 當將本發(fā)明付諸實踐時，可以調(diào)節(jié)和考慮影響纖維蛋白原活化成纖維蛋白的其它因子和化學藥劑的精確選擇。但是，根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的第三個和第四個方面的方法的所有實施方案可以與FXIII的施用相組合，以便提高施用的纖維蛋白原的效果。附圖標記

圖1顯示了重組生產(chǎn)的纖維蛋白原的IMAC的洗脫曲線。2個蛋白峰各自含有從 HEK293t細胞制備的重組人纖維蛋白原。通過應用20mM L-精氨酸以及50mM精氨酸，洗脫 2個峰，分別產(chǎn)生F5和F6蛋白。圖2顯示了在肝素柱上的進一步分離，其中用TBS緩沖液洗脫來自圖1中的蛋白峰的物質(zhì)。
2A 在20mM L-精氨酸時在IMAC柱上得到的F5重組人纖維蛋白原級分，它的出現(xiàn)沒有大拖尾。2B 在50mM L-精氨酸時在IMAC柱上得到的F6重組人纖維蛋白原級分，它出現(xiàn)一些蛋白拖尾。圖3顯示了在IMAC和肝素柱純化以后，關于F5和F6蛋白進行的PAGE凝膠電泳的結(jié)果。顯示了未還原的(標記為” _”)和還原的(標記為(”+”)蛋白的結(jié)果。觀察到， 與F6相比，還原的F5的Aa泳帶更寬，且稍微發(fā)散，且不太分離。在F5和F6中的還原的 Ββ和γ泳帶實際上具有相同的強度。圖4顯示了純化的纖維蛋白原的PAGE凝膠結(jié)果。在左側(cè)的泳道編號1至4顯示了在非還原條件中的純化的纖維蛋白原，右側(cè)PAGE 凝膠泳道編號1至4顯示了還原的纖維蛋白原。泳道1未還原的凝膠顯示了血漿纖維蛋白原(Sigma#F4883)，其具有更寬的泳帶，類似于泳道4中的未還原的泳帶(它是來自HEK細胞的F5重組人纖維蛋白原)，泳道2顯示了來自CHO細胞的未還原的重組纖維蛋白原，即更寬的且更發(fā)散的泳帶，其位置低于其它未還原的纖維蛋白原；泳道3顯示了來自HEK細胞的未還原的F6重組人纖維蛋白原，其密集度高于該凝膠中的其它纖維蛋白原；泳道4顯示了來自HEK細胞的未還原的F5重組人纖維蛋白原，如前述的，其類似于泳道1中的未還原的血漿纖維蛋白原。未還原的泳道5顯示了 F6和F5的混合物，其中泳帶更密集，這最可能是由于F6的影響。在還原的PAGE凝膠上，泳道1中的A α鏈在一定程度上類似于泳道4中的A α (F5 重組人纖維蛋白原)，比來自其它纖維蛋白原的其它A α鏈更發(fā)散和更弱。泳道1中的B β 和Y鏈類似于泳道4中的相同泳帶。泳道2中來自CHO細胞的重組纖維蛋白原的Aa鏈比其它纖維蛋白原的Aa鏈更纖細和更弱；來自CHO細胞的重組纖維蛋白原的B β鏈的位置稍微低于其它纖維蛋白原的Ββ鏈。還原的泳道5顯示了 F6和F5的混合物，其中Aa 泳帶更密集，這最可能是由于F6的影響。圖5顯示了纖維蛋白原的聚合試驗。以0. 2mg/ml的濃度，測試了纖維蛋白原，用在含有IOmM CaCl2的TBS中的凝血酶 1 μ g/ml誘導聚合。顯然，根據(jù)本發(fā)明在HEK細胞中制備的F5重組人纖維蛋白原顯示出與血漿纖維蛋白原(Sigma F4883)相同的聚合曲線，而根據(jù)本發(fā)明在HEK細胞中制備的F6重組人纖維蛋白原遵循在CHO細胞中制備的重組纖維蛋白原所顯示出的聚合曲線。圖6顯示了纖維蛋白原的聚合試驗。以0. 2mg/ml的濃度，測試了纖維蛋白原，用在含有IOmM CaCl2的TBS中的凝血酶 1 μ g/ml誘導，并在這些條件下聚合。顯然，F(xiàn)5重組人纖維蛋白原顯示出與血漿纖維蛋白原 (Sigma F4883)基本上相同的聚合曲線，而F6重組人纖維蛋白原顯示出與重組人纖維蛋白原F5相比和與血漿纖維蛋白原(F488;3)相比明顯不同的聚合模式。當混合(50/50)F5和 F6時，與50/50混合物所預見到的相比，聚合曲線更接近F5。實施例前言以前已經(jīng)描述了在下述實施例中用于制備纖維蛋白原基因的Aa、Ββ和、對的基因材料購得用于制備重組纖維蛋白原的起始人纖維蛋白原Αα、Ββ和、基因，GB
14登記號為:NM_021871 (Fb_A α ) ；BC106760 (Fb_B β )和 BC021674 (Fb_ Y )，例外是登錄號 BC106760，具有在引物 5，-3，序列 SEQ ID NO 3 :GTGAATAGCAATATCC 處的 156 堿基對大小 (用于表達在位置號162處的脯氨酸)的Ββ鏈被改變?yōu)榫哂性谝?’-3’序列SEQ IDNO 4 :GTGAATAGGCAATATCG處的156堿基對大小(其編碼在位置162處的丙氨酸)的B β編碼鏈。如上所述，在目前可利用的基因材料中，尚未完全確立含有脯氨酸或含有丙氨酸的B β 是否是正確的野生型，但是，這2種不同的纖維蛋白原的最高活性形式最可能是真實的野生型——無論如何，最高活性形式是根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選形式。形成的B β纖維蛋白原氨基酸序列顯示為SEQ ID NO :2，而由BC106760最初編碼的序列顯示為SEQ ID NO :1ο實施例1 測試了構建進PHZsec載體-啟動子系統(tǒng)(經(jīng)HumanZyme許可)中的A α、B β禾口 Y纖維蛋白原基因?qū)EK 細胞(HumanZyme，并經(jīng)HumanZyme許可)以及幾種HEK細胞變體的轉(zhuǎn)染。在大腸桿菌中擴增載體，得到多載體/基因庫，隨后轉(zhuǎn)染進各個HEK細胞，并在含有血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)成單層細胞系。選擇克隆，并單獨地培養(yǎng)。選擇生產(chǎn)纖維蛋白原 (具有在β鏈中的氨基酸位置162處的丙氨酸)的克隆。選擇最佳生產(chǎn)細胞克隆，并用于適應無血清的培養(yǎng)基(HumanZyme，經(jīng)HumanZyme許可)或無血清的、化學上確定的培養(yǎng)基 (HumanZyme,經(jīng)HumanZyme許可)大約1周，以便適應細胞懸浮培養(yǎng)。在WO 2007/103447中使用和描述的以前使用的HEK293細胞系表現(xiàn)得不能轉(zhuǎn)變成懸浮培養(yǎng)，而是繼續(xù)結(jié)塊或簇集在一起。選擇另一個細胞系(來自HumanZyme的HEK293t 細胞系，經(jīng)HumanZyme許可)細胞，且表現(xiàn)得能夠適應懸浮培養(yǎng)，且經(jīng)證實會生產(chǎn)重組人纖維蛋白原。該轉(zhuǎn)化的細胞系因此繼續(xù)進入懸浮培養(yǎng)，并分離出纖維蛋白原。令人驚奇地，在IMAC(固定化金屬親和色譜法)柱上純化出2個不同的纖維蛋白原泳帶，如圖1所示。當在IMAC操作中加入20mM L-精氨酸時，出現(xiàn)一個含有重組人纖維蛋白原的顯著蛋白峰；當在IMAC操作中將L-精氨酸濃度升高至50mM時，清楚地出現(xiàn)第二個顯著的蛋白峰，其也含有重組人纖維蛋白原。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在它的聚合特征以及它在PAGE凝膠上的外觀方面，在20mM L-精氨酸時出現(xiàn)的代表重組人纖維蛋白原的蛋白峰明顯不同于在50mM L-精氨酸時出現(xiàn)的重組人纖維蛋白原；在20mM L-精氨酸時出現(xiàn)的纖維蛋白原被命名為“F5重組人纖維蛋白原”(或簡稱” F5”)。在50mM L-精氨酸時出現(xiàn)的也含有重組人纖維蛋白原的第二個蛋白峰，表現(xiàn)得在它的聚合和它的外觀方面(在下述的研究中予以描述)明顯不同于F5重組人纖維蛋白原。 出現(xiàn)在該第二個峰中的纖維蛋白原被命名為“F6重組人纖維蛋白原”或簡稱”F6”。實施例2合并含有顯著的F5蛋白峰(如在實施例1和圖1中所證實的)的級分，并上肝素柱，用TBS緩沖液洗脫。在肝素柱上進行的純化如圖2A所示。合并含有顯著的F5蛋白峰(如在實施例1和圖1中所證實的)的級分，并上肝素柱，用TBS緩沖液洗脫。在肝素柱上進行的純化如圖2B所示。實施例3
通過PAGE凝膠電泳，單個地測試純化的F5和F6重組人纖維蛋白原，如圖3所示。 結(jié)果表明，在凝膠上的未還原的F5重組人纖維蛋白原顯示出比關于F6所觀察到的泳帶更寬的泳帶，F(xiàn)6未還原的泳帶顯得更分離，且模糊性更低。當F5被還原時，"F5A α，，顯得比“F6A α，，更發(fā)散，“F6A α，，顯得更分離且相對濃度更高，而在“F5Bi3 “和”F6Bi3 ”之間，以及在“F5y “和”F6Y “泳帶之間，存在更少的差
已實施例4使用PAGE凝膠電泳，進行了纖維蛋白原的下述對比。在圖4左側(cè)的泳道中，顯示了未還原的纖維蛋白原蛋白，在右側(cè)，顯示了還原的纖維蛋白原蛋白。在左側(cè)和右側(cè)泳道1中，應用了未還原的和還原的血漿纖維蛋白原(Sigma F4883)。在左側(cè)和右側(cè)泳道2中，顯示了從CHO細胞制備的未還原的和還原的重組纖維蛋白原。在左側(cè)和右側(cè)泳道3中，顯示了未還原的和還原的F6重組人纖維蛋白原，在左側(cè)和右側(cè)泳道4中，顯示了未還原的和還原的F5重組人纖維蛋白原。結(jié)果表明，在未還原的泳道中，血漿纖維蛋白原(Sigma F4883)類似于未還原的 F5重組人纖維蛋白原。將該令人感興趣的觀察結(jié)果與在實施例5中揭示的關于聚合的觀察結(jié)果相對比。在泳道3中，來自HEK細胞的未還原的F6重組人纖維蛋白原不同于其它未還原的纖維蛋白原，因為泳帶是狹窄的且分離的。泳道5是F6和F5重組人纖維蛋白原的 50/50混合物。未還原的泳道5顯示了 F6和F5的混合物(50/50)，其中泳帶更密集，這最可能是由于F6的影響(圖4)。血漿纖維蛋白原的A α (在還原的泳道1中)和重組纖維蛋白原F5的還原的A α 鏈(在泳道4中)似乎沒有表現(xiàn)出任何顯著的差異，盡管仔細檢查凝膠確實表明，還原的泳道1含有2個分開的A α泳帶(一個是發(fā)散的，一個是在該發(fā)散泳帶上面緊鄰處更清楚的)，而還原的泳道4僅含有1個模糊的泳帶；這可能暗示，血漿纖維蛋白原實際上含有2 種不同的Aa物質(zhì)。血漿纖維蛋白原的還原的Ββ鏈類似于F5重組人纖維蛋白原的還原的Ββ鏈，而且血漿纖維蛋白原的還原的Y鏈也在一定程度上類似于F5重組人纖維蛋白原的還原的Y鏈。與其它未還原的纖維蛋白原中的任一種相比，來自CHO細胞的未還原的重組纖維蛋白原在泳道2中的位置明顯更低，且相對更發(fā)散和更寬。這最可能是由于下述事實，即 CHO細胞是倉鼠衍生出的細胞，與在人細胞中制備的重組人纖維蛋白原相比，其提供不同的糖基化模式——糖基化模式由轉(zhuǎn)染的細胞的性質(zhì)決定，而不是由轉(zhuǎn)染到細胞中的基因決定，或換而言之，不是由插入特定細胞中的基因決定，而是由翻譯后修飾(PTM)決定。因此， 宿主細胞的選擇可以在它們的物理和化學性質(zhì)方面(例如，MW、P〗、折疊、穩(wěn)定性和生物活性)改變所得到的加工過的和分泌的糖蛋白。也認識到，磷酸化由翻譯后修飾決定。還原的泳道3顯示了來自HEK細胞的F6重組人纖維蛋白原，與在任意其它纖維蛋白原中所觀察到的結(jié)果相比，其顯示出明顯更強的和更密集的Aa泳帶(圖4)。當觀察還原的泳道3(F6)時，令人感興趣的是，與來自其它纖維蛋白原的還原的 Aa鏈相比，來自人細胞的重組人纖維蛋白原的還原的Aa鏈是非常纖細且密集的泳帶。結(jié)果還表明，來自CHO細胞的重組纖維蛋白原的還原的Ββ和γ鏈的位置低于其它纖維蛋白原的還原的Ββ和γ鏈。所以，基于在非還原條件下和在還原條件下泳帶的位置，所述重組纖維蛋白原是不同的。代表來自人細胞的未還原的F6重組人纖維蛋白原的泳道4不同于其它未還原的纖維蛋白原，因為如前所述的，與其它未還原的纖維蛋白原相比，Aa泳帶是更密集的且更不發(fā)散。還原的泳道5顯示了 F6和F5的混合物，其中A α泳帶更密集，這最可能是由于F6的影響(圖4)。實施例5將血漿纖維蛋白原(Sigma F4883)的聚合與來自CHO細胞的重組纖維蛋白原、F5 重組人纖維蛋白原和F6重組人纖維蛋白原(后二者根據(jù)本發(fā)明在轉(zhuǎn)染的HEK細胞中制備) 的聚合進行了對比。在該試驗中，以0. 2mg/mL的濃度，加入纖維蛋白原，并用在含有IOmM CaCl2的TBS中的凝血酶1 μ g/ml誘導。該研究證實，F(xiàn)5重組人纖維蛋白原顯示出與血漿纖維蛋白原基本上相同的聚合曲線，而F6重組人纖維蛋白原顯示出不同的聚合曲線。F6聚合曲線在某種程度上類似于來自 CHO的重組纖維蛋白原所顯示的聚合曲線，參照圖5。實施例6將血漿纖維蛋白原(Sigma F4883)的聚合與重組人纖維蛋白原F5、重組人纖維蛋白原F6、以及F5重組人纖維蛋白原和F6重組人纖維蛋白原的50/50混合物的聚合進行了對比。在該試驗中，以0. 2mg/mL的濃度，加入纖維蛋白原，并用在含有IOmM CaCl2的TBS中的凝血酶1 μ g/ml誘導。結(jié)果再次表明，重組人纖維蛋白原F5顯示出與血漿纖維蛋白原(Sigma F4883)相同水平的聚合曲線。重組人纖維蛋白原F6再次顯得明顯不同于重組人纖維蛋白原F5和血漿纖維蛋白原(Sigma F4883)。當檢查在這些條件下的聚合開始時，測試的所有纖維蛋白原似乎大致同時聚合， 具有微小的非顯著的差異。當以50/50混合F5和F6時，預期聚合會表現(xiàn)出幾乎在F5和F6 水平之間的曲線，但是相反，令人驚訝地證實，F(xiàn)5/F6混合物遠遠更接近F5和血漿纖維蛋白原。該發(fā)現(xiàn)表明這樣的導向，即使在可能的血漿纖維蛋白原F5和可能的血漿纖維蛋白原F6的理論混合物中，聚合特征可能由纖維蛋白原F5(而不是F6)控制，這可以反駁F6 可能在血漿中退化(由于纖維蛋白原F6的穩(wěn)定性更低)，還反駁在F6的血漿纖維蛋白原的熱處理過程中可能被滅活，這是由于下述事實，即在整個測試之前和過程中，兩種重組人纖維蛋白原F5和F6保持在相同條件下。實際上，在聚合試驗之前，在-80°C保存重組纖維蛋白原F5和F6。
權利要求
1.一種用于制備纖維蛋白原的方法，所述方法包括提供用編碼單個纖維蛋白原鏈的表達載體轉(zhuǎn)染的細胞，隨后在便于所述細胞生產(chǎn)纖維蛋白原的條件下，培養(yǎng)所述細胞，隨后回收所述纖維蛋白原，并分離以至少2種翻譯后修飾的物質(zhì)存在的所述纖維蛋白原，所述至少2種翻譯后修飾的物質(zhì)通過在PAGE凝膠中的不同遷移模式進行區(qū)分，和/或通過凝血酶活化后的不同聚合進行區(qū)分。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述纖維蛋白原是人纖維蛋白原或在每個纖維蛋白原鏈中包含至多10個氨基酸突變的人纖維蛋白原。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)染的細胞由選自人細胞克隆或人細胞系的人細胞組成。
4.根據(jù)權利要求4所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)染的細胞是HEK細胞，諸如HEK293t和 HEK293ts 細胞。
5.根據(jù)權利要求2-4中任一項所述的方法，其中所述人纖維蛋白原分離成為至少2種翻譯后修飾的形式，其中一種(冊)具有與血清纖維蛋白原類似的PAGE遷移模式和聚合特征，且其中另一種(F6)具有泳帶強度不同的PAGE遷移模式但具有與CHO細胞表達的纖維蛋白原類似的聚合特征。
6.一種基本上純的人纖維蛋白原制品，其不含有非-纖維蛋白原血清蛋白，且其中所述纖維蛋白原由下述物質(zhì)組成a)F5纖維蛋白原，b)F6纖維蛋白原，或c)F5和F6纖維蛋白原的混合物。
7.根據(jù)權利要求6所述的基本上純的制品，其中所述纖維蛋白原是天然的人纖維蛋白原或在每個纖維蛋白原鏈中包含至多10個氨基酸突變的人纖維蛋白原。
8.根據(jù)權利要求7所述的基本上純的制品，其中所述人纖維蛋白原包含非脯氨酸作為 β -鏈中的氨基酸殘基162，諸如丙氨酸殘基。
9.一種治療或預防個體中的出血的方法，所述方法包括給所述個體施用有效量的根據(jù)權利要求6-8中任一項所述的制品或通過權利要求1-5中任一項所述的方法得到的纖維蛋白原。
10.根據(jù)權利要求9所述的方法，其中施用所述根據(jù)權利要求6-8中任一項所述的制品或通過權利要求1-5中任一項所述的方法得到的纖維蛋白原有效地基本上維持或恢復斷裂的/受損傷的脈管系統(tǒng)的凝血能力。
11.根據(jù)權利要求9或10所述的方法，其中在所述治療或預防之前，所述個體遭受出血或易于出血，所述出血由下述原因引起功能性纖維蛋白原的功能障礙或缺乏，損傷，過去的或?qū)淼氖中g治療，產(chǎn)后出血，彌漫性血管內(nèi)凝血，和器官移植。
12.根據(jù)權利要求11所述的方法，其中系統(tǒng)地施用有效量的根據(jù)權利要求6-8中任一項所述的制品或通過權利要求1-5中任一項所述的方法得到的纖維蛋白原。
13.根據(jù)權利要求11所述的方法，其中表面地或局部地施用有效量的根據(jù)權利要求 6-8中任一項所述的制品或通過權利要求1-5中任一項所述的方法得到的纖維蛋白原，其任選地與凝血酶或其類似物相組合。
14.根據(jù)權利要求13所述的方法，其中施用所述制品或纖維蛋白原、凝血酶或其類似物，從而將器官或細胞粘合在一起。
15.根據(jù)權利要求13所述的方法，其中施用所述制品或纖維蛋白原、凝血酶或其類似物，從而實現(xiàn)止血。
16.一種將細胞或組織移植給個體的方法，所述方法包括給所述個體施用有效量的根據(jù)權利要求6-8中任一項所述的制品或通過權利要求1-5中任一項所述的方法得到的纖維蛋白原，其任選地與細胞和/或組織因子和/或凝血酶和/或凝血酶類似物的施用相組合O
17.一種將諸如干細胞或祖細胞或前體細胞的細胞粘附到個體中的靶位置的方法，所述細胞會粘附在所述靶位置，以便適當?shù)匦惺构δ?，修復鄰近的細胞和組織，所述方法包括給所述個體施用有效量的根據(jù)權利要求6-8中任一項所述的制品或通過權利要求1-5 中任一項所述的方法得到的纖維蛋白原，其任選地與凝血酶或凝血酶類似物的施用相組合O
18.一種連接個體中的手術傷口的方法，所述方法包括給所述個體施用有效量的根據(jù)權利要求6-8中任一項所述的制品或通過權利要求1-5中任一項所述的方 法得到的纖維蛋白原，其任選地與凝血酶或其類似物相組合。
19.根據(jù)權利要求9-18中任一項所述的方法，其中所述個體是人類。
20.一種將細胞粘附到固體或半固體表面上的方法，其中使所述細胞和所述固體或半固體表面接觸根據(jù)權利要求6-8中任一項所述的制品或通過權利要求1-5中任一項所述的方法得到的纖維蛋白原。
21.—種試劑盒，其在單獨的容器或器皿中包含1)根據(jù)權利要求6-8中任一項所述的制品或通過權利要求1-5中任一項所述的方法得到的纖維蛋白原，和2、凝血酶或其類似物，以及任選的3)因子XIII。
22.根據(jù)權利要求21所述的試劑盒，其中1)根據(jù)權利要求6-8中任一項所述的制品或通過權利要求1-5中任一項所述的方法得到的纖維蛋白原和/或2、凝血酶或其類似物和 /或幻因子XIII是干燥形式，諸如冷凍干燥形式。
23.根據(jù)權利要求6-8中任一項所述的制品或通過權利要求1-5中任一項所述的方法得到的纖維蛋白原，其用作藥物。
24.根據(jù)權利要求6-8中任一項所述的制品或通過權利要求1-5中任一項所述的方法得到的纖維蛋白原，其用在根據(jù)權利要求9-19中任一項所述的方法中。
全文摘要
本發(fā)明提供了纖維蛋白原(尤其是人纖維蛋白原)的新穎的翻譯后修飾的變體，用于生產(chǎn)和分離所述變體的方法，以及使用所述變體的方法，尤其是用于系統(tǒng)地和局部地/表面地治療和預防過量出血。
文檔編號A61K31/405GK102481346SQ201080026316
公開日2012年5月30日 申請日期2010年4月13日 優(yōu)先權日2009年4月14日
發(fā)明者庫爾特·奧斯特 申請人:胡瑪基因公司