本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種D-二聚體檢測(cè)試劑盒及其制備方法。

背景技術(shù)：

纖維蛋白溶解系統(tǒng)是人體最重要的抗凝系統(tǒng)，它對(duì)保持血管壁的正常通透性及維持血液的流動(dòng)狀態(tài)和組織修復(fù)起著重要作用，該系統(tǒng)主要由4部分組成：纖溶酶原、纖溶酶原激活劑、纖溶酶、纖溶酶抑制物。當(dāng)纖維蛋白凝結(jié)塊形成時(shí)，在纖溶酶原激活劑的存在下，纖溶酶原激活轉(zhuǎn)化為纖溶酶，纖維蛋白開(kāi)始溶解，纖溶酶降解纖維蛋白原和交聯(lián)纖維蛋白形成各種可溶性片段，統(tǒng)稱(chēng)纖維蛋白原降解產(chǎn)物(FDP)。其中，D-二聚體是降解產(chǎn)物中最小片段，是交聯(lián)纖維蛋白的特異性降解產(chǎn)物。

在正常生理狀態(tài)下，人體正常D-二聚體的水平小于200μg/L，機(jī)體內(nèi)維持著凝血與纖溶系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡，以保證纖維蛋白的及時(shí)形成與清除。一旦這種動(dòng)態(tài)平衡被破壞，血管內(nèi)凝血傾向增強(qiáng)，纖維蛋白增多，纖維蛋白降解產(chǎn)物增加，D-二聚體含量增加。因此，D-二聚體含量的升高反映了體內(nèi)凝血和纖溶系統(tǒng)的雙重激活，可作為體內(nèi)高凝狀態(tài)和纖溶亢進(jìn)的敏感標(biāo)記物(參見(jiàn)《臨床血液學(xué)雜志》，2011年，鄧家棟，臨床血液學(xué)[M])，因此D-二聚體的含量變化可以用來(lái)檢測(cè)具有凝血和纖溶過(guò)程的一類(lèi)疾病，如深靜脈血栓、肺栓塞(PE)、彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)、重癥肝炎等疾病的檢測(cè)。另外D-二聚體測(cè)定法還可作為PE的敏感、快速的初步篩選指標(biāo)(參見(jiàn)《臨床肺科雜志》，2011年11卷，陳曉燕；定量測(cè)定血漿D-二聚體在肺栓塞診斷中的意義)。

目前臨床常用的D-二聚體檢測(cè)方法主要包括：乳膠凝集法、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、膠乳增強(qiáng)免疫比濁法、免疫金標(biāo)法等。其中乳膠凝集法操作簡(jiǎn)單，快速，適用于急診檢測(cè)，但是只能用于定性或半定量的檢測(cè)，常作為篩查用；酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法精確，定量，敏感性高，但操作要求嚴(yán)格，步驟繁瑣，不適用于急診和臨床病人的快速診斷和監(jiān)測(cè)；免疫金標(biāo)法具有乳膠凝集法的易于操作、快速，又具有ELISA法準(zhǔn)確、定量的特點(diǎn)，但類(lèi)風(fēng)濕因子、肝素及血脂等對(duì)其檢測(cè)的結(jié)果具有一定的干擾，不適于大規(guī)模推廣使用；膠乳免疫比濁法具有操作簡(jiǎn)便、快速、定量準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)、敏感度高等優(yōu)點(diǎn)，可滿足門(mén)診和急診的需要，在臨床應(yīng)用中越來(lái)越廣泛。但現(xiàn)有的利用膠乳免疫比濁法制備的D-二聚體測(cè)定試劑盒大多使用聚乙二醇或葡聚糖作為促凝劑，這也導(dǎo)致了下述缺點(diǎn)，例如在試劑盒靈敏度提高時(shí)，就會(huì)造成了線性范圍窄、穩(wěn)定性欠佳等缺點(diǎn)；而進(jìn)口試劑盒價(jià)格昂貴、檢測(cè)成本高，不利于該檢測(cè)項(xiàng)目在臨床診斷中的推廣應(yīng)用。

綜上所述，提供一種線性范圍廣、穩(wěn)定性好、成本低廉的D-二聚體測(cè)定試劑盒是目前我們亟需解決的問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種D-二聚體檢測(cè)試劑盒及其制備方法，使得D-二聚體測(cè)定試劑盒線性范圍廣、穩(wěn)定性好、成本低廉。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的實(shí)施方式提供了一種D-二聚體檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包含：緩沖液、D-二聚體、促凝劑、穩(wěn)定劑以及防腐劑，其中，促凝劑為聚乙烯吡絡(luò)烷酮。

另外，本實(shí)施方式還提供了一種D-二聚體檢測(cè)試劑盒的制備方法，該方法包含以下步驟：聚苯乙烯微球的活化：用緩沖液將聚苯乙烯粒子稀釋后，加入N-羥基琥珀酰亞胺溶液，混合均勻、攪拌，在攪拌中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽溶液，繼續(xù)攪拌反應(yīng)30～60min之后離心、超聲洗滌溶解到緩沖液中，即得到聚苯乙烯微球溶液；抗體的偶聯(lián)：向聚苯乙烯微球溶液中加入抗體溶液，震蕩反應(yīng)90～120min；微球的封閉：向震蕩反應(yīng)過(guò)程中的混合液加入牛血清白蛋白；洗滌、溶解：將震蕩反應(yīng)結(jié)束后的混合物經(jīng)過(guò)離心、超聲洗滌后，溶解到緩沖液中，即得D-二聚體檢測(cè)試劑盒。

本發(fā)明實(shí)施方式相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)而言，通過(guò)在D-二聚體檢測(cè)試劑盒加入作為促凝劑的聚乙烯吡絡(luò)烷酮(PVP)，使得D-二聚體檢測(cè)試劑盒不僅可以促進(jìn)抗原抗體的結(jié)合，使其快速形成復(fù)合物，又能抑制免疫復(fù)合物的解離，使沉淀出現(xiàn)快，提高了檢測(cè)的速度；而且還不會(huì)因此而擴(kuò)大非特異性范圍，使得D-二聚體檢測(cè)試劑盒保持一個(gè)寬的線性范圍。另外，PVP可將D-二聚體單克隆抗體固定在乳膠微粒上，可特異性的增強(qiáng)濁度的變化，從而提高試劑盒的檢測(cè)靈敏度。

另外，要求R1和R2試劑中的緩沖液的可調(diào)節(jié)pH范圍在7.0～9.0之間，優(yōu)選為以下之一：三羥甲基氨基甲烷緩沖液、磷酸鹽緩沖液，與其他緩沖液相比，這兩種緩沖液具有緩沖能力強(qiáng)、溶解度高、很好的生物想任性和反應(yīng)惰性，且pH隨溫度和稀釋度的改變而改變很小的優(yōu)點(diǎn)。

另外，D-二聚體為聚苯乙烯微球包被的D-二聚體。聚苯乙烯微球與D-二聚體的包被是通過(guò)化學(xué)偶聯(lián)完成反應(yīng)，其結(jié)合力要比物理吸附更強(qiáng)，不容易被洗脫，試劑的穩(wěn)定性更好。

另外，穩(wěn)定劑為以下之一或其任意組合：離子穩(wěn)定劑、懸浮穩(wěn)定劑；防腐劑為以下之一或其任意組合：疊氮鈉、硫柳汞、苯酚、乙基汞硫代硫酸鈉，這些防腐劑防腐效果好，毒性低，為比較常用的防腐劑。

另外，離子穩(wěn)定劑為以下之一或其組合：氯化鈉、氯化鉀，懸浮穩(wěn)定劑為聚乙二醇，少量的聚乙二醇既可以起到穩(wěn)定劑的作用，與離子穩(wěn)定劑一起作用可以使試劑的穩(wěn)定性提高。

另外，聚苯乙烯微球的活化步驟中的緩沖液為2-(N-嗎啡啉)乙磺酸緩沖液，其中，緩沖液的濃度為25～50mM，pH為5.5～6.5。在此條件下聚苯乙烯微球上的羧基活化程度最大，有利于結(jié)合更多的抗體，提高偶聯(lián)率，從而增加試劑檢測(cè)的靈敏度。

另外，通過(guò)實(shí)驗(yàn)探索的結(jié)果，最終優(yōu)選N-羥基琥珀酰亞胺溶液以及1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽溶液的濃度分別為80～100mg/mL和8～10mg/mL。

另外，聚苯乙烯微球的活化步驟中的聚苯乙烯粒子的粒徑為60～500nm。這一寬的粒徑范圍，有利于在制備過(guò)程中，改善試劑的靈敏度和提高線性范圍。

另外，通過(guò)實(shí)驗(yàn)探索，在聚苯乙烯微球的活化以及洗滌、溶解步驟中，最佳的離心的速率為18000～20000rpm，離心的時(shí)間為1～30min；超聲的時(shí)間為1～5min，這樣可以保證抗體可以在粒子很快均勻分散，增加抗體與粒子的偶聯(lián)率。

附圖說(shuō)明

圖1是根據(jù)本發(fā)明第一實(shí)施方式中的校準(zhǔn)曲線；

圖2是根據(jù)本發(fā)明第一實(shí)施方式中的靈敏度檢測(cè)曲線；

圖3是根據(jù)本發(fā)明第一實(shí)施方式中的相關(guān)性檢測(cè)曲線。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的各實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)的闡述。然而，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解，在本發(fā)明各實(shí)施方式中，為了使讀者更好地理解本申請(qǐng)而提出了許多技術(shù)細(xì)節(jié)。但是，即使沒(méi)有這些技術(shù)細(xì)節(jié)和基于以下各實(shí)施方式的種種變化和修改，也可以實(shí)現(xiàn)本申請(qǐng)所要求保護(hù)的技術(shù)方案。

本發(fā)明的第一實(shí)施方式涉及一種D-二聚體檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包含：緩沖液、D-二聚體、促凝劑、穩(wěn)定劑以及防腐劑，其中，促凝劑為聚乙烯吡絡(luò)烷酮(簡(jiǎn)稱(chēng)：PVP)。

值得注意的是，在本實(shí)施方式中，緩沖液可以是三羥甲基氨基甲烷緩沖液，緩沖液還可以是磷酸鹽緩沖液；或者緩沖液也可以是上述兩種緩沖液的組合。

值得注意的是，在本實(shí)施方式中，D-二聚體可以為聚苯乙烯微球包被的D-二聚體。

進(jìn)一步地，在本實(shí)施方式中，穩(wěn)定劑可以是離子穩(wěn)定劑；穩(wěn)定劑還可以是懸浮穩(wěn)定劑；或者穩(wěn)定劑還可以是上述兩種穩(wěn)定劑的組合，另外，防腐劑可以是疊氮鈉；或者硫柳汞；或者苯酚；或者乙基汞硫代硫酸鈉；或者上述4種防腐劑的組合，本實(shí)施方式不應(yīng)以此為限。

另外，在本實(shí)施方式中，離子穩(wěn)定劑可以是氯化鈉；或者氯化鉀，懸浮穩(wěn)定劑可以為聚乙二醇。

在實(shí)際使用D-二聚體檢測(cè)試劑盒過(guò)程中，通常將D-二聚體檢測(cè)試劑盒分成R1試劑、R2試劑以及校準(zhǔn)品，其中，R1試劑成分中含有緩沖液、促凝劑、穩(wěn)定劑、防腐劑；R2試劑成分中含有緩沖液、包被了抗D-二聚體抗體的聚苯乙烯粒子、防腐劑；校準(zhǔn)品含有：纖維蛋白降解產(chǎn)物D-二聚體、緩沖液、穩(wěn)定劑、防腐劑。

具體地，R1試劑的緩沖液優(yōu)選HEPES緩沖液，pH在7.0-8.5之間；促凝劑選擇PVP-K90和PVP-K25混合，可以加快免疫反應(yīng)的速度，縮短檢測(cè)時(shí)間，終濃度為1.6-5.0％之間；穩(wěn)定劑可以為Nacl，濃度為0.2-0.5％之間；防腐劑疊氮鈉的濃度可以為0.1％；

R2試劑是由抗人D-二聚體單克隆抗體與羧基化的聚苯乙烯微球在MES緩沖液中通過(guò)化學(xué)交聯(lián)法致敏，之后經(jīng)過(guò)離心，洗滌后，在含有穩(wěn)定劑和防腐劑的Good’s緩沖液中分散而成。

下面通過(guò)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)本實(shí)施方式配置的D-二聚體檢測(cè)試劑盒的各項(xiàng)參數(shù)：1.D-二聚體檢測(cè)試劑盒R1試劑的制備

D-二聚體檢測(cè)試劑盒R1試劑的配方如表1：

2.D-二聚體檢測(cè)試劑盒R2試劑的配制

D-二聚體檢測(cè)試劑盒R2試劑稀釋液的配方如表2：

3.洗滌液配方如表3：

4.羧基化聚苯乙烯微球與抗體的偶聯(lián)過(guò)程

a.取20mg粒徑為160nm羧基化聚苯乙烯微球，用25mM pH6.0的MES緩沖液通過(guò)離心、超聲洗滌1-2次；

b.將沉淀用MES稀釋到10mg/mL混勻之后，加入0.5mL和0.75mL的EDC(10mg/mL)和NHS(100mg/mL)溶液活化聚苯乙烯微球上的羧基，室溫下震蕩反應(yīng)30min；

c.活化結(jié)束之后，離心棄去上清，取2.0mL 25mM pH6.0的MES溶解，并用超聲混合均勻之后，加入18mg/mL的D-二聚體單克隆抗體，室溫震蕩下交聯(lián)90min，之后加入0.1％的BSA，室溫震蕩封閉30min；

d.用25mM pH6.0的MES緩沖液洗滌2次；再用50mM pH7.4的MOPSO洗滌一次；

e.加入4.0mL含有50mM pH7.4的HEPES，100mM，0.1％BSA溶液中，2-8℃保存。

5.校準(zhǔn)品的配制

a.取適量的纖維蛋白溶解于HEPES緩沖液中，使其濃度為20mg/mL，加入適量的纖溶酶(終濃度為2.0u/mL)，在37℃下攪拌過(guò)夜反應(yīng)，最后離心得到纖維蛋白的降解產(chǎn)物D-二聚體溶液；

b.以積水的D-二聚體校準(zhǔn)品為標(biāo)準(zhǔn)，采用其D-二聚體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)試，求出其平均值，得到D-二聚體溶液的初始濃度。

c.將d-二聚體用HEPES緩沖液稀釋幾個(gè)不同的濃度，再加入終濃度分別為50mg/mL、20mg/mL、0.9％、0.15％的BSA、甘露醇、氯化鈉、疊氮鈉混合均勻，以每瓶0.5mL分裝進(jìn)行冷凍干燥，每次使用時(shí)加入0.5mL純化水復(fù)溶30min左右。

6.檢測(cè)樣本的方法

(1)取出試劑盒中D-二聚體校準(zhǔn)品，精準(zhǔn)加入0.5mL的純化水復(fù)溶，并用生理鹽水配制成9個(gè)濃度梯度，分別為1.0mg/mL、5.0mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL；

(2)以東芝7100為例：測(cè)定主波長(zhǎng)為570nm，副波長(zhǎng)800nm；分別取不同濃度的校準(zhǔn)品溶液8.0uL，加入d-二聚體稀釋液8.0μL，在37℃下反應(yīng)30s后加入D-二聚體R1試劑240uL，反應(yīng)60s后加入D-二聚體R2試劑60uL，在37℃下混合均勻，孵育約20s后讀取第一次吸光度(A1)，在孵育約5min，讀取第二次吸光度(A2)，計(jì)算吸光度變化△A＝A2-A1；

(3)6點(diǎn)非線性校準(zhǔn)曲線定標(biāo)法：以空白樣本定值為0.0mg/L，依次對(duì)校準(zhǔn)品a、b、c、d、e測(cè)定相應(yīng)的△A(A2-A1)值，以△A為Y軸，濃度為X軸；校準(zhǔn)曲線y＝18.827x+14.031，相關(guān)系數(shù)R²＝0.998(見(jiàn)附圖1)。

使用上述反應(yīng)所得的聚苯乙烯微球-D-二聚體單克隆抗體試劑，使用上述檢測(cè)方法進(jìn)行靈敏度檢測(cè)。以5％人血清白蛋白為空白，平均測(cè)定15次，計(jì)算結(jié)果如表4所示，均值為0.6，標(biāo)準(zhǔn)差S為0.23。再以稀釋后的D-二聚體校準(zhǔn)品溶液測(cè)定，在R1試劑中加入不同濃度的和不同類(lèi)型的促凝劑。

從表4的結(jié)果可以看出，使用PVP和DT處理的R1試劑，與空白相比靈敏度都有了很大的提高，但是在同樣的濃度下，PVP處理過(guò)后的效果要比DT的更好，靈敏度提高了很多，這說(shuō)明作為促凝劑PVP的效果更好。因此再以下實(shí)例中都用加入2.5％的PVP-K90/25的R1試劑測(cè)試。

將接近線性范圍上限的D-二聚體高值樣本(1000ug/L)，用生理鹽水按照1/640、1/320、1/160、1/80、1/40、1/20、1/10-1稀釋?zhuān)才渲?6個(gè)濃度梯度，用實(shí)施例1中的測(cè)試樣本的方法測(cè)試，將測(cè)定的平均值與理論濃度進(jìn)行線性回歸分析最終得出結(jié)果為，相關(guān)系數(shù)R²＝0.9963，線性回歸方程為y＝1.0627x-0.4014(見(jiàn)附圖2)。

將濃度為0.05mg/mL的D-二聚體校準(zhǔn)品溶液，分別加入相同體積的各干擾物質(zhì)溶液，加入后的濃度分別為游離型膽紅素(450mg/mL)、血紅蛋白(5g/L)、甘油三酯(15mM)、Vc(600mg/mL)、乳糜(福爾馬肼)濁度為(2940)。用本發(fā)明提供的試劑盒與市售對(duì)照試劑盒分別對(duì)每個(gè)樣本重復(fù)測(cè)定3次，求取平均值，與加入相同體積的純化水比較，觀察加入干擾物質(zhì)與加入純化水后D-二聚體測(cè)定結(jié)果的相對(duì)誤差。結(jié)果如表5所示：

從表中的結(jié)果可以看出本發(fā)明提供的試劑盒在對(duì)加入以上干擾物與加入同體積純化水后測(cè)定值的相對(duì)誤差小于3％，即認(rèn)為在中輕度溶血、黃疸、或乳糜時(shí)，本發(fā)明提供的試劑盒的檢測(cè)結(jié)果幾乎不受干擾；二對(duì)照試劑盒的測(cè)試結(jié)果相對(duì)誤差較大，容易受膽紅素、血紅蛋白等物質(zhì)的影響，不利于疾病的正確診斷。

取正常人血和患者的血液樣本共90份，加入肝素鈉抗凝混合均勻之后，離心獲得血漿。用本發(fā)明實(shí)施方式中的試劑盒和積水公司生產(chǎn)的D-二聚體檢測(cè)試劑盒分別對(duì)樣本檢測(cè)，分別計(jì)算檢測(cè)均值，得出兩者的相關(guān)系數(shù)，并進(jìn)行線性回歸。最終得出結(jié)果為，兩種試劑盒的相關(guān)系數(shù)R²＝0.9903，線性回歸方程為y＝1.261x+0.026(見(jiàn)附圖3)。由此可見(jiàn)本發(fā)明提供的試劑盒在臨床上對(duì)于深靜脈血拴、彌漫性血管內(nèi)凝血及肺栓塞等疾病的診斷和病程檢測(cè)具有同樣的準(zhǔn)確率，可在臨床上代替進(jìn)口試劑盒的使用，減低檢測(cè)成本。

不難發(fā)現(xiàn)，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明實(shí)施方式中的D-二聚體檢測(cè)試劑盒具有下述優(yōu)點(diǎn)：

(1)本發(fā)明實(shí)施方式中的D-二聚體檢測(cè)試劑盒具有較高的檢測(cè)靈敏度，最低檢測(cè)限可達(dá)到0.1μg/mL；操作簡(jiǎn)單，快速。

(2)本發(fā)明實(shí)施方式中的D-二聚體檢測(cè)試劑盒特異性強(qiáng)，在一定范圍內(nèi)不受其他物質(zhì)的干擾；

(3)本發(fā)明實(shí)施方式中的D-二聚體檢測(cè)試劑盒線性范圍廣，在(0.5～40)mg/L范圍內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)r≥0.99，(0.5～10)mg/L范圍內(nèi)，線性絕對(duì)偏差應(yīng)不超過(guò)±1.0mg/L；

(4)本發(fā)明實(shí)施方式中的D-二聚體檢測(cè)試劑盒穩(wěn)定性好，在2-8℃至少可保存24個(gè)月，試劑開(kāi)瓶后可以保存45天；比現(xiàn)有市售的試劑盒開(kāi)瓶后保存時(shí)間久；

(5)本發(fā)明實(shí)施方式中的D-二聚體檢測(cè)試劑盒與對(duì)照試劑相比，其檢測(cè)的結(jié)果準(zhǔn)確可靠，且成本低，可在醫(yī)院中推廣使用。

本發(fā)明的第二實(shí)施方式涉及一種D-二聚體檢測(cè)試劑盒的制備方法，該方法包含以下步驟：

聚苯乙烯微球的活化：用緩沖液將聚苯乙烯粒子稀釋后，加入N-羥基琥珀酰亞胺溶液，混合均勻、攪拌，在攪拌中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽溶液，繼續(xù)攪拌反應(yīng)30～60min之后離心、超聲洗滌溶解到緩沖液中，即得到聚苯乙烯微球溶液；

抗體的偶聯(lián)：向聚苯乙烯微球溶液中加入抗體溶液，震蕩反應(yīng)90～120min；

微球的封閉：向震蕩反應(yīng)過(guò)程中的混合液加入牛血清白蛋白；

洗滌、溶解：將震蕩反應(yīng)結(jié)束后的混合物經(jīng)過(guò)離心、超聲洗滌后，溶解到緩沖液中。

進(jìn)一步地，聚苯乙烯微球的活化步驟中的緩沖液可以為2-(N-嗎啡啉)乙磺酸緩沖液，其中，緩沖液的濃度可以為25～50mM，pH為5.5～6.5。

具體地，N-羥基琥珀酰亞胺溶液以及1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽溶液的濃度分別可以為80～100mg/mL和8～10mg/mL。

值得一提的是，聚苯乙烯微球的活化步驟中的聚苯乙烯粒子的粒徑可以為60～500nm。

另外，在聚苯乙烯微球的活化以及洗滌、溶解步驟中，離心的速率可以為18000～20000rpm，離心的時(shí)間可以為1～30min；超聲的時(shí)間可以為1～5min。

具體地，本實(shí)施方式詳細(xì)地反應(yīng)步驟如下：

(1)聚苯乙烯微球的活化：取0.2mL粒徑為500nm的聚苯乙烯粒子用濃度為25mM，pH為5.5的2-(N-嗎啡啉)乙磺酸緩沖液稀釋到質(zhì)量體積比(即：溶質(zhì)的質(zhì)量與溶液的體積之比)為20mg/mL后，再加入200μL、濃度為100mg/mL的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶液，混合均勻，然后攪拌中加入80μL、濃度為10mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)溶液，室溫下攪拌反應(yīng)30min之后離心洗滌超聲溶解到緩沖液中。

(2)抗體的偶聯(lián)：向第一步活化洗滌過(guò)的微球溶液中加入2mg的抗體溶液，在室溫下震蕩反應(yīng)90min。

(3)微球的封閉：在偶聯(lián)完成時(shí)向步驟(2)中的混合液中加入6mg的牛血清白蛋白對(duì)微球表面沒(méi)有偶聯(lián)蛋白質(zhì)的殘留位點(diǎn)進(jìn)行封閉，室溫震蕩封閉30min。

(4)洗滌、溶解：將反應(yīng)結(jié)束的混合物經(jīng)過(guò)離心、超聲洗滌2-3次，其中，離心的速率可以為20000rpm，離心的時(shí)間可以為30min；超聲的時(shí)間可以為5min，最后溶解到Good’s緩沖液中，即完成D-二聚體檢測(cè)試劑盒的制備。

本發(fā)明的第三實(shí)施方式涉及一種D-二聚體檢測(cè)試劑盒的制備方法，該方法包含以下步驟：

(1)聚苯乙烯微球的活化：取0.2mL粒徑為500nm的聚苯乙烯粒子用濃度為50mM，pH為6.5的2-(N-嗎啡啉)乙磺酸緩沖液稀釋到稀釋到質(zhì)量體積比(即：溶質(zhì)的質(zhì)量與溶液的體積之比)為10mg/mL后，再加入200μL、濃度為80mg/mL的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶液，混合均勻，然后攪拌中加入80μL、濃度為8mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)溶液，室溫下攪拌反應(yīng)30min之后離心洗滌超聲溶解到緩沖液中。

(2)抗體的偶聯(lián)：向第一步活化洗滌過(guò)的微球溶液中加入2mg的抗體溶液，在室溫下震蕩反應(yīng)90min。

(3)微球的封閉：在偶聯(lián)完成時(shí)向步驟(2)中的混合液中加入6mg的牛血清白蛋白對(duì)微球表面沒(méi)有偶聯(lián)蛋白質(zhì)的殘留位點(diǎn)進(jìn)行封閉，室溫震蕩封閉30min。

(4)洗滌、溶解：將反應(yīng)結(jié)束的混合物經(jīng)過(guò)離心、超聲洗滌2-3次，其中，離心的速率可以為18000rpm，離心的時(shí)間可以為1min；超聲的時(shí)間可以為1min，最后溶解到Good’s緩沖液中，即完成D-二聚體檢測(cè)試劑盒的制備。

本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解，上述各實(shí)施方式是實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的具體實(shí)施例，而在實(shí)際應(yīng)用中，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作各種改變，而不偏離本發(fā)明的精神和范圍。