專利名稱：：熱加工處理中保持纖維蛋白原活性的方法及物質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)的活性保持，尤其涉及使纖維蛋白原在干熱滅活病毒處理中保持蛋白活性的物質(zhì)和方法。
背景技術(shù)：
：人纖維蛋白原即凝血因子I，是血漿蛋白的主要成分之一，分子量約34萬。纖維蛋白原在凝血酶的作用下可形成纖維蛋白，纖維蛋白進(jìn)而與血小板等一起形成穩(wěn)固的纖維蛋白血栓。在臨床上，可單獨(dú)通過靜脈注射補(bǔ)充纖維蛋白原，纖維蛋白原也可與凝血酶一起用于急救止血、創(chuàng)口粘合。隨著科技的發(fā)展，血液制品的潛在風(fēng)險(xiǎn)性更加被重視?！吨袊?guó)藥典》2005版三部頒布執(zhí)行，已經(jīng)明確提出"人纖維蛋白原的生產(chǎn)過程中應(yīng)采用經(jīng)批準(zhǔn)的方法去除和滅活脂包膜病毒和非脂包膜病毒"。目前用于血液制品中大規(guī)模生產(chǎn)的病毒滅活方法主要有巴氏法、有機(jī)溶劑/去污劑(S/D)法、干熱滅活法等。巴氏消毒法是法國(guó)微生物學(xué)家巴斯德為葡萄酒消毒時(shí)發(fā)明，并以他的名字來命名的一種消毒方法。指在規(guī)定時(shí)間內(nèi)以不太高的溫度處理液體食品的一種加熱滅菌方法。它可消滅絕大部分細(xì)菌、酵母和霉菌。此法主要分為低溫法(6065°0滅菌1530分鐘和高溫法(7080。C)消毒515分鐘。S/D法即有機(jī)溶劑/去污劑法能破壞脂包膜病毒的外膜結(jié)構(gòu)，因而可有效地滅活艾滋病病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)等脂包膜。可選擇有機(jī)溶劑磷酸三丁脂(TNBP)和非離子化的去污劑，如TritonX-100或吐溫-80結(jié)合滅活脂包膜病毒。調(diào)節(jié)溶液溫度為24-26°C，至少保溫4小時(shí)。由于S/D法滅活病毒時(shí)的條件比較溫和，對(duì)凝血因子產(chǎn)品中活性蛋白的結(jié)構(gòu)和生物活性幾乎沒有破壞作用，因此已用于凝血因子凍干制品的大規(guī)模生產(chǎn)中。然而S/D法不能滅活非脂包膜，僅用S/D法處理的凝血因子制品仍有傳播甲肝、B19等非脂包膜病毒的可能。干熱處理能有效地滅活脂包膜和非脂包膜病毒，因此在90年代就已用于IX、VIII因子等血液制品地生產(chǎn)。干熱滅活病毒工藝，加熱條件主要有三種600C，144小時(shí);800C，72小時(shí)和100。C，30分鐘;從產(chǎn)品的熱處理工藝控制和操作的方便性看，選擇100。C，30分鐘的加熱條件是最多被采用的。人纖維蛋白原是一種本身不耐熱的蛋白，加熱處理很容易改變其結(jié)構(gòu)，試驗(yàn)表明經(jīng)過干熱滅活病毒處理后，纖維蛋白原的溶解時(shí)間延長(zhǎng)，甚至超過30分鐘的可接受極限；產(chǎn)品外觀變黃、萎縮，溶解后有絮狀物、不澄清、發(fā)黃、穩(wěn)定性下降；說明纖維蛋白原已經(jīng)變性。因此，本領(lǐng)域迫切需要提供一種新的物質(zhì)和方法，它可以使纖維蛋白原產(chǎn)品在經(jīng)過S/D法和干熱病毒滅活處理后，不但病毒滅活效果佳，而且其中的纖維蛋白原的蛋白活性也能有效保持。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明旨在提供一種使纖維蛋白原在經(jīng)過熱處理后仍能保持蛋白活性的物質(zhì)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種方法，它能使纖維蛋白原在經(jīng)過熱處理后仍能保持蛋白活性。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種在經(jīng)過了S/D法和干熱病毒滅活處理后，仍能保持蛋白活性的纖維蛋白原產(chǎn)品及其制備方法。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種氨基酸的用途，所述的氨基酸被用作或用于制備纖維蛋白原熱加工處理過程中的蛋白活性保護(hù)劑。在另一優(yōu)選例中，所述的蛋白活性保護(hù)劑含有1-100%氨基酸。在另一優(yōu)選例中，所述的氨基酸是甘氨酸、精氨酸、或其組合；精氨酸優(yōu)選精氨酸鹽酸鹽。在另一優(yōu)選例中，所述的蛋白活性保護(hù)劑是熱穩(wěn)定劑和/或蛋白復(fù)溶促進(jìn)劑。在另一優(yōu)選例中，本發(fā)明提供了一種甘氨酸的用途，它被用作或用于制備纖維蛋白原熱加工處理過程中的熱穩(wěn)定劑。在另一優(yōu)選例中，所述的熱穩(wěn)定劑含有卜100%甘氨酸。在另一優(yōu)選例中，所述的熱穩(wěn)定劑還含有1-99%精氨酸；精氨酸優(yōu)選精氨酸鹽酸鹽。在另一優(yōu)選例中，所述的熱穩(wěn)定劑由甘氨酸和精氨酸組成；精氨酸優(yōu)選精氨4酸鹽酸鹽。在另一優(yōu)選例中，本發(fā)明提供了一種精氨酸的用途，它被用作或用于制備纖維蛋白原熱加工處理過程中的蛋白復(fù)溶促進(jìn)劑。在另一優(yōu)選例中，所述的蛋白復(fù)溶促進(jìn)劑含有1-100%精氨酸；精氨酸優(yōu)選精氨酸鹽酸鹽。在另一優(yōu)選例中，所述的蛋白復(fù)溶促進(jìn)劑還含有1_99%甘氨酸。在另一優(yōu)選例中，所述的蛋白復(fù)溶促進(jìn)劑由甘氨酸和精氨酸組成；精氨酸優(yōu)選精氨酸鹽酸鹽。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種制備纖維蛋白原的方法，所述的方法包括步驟(a)將纖維蛋白或纖維蛋白原與蛋白活性保護(hù)劑混合，形成混有蛋白活性保護(hù)劑的纖維蛋白原，其中所述蛋白活性保護(hù)劑含有氨基酸；(b)干熱滅活病毒處理所述的混有蛋白活性保護(hù)劑的纖維蛋白原，形成經(jīng)干熱滅活病毒處理的纖維蛋白原。在另一優(yōu)選例中，所述的氨基酸是甘氨酸、精氨酸、或其組合；精氨酸優(yōu)選精氨酸鹽酸鹽。在另一優(yōu)選例中，所述的蛋白活性保護(hù)劑是熱穩(wěn)定劑和/或蛋白復(fù)溶促進(jìn)劑。在另一優(yōu)選例中，本發(fā)明提供了一種制備纖維蛋白原的方法，所述的方法包括步驟(a)將纖維蛋白或纖維蛋白原與熱穩(wěn)定劑混合，形成混有熱穩(wěn)定劑的纖維蛋白原，其中所述熱穩(wěn)定劑含有甘氨酸；(b)干熱滅活病毒處理所述的混有熱穩(wěn)定劑的纖維蛋白原，形成經(jīng)干熱滅活病毒處理的纖維蛋白原。在另一優(yōu)選例中，所述步驟(a)前還包括步驟(a'):用有機(jī)溶劑/去污劑(S/D)法對(duì)纖維蛋白原進(jìn)行病毒滅活處理。在另一優(yōu)選例中，所述步驟(b)前還包括步驟(b'):將混有熱穩(wěn)定劑的纖維蛋白原進(jìn)行冷凍干燥。在另一優(yōu)選例中，本發(fā)明提供了一種制備纖維蛋白原的方法，所述的方法包括步驟(a)將纖維蛋白原與蛋白復(fù)溶促進(jìn)劑混合，形成混有蛋白復(fù)溶促進(jìn)劑的纖維蛋白原，其中所述蛋白復(fù)溶促進(jìn)劑含有精氨酸；精氨酸優(yōu)選精氨酸鹽酸鹽。(b)干熱滅活病毒處理所述的混有蛋白復(fù)溶促進(jìn)劑的纖維蛋白原，形成經(jīng)干熱滅活病毒處理的纖維蛋白原。在另一優(yōu)選例中，所述步驟(a)前還包括步驟(a'):用有機(jī)溶劑/去污劑(S/D)法對(duì)纖維蛋白原進(jìn)行病毒滅活處理。在另一優(yōu)選例中，所述步驟(b)前還包括步驟(b'):將混有熱穩(wěn)定劑的纖維蛋白或纖維蛋白原進(jìn)行冷凍干燥。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種組合物，它含有1-200重量份甘氨酸和1-200重量份精氨酸，所述甘氨酸和精氨酸的重量是組合物總重量的1—99%;精氨酸優(yōu)選精氨酸鹽酸鹽。在另一優(yōu)選例中，它還含有0.4-400重量份枸櫞酸離子和0-200重量份蔗糖。在另一優(yōu)選例中，它還含有1-300重量份枸櫞酸離子和0-150重量份蔗糖。在另一優(yōu)選例中，它還含有2-220重量份枸橡酸離子和0-100重量份蔗糖。在另一優(yōu)選例中，甘氨酸的濃度為0.5—10(w/v)%，精氨酸的濃度為0.5—10(w/v)%;精氨酸優(yōu)選精氨酸鹽酸鹽。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物由1-200重量份甘氨酸和1-200重量份精氨酸組成；精氨酸優(yōu)選精氨酸鹽酸鹽。在本發(fā)明的第四方面，提供了一種上述組合物的用途，它被用作或用于制備纖維蛋白或纖維蛋白原熱加工處理過程中的蛋白活性保護(hù)劑；所述的組合物含有1-200重量份甘氨酸和1-200重量份精氨酸，所述甘氨酸和精氨酸的重量是組合物總重量的1一99%;精氨酸優(yōu)選精氨酸鹽酸鹽。在本發(fā)明的第五方面，提供了一種纖維蛋白原組合物，它含有卜io重量份纖維蛋白原，1-200重量份甘氨酸，和1-200重量份精氨酸；所述組合物為灰白色或淡黃色疏松體，復(fù)溶后溶液澄清；且復(fù)溶時(shí)間《30分鐘；精氨酸優(yōu)選精氨酸鹽酸±卜nH-。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物的復(fù)溶時(shí)間為《20分鐘。在另一優(yōu)選例中，它含有3-8重量份纖維蛋白原，3-150重量份甘氨酸，和3-150重量份精氨酸；精氨酸優(yōu)選精氨酸鹽酸鹽。6在另一優(yōu)選例中，它含有4-7重量份纖維蛋白原，5-100重量份甘氨酸，和5-100重量份精氨酸；精氨酸優(yōu)選精氨酸鹽酸鹽。在另一優(yōu)選例中，它還含有0.4-400重量份枸櫞酸離子和0-200重量份蔗糖。在另一優(yōu)選例中，它還含有1-300重量份枸櫞酸離子和0-150重量份蔗糖。在另一優(yōu)選例中，它還含有2-220重量份枸櫞酸離子和0-100重量份蔗糖。在另一優(yōu)選例中，所述的纖維蛋白原組合物由包括以下步驟的方法制備(1)血漿經(jīng)cohn低溫乙醇法得到富含纖維蛋白原的沉淀；(2)將步驟(1)獲得的沉淀溶于枸櫞酸鈉一Tris緩沖液(pH6.0-8.0),然后經(jīng)S/D法滅活脂包膜病毒；(3)S/D病毒滅活處理后，用上述的緩沖液進(jìn)行稀釋，加入乙醇后離心取沉淀；(4)將步驟(3)中得到的沉淀用枸櫞酸鈉一Tris緩沖液溶解(pH6.0-8.0)，進(jìn)行過濾、冷卻，然后加入乙醇并離心得到純化的沉淀；(5)將步驟(4)得到的沉淀溶于枸橡酸鈉一鹽酸緩沖液(p服.0-8.0)，所得到的溶液中含有纖維蛋白原、精氨酸和甘氨酸，除菌后凍干；精氨酸優(yōu)選精氨酸鹽酸鹽；(6)干熱滅活病毒處理步驟(5)得到的凍干制品，從而制得如上述的纖維蛋白原組合物。在本發(fā)明的第六方面，提供了一種制備纖維蛋白原組合物的方法，所述的方法包括步驟(1)血漿經(jīng)cohn低溫乙醇法得到富含纖維蛋白原的沉淀；(2)將步驟(l)獲得的沉淀溶于枸櫞酸鈉一Tris緩沖液(p朋.0-8.0)，然后經(jīng)S/D法滅活脂包膜病毒；(3)S/D病毒滅活處理后，用上述緩沖液進(jìn)行稀釋，加入乙醇后離心取沉淀；(4)將步驟(3)中得到的沉淀用枸櫞酸鈉一Tris緩沖液(p朋.0-8.0)進(jìn)行過濾、冷卻，然后加入乙醇并離心得到純化的沉淀；(5)將步驟(4)得到的沉淀溶于枸櫞酸鈉一鹽酸緩沖液(p朋.0-8.0)，所得到的溶液中含有纖維蛋白原、精氨酸和甘氨酸，除菌后凍干；精氨酸優(yōu)選精氨酸鹽酸鹽；(6)干熱滅活病毒處理步驟(5)得到的凍干制品，從而制得纖維蛋白原組合物。在本發(fā)明的第七方面，提供了一種纖維蛋白原組合物在制備止血?jiǎng)┲械膽?yīng)用，所述的纖維蛋白原組合物含有1-10重量份纖維蛋白原，1-200重量份甘氨酸，和1-200重量份精氨酸；所述的纖維蛋白原組合物是灰白色或淡黃色疏松體，復(fù)溶后溶液澄清；且復(fù)溶時(shí)間《30分鐘；精氨酸優(yōu)選精氨酸鹽酸鹽。在另一優(yōu)選例中，所述的纖維蛋白原為人纖維蛋白原。據(jù)此，本發(fā)明提供了一種新的物質(zhì)和方法，它可以使纖維蛋白原產(chǎn)品在經(jīng)過S/D法和干熱病毒滅活處理后，不但病毒滅活效果佳，而且其中的纖維蛋白原的蛋白活性也能有效保持。具體實(shí)施例方式發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，意外地發(fā)現(xiàn)，甘氨酸對(duì)纖維蛋白原產(chǎn)品的熱穩(wěn)定性有很大的影響；精氨酸對(duì)加熱后的纖維蛋白原制品的復(fù)溶有很大的促進(jìn)作用；而兩者一起用的效果更明顯。具體地，在纖維蛋白原的原液配制階段加入甘氨酸和/或精氨酸等，能使纖維蛋白原制品在經(jīng)過了S/D法和干熱病毒滅活處理后，仍能保持良好的蛋白活性。如本文所用，"熱穩(wěn)定劑"是指能使纖維蛋白或纖維蛋白原在熱加工過程中不受高溫破壞，仍然保持蛋白活性的物質(zhì)。它包括1一100%甘氨酸，較佳地，它含有50—100%甘氨酸，更佳地，它含有80—100%甘氨酸。所述的熱穩(wěn)定劑中還可以包括精氨酸、枸櫞酸鈉、氯化鈉。如本文所用，"蛋白復(fù)溶促進(jìn)劑"是指能使纖維蛋白或纖維蛋白原在熱加工過程后仍能快速復(fù)溶的物質(zhì)，其復(fù)溶時(shí)間《30分鐘，更佳地《20分鐘；復(fù)溶后的溶液澄清。所述的蛋白復(fù)溶促進(jìn)劑包括1一100%精氨酸，較佳地，它含有50—100%精氨酸，更佳地，它含有80—100%精氨酸。所述的蛋白復(fù)溶促進(jìn)劑中還可以包括甘氨酸、枸櫞酸鈉、氯化鈉。如本文所用，"蛋白活性保護(hù)劑"或"保護(hù)劑"是指能使纖維蛋白或纖維蛋白原在熱加工過程中仍然保持蛋白活性的物質(zhì)。所述的保護(hù)劑具有多重效果，如能維持組合物一定的滲透壓；能使組合物在凍干時(shí)保持形態(tài)避免崩解；8具有熱穩(wěn)定性，能保持蛋白活性；對(duì)纖維蛋白或纖維蛋白原制品具有助溶作用等。所述的保護(hù)劑包括1-200重量份甘氨酸和1-200重量份精氨酸，所述甘氨酸和精氨酸的重量是保護(hù)劑總重量的1一99%。較佳地，所述的保護(hù)劑包括3一150重量份甘氨酸和3—150重量份精氨酸；更佳地，所述的保護(hù)劑包括5—100重量份甘氨酸和5—100重量份精氨酸。所述的保護(hù)劑中還可以含有糖、醇和/或其它氨基酸。糖類包括但不限于蔗糖、麥芽糖、海藻糖等。醇類包括但不限于山梨醇、甘露醇等。其它的氨基酸優(yōu)選色氨酸、組氨酸和賴氨酸。所述的保護(hù)劑中還可以添加枸櫞酸離子，如枸櫞酸鈉、枸櫞酸鉀等。如本文所用，"甘氨酸"是指結(jié)構(gòu)如下式的化合物或其鹽酸鹽+H3N—G—HH優(yōu)選其藥用級(jí)輔料，極易溶于水。如本文所用，"精氨酸"是指結(jié)構(gòu)如下式的化合物或其鹽酸鹽poo———HH2H2H2H=NH2+H2優(yōu)選其藥用級(jí)輔料，極易溶于水。在本發(fā)明提供的一種纖維蛋白原組合物中含有纖維蛋白原和保護(hù)劑。所述的纖維蛋白原來自哺乳動(dòng)物，其中優(yōu)選人纖維蛋白原。所述的組合物由于精氨酸攝入量增多，增加了肝臟中精氨酸酶的活性，有助于將血液中氨轉(zhuǎn)變?yōu)槟蛩囟懦觯淮龠M(jìn)了膠原組織的合成和傷口的愈合；促進(jìn)了胸腺中淋巴細(xì)胞的增殖，防止胸腺功能退化，從而具有免疫調(diào)節(jié)功能。組合物中的甘氨酸參與嘌呤、腺苷、肌酸等的代謝。它在體內(nèi)與多種物質(zhì)結(jié)合，加快它們從膽汁和尿液中排出；甘氨酸具有解毒、抗變態(tài)反應(yīng)作用，并可提供非必需氨基酸的氮源，改進(jìn)氨基酸注射液在體內(nèi)的耐受性。Z本發(fā)明提供的纖維蛋白原組合物可以將纖維蛋白原和保護(hù)劑混合制得。在一個(gè)優(yōu)選例中，可以通過以下步驟得到本發(fā)明提供的纖維蛋白原組合物(1)人血漿經(jīng)cohn低溫乙醇法得到富含纖維蛋白原的沉淀。所述的cohn低溫乙醇法是本領(lǐng)域所熟知的，其中可以將血漿pH調(diào)至中性，加入乙醇至6-12(v/v)y。濃度，溫度降至冰點(diǎn)或以下，離心得到富含纖維蛋白原的沉淀。(2)將步驟(1)獲得的沉淀溶于枸櫞酸鈉一Tris緩沖液中，pH為6.0-8.0，然后經(jīng)S/D法滅活脂包膜病毒?？梢栽诔叵聦⒉襟E(l)獲得的沉淀溶于上述的緩沖液中，優(yōu)選10-35'C，更優(yōu)選15-30°C。通過本領(lǐng)域熟知的S/D法進(jìn)行病毒滅活，如選擇有機(jī)溶劑磷酸三丁脂(TNBP)和非離子化的去污劑，如ritonX-100或吐溫-80結(jié)合滅活脂包膜病毒。一種優(yōu)選的方法是在溶液中加入植物源性吐溫80(Tween80)和磷酸三丁酯(TNBP)，調(diào)節(jié)溶液溫度為24-26°C,保溫至少4小時(shí)，滅活脂包膜病毒。所加入的Tween80至最終濃度為0.2-2(v/v)%，所加入的TNBP至最終濃度為0.05-l(v/v)%;優(yōu)選地，Tween80最終濃度為0.5-1.5(v/v)%,TNBP最終濃度為0.08-0.6(v/v)%。在另一優(yōu)選例中，S/D處理前先用lum濾器除去蛋白溶液中可能存在的顆粒(顆?？赡懿啬洳《緩亩绊懖《緶缁钚Ч?。加入S/D后應(yīng)確保是均一的混合物。如果在加入S/D后過濾，則須檢測(cè)過濾后S/D的濃度是否發(fā)生變化，如有變化應(yīng)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。(3)S/D病毒滅活處理后，用上述的緩沖液進(jìn)行稀釋，加入乙醇后離心取沉淀。在用緩沖液進(jìn)行稀釋前將溶液降溫至》(TC,更佳地為0_2匸。所加入的乙醇濃度達(dá)3-20(v/v)%，優(yōu)選地為5-15(v/v)%。離心時(shí)的溫度需加以控制，一般》0。C，更佳地為0-2°C。(4)將步驟(3)中得到的沉淀用枸櫞酸鈉一Tris緩沖液中，pH為6.0-8.0進(jìn)行溶解、過濾、冷卻，然后加入乙醇并離心得到純化的沉淀。在常溫下將步驟(3)獲得的沉淀溶于上述的緩沖液中，優(yōu)選IO-35°C,更優(yōu)選15-30。C。步驟(3)獲得的沉淀溶于緩沖液后過濾，使濾液溫度》(TC，更佳地為0-2°C。所加入的乙醇濃度達(dá)3_20(v/v)%，優(yōu)選地為5-15(v/v)%。(5)將步驟(4)得到的沉淀溶于枸櫞酸鈉一鹽酸緩沖液中，pH6.0-8.0，所得到的溶液中含有纖維蛋白原、精氨酸和甘氨酸，除菌后凍干。步驟(4)得到的沉淀與緩沖液III的重量體積比為1:1-10，優(yōu)選1:2-5;溶解溫度為15-35°C,優(yōu)選20-3(TC。(6)干熱滅活病毒處理步驟(5)得到的凍干制品，從而制得人纖維蛋白原組合物。可以使用本領(lǐng)域熟知的干熱滅活病毒的方法，如6(TC加熱144小時(shí)；80°C加熱72小時(shí)；或100土1。C加熱30分鐘。其中優(yōu)選100土rC加熱30分鐘。本發(fā)明提供的纖維蛋白原組合物可用于制備止血的藥物。本發(fā)明的纖維蛋白原組合物可以通過常規(guī)方法制成任何注射用或局部用的常規(guī)制劑形式。注射劑如注射液、大輸液、凍干粉等；局部用制劑如粉劑、貼劑等。本發(fā)明纖維蛋白原組合物的施用量可根據(jù)用藥途徑、患者年齡、體重、所治療疾病的類型和嚴(yán)重程度等而變化，其日劑量按纖維蛋白原量計(jì)可以是卜2g/70kg體重?？梢砸淮位蚨啻问┯?。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于1、含有保護(hù)劑(氨基酸、糖等)的血液制品纖維蛋白或纖維蛋白原在S/D法和干熱病毒滅活處理后，不僅將各類病毒滅活，而且能使纖維蛋白原的蛋白活性完整保留；2、所選用的保護(hù)劑不僅可保持纖維蛋白原的蛋白活性，而且易于在體內(nèi)代謝并具有多種生物功能。3、本發(fā)明使用確定的保護(hù)劑和產(chǎn)品工藝，能夠連續(xù)、穩(wěn)定地生產(chǎn)合格的廣叩o下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則所有的百分比和份數(shù)按重量計(jì)。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例1制備纖維蛋白原組合物①調(diào)整人血衆(zhòng)pH至5.0-9.0，加乙醇離心得到富含纖維蛋白原的沉淀。將沉淀溶于溶解枸櫞酸鈉一Tris緩沖液中，pH為6.0-8.0，，過濾去除不溶顆粒，然后在溶液中加入吐溫80(Tween80)及磷酸三丁酯(TNBP)至最終濃度Tween80為1.0%，TNBP為0.3%,調(diào)節(jié)溶液溫度為24-26。C，保溫至少6小時(shí)，滅活脂包膜病毒。在S/D病毒滅活處理后，用枸櫞酸鈉一Tris緩沖液，pH為6.0-8.0，進(jìn)行稀釋，將溶液降溫后加入乙醇離心得到沉淀。將沉淀再溶于枸櫞酸鈉一Tris緩沖液中，pH為6.0-8.0，過濾，將溶液降溫后加入乙醇離心得到純化的沉淀。將此沉淀一份溶于3份25。C溶于枸橡酸鈉一鹽酸緩沖液中，pH6.0-8.0，，所得溶液中含有纖維蛋白原3.0%，枸櫞酸鈉60mmol/L，L-精氨酸鹽酸鹽60g/L，甘氨酸60g/L。除菌分裝25ml/瓶，凍干，最后10CTC30分鐘干熱滅活病毒處理，即可制成兩步病毒滅活凍干人纖維蛋白原組合物①。實(shí)施例2制備纖維蛋白原組合物②將此沉淀一份溶于3份25r溶于枸櫞酸鈉一鹽酸緩沖液中，pH6.0-8.0，，所得溶液中含有纖維蛋白原2.0%，枸櫞酸鈉5mmol/L，L-精氨酸鹽酸鹽5g/L，甘氨酸5g/L。實(shí)施例3制備纖維蛋白原組合物③將此沉淀一份溶于3份25'C溶于枸櫞酸鈉一鹽酸緩沖液中，p服.0-8.0，，所得溶液中含有纖維蛋白原5.0%，枸櫞酸鈉100mmol/L，L-精氨酸鹽酸鹽100g/L，甘氨酸100g/L。實(shí)施例4-6病毒滅活驗(yàn)證對(duì)實(shí)施例1-3制得的組合物①-③進(jìn)行病毒滅活驗(yàn)證。凍干后產(chǎn)品經(jīng)100±rc3o分鐘加熱處理。中間過程取樣，分析病毒滴度。干熱法滅活病毒驗(yàn)證結(jié)果顯示(1)干熱法可滅活EMCV，組合物①》4.00LgTCID50/0.lml，組合物②》4.13LgTCID50/0.1ml，組合物③》4.25LgTCID50/0.lml;(2)干熱法可滅活PPV，組合物①》4.38LgTCID50/0.lml，組合物②》4.50LgTCID50/0.lml，組合物③》4.50LgTCID50/0.lml。結(jié)果表明，所制得的組合物中的病毒含量能符合《藥典》的要求，說明加入保護(hù)劑后的組合物的干熱病毒滅活處理是有效的。實(shí)施例7-9蛋白活性試驗(yàn)對(duì)實(shí)施例1-3制得的組合物①-③嚴(yán)格按照《藥典》進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表l。表1檢測(cè)結(jié)果質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)結(jié)果檢測(cè)項(xiàng)目合格標(biāo)準(zhǔn)20060622A2組合物①20060721A2組合物②20060722A2組合物③外觀灰白色或淡黃色疏松體，復(fù)溶后應(yīng)澄清溶液，可帶輕微乳光合格合格合格復(fù)溶時(shí)間《30分鐘191515凝固活力《60秒504256結(jié)果表明，產(chǎn)品全部符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，說明加入保護(hù)劑后的組合物在干熱病13毒滅活處理后仍能有效地保持蛋白活性。對(duì)比例1不含保護(hù)劑的纖維蛋白原對(duì)熱的耐受人纖維蛋白原制品的制備如上述方法得到人纖維蛋白原，其中不含保護(hù)劑L-精氨酸鹽酸鹽和甘氨酸<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>1CKTC，30min加熱處理得到的纖維蛋白原制品，然后對(duì)產(chǎn)品外觀和復(fù)溶時(shí)間兩個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)進(jìn)行產(chǎn)品質(zhì)量的考核。結(jié)果見表2。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>加熱工藝通過熱輻射破壞病毒的分之結(jié)構(gòu)從而滅活病毒，但同時(shí)人纖維蛋白原分子也可能受加熱影響而發(fā)生變化，在質(zhì)量上表現(xiàn)為外觀和復(fù)溶情況、以及生物活性的變化。以上結(jié)果表明，對(duì)不含保護(hù)劑的纖維蛋白原制品進(jìn)行干熱病毒滅活處理(IO(TC，30min加熱)后，纖維蛋白原凍干物會(huì)出現(xiàn)輕度萎縮、發(fā)黃，凍干制品復(fù)溶時(shí)間大大延長(zhǎng)，復(fù)溶后制品出現(xiàn)嚴(yán)重絮狀物、不溶蛋白顆粒，且纖維蛋白原凝固活力超過60秒，這說明IO(TC干熱破壞了纖維蛋白原的活性。若以8(TC加熱72小時(shí)處理，則出現(xiàn)嚴(yán)重萎縮、發(fā)黃，制品甚至不能復(fù)溶，說明纖維蛋白原已嚴(yán)重變性。結(jié)果表明，若要使用加熱處理工藝，就必須解決產(chǎn)品的穩(wěn)定性問題。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。權(quán)利要求1.一種氨基酸的用途，其特征在于，它被用作或用于制備纖維蛋白原熱加工處理過程中的蛋白活性保護(hù)劑。2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的蛋白活性保護(hù)劑含有1-100%氨基酸。3.如權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的氨基酸是甘氨酸、精氨酸、或其組合；精氨酸優(yōu)選精氨酸鹽酸鹽。4.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的蛋白活性保護(hù)劑是熱穩(wěn)定劑和/或蛋白復(fù)溶促進(jìn)劑。5.—種制備纖維蛋白原的方法，其特征在于，它包括步驟(a)將纖維蛋白或纖維蛋白原與蛋白活性保護(hù)劑混合，形成混有蛋白活性保護(hù)劑的纖維蛋白原，其中所述蛋白活性保護(hù)劑含有如權(quán)利要求l所述的氨基酸；(b)干熱滅活病毒處理所述的混有蛋白活性保護(hù)劑的纖維蛋白原，形成經(jīng)干熱滅活病毒處理的纖維蛋白原。6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的氨基酸是甘氨酸、精氨酸、或其組合；精氨酸優(yōu)選精氨酸鹽酸鹽。7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的蛋白活性保護(hù)劑是熱穩(wěn)定劑和/或蛋白復(fù)溶促進(jìn)劑。8.—種組合物，其特征在于，它含有1-200重量份甘氨酸和1-200重量份精氨酸，所述甘氨酸和精氨酸的重量是組合物總重量的1一99%;精氨酸優(yōu)選精氨酸鹽酸鹽。9.一種如權(quán)利要求8所述的組合物的用途，其特征在于，它被用作或用于制備纖維蛋白或纖維蛋白原熱加工處理過程中的蛋白活性保護(hù)劑。10.—種纖維蛋白原組合物，其特征在于，它含有1-10重量份纖維蛋白原，1-200重量份甘氨酸，和1-200重量份精氨酸；是灰白色或淡黃色疏松體，復(fù)溶后溶液澄清；且復(fù)溶時(shí)間《30分鐘；精氨酸優(yōu)選精氨酸鹽酸鹽。全文摘要本發(fā)明公開了一種使纖維蛋白原在S/D法、干熱病毒滅活兩步病毒滅活處理后仍能保持蛋白活性的方法和物質(zhì)。文檔編號(hào)C07K14/435GK101544683SQ20081003530公開日2009年9月30日申請(qǐng)日期2008年3月28日優(yōu)先權(quán)日2008年3月28日發(fā)明者秋何,煒施,沈積慧,胡維兵,凱黃申請(qǐng)人:上海萊士血液制品股份有限公司