專利名稱：脫端基纖維蛋白原及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)藥學(xué)領(lǐng)域，特別是一種脫端基纖維蛋白原及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
纖維蛋白原(Fibrinogen)又稱為凝血因子I，在血漿中的含量為2 4mg/ml， 其分子量為34萬道爾頓，由3對多肽鏈組成，多肽鏈由二硫鍵連接，形成對稱的二體結(jié)構(gòu)，通常用(α β Υ)2表示，其α鏈、β鏈和γ鏈分別由610個(gè)氨基酸殘基、461個(gè)氨基酸殘基和411個(gè)氨基酸殘基組成。人纖維蛋白原3條肽鏈的氨基酸序列已經(jīng)完成測定 (R. F. Doolittle, K. W. K. Watt, 1979，Nature. 280 (9) 464 468)。一般將纖維蛋白原的結(jié)構(gòu)劃分為中心區(qū)(E區(qū))和外圍區(qū)(D區(qū))，6條肽鏈的氨基末端(N末端)組成E區(qū)。D區(qū)和E區(qū)之間由三條肽鏈組成的螺旋結(jié)構(gòu)連接(John W ffeisel, 2005，Advances in Protein Chemistry. 70 247 299)見附圖 1。在血液凝固的最后階段，凝血酶(Th rombin)催化纖維蛋白原的α鏈和β鏈分別水解釋放纖維蛋白肽A (FPA)和纖維蛋白肽B (FPB)，從而暴露出結(jié)合位點(diǎn)A和B，與相鄰的纖維蛋白分子上的互補(bǔ)位點(diǎn)a和b結(jié)合，形成纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)。據(jù)文獻(xiàn)研究(JBiol Chem 1993,268(18) 13577 13585 ;Biochemistry. 2007， 46(31) =9133-9142)纖維蛋白原α鏈的羧基末端(C末端)(α鏈392 610)與E區(qū)存在特異性作用，F(xiàn)PA(Fibrinopeptides Α，纖維蛋白原α鏈N末端的16個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，其氨基酸序列為ADSGE GDFLA EGGGV R)和FPB(Fibrinop印tides B，纖維蛋白原β 鏈N末端的14個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，其氨基酸序列為QGVND NEEGF FSAR)參與了二者之間的相互作用，當(dāng)FPA釋放后，二者的作用減弱；進(jìn)一步當(dāng)FPB釋放后，二者的作用更加變小，從而使C末端與E區(qū)分開，C末端呈游離狀態(tài)。游離的α鏈C末端易于形成兩個(gè)相鄰纖維蛋白分子間的連接。見附圖2和附圖3。目前，一般采用凝血酶(包括人類和哺乳動(dòng)物來源)或類凝血酶(蛇毒來源)催化水解纖維蛋白原釋放FPA和/或FPB后，形成纖維蛋白交聯(lián)物。由于纖維蛋白交聯(lián)物為生物來源，具有生物吸收，生物相容和生物降解的優(yōu)勢，常用來制備生物膠，用于止血，組織填充，并且可作為緩控釋制劑的包埋劑等。但現(xiàn)有的技術(shù)存在以下缺點(diǎn)1.纖維蛋白原溶液不穩(wěn)定，需要制成凍干粉，凍干粉在使用時(shí)溶解緩慢，不利于臨床應(yīng)用。2.需要與凝血酶聯(lián)合應(yīng)用。人們已經(jīng)了解牛凝血酶可能攜帶牛海綿狀組織腦炎病原體以及其它使哺乳動(dòng)物致病的病毒，而且牛凝血酶是一種強(qiáng)抗原，使用牛凝血酶后會(huì)在人體引起各種免疫反應(yīng)。牛凝血酶引發(fā)交叉免疫反應(yīng)所產(chǎn)生的抗體，可能會(huì)因其削弱抗凝血酶I(AT-I)的正常抑制作用而導(dǎo)致血栓形成。目前市場上，牛凝血酶都混有牛凝血因子V，進(jìn)入人體后可發(fā)生交叉免疫反應(yīng)，所產(chǎn)生的免疫復(fù)合物經(jīng)血循環(huán)被清除，由此可導(dǎo)致人凝血因子V的缺乏，并可能引起嚴(yán)重出血傾向(李征，1999，華西藥學(xué)雜志，14(1) :34 36)。有人使用豬凝血酶，但一樣存在攜帶人畜共患病毒等可能。3. Tisseel、BeriplastP等幾家公司使用人凝血酶制劑，用人凝血酶替代牛凝血酶，但人類攜帶的各種病毒，例如肝炎、艾滋病等病毒將存在潛在的傳播危險(xiǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明根據(jù)上述領(lǐng)域的缺陷及需求，提供一種不需要凝血酶就能形成纖維蛋白交聯(lián)結(jié)構(gòu)的脫端基纖維蛋白原。一種脫端基纖維蛋白原(CNFg)，包括α、β、Y 3對肽鏈，其特征在于所述α鏈脫去了 N末端1 16位中包括2D、5E、7D， IlE和/或16R在內(nèi)的氨基酸殘基；和/或β鏈脫去了 N末端1 14位中包括5D、7E、8E和/或14R在內(nèi)的氨基酸殘基。所述α鏈的N末端脫去的若干氨基酸殘基包括自N末端開始的11 16個(gè)氨基酸；所述所β鏈的N末端脫去的若干氨基酸殘基包括自N末端開始的8 14個(gè)氨基酸。 上述脫端基纖維蛋白原的制備方法，指酶解纖維蛋白原；所述酶解纖維蛋白原采用的酶為氨基肽酶、胰蛋白酶法、V8蛋白酶法、凝血酶或蛇毒類凝血酶。所述纖維蛋白原為人或哺乳動(dòng)物的血液中分離獲得，或基因工程方法制備而得。所述酶解之后收集絲狀纖維蛋白交聯(lián)物。所述收集之后對收集物進(jìn)行純化和干燥，所述純化指水洗所述絲狀纖維蛋白交聯(lián)物。所述酶解在25 45°C，pH7. 0 8. 0環(huán)境下進(jìn)行，酶解時(shí)間為10分鐘 4小時(shí)。上述脫端基纖維蛋白原在制備止血制劑、組織填充物、緩釋制劑中的應(yīng)用。所述制備止血制劑中的應(yīng)用是指以所述脫端基纖維蛋白原為主要成分配制成 10 100mg/ml的液體制劑，pH為2. O 5. O。所述制備緩釋制劑中的應(yīng)用指將所述脫端基纖維蛋白原作為緩控釋制劑的包埋劑。本發(fā)明提供一種脫端基纖維蛋白原，不需要凝血酶參與，該脫端基纖維蛋白原分子之間即可形成交聯(lián)狀分子。其原理如下纖維蛋白原包括α、β、γ 3對肽鏈，α鏈的 C末端的氨基酸序列(601 610)為KRGHA KSRPV其中有四個(gè)堿性氨基酸殘基601(K)、 (602) R、(606) K、(608) R ； α 鏈的 N 末端的氨基酸序列(1 16)為=ADSGE GDFLA EGGGV R, 其中含有四個(gè)酸性氨基酸殘基2(D)、5(E)、7(D)、11(E)；—個(gè)堿性氨基酸16 (R)。β鏈的N 末端的氨基酸序列(1 15)為QGVND NEEGF FSARG，其中含有三個(gè)酸性氨基酸殘基5 (D)、 7 (E), 8 (E)；一個(gè)堿性氨基酸14 (R)?？梢姡伶淐末端氨基酸序列(601 610)中含有四個(gè)堿性氨基酸，不含酸性氨基酸，其在酸堿度中性條件下帶正電荷。而α鏈N末端氨基酸序列(1 16)中含有四個(gè)酸性氨基酸和一個(gè)堿性氨基酸，其在酸堿度中性條件下帶負(fù)電荷。 β鏈N末端的氨基酸序列(1 15)中含有三個(gè)酸性氨基酸和一個(gè)堿性氨基酸，其在酸堿度中性條件下帶負(fù)電荷。因此通常的纖維蛋白原α鏈的C末端與E區(qū)通過靜電力結(jié)合在一起，進(jìn)而將纖維蛋白原結(jié)合位點(diǎn)A、B屏蔽，使分子間不能聚合。本發(fā)明中由于α、β鏈脫去了 N端酸、堿性氨基酸殘基，因此，α、β鏈的N端在 PH中性條件下不再帶電荷，使得α鏈的C端處于游離狀態(tài)，而不是與纖維蛋白原的E區(qū)特異性識(shí)別及結(jié)合；α鏈游離狀態(tài)的C端形成兩個(gè)相鄰纖維蛋白分子間的連接，見圖2和圖3，從而實(shí)現(xiàn)無凝血酶條件下纖維蛋白原分子的交聯(lián)，節(jié)約資源，降低成本，同時(shí)避免了由凝血酶帶來的不利影響。經(jīng)止血試驗(yàn)檢測見實(shí)施例7，本發(fā)明脫端基纖維蛋白原制備的止血?jiǎng)?，噴在手術(shù)創(chuàng)面上，PH中性條件下立即形成纖維蛋白交聯(lián)物，見圖6，本發(fā)明采用與PH8. 0 的TRis-HCl同時(shí)碰到創(chuàng)口的方法，創(chuàng)造pH中性環(huán)境；穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明脫端基纖維蛋白原在溶液狀態(tài)下，2°C 6°C，24個(gè)月內(nèi)未見明顯變化，說明具有良好的穩(wěn)定性，見表7。本發(fā)明還提供了上述脫端基纖維蛋白原的制備方法，主要采用限制性蛋白水解酶進(jìn)行專一位點(diǎn)酶解或采用氨基肽酶從肽鏈的N末端逐個(gè)酶解，酶解的纖維蛋白原形成交聯(lián)物，收集純化交聯(lián)物，冷凍干燥得到脫端基纖維蛋白原；本發(fā)明采用的酶優(yōu)選氨基肽酶、胰蛋白酶法、V8蛋白酶法、凝血酶或蛇毒類凝血酶。該制備方法獲得的脫端基纖維蛋白原經(jīng)測定其α鏈和β鏈的N末端的1 16位氨基酸中，均不含氨基酸殘基D，E或R，見實(shí)施例1 5。本發(fā)明還采用凝膠排阻高效液相色譜法比較了纖維蛋白原和制備得到的脫端基纖維蛋白原，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明制備得到的脫端基纖維蛋白原的分子量明顯低于纖維蛋白原， 且為單一組分，不含其他蛋白質(zhì)成份如凝血酶、類凝血酶、抑肽酶、白蛋白等，見圖4和圖5。本發(fā)明中用于制備脫端基纖維蛋白原的纖維蛋白原為常規(guī)產(chǎn)品，可為人或哺乳動(dòng)物的血液分離而得，也可以是基因工程制備而得。本發(fā)明的實(shí)施例中還提供了對制備產(chǎn)物的收集及純化工藝。本發(fā)明中采用酶解制備得到絲狀交聯(lián)的脫端基纖維蛋白原之后，收集絲狀交聯(lián)物，可以是常規(guī)方法收集，本發(fā)明采用離心收集，離心過程可以將降解太嚴(yán)重的小分子物質(zhì)或未降解的單分子纖維蛋白原留在液相中，僅僅交聯(lián)狀的脫端基纖維蛋白原成為離心沉淀，提高產(chǎn)率。本發(fā)明的制備方法，優(yōu)選對制備得到的產(chǎn)物中進(jìn)行純化和干燥。由于初產(chǎn)物中可能還含有部分單分子纖維蛋白原及酶蛋白，為了得到純度較高的產(chǎn)物，本發(fā)明優(yōu)選采用水洗的方法去掉這些雜質(zhì)，然后進(jìn)行冷凍干燥，干燥后有利于保存。本發(fā)明的制備方法采用的酶的反應(yīng)溫度及所需的pH值為每種酶自身的特性決定的，本發(fā)明優(yōu)選采用的這些酶的最適反應(yīng)溫度在25 40攝氏度之間，PH在7. 0 8. 0之間。而酶解所需的時(shí)間在10分鐘 4小時(shí)，時(shí)間太短或太長都會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)率太低。在這個(gè)時(shí)間段內(nèi)，可以間隔一定時(shí)間收集一次得到的絲狀交聯(lián)物，如實(shí)施例1 5。收集后余下的原料繼續(xù)進(jìn)行降解反應(yīng)。本發(fā)明的脫端基纖維蛋白原，根據(jù)其自動(dòng)交聯(lián)的性能，可應(yīng)用于制備止血制劑、組織填充物、緩釋制劑中。本發(fā)明的實(shí)施例中，提供在制備止血?jiǎng)┖途忈寗┲袘?yīng)用的優(yōu)選方案，止血?jiǎng)┑膬?yōu)選方案中，制成的液體制劑的PH須為2. 0 5. 0，因?yàn)楸景l(fā)明的脫端基纖維蛋白原可以溶解在PH 2. 0 5. 0的溶液中，而在ρΗ5. 5 9. 0的溶液中可自發(fā)的形成交聯(lián)物。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)制備的止血制劑的劑型要求，組織填充物所應(yīng)用的組織，以及緩釋劑中藥物成分的不同，選擇不同比例或濃度的脫端基纖維蛋白原。


圖1.纖維蛋白原的構(gòu)象圖2.α鏈C末端與E區(qū)相互作用示意3.α鏈C末端與E區(qū)相互作用示意圖二
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圖4.纖維蛋白原高效液相色譜圖色譜條件見實(shí)施例6，纖維蛋白原高效液相色譜圖顯示結(jié)果參數(shù)
權(quán)利要求
1.一種脫端基纖維蛋白原，包括α、β、Υ3對肽鏈，其特征在于所述α鏈脫去了 N末端第1至第16位中包括2D、5E、7D、IlE和/或16R在內(nèi)的氨基酸殘基；和/或β鏈脫去了 N末端1 14位中包括5D、7E、8E和/或14R在內(nèi)的氨基酸殘基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脫端基纖維蛋白原，所述α鏈的N末端脫去的氨基酸殘基包括自N末端開始的11 16個(gè)氨基酸；所述β鏈的N末端脫去的氨基酸殘基包括自N末端開始的8 14個(gè)氨基酸。
3.權(quán)利要求1或2所述的脫端基纖維蛋白原的制備方法，其特征在于，將纖維蛋白原進(jìn)行酶解；所述酶解所采用的酶為氨基肽酶、胰蛋白酶、V8蛋白酶、凝血酶或蛇毒類凝血酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，所述酶解所采用的酶為凝血酶或蛇毒類凝血酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，所述酶為蛇毒類凝血酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，所述纖維蛋白原為人或哺乳動(dòng)物的血液中分離獲得，或基因工程方法制備而得。
7.根據(jù)權(quán)利要求3 6任一所述的制備方法，所述酶解在25 45°C，pH7.0 8. 0環(huán)境下進(jìn)行，酶解時(shí)間為10分鐘 4小時(shí)。
8.權(quán)利要求1或2所述的脫端基纖維蛋白原在制備止血制劑、組織填充物、緩釋制劑中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，所述在制備止血制劑中的應(yīng)用是指以所述脫端基纖維蛋白原為主要成分配制成10 100mg/ml的液體制劑，pH為2. O 5. O。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，所述在制備緩釋制劑中的應(yīng)用是指將所述脫端基纖維蛋白原作為包埋劑應(yīng)用于緩控釋制劑。
全文摘要
本發(fā)明脫端基纖維蛋白原及其制備方法與應(yīng)用，屬于蛋白質(zhì)藥學(xué)領(lǐng)域。其特征在于所述α鏈脫去了N末端第1至第16位中包括2D、5E、7D、11E和/或16R在內(nèi)的氨基酸殘基；和/或β鏈脫去了N末端1～14位中包括5D、7E、8E和/或14R在內(nèi)的氨基酸殘基。經(jīng)變構(gòu)而得的本發(fā)明的脫端基纖維蛋白原，在無凝血酶的環(huán)境下能自動(dòng)形成交聯(lián)物，可以用來制備生物膠，用于止血，還可以作為制備緩釋劑，組織填充物等的主要原料。
文檔編號(hào)C12P21/06GK102268083SQ20101019291
公開日2011年12月7日 申請日期2010年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月7日
發(fā)明者孔雙泉, 王天燕, 馬骉 申請人:北京賽生藥業(yè)有限公司