專利名稱：一種抗急性髓系白血病的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗急性髓系白血病的藥物組合物，具體地說是一種含有苯扎貝特和甲 地孕酮的抗急性髓系白血病的藥物組合物。
背景技術(shù)：
我國白血病的發(fā)病率為2. 76/105，其中急性髓系白血病(AML)年發(fā)病率最高，達 1.62/105。AML是白血病中較嚴重的一種，主要由于髓系造血干細胞的克隆異常導致異常造 血細胞的過度增殖，分化受阻及凋亡抑制所致。其發(fā)病率隨年齡的增加而增加，其中數(shù)年齡 為65 70歲。臨床上，急性髓性白血病的治療較為棘手，一方面是由于其發(fā)病迅速，一方 面由于絕大多數(shù)患者為老年人，身體機能弱，常常無法耐受常規(guī)治療。目前，臨床上多采用聯(lián)合序貫化療治療急性髓系白血病，即獲得初始緩解(誘導 治療)后進行緩解后治療(鞏固治療)，國內(nèi)外經(jīng)典的一線方案主要有DA(柔紅霉素+阿 糖胞苷)、MA (米托蒽醌+阿糖胞苷)、HA (三尖杉酯堿+阿糖胞苷)、IDA (去甲氧柔紅霉素 +阿糖胞苷)。誘導治療方案取決于患者的年齡和有無血液學疾病史，緩解后的鞏固治療方 案取決于細胞遺傳學危險因素。如果患者對初始誘導治療不敏感，則嘗試放射治療。骨髓 移植術(shù)也是白血病的有效治療手段之一。雖然近年來聯(lián)合化療及骨髓移植術(shù)在治療白血病 方面取得了長足進步，成人AML完全緩解率已達50% -80%，長期生存率為20% -30%，兒 童AML完全緩解率為70% -90%，長期生存率為30% -40%。但化療由于嚴重的骨髓抑制 和心肝腎等重要臟器的損害而受到限制，放療對人體的危害也很大，而骨髓移植則價格昂 貴且很難找到相互匹配的骨髓源，許多患者因苦尋不到配型相合的骨髓源而喪失了治療時 機。AML-M3亞型(急性早幼粒細胞白血病)的治療主要是使用全反式維甲酸誘導分 化，使用全反式維甲酸治療急性早幼粒細胞白血病(APL)有72% -95%的患者可取得完全 緩解，但全反式維甲酸對90%的AML患者缺乏理想的療效。而且全反式維甲酸治療APL完 全緩解后如繼續(xù)使用全反式維甲酸鞏固和維持，則多數(shù)患者短期內(nèi)復(fù)發(fā)。一旦復(fù)發(fā)，多數(shù)患 者對全反式維甲酸不再起反應(yīng)。對全反式維甲酸耐藥目前尚缺乏有效治療方法。葉酸受體(FR)是一種可以介導細胞內(nèi)化，將葉酸攝取人真核細胞胞漿的一種高 親和力受體，在正常組織中的表達高度保守，F(xiàn)Ra僅只表達于特定上皮細胞，在大部分來 源于上皮組織的惡性腫瘤，如卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、腎癌、乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌和鼻咽癌細 胞中均有高度表達，特別是婦科腫瘤，90%的卵巢癌細胞系都有葉酸受體的過度表達。與 FRa分布不同，F(xiàn)R0高表達于胎盤、粒單核細胞系中成熟的中性粒細胞、被激活的單核或 巨噬細胞及超髓系白血病細胞，在其它組織中幾乎沒有表達。在正常造血細胞中，F(xiàn)R3只 表達于粒單核細胞系，在中性粒細胞成熟過程中其表達水平升高5倍。不過正常造血細 胞的FRFR0不能與葉酸高度緊密結(jié)合。Ross等對43例各種白血病病例骨髓涂片的免 疫組織化學分析顯示，在21例慢性粒細胞白血病和急性非淋白血病病例中有70%表達 FR3，在15例淋巴細胞白血病和7例毛細胞白血病中沒有FR0表達(Ross JF，Wang H，Behm FG,等.Folate receptor type 旦 is a neutrophilic lineage marker and is diffreentially expressed inmyeloid leukemia. Cancer, 1999 ;85 :348_357)。這提不， FR3主要表達在髓細胞白血病細胞中。由于髓細胞白血病細胞特異性高表達0亞型葉酸 受體，因此0亞型葉酸受體成為葉酸受體介導的髓細胞白血病靶向治療的潛在靶標。關(guān)于 葉酸受體介導治療各種腫瘤的靶向脂質(zhì)體已有較多的報道，中國專利200310108850. 5(專 利權(quán)人上海復(fù)旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司，授權(quán)公告日2008年10月8日)及陸偉躍等 (陸偉躍，劉敏，潘俊，力弘，馬俊.葉酸-脂質(zhì)體制備及對HeLa細胞靶向作用.上海醫(yī)科大 學學報.2000 ;27(1) 4-8.)均對葉酸受體介導治療各種腫瘤的靶向脂質(zhì)體的制備做了報 道。甲孕酮和苯扎貝特聯(lián)合使用對急性髓系白血病有一定治療作用，并且要更好的安 全性，副作用很小(中國醫(yī)藥報-藥學周刊2010年1月26日，B1版)。但其療效與現(xiàn)有藥 物相比尚未發(fā)現(xiàn)有優(yōu)越性。如何使這種安全性高，副作用很小的藥物組合物提高療效，以替 代現(xiàn)有的白血病化療藥物并降低使用化療藥物的毒副作用是目前亟待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明目的是提供了一種療效顯著高于甲孕酮與苯扎貝特組 合物的治療急性髓系白血病的藥物組合物。本發(fā)明所述抗急性髓系白血病的藥物組合物，其特征在于所述藥物組合物每單 位劑量中含有全反式維甲酸2mg、醋酸甲地孕酮l_2mg、苯扎貝特100_200mg及醫(yī)藥學上可 接受的載體，且醋酸甲地孕酮與苯扎貝特質(zhì)量比為1 100。其中所述醫(yī)藥學上可接受的載體首選醫(yī)藥學上口服制劑或靜脈注射制劑的載 體；優(yōu)選葉酸受體靶向的脂質(zhì)體藥物載體。上述葉酸受體靶向的脂質(zhì)體藥物載體組成按摩爾百分比計優(yōu)選為二硬脂酰磷脂 酰膽堿56%、膽固醇40%、PEG2000-磷脂酰乙醇胺3. 7%、葉酸-半胱氨酸-PEG3400-磷脂 酰乙醇胺0.3%。關(guān)于葉酸受體靶向的脂質(zhì)體藥物載體的制備已有文獻報道，其中脂質(zhì)體藥物載 體的制備技術(shù)已較為成熟，在藥物載體組成不變的情況下，在脂質(zhì)體表面聯(lián)接葉酸從而 提高脂質(zhì)體針對葉酸受體的靶向性的葉酸受體靶向脂質(zhì)體的制備方法可參考中國專利 200310108850. 5 (專利權(quán)人上海復(fù)旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司，授權(quán)公告日2008年10 月8日)及陸偉躍等(陸偉躍，劉敏，潘俊，力弘，馬俊.葉酸-脂質(zhì)體制備及對HeLa細胞 靶向作用.上海醫(yī)科大學學報.2000 ；27(1) 4-8.)所述的制備方法及相關(guān)文獻。本發(fā)明所述的抗急性髓系白血病的藥物組7物，優(yōu)選的藥物組成為全反式維甲酸2g醋酸甲地孕酮2g苯扎貝特200g二硬脂酰磷脂酰膽堿442g (0. 56mol)膽固醇155g(0. 4mol)PEG2000-磷脂酰乙醇胺 104g(0. 037mol)葉酸-半胱氨酸-PEG3400-磷脂酰乙醇胺15g(0. 003mol)。
上述抗急性髓系白血病的藥物組合物(全反式維甲酸/醋酸甲地孕酮/苯扎貝特 復(fù)方葉酸靶向脂質(zhì)體)的制備方法(1)按處方取全反式維甲酸、醋酸甲地孕酮、苯扎貝特溶于磷酸鹽緩沖液 (pH7. 5)，置于65 70°C水浴中，保溫，待用；(2)將硬脂酰磷脂酰膽堿、膽固醇、PEG2000-磷脂酰乙醇胺、葉酸-半胱氨 酸-PEG3400-磷脂酰乙醇胺溶于氯仿，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將溶液中氯仿減壓蒸去，形成脂質(zhì)薄 膜；(3)取預(yù)熱的全反式維甲酸/醋酸甲地孕酮/苯扎貝特磷酸鹽緩沖液，對脂質(zhì)薄膜 進行水化；水化溫度為65 70°C。水化后室溫下以1500rpm攪拌速度攪拌30分鐘。然后 經(jīng)液氮驟冷、-20°C冰箱續(xù)冷、凍融5個循環(huán)處理。然后用高壓均質(zhì)機使其通過孔徑為lOOnm 聚碳酸脂薄膜，4°C下以3000rpm離心2h，得固體全反式維甲酸/醋酸甲地孕酮/苯扎貝特 復(fù)方葉酸靶向脂質(zhì)體。低壓凍干制成凍干粉后滅菌分裝成1000份。申請人:在對醋酸甲地孕酮和苯扎貝特藥物組合物的研究中發(fā)現(xiàn)，雖然醋酸甲地孕 酮和苯扎貝特藥物組合物對急性髓系白血病的治療作用不優(yōu)于甲孕酮與苯扎貝特組合物， 而全反式維甲酸對大多數(shù)急性髓系白血病的治療作用也較低，但全反式維甲酸對醋酸甲地 孕酮/苯扎貝特藥物組合物之間有驚人的增效作用，對提高急性髓系白血病存活率的作用 尤為顯著。故本發(fā)明提出了一種療效顯著高于甲孕酮與苯扎貝特組合物的治療急性髓系白 血病的藥物組合物，為急性髓系白血病的治療又開辟了一條途徑。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但本發(fā)明內(nèi)容不僅限于此。實施例1全反式維甲酸/醋酸甲地孕酮/苯扎貝特復(fù)方口腔崩解片劑的制備制劑處方全反式維甲酸2g、醋酸甲地孕酮lg、苯扎貝特100g、微晶纖維素80g，甘 露醇60g，低取代羥丙基纖維素30g，硬脂酸鎂3g，聚乙烯吡咯烷酮35g，共制成1000片。制備方法取處方量全反式維甲酸、醋酸甲地孕酮、苯扎貝特、微晶纖維素，甘露 醇，低取代羥丙基纖維素，分別研細，過4號篩，混合，將聚乙烯吡咯烷酮溶于適量60%乙醇 中作為黏合劑，制成軟材，濕法制粒，60°C鼓風烘干，過篩后，加硬脂酸鎂，整粒，混勻，壓片， 即得。崩解時限檢查溶出度測定儀裝上小杯，加入純化水50ml為遞質(zhì)，溫度為 (37. 0士0. 5) °C，加入1片到杯中，用秒表開始計時，直到藥片完全崩解成顆粒并通過2號篩 的時間為崩解時間。按上述方法隨機檢查6片。結(jié)果表明本工藝制備的口腔崩解片全部在lmin內(nèi)崩 解并通過篩網(wǎng)。全反式維甲酸/醋酸甲地孕酮/苯扎貝特復(fù)方口腔崩解片在服用時不需用水或只 需少量水，將片劑置于舌面，無需咀嚼，遇唾液即能崩解或溶解，然后借吞咽動力入胃，可方 便老人、兒童、吞咽困難或特殊環(huán)境下的患者用藥，更適于急性髓系白血病患者人群。實施例2全反式維甲酸/醋酸甲地孕酮/苯扎貝特復(fù)方脂質(zhì)體注射液的制備(1)將全反式維甲酸2g、醋酸甲地孕酮2g、苯扎貝特200g溶于磷酸鹽緩沖液 (pH7. 5) 50ml置于65 70°C水浴中，保溫，待用；
(2)將硬脂酰磷脂酰膽堿442g、膽固醇155g溶于氯仿，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將溶液中氯 仿減壓蒸去，形成脂質(zhì)薄膜；(3)取預(yù)熱的全反式維甲酸/醋酸甲地孕酮/苯扎貝特磷酸鹽緩沖液50ml，對脂 質(zhì)薄膜進行水化。水化溫度為65 70°C。水化后用高壓均質(zhì)機使其通過孔徑為50nm聚碳 酸脂薄膜。注射用水定容至5000ml，滅菌后分裝為5ml/瓶。實施例3全反式維甲酸/醋酸甲地孕酮/苯扎貝特復(fù)方葉酸靶向脂質(zhì)體的制備制劑處方全反式維甲酸2g醋酸甲地孕酮2g苯扎貝特200g 二硬脂酰磷脂酰膽堿442g (0. 56mol)膽固醇155g(0. 4mol)PEG2000-磷脂酰乙醇胺 104g(0. 037mol)葉酸-半胱氨酸-PEG3400-磷脂酰乙醇胺15g(0. 003mol)PEG2000-磷脂酰乙醇胺(2805. 497)購自德國Lipoid GmbH公司；葉酸-半胱 氨酸-PEG3400-磷脂酰乙醇胺購自美國Endocyte公司；磷脂酰膽堿及膽固醇均購自美國 Sigma公司制備方法(1)取全反式維甲酸2g、醋酸甲地孕酮2g、苯扎貝特200g溶于磷酸鹽緩沖液 (pH7. 5) 50ml置于65 70°C水浴中，保溫，待用；(2)將硬脂酰磷脂酰膽堿442g、膽固醇155g、PEG2000-磷脂酰乙醇胺104g、葉 酸_半胱氨酸-PEG3400-磷脂酰乙醇胺15g溶于氯仿，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將溶液中氯仿減壓蒸 去，形成脂質(zhì)薄膜；(3)取預(yù)熱的全反式維甲酸/醋酸甲地孕酮/苯扎貝特磷酸鹽緩沖液50ml，對脂 質(zhì)薄膜進行水化。水化溫度為65 70°C。水化后室溫下以1500rpm攪拌速度攪拌30分 鐘。然后經(jīng)液氮驟冷、-20°C冰箱續(xù)冷、凍融5個循環(huán)處理。然后用高壓均質(zhì)機使其通過孔 徑為lOOnm聚碳酸脂薄膜，4°C下以3000rpm離心2h，得固體全反式維甲酸/醋酸甲地孕酮 /苯扎貝特復(fù)方葉酸靶向脂質(zhì)體。低壓凍干制成凍干粉后滅菌分裝成1000份。取上述脂質(zhì)體樣品上樣至10cm Sepharose CL4B柱用磷酸鹽緩沖液洗脫，分析全 反式維甲酸、醋酸甲地孕酮、苯扎貝特濃度，計算各自的包封率，結(jié)果表明上述脂質(zhì)體中全 反式維甲酸、醋酸甲地孕酮、苯扎貝特包封率(均值)分別為90.7%、86.4%、92.5%。實施例4全反式維甲酸/醋酸甲地孕酮/苯扎貝特藥物組合物對急性髓系白血病 NB4、KGla、U937細胞的體外作用研究將急性髓系白血病NB4、KGla、U937細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、 100mg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液，37°C,5% C02的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，復(fù)蘇后，接種于含 10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，每2-3天傳代1次，實驗時取對數(shù)生長期細胞。 0. 4%臺盼蘭鑒定細胞活性在98%以上。取對數(shù)生長期NB4、KGla、U937細胞配成細胞終濃度為2 X 106個/ml的懸液，分別 接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200 ill。
各種急性髓系白血病細胞株均分為四組，分別加入(A)苯扎貝特0.2g/ml+醋酸 甲地孕酮2X 10_3g/ml⑶全反式維甲酸2X 10_3g/ml (C)苯扎貝特0. 2g/ml+醋酸甲地孕酮 2X10_3g/ml+全反式維甲酸2X10_3g/ml(D)米托蒽醌1 X 10_5g/ml。細胞與藥物共培養(yǎng)， 37°C,5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10天后分別取培養(yǎng)細胞，PBS洗3次.70%冷乙醇固定，染色前 PBS洗，后加入50mg/L碘化丙啶，4°C，避光30min，用流式細胞儀計數(shù)凋亡細胞，計算出凋亡 細胞百分比。急性髓系白血病細胞的凋亡率(％，平均值士標準差)
“與A組比較p<0.01; 1)與0組比較p<0. 05實驗結(jié)果表明，全反式維甲酸/醋酸甲地孕酮/苯扎貝特藥物組合物對急性髓系 白血病NB4、KGla、U937細胞株的致凋亡作用顯著高于醋酸甲地孕酮/苯扎貝特藥物組合物 及米托蒽醌，且維甲酸對醋酸甲地孕酮/苯扎貝特藥物組合物有增效作用。實施例5醋酸甲地孕酮/苯扎貝特藥物組合物對全反式維甲酸(ATRA)耐藥的急 性髓系白血病HL-60細胞的體外藥效學研究HL-60/ATRA細胞的誘導取對數(shù)生長期的HL-60細胞1 X 106/ml加入1 X lO.mol/ LATRA,培養(yǎng)72h后用RPMI 1640洗滌，用不含ATRA的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)2_3代后提高ATRA 濃度1倍，如此反復(fù)，經(jīng)過4個月后誘導出在含1 X 10_8mol/L ATRA RPMI 1640維持培養(yǎng)基 中保持原細胞增殖和分化狀態(tài)基本不變的細胞系，即全反式維甲酸耐藥的HL-60/ATRA。將上述細胞配成細胞終濃度為2 X 106個/ml的懸液，分別接種于96孔培養(yǎng)板，每 孔200iU。然后分為三組，分別加入(A)苯扎貝特0. 2g/ml+醋酸甲地孕酮2X10_3g/ml(B) 全反式維甲酸2X10_3g/ml(C)苯扎貝特0. lg/ml+醋酸甲地孕酮1 X 10_3g/ml+全反式維甲 酸1 X 10_3g/ml。細胞與藥物共培養(yǎng)，37°C,5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天后，用流式細胞儀檢測 細胞表面分化抗原CDllb，檢測細胞分化。A、B、C三組的HL-60細胞分化研究表明，C組92%的細胞出現(xiàn)⑶lib表達顯著升 高，A、B兩組細胞出現(xiàn)⑶lib表達顯著升高的百分數(shù)分別為16%和9%。說明醋酸甲地孕 酮/苯扎貝特藥物組合物對全反式維甲酸(ATRA)耐藥的急性髓系白血病HL-60細胞有逆 轉(zhuǎn)作用，有利于提高全反式維甲酸的誘導分化作用。實施例6全反式維甲酸/醋酸甲地孕酮/苯扎貝特藥物組合物對急性髓系白血病 的體內(nèi)藥效學研究細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100mg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng) 液，37°C、5% C02的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，復(fù)蘇后，接種于含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液 中培養(yǎng)，每2-3天傳代1次，實驗時取對數(shù)生長期HL-60細胞配成細胞終濃度為5 X 106個/ ml的懸液。
雄性SCID小鼠，3 4周齡，每只靜脈直接接種1ml上述HL-60細胞懸液。接種7 天后隨機分為五組，每組6只。A組每次靜脈注射給予生理鹽水2ml/只，每日兩次，共給藥20天；B組每次靜脈注射給予全反式維甲酸2mg/只，每日兩次，共給藥20天；C組每次靜脈注射給予醋酸甲地孕酮2mg+苯扎貝特200mg/只，每日兩次，共給藥 20天;D組每次靜脈注射給予實施例3制備的脂質(zhì)體1份/只，每日兩次，共給藥20天；E組每次靜脈注射給予阿糖胞苷2mg/只，每日兩次，共給藥20天；計數(shù)小鼠生存天數(shù)，根據(jù)公式計算各治療組生命延長率生命延長率=(給藥組 平均生存天數(shù)-生理鹽水組平均生存天數(shù))/生理鹽水組平均生存天數(shù)X 100%。A-E組小鼠平均生存天數(shù)分別為(23. 2士 10. 05)天、(60. 3士 11. 04)天、 (55. 1 士 11. 07)天、(93. 1 士2. 87)天、(55. 0士7. 24)天。B-E 組生命延長率分別為 159.9%, 137. 5%,301. 3%U37. 1%D D組與各組比較均有顯著差異(p < 0. 01)。結(jié)果表明全反式維甲酸/醋酸甲地孕酮/苯扎貝特葉酸靶向脂質(zhì)體可使急性髓 系白血病小鼠存活率顯著提高。
權(quán)利要求
一種抗急性髓系白血病的藥物組合物，其特征在于所述藥物組合物每單位劑量中含有全反式維甲酸2mg、醋酸甲地孕酮1-2mg、苯扎貝特100-200mg及醫(yī)藥學上可接受的載體，且醋酸甲地孕酮與苯扎貝特質(zhì)量比為1∶100。
2.如權(quán)利要求1所述的抗急性髓系白血病的藥物組合物，其特征在于所述醫(yī)藥學上 可接受的載體為葉酸受體靶向的脂質(zhì)體藥物載體。
3.如權(quán)利要求2所述的抗急性髓系白血病的藥物組合物，其特征在于所述葉酸受體 靶向的脂質(zhì)體藥物載體組成按摩爾百分比計為二硬脂酰磷脂酰膽堿56%、膽固醇40%、 PEG2000-磷脂酰乙醇胺3. 7%、葉酸-半胱氨酸-PEG3400-磷脂酰乙醇胺0. 3%。
4.如權(quán)利要求1所述的抗急性髓系白血病的藥物組合物，其特征在于所述藥物組合 物組成為全反式維甲酸2g 醋酸甲地孕酮2g 苯扎貝特200g 二硬脂酰磷脂酰膽堿442g 膽固醇155gPEG2000-磷脂酰乙醇胺104g葉酸_半胱氨酸-PEG3400-磷脂酰乙醇胺15g。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗急性髓系白血病的藥物組合物，所述藥物組合物每單位劑量中含有全反式維甲酸2mg、醋酸甲地孕酮1-2mg、苯扎貝特100-200mg及醫(yī)藥學上可接受的載體，且醋酸甲地孕酮與苯扎貝特質(zhì)量比為1∶100。本發(fā)明的藥物組合物可使急性髓系白血病的存活率顯著提高，為臨床治療開辟了一條新途徑。
文檔編號A61K31/57GK101856359SQ201010171968
公開日2010年10月13日 申請日期2010年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月14日
發(fā)明者厲保秋 申請人:山東大學