基于氟代核酸探針的雙通道傳感器檢測急早幼粒PML/RARα基因序列的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種基于氟代核糖核酸雙探針的雙通道電化學(xué)傳感器檢測急性早幼 粒細胞白血病雙鏈PML/RARa融合基因序列的方法，屬于生物傳感技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 急性早幼粒細胞白血?。ˋPL)是急性髓細胞白血病（AML) FAB分型中的M3亞型，是 嚴重危害人類健康的惡性血液病之一。它起病急，迅速惡化，表現(xiàn)十分兇險，出血傾向明顯， 易發(fā)生彌漫性血管內(nèi)凝血，死亡率高，治療比較困難。白血病早期診斷（基因診斷）水平將 直接影響患者的治療效果及生存質(zhì)量，其重要意義不言而喻。
[0003] 目前臨床上常用的檢測方法主要有流式細胞技術(shù)、FISH技術(shù)、染色體分析法、 RT-PCR技術(shù)等，但都存在一定的局限性，如價格昂貴、操作繁瑣、靈敏度不高等。因此，研發(fā) 一種尚敏感性、尚選擇性的APL相關(guān)基因的檢測技術(shù)具有極其廣闊的臨床應(yīng)用如景。
[0004] APL最為常見的染色體易位為t (15 ; 17) (q22 ;q21)，其易位產(chǎn)物PML/RARa融合 基因發(fā)生于95%的APL中，是惡性克隆的標志基因。
[0005] 臨床樣品中，待測DNA通常以雙鏈大片段形式存在，雙鏈片段中與靶標ssDNA互 補的另一條DNA序列容易對DNA探針分子的檢測造成干擾。利用單通道電化學(xué)DNA生物 傳感器檢測基因序列，其單探針捕獲靶標dsDNA的過程存在干擾分子識別及降低雜交效率 等不足。因此，為解決單通道電化學(xué)DNA生物傳感器的局限性，對原有單組DNA探針分子 進行優(yōu)化，設(shè)計了基于雙組探針檢測的新型傳感檢測方法，即將兩組分別與待測靶標dsDNA 兩條序列部分互補的捕獲探針修飾在雙通道電化學(xué)DNA陣列傳感器不同通道的電極表面， 通過雙通道電化學(xué)陣列傳感器實現(xiàn)對靶標dsDNA兩條序列的同時檢測，有利于提高探針與 dsDNA的雜交效率，有助于陣列傳感器日后實現(xiàn)對臨床實際樣品中dsDNA的直接檢測。
[0006] DNA探針分子作為多通道電化學(xué)DNA陣列傳感器設(shè)計的關(guān)鍵，其與待測靶標DNA 之間的序列選擇性對DNA陣列傳感器的性能具有很大的影響，而經(jīng)典傳感器中，所設(shè)計 的ssDNA探針多數(shù)存在穩(wěn)定性差的問題。所以，研制高靈敏度和高特異性的DNA探針，并 將其應(yīng)用于與靶標DNA序列間雜交信息的檢測具有重要意義。2' -氟代核糖核酸單體 (2' -fluoro RNA monomers, 2' -F RNA)作為一種新型的寡核酸衍生物，是通過氟元素取代 核糖C2'位的羥基，加固了 C3'內(nèi)型的N構(gòu)型，使得核糖結(jié)構(gòu)的柔韌性降低，進而增強了磷 酸鹽骨架局部結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。正是因為這樣的結(jié)構(gòu)特點，使得2-F RNA具有抗脫氧核苷酸 酶降解的特性，同時對DNA、RNA也有很好的親和力，且其與DNA、RNA進行雜交后所形成的雙 螺旋結(jié)構(gòu)具有更好的穩(wěn)定性，序列中每增加一個2' -氟代RNA單體修飾，即可使解鏈溫度 (Tm)值升高1~2°C，利用這一特性有助于實現(xiàn)提高探針序列對非靶標序列的錯配識別能 力。
[0007] 下面所述的為本發(fā)明人率先將基于2'-氟代RNA單體修飾雙探針的電化學(xué)酶鏈放 大檢測方法應(yīng)用于快速檢測PML/RAR a融合基因 dsDNA片段：本實驗針對APL中PML/RAR a 融合基因的相關(guān)堿基序列，設(shè)計了兩組2'-F RNA單體修飾探針（包含了捕獲探針和報告探 針），與酶聯(lián)放大技術(shù)相結(jié)合構(gòu)建一種新型的"三明治"構(gòu)型雙通道電化學(xué)DNA陣列傳感模 式，并將其用于人工合成的PML/RARa融合基因 dsDNA的檢測。
[0008] 該傳感模式包含有兩組檢測探針，每組探針各包含有一條3'端修飾巰基的捕 獲探針（Capture probe,以下簡稱C)和一條5'端修飾有生物素的報告探針（Reporter probe，R)，且這兩組探針（以下簡稱C1/R1和以下簡稱C2/R2)分別與靶標dsDNA中相應(yīng)的 兩條ssDNA(以下簡稱Sa和Sb)部分基因序列存在互補。其中，修飾有巰基的捕獲探針（以 下簡稱Cl和C2)能夠通過自組裝分別固定到不同的工作電極表面，而過量的報告探針（以 下簡稱Rl和R2)則提前加入到含有待測靶標dsDNA的雜交溶液中進行熱變性后置于冰浴 中以確保雜交液中的DNA序列均保持ssDNA狀態(tài)，并將修飾了 Cl和C2的兩個金電極工作 電極放入含有報告探針Rl、R2和祀標dsDNA的待測溶液中進行雜交反應(yīng)。通過雜交反應(yīng)， 在兩個工作電極表面形成了"三明治"傳感模式。此時生物素已通過雜交修飾到電極表面， 親和素修飾的辣根過氧化物酶可以與生物素相互識別，將辣根過氧化物酶結(jié)合到工作電極 上。最后，可將工作電極置于由3,3'，5,5'_四甲基聯(lián)苯胺（TMB)和H 2O2組成的檢測底液， 通過HRP催化使得H2O2氧化TMB產(chǎn)生電化學(xué)信號，利用雙通道電化學(xué)工作站進行信號采集。 若溶液中不含靶標dsDNA，則雜交反應(yīng)無法進行，工作電極界面上無法形成"三明治"構(gòu)型傳 感模式，那么HRP也就無法固定到電極表面，電極無法對檢測底液進行催化，所以雙通道電 化學(xué)工作站檢測到的電流信號很弱。通過對雙通道所采集到的電流信號進行處理，比較其 最終結(jié)果的信號變化就可以說明雜交反應(yīng)是否進行，溶液中是否含有靶標dsDNA。該傳感模 式通過修飾有2'-F RNA的DNA檢測探針和酶的催化功能，極大地增強了該檢測方法測定雙 鏈DNA的特異性及靈敏度，從而建立了高靈敏度、高特異性的急性早幼粒細胞白血病基因 檢測方法，應(yīng)用于有效解決急性早幼粒細胞白血病早期診斷這一臨床迫切的實際問題，無 疑具有極其重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于提供一種基于氟代核糖核酸雙探針的雙通道電化學(xué)傳感器及 其檢測急性早幼粒細胞白血病PML/RARa融合基因 dsDNA的方法，旨在解決臨床實際樣品 中DNA多以雙鏈片段形式存在，雙鏈片段中與靶標單鏈DNA相互補的另一條DNA鏈容易對 探針的檢測造成干擾，影響檢測效果，且現(xiàn)有檢測方法靈敏度低、檢測周期長、價格昂貴等。
[0010] 本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的，本發(fā)明所述的基于2' -氟代核糖核酸雙探針的雙通 道電化學(xué)傳感器，包含有兩組檢測探針，其特征在于每組探針包含有一條3'端修飾巰基的 捕獲探針和一條5'端修飾有生物素的報告探針，且這兩組探針分別與靶標急性早幼粒細 胞白血病PML/RARa融合基因 dsDNA中相應(yīng)的兩條ssDNA部分基因序列存在互補；其中， 兩個修飾有巰基的捕獲探針能夠通過自組裝相應(yīng)固定到位于兩個通道上的兩個具有型號 相同的金電極工作電極表面上，在兩個金電極工作電極表面未結(jié)合的位點通過封閉劑進行 封閉，而過量的報告探針則提前加入到含有待測靶標dsDNA的雜交溶液中進行熱變性后置 于冰浴中以確保雜交液中的DNA序列均保持ssDNA狀態(tài)，并將一組中的修飾有巰基的一條 捕獲探針的金電極工作電極和另一組中的修飾有巰基的另一條捕獲探針的金電極工作電 極一同放入含有一條5'端修飾有生物素的報告探針、另一條5'端修飾有生物素的報告探 針和靶標急性早幼粒細胞白血病PML/RARa融合基因 dsDNA的待測溶液中進行雜交反應(yīng)， 通過雜交反應(yīng)，在兩個金電極工作電極表面形成了 "三明治"傳感模式，此時生物素已通過 雜交修飾到電極表面，加入親和素修飾的辣根過氧化物酶與生物素相互識別，將辣根過氧 化物酶結(jié)合到金電極工作電極上；所述的金電極工作電極置于由3, 3'，5, 5' -四甲基聯(lián)苯 胺和H2O2組成的檢測底液中，通過辣根過氧化物酶HRP催化使得H 202氧化TMB產(chǎn)生電化 學(xué)信號，利用雙通道電化學(xué)工作站進行信號采集，當溶液中不含靶標dsDNA時，則雜交反應(yīng) 無法進行，金電極工作電極界面上無法形成"三明治"構(gòu)型傳感模式，那么辣根過氧化物酶 HRP也就無法固定到金電極工作電極表面上，金電極工作電極無法對檢測底液進行催化， 所以雙通道電化學(xué)工作站檢測到的電流信號很弱，通過對雙通道所采集到的電流信號進 行處理，比較所采集到的電流信號變化就能說明雜交反應(yīng)是否進行，溶液中是否含有靶標 dsDNA。
[0011] 所述的待檢測APL的PML/RAR a融合基因 dsDNA型別為長型融合基因，所述兩組探 針中的捕獲探針和5'端修飾有生物素的報告探針均是2'-氟代核糖核酸單體探針，其中一 組探針中的一捕獲探針和一報告探針以及另一組探針中的另一捕獲探針和另一報告探針， 其中捕獲探針基因為：5'-GCGCCG GGGAGG CAGCCA TTGAGA CCCAGA TnTTITITT-C6-SH-3'； 報告探針基因為：5' -biotin-TCCTGC CCAACA GCAACC ACGTGG CCAGTG-3';另一捕獲探針基 因為：5' -TCTGGG TCTCAA TGGCTG CCTCCC CGGCGC TTTTTTTTTT-C6-SH-3' ；另一報告探針基 因為：5' -biotin-GGCTGG GCACTA TCTCTTCAGAACTGCTGC-3'。
[0012] 本發(fā)明所述的雙通道電化學(xué)傳感器檢測急性早幼粒細胞白血病PML/RARa融合 基因的方法，包括如下步驟：待檢測基因為急性早幼粒細胞白血病的PML/RARa融合基因， 95%的APL病人為t 15 ;17q22;q21，在PML和RARa基因發(fā)生斷裂時，RARa基因斷裂點 較為固定，發(fā)生在第2內(nèi)含子，在與RARa基因發(fā)生融合時，PML基因的斷裂點通常集中在 三個區(qū)域，分別稱為bcrl、bcr2和bcr3, Bcrl位于PML的第6內(nèi)含子，形成長型融合基因， 約占病人的55% ;bcr2位于PML的第6外顯子，在與RARa第3外顯子融合區(qū)內(nèi)常常插入 RARa第2內(nèi)含子中的3~127bp，形成變異型融合基因，約占病人的5%;bcr3位于PML的 第3內(nèi)含子，形成短型融合基因，約占病人的40%;為了實現(xiàn)對APL的PML/RARa融合基因 的檢測，從NCBI基因數(shù)據(jù)庫中查找長型、變異型及短型PML/RARa融合基因 dsDNA的融合 位點，選擇位點前后的堿基作為人工合成的兩組檢測探針使用，檢測探針長度為30堿基， 經(jīng)過同源比對，同時利用生物學(xué)軟件對兩組檢測探針與其相應(yīng)的靶標序列兩兩間的解鏈溫 度進行模擬，以確保探針的特異性，將對應(yīng)序列作為APL的特異性序列進行合成，采用電化 學(xué)酶鏈放大檢測和應(yīng)用雙通道電化學(xué)工作站檢測APL的PML/RAR a融合基因 dsDNA，通過對 采集信號的計算處理實現(xiàn)對PML/RARa融合基因 dsDNA的定性定量檢測。
[0013] 所述的待檢測APL的PML/RARa融合基因型別為長型融合基因作為靶標，分 別設(shè)計了兩組2' -氟代核糖核酸單體探針，分別為一組探針的捕獲探針和報告探針以 及另一組探針的另一捕獲探針和另一報告探針，其中一組探針中的一捕獲探針基因為： 5'-GCGCCG