仍能將其測(cè)定出來(lái)，且在5. OX 10 13~ 7. OX 10 12m〇l/L范圍呈較好的線性關(guān)系（圖4(D))，其相關(guān)的回歸方程為Σ I (nA)= 402. 4320+66. 9329CdsDNA(pmol/L)，r = (λ 9922,檢測(cè)限可達(dá) 8· 4X 10 14mol/L。而單組探針 (C1/R1或者C2/R2)的檢測(cè)范圍僅為1.0 X 10 ~IOX 10 smol/L。該結(jié)果表明該傳感器通 過(guò)組裝兩組2'-氟代RNA單體修飾探針，能更有效的阻止靶標(biāo)dsDNA的自身復(fù)性，提高探針 與靶標(biāo)dsDNA的雜交效率，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)APL中人工合成的PML/RAR a dsDNA片段的定量檢 測(cè)，且具有較高的靈敏度。
[0097] 本發(fā)明檢測(cè)急性早幼粒細(xì)胞白血病PML/RARa融合基因 dsDNA片段具有高靈敏 度，高特異性的特點(diǎn)，且相對(duì)其它的檢測(cè)方法成本低。本發(fā)明適應(yīng)于：急性早幼粒細(xì)胞白血 病基因型與腫瘤相關(guān)性的研究，白血病發(fā)生和發(fā)展的檢測(cè)。
[0098] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)所作的任何修改，等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基于2' -氟代核糖核酸雙探針的雙通道電化學(xué)傳感器，包含有兩組檢測(cè)探針， 其特征在于每組探針包含有一條3'端修飾巰基的捕獲探針和一條5'端修飾有生物素 的報(bào)告探針，且這兩組探針?lè)謩e與靶標(biāo)急性早幼粒細(xì)胞白血病PML/RARa融合基因dsDNA 中相應(yīng)的兩條ssDNA部分基因序列存在互補(bǔ)；其中，兩個(gè)修飾有巰基的捕獲探針能夠通過(guò) 自組裝相應(yīng)固定到位于兩個(gè)通道上的兩個(gè)具有型號(hào)相同的金電極工作電極表面上，在兩個(gè) 金電極工作電極表面未結(jié)合的位點(diǎn)通過(guò)封閉劑進(jìn)行封閉，而過(guò)量的報(bào)告探針則提前加入到 含有待測(cè)靶標(biāo)dsDNA的雜交溶液中進(jìn)行熱變性后置于冰浴中以確保雜交液中的DNA序 列均保持ssDNA狀態(tài)，并將一組中的修飾有巰基的一條捕獲探針的金電極工作電極和另 一組中的修飾有巰基的另一條捕獲探針的金電極工作電極一同放入含有一條5'端修飾 有生物素的報(bào)告探針、另一條5'端修飾有生物素的報(bào)告探針和靶標(biāo)急性早幼粒細(xì)胞白血 病PML/RARa融合基因dsDNA的待測(cè)溶液中進(jìn)行雜交反應(yīng)，通過(guò)雜交反應(yīng)，在兩個(gè)金電極 工作電極表面形成了 "三明治"傳感模式，此時(shí)生物素已通過(guò)雜交修飾到電極表面，加入親 和素修飾的辣根過(guò)氧化物酶與生物素相互識(shí)別，將辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合到金電極工作電極 上；所述的金電極工作電極置于由3,3'，5,5'_四甲基聯(lián)苯胺和H 2O2組成的檢測(cè)底液中， 通過(guò)辣根過(guò)氧化物酶HRP催化使得H2O 2氧化TMB產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)，利用雙通道電化學(xué) 工作站進(jìn)行信號(hào)采集，當(dāng)溶液中不含靶標(biāo)dsDNA時(shí)，則雜交反應(yīng)無(wú)法進(jìn)行，金電極工作電極 界面上無(wú)法形成"三明治"構(gòu)型傳感模式，那么辣根過(guò)氧化物酶HRP也就無(wú)法固定到金電 極工作電極表面上，金電極工作電極無(wú)法對(duì)檢測(cè)底液進(jìn)行催化，所以雙通道電化學(xué)工作站 檢測(cè)到的電流信號(hào)很弱，通過(guò)對(duì)雙通道所采集到的電流信號(hào)進(jìn)行處理，比較所采集到的電 流信號(hào)變化就能說(shuō)明雜交反應(yīng)是否進(jìn)行，溶液中是否含有靶標(biāo)dsDNA。2. 如權(quán)利要求1所述的基于氟代核糖核酸雙探針的雙通道電化學(xué)傳感器，其特 征在于所述的待檢測(cè)APL的PML/RARa融合基因dsDNA型別為長(zhǎng)型融合基因，所述兩 組探針中的捕獲探針和5'端修飾有生物素的報(bào)告探針均是2' -氟代核糖核酸單體探 針，其中一組探針中的一捕獲探針（1)和一報(bào)告探針（1-1)以及另一組探針中的另一捕 獲探針（2)和另一報(bào)告探針（2-1)，其中捕獲探針基因?yàn)椋?'-GCGCCf GGGAGf CAGCC4 TTGAGJ CCCAGJ TTTTTTTTTT-C6-SH -3' ；報(bào)告探針基因?yàn)椋?'-biotin-TCCTGC CCAACL4 GCAACC ACGTGf CCAGT6-3' ；另一捕獲探針基因?yàn)椋?' -TCTGGf TCTCAJ TGGCTf CCTCCC CGGCGCIttitititt-C6-SH -3' ；另一報(bào)告探針基因?yàn)椋?' -biotin-GGCTGf GCACL4 TCTCTTCAGAACTGCTG C-3'。3. -種權(quán)利要求1-2任一所述的雙通道電化學(xué)傳感器檢測(cè)急性早幼粒細(xì)胞白血病 PML/RARa融合基因的方法，包括如下步驟：待檢測(cè)基因?yàn)榧毙栽缬琢＜?xì)胞白血病的PML/ RARa融合基因，95%的APL病人為t 15; 17 q22;q21，在PML和RARa基因發(fā)生斷裂 時(shí)，RARa基因斷裂點(diǎn)較為固定，發(fā)生在第2內(nèi)含子，在與RARa基因發(fā)生融合時(shí)，PML基 因的斷裂點(diǎn)通常集中在三個(gè)區(qū)域，分別稱為bcrl、bcr2和bcr3，Bcrl位于PML的第6內(nèi) 含子，形成長(zhǎng)型融合基因，約占病人的55% ;bcr2位于PML的第6外顯子，在與RARa第3 外顯子融合區(qū)內(nèi)常常插入RARa第2內(nèi)含子中的3~127 bp，形成變異型融合基因，約占病 人的5% ;bcr3位于PML的第3內(nèi)含子，形成短型融合基因，約占病人的40% ;為了實(shí)現(xiàn)對(duì)APL 的PML/RARa融合基因的檢測(cè)，從NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)中查找長(zhǎng)型、變異型及短型PML/RARa 融合基因dsDNA的融合位點(diǎn)，選擇位點(diǎn)前后的堿基作為人工合成的兩組檢測(cè)探針使用，檢 測(cè)探針長(zhǎng)度為30堿基，經(jīng)過(guò)同源比對(duì)，同時(shí)利用生物學(xué)軟件對(duì)兩組檢測(cè)探針與其相應(yīng)的 靶標(biāo)序列兩兩間的解鏈溫度進(jìn)行模擬，以確保探針的特異性，將對(duì)應(yīng)序列作為APL的特異 性序列進(jìn)行合成，采用電化學(xué)酶鏈放大檢測(cè)和應(yīng)用雙通道電化學(xué)工作站檢測(cè)APL的PML/ RARa融合基因dsDNA，通過(guò)對(duì)采集信號(hào)的計(jì)算處理實(shí)現(xiàn)對(duì)PML/RARa融合基因dsDNA的 定性定量檢測(cè)。4. 如權(quán)利要求3所述的檢測(cè)急性早幼粒細(xì)胞白血病PML/RARa融合基因dsDNA的 方法，其特征在于所述的待檢測(cè)APL的PML/RARa融合基因型別為長(zhǎng)型融合基因作為靶 標(biāo)，分別設(shè)計(jì)了兩組2' -氟代核糖核酸單體探針，分別為一組探針的捕獲探針和報(bào)告探針 以及另一組探針的另一捕獲探針和另一報(bào)告探針，其中一組探針中的一捕獲探針基因?yàn)椋?5' -GCGCCf GGGAGf CAGCCL4 TTGAGJ CCCAGJ TTTTTTTTTT-C6-SH -3' ；一報(bào)告探針基因?yàn)椋?5' -biotin-TCCTGC CCAACL4 GCAACC ACGTGf CCAGT6-3' ；另一組探針中的另一捕獲探針基 因?yàn)椋?' -TCTGGf TCTCAJ TGGCTf CCTCCC CGGCGC TTTTTTTTTT-C6-SH -3' ；另一報(bào)告探針 基因?yàn)椋?' -biotin-GGCTGf GCACL4 TCTCT7CAGAACTGCTGC-3'。5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的檢測(cè)急性早幼粒細(xì)胞白血病PML/RARa融合基因 dsDNA的方法，其特征在于（1)根據(jù)帶疏基的捕獲探針在金電極表面能形成自組裝單分子 膜的特性，將兩捕獲探針?lè)謩e固定在兩個(gè)不同通道上分別設(shè)置的兩個(gè)型號(hào)相同的金電極工 作電極表面，每個(gè)通道有一個(gè)金電極工作電極，對(duì)兩個(gè)金電極工作電極表面未結(jié)合的位點(diǎn) 通過(guò)封閉劑進(jìn)行封閉，采用巰基己醇，巰基乙酸，牛血清白蛋白或酪蛋白封閉；（2)將兩報(bào) 告探針提前混于含有靶標(biāo)dsDNA的雜交液中，通過(guò)高溫變性使雙鏈DNA解鏈成單鏈，并 將變性后的雜交液置于冰浴中保持雜交溶液中DNA單鏈狀態(tài)；（3)變性后的兩條單鏈靶標(biāo) DNA的一端分別與5'端標(biāo)記有生物素的兩報(bào)告探針雜交，然后利用兩條長(zhǎng)鏈靶標(biāo)鏈的另 一端分別與兩捕獲探針通過(guò)堿基配對(duì)結(jié)合實(shí)現(xiàn)共雜交，將兩組探針新形成dsDNA片段固 定在相應(yīng)的金電極工作電極上；（4)加入帶有辣根過(guò)氧化物酶的親和素，通過(guò)辣根過(guò)氧化 物酶上的親和素，根據(jù)親和素與生物素之間的親和作用，將辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合到金電極 工作電極表面，利用辣根過(guò)氧化物酶的信號(hào)放大作用，將兩個(gè)修飾的金電極工作電極同時(shí) 置于相同的底物3, 3'，5, 5' -四甲基聯(lián)苯胺中，利用電化學(xué)雙通道工作站同時(shí)采集電信號(hào) 檢測(cè)。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)急性早幼粒細(xì)胞白血病PML/RARa融合基因dsDNA的 方法，其特征在于所述兩組2'-氟代RNA單體修飾的報(bào)告探針加入到靶標(biāo)雙鏈DNA中一同 變性后，進(jìn)行雜交，能夠有效的防止原有靶標(biāo)兩條互補(bǔ)鏈之間的自身復(fù)性，提高雜交效率， 且修飾了 2'-氟代RNA單體后的報(bào)告探針的解鏈溫度升高，有利于提高報(bào)告探針識(shí)別靶標(biāo) DNA的專一性，提高檢測(cè)的特異性。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)急性早幼粒細(xì)胞白血病PML/RARa融合基因dsDNA 的方法，其特征在于兩組探針DNA加入后、探針DNA與靶標(biāo)dsDNA雜交后需采用洗滌劑 洗滌除去非特異性吸附，以去除PBS、0. 2% SDS物質(zhì)。8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)急性早幼粒細(xì)胞白血病PML/RARa融合基因dsDNA 的方法，其特征在于將酶固定在修飾有生物素的金電極工作電極表面之前，需采用封閉劑 防止電極表面的非特異性吸附，以去除0. 1% BSA。9. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)急性早幼粒細(xì)胞白血病PML/RARa融合基因dsDNA 的方法，其特征在于將辣根過(guò)氧化物酶固定在修飾有生物素的工作電極表面后，需采用洗 脫液除去電極表面的非特異性吸附，以去除0. 1% Tween-PBS、PBS。10.權(quán)利要求3-9任一所述的檢測(cè)急性早幼粒細(xì)胞白血病PML/RARa融合基因 dsDNA的方法，其特征在于對(duì)探針的特異性及靈敏度進(jìn)行測(cè)試，實(shí)現(xiàn)對(duì)急性早幼粒細(xì)胞白 血病PML/RARa融合基因dsDNA的定量檢測(cè)。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種<b>基于</b><b>氟代核酸探針</b><b>的雙通道傳感器檢測(cè)急早幼粒</b><b>PML/RARα</b><b>基因序列的方法</b>，包括如下步驟：根據(jù)所選擇的待檢測(cè)APL基因型別通用引物序列的融合位點(diǎn)，對(duì)APL的特異性序列進(jìn)行設(shè)計(jì)及合成兩組特異性的2’-氟代RNA單體修飾探針；采用2’-氟代RNA單體修飾探針技術(shù)與電化學(xué)酶聯(lián)放大技術(shù)實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)APL的？PML/<b>RARα</b>融合基因雙鏈DNA中的兩條互補(bǔ)鏈。采集兩組探針與相對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)鏈雜交后催化產(chǎn)生的電流信號(hào)并進(jìn)行計(jì)算處理，可定量檢測(cè)靶標(biāo)？dsDNA。實(shí)現(xiàn)了對(duì)急性早幼粒細(xì)胞白血病的早期診斷，同時(shí)也有望應(yīng)用于其它疾病相關(guān)基因dsDNA？的檢測(cè)。
【IPC分類】C12Q1/68, G01N27/26
【公開(kāi)號(hào)】CN105044168
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510296829
【發(fā)明人】林新華, 劉愛(ài)林, 王昆, 陳元仲
【申請(qǐng)人】福建醫(yī)科大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年11月11日
【申請(qǐng)日】2015年6月3日