專利名稱：生存素與路易斯寡糖的復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生存素(Survivin)與路易斯寡糖(Lewis )的復(fù)合物(Survivin-Lewis),還涉及該復(fù)合物的制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
惡性肺瘤的治療已取得很多進(jìn)展，但微小殘留病灶仍難以被現(xiàn)行的化療、 放療、手術(shù)等方案徹底清除。應(yīng)用腫瘤免疫治療激發(fā)機(jī)體免疫監(jiān)視系統(tǒng)，消滅 殘存腫瘤細(xì)胞，有可能徹底治愈腫瘤。因此，腫瘤免疫治療和腫瘤疫苗開發(fā)成 為現(xiàn)今研究熱點之一。Survivin是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的凋亡抑制因子，具有抑制細(xì)胞凋亡和維持 細(xì)胞有絲分裂的雙重功能。Survivin在正常的終末分化組織中幾乎不表達(dá)，但在 幾乎所有惡性腫瘤組織中高表達(dá)，被視為最具腫瘤特異性的腫瘤共享抗原。 Survivin表達(dá)水平與肺瘤惡性程度成正相關(guān)，若腫瘤組織高表達(dá)Survivin,則腫 瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)下降，對放化療的耐受性增強(qiáng)，預(yù)后差；反之，若腫瘤組織低 表達(dá)或不表達(dá) survivin,貝'J對》丈化療敏感，預(yù)后良好。近年來研咒發(fā)5見,月中瘤新 生血管內(nèi)皮細(xì)胞受到某些細(xì)胞因子如血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、堿性成纖維細(xì)胞 生長因子等的刺激后可以高表達(dá)Survivin,而靜止的血管內(nèi)皮細(xì)胞幾乎不表達(dá) Survivin,因此，Survivin又被視為一種新的胂瘤新生血管標(biāo)志物。以Survivin 為抗腫瘤靶標(biāo)具有以下獨特優(yōu)勢(1) Survivin表達(dá)于幾乎所有腫瘤細(xì)胞中，尤 其在惡性度高、耐放化療的腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，若腫瘤細(xì)胞為逃逸免疫監(jiān)視而 下調(diào)Survivin表達(dá)，則會相應(yīng)增加其凋亡指數(shù)和放化療敏感性；(2 ) Survivin所 誘導(dǎo)的特異性細(xì)胞免疫在殺傷肺瘤細(xì)胞的同時，還可石皮壞腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì) 胞，由此產(chǎn)生協(xié)同抗肺瘤效應(yīng)，即使在部分腫瘤細(xì)胞逃逸免疫監(jiān)視的情況下，同樣能通過抑制血管生成達(dá)到打擊腫瘤的目的。但是，腫瘤抗原為自身抗原，存在免疫原性低，特異性細(xì)胞免疫激活不足, 外周免疫耐受等問題，在設(shè)計腫瘤疫苗時需增強(qiáng)免疫系統(tǒng)對腫瘤抗原的識別能 力以激發(fā)有力的特異性細(xì)胞免疫。樹突狀細(xì)胞(DC)是體內(nèi)最強(qiáng)大的專職抗原遞呈細(xì)胞，能夠識別、捕獲、 加工、遞呈抗原引發(fā)初始免疫反應(yīng)。利用DC來改善肺瘤疫苗的免疫原性是肺瘤 疫苗設(shè)計的重要策略之一。其主要方式有體外和體內(nèi)兩種。體外方式是先體外分離DC,再用腫瘤細(xì)胞裂解物、肺瘤抗原蛋白、肺瘤抗原多肽或腫瘤來源的 RNA沖擊致敏DC,或?qū)⒎瘟黾?xì)胞與DC融合，或?qū)⒎瘟鱿嚓P(guān)抗原(TAA)基因 轉(zhuǎn)染DC,制成各種DC腫瘤疫苗，最后回輸體內(nèi)。體內(nèi)方式是將蛋白、多肽或 基因疫苗直接體內(nèi)靶向DC，是更簡便、更易于臨床操作的方式，但其存在如下 問題既往研究的蛋白疫苗多以DC表達(dá)的Fc受體、補(bǔ)體受體、甘露糖受體、 CD40或B7為靶向受體，但這些受體在血細(xì)胞上也有表達(dá)，乂人而在DC特異性 靶向方面有所欠缺；基因疫苗多采用具有高轉(zhuǎn)染率的病毒載體，但大多數(shù)病毒 載體并不能特異性靶向DC,且病毒載體本身可能表達(dá)大量的具有免疫原性的蛋 白，不僅會干擾目的基因的免疫效果，而且可能導(dǎo)致含目的基因的病毒載體被 機(jī)體迅速清除，另外，生物安全性也是病毒載體的固有缺陷。樹突狀細(xì)胞表面特異性C型凝集素-細(xì)胞間黏附分子3結(jié)合非整合素分子(DC-SIGN)是新近發(fā)現(xiàn)的限制性表達(dá)于DC和某些組織巨噬細(xì)胞上的凝集素 受體，可有效地攝取顆粒性抗原和可溶性抗原，再以主要組織相容性復(fù)合體(MHC) I類分子和II類分子限制性方式進(jìn)行抗原遞呈，因此，DC-SIGN是較 好的DC特異性靶向受體。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與DC-SIGN結(jié)合的實際是表達(dá)于 自然配體上的結(jié)構(gòu)簡單的寡糖，主要有高甘露糖結(jié)構(gòu)和Lewis系列包括路易斯 寡糖-a (Lea)、路易斯寡糖-x (Lex)和路易斯寡糖-y (Ley)等。其中，高甘露 糖結(jié)構(gòu)雖然可被DC-SIGN高效攝取，但對DC-SIGN的靶向特異性較差，同時 可被甘露糖受體等其他凝集素受體識別、攝取；而Lex是DC-SIGN的高親和力配體，對DC-SIGN具有較強(qiáng)的特異性。 發(fā)明內(nèi)容有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于^是供一種Survivin-Lewis;目的之二在于 提供所述Survivin-Lewis的制備方法；目的之三在于提供所述Survivin-Lewis在 醫(yī)藥方面的應(yīng)用。為達(dá)到上述目的，在本發(fā)明的第 一 方面，提供了 一種Survivin-Lewis,由 Survivin與Lex以非共價4建結(jié)合而成，所述Survivin具有SEQ ID No.2所示的氨 基酸序列；進(jìn)一步，由Survivin與Lex通過鏈霉親和素(SA)與生物素(biotin)的高 親和力結(jié)合而成。在本發(fā)明的第二方面，提供了所述Survivin-Lewis的制備方法，包括以下步驟a、 Survivin與SA的交4關(guān)物(Survivin-SA )的制備將SA與Traut，s試劑反應(yīng)制得巰基化修飾的SA;將Survivin與巰基化修飾 的SA反應(yīng)制得Survivin-SA;b、 Survivin-Lewis的制備在酶標(biāo)板中加入(路易斯寡糖-x)-聚丙烯酸鈉-生物素(Lex-PAA-biotin )溶液， 4'C包被過夜，棄去包被液，用PBS洗滌后，再加入牛血清白蛋白(BSA)溶液， 4。C封閉過夜，棄去封閉液，用PBS洗滌后，再加入步驟a所得Survivin-SA溶 液，37。C反應(yīng)0.5 2小時，再室溫反應(yīng)10-60分鐘，即得Survivin-Lewis。進(jìn)一步，所述步驟a是將SA與Traut，s試劑在含有PBS和乙二胺四乙酸 (EDTA)的水溶液中4。C避光反應(yīng)2小時，超濾脫鹽，再用含有PBS和EDTA 的水溶液稀釋后繼續(xù)超濾以稀釋Traut，s試劑，制得巰基化修飾的SA;向所得巰 基化修飾的SA溶液中，加入Survivin溶液，混勻，4。C反應(yīng)4小時，即得Survivin-SA;進(jìn)一步，所述步驟b是在酶標(biāo)板中加入濃度為10|ag/ml的Lex-PAA-biotin 溶液，4。C包被過夜，棄去包被液，用PBS洗滌后，再加入質(zhì)量百分比濃度為 2%的BSA溶液，4。C封閉過夜，棄去封閉液，用PBS洗滌后，再加入濃度為 10jig/ml的Survivin-SA溶液，37。C反應(yīng)1小時，再室溫反應(yīng)30分鐘，即得Survivin-Lswis。在本發(fā)明的第三方面，提供了所述Survivin-Lewis在制備腫瘤疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明復(fù)合物通過Lex的導(dǎo)向作用，可成功靶向 DC-SIGN，促進(jìn)Survivin特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答，高效-漆導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡并抑 制腫瘤血管生成，可用于制備腫瘤疫苗，在腫瘤免疫治療領(lǐng)域有著良好的開發(fā) 應(yīng)用前景。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā) 明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，其中圖1為蛋白免疫印跡(Western Blot)鑒定Survivin;圖2為十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測Survivin-SA;圖3為SDS-PAGE檢測Survivin-Lewis;圖4為酶聯(lián)免疫斑點(ELISPOT)法檢測Survivin-Lewis激發(fā)T細(xì)胞分泌干擾素-y (IFN-y)的能力；圖5為51Cr釋放法檢測Survivin-Lewis激發(fā)T細(xì)胞對Survivin陽性腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷效應(yīng)。
具體實施方式
以下將參照附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。優(yōu)選實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件， 或按照制造廠商所建議的條件。一、Survivin-Lewis的制備1、 Survivin-SA的制備 (1 ) Survivin基因的克隆將高表達(dá)Survivin的白血病細(xì)胞HL-60用RPMI 1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，調(diào) 節(jié)細(xì)胞密度為2x 10 個/mL，用濃度為100U/mL的重組人白介素-3刺激24小時， 收集細(xì)胞，用PBS (即pH為7.4的磷酸鹽緩沖液)洗滌3次，再用總RNA提 取試劑盒提取細(xì)胞總RNA,紫外分光光度法測定所得RNA的純度和濃度；根 據(jù)GenBank登錄號為NM—001168.2的Survivin基因序列，設(shè)計并合成如下PCR 引物以擴(kuò)增含有Survivin全長編碼基因、5，端BamHI酶切位點和3，端Hincffll酶 切位點的DNA片卑更引物F1: 5，-tagg^eeatgggtgccccgacgttgccccctg-3 ， ( SEQ ID No.3 )，下劃線部分為BamHI酶切4立點；引物Rl: 5，-gcaagcttatccatggcaccagctgctg -3， (SEQIDNo.4)，下劃線部分為HindIII酶切位點；將提取的細(xì)胞總RNA逆 轉(zhuǎn)錄為cDNA,再以所得cDNA為模板進(jìn)行PCR， PCR條件為94。C預(yù)變性3 分鐘，然后94。C變性1分鐘、58。C退火1分鐘，72。C延伸1分鐘，共30個循環(huán)， 最后72。C延伸7分鐘；PCR產(chǎn)物經(jīng)濃度為20g/L的瓊脂糖凝膠電泳鑒定、凝膠 回收試劑盒切膠回收純化后，與克隆載體pGEM-TEasy連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大 腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，用含有氨千青霉素的LB平板篩選陽性克隆，提取 質(zhì)粒，委托上海生工公司測定基因序列，將序列正確的陽性克隆質(zhì)粒命名為 pGEM-T Easy/Survivin。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物在約450bp處呈單一特異性條帶，與預(yù) 期結(jié)果相符；測序結(jié)果顯示插入基因序列與Survivin全長編碼基因序列(SEQ ID No.l) —致。(2 ) Survivin基因重組原核表達(dá)載體的構(gòu)建將步驟(1 )所得質(zhì)粒pGEM-T Easy/Survivin和原核表達(dá)載體pET32a(+)分 別用限制性內(nèi)切酶Bamffl和HindIII進(jìn)行雙酶切，用凝膠回收試劑盒切膠回收純 化雙酶切后的SurvivinDNA片段和線性載體pET32a(+)，以摩爾比為3 : 1于16 。C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，用含有氨芐青霉素的 LB平板篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，用BamHI和HindIII進(jìn)行雙酶切鑒定，并委 托上海生工公司測定基因序列，序列和閱讀框架正確的陽性克隆質(zhì)粒即為構(gòu)建 成功的Survivin基因重組原核表達(dá)載體，命名為pET32/Survivin。雙酶切鑒定結(jié)果顯示雙酶切產(chǎn)物在約450bp處出現(xiàn)電泳帶，與插入片段大 小相符；測序結(jié)果顯示陽性克隆質(zhì)粒的插入基因序列無突變，閱讀框架正確， 無移碼。(3 ) Survivin基因工程菌的構(gòu)建將步驟(2 )所得Survivin基因重組原核表達(dá)載體pET32/Survivin用限制性 內(nèi)切酶SalI酶切使線性化，用電穿孔法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化 產(chǎn)物涂布于MD平板上，3(TC培養(yǎng)3 4天，挑取白色酵母菌落，分別點接于MD 平板和MM平板上，30。C培養(yǎng)3 6天(每天向MM平板中添加曱醇100pL)， 挑取MD平板上生長明顯快于MM平板的酵母菌落，點接于含有濃度為4mg/mL 的G418的YPD平板上，30。C培養(yǎng)7天，所得酵母菌即為高拷貝Survivin基因 工程菌。(4) Survivin的誘導(dǎo)表達(dá)將步驟(3 )所得高拷貝Survivin基因工程菌于30。C培養(yǎng)至OD600為2，按 10。/。接種量接入BMGY培養(yǎng)基中，30。C培養(yǎng)24小時，5000g離心5分鐘，棄上 清，菌體用無菌水洗滌2次后，重懸于等體積的BMMY培養(yǎng)基中，3(TC誘導(dǎo)表 達(dá)3天(每24小時補(bǔ)加誘導(dǎo)劑曱醇至最終體積百分濃度為0.5% ) ， 4°C 、 6000g 離心5分鐘，收集上清，加入質(zhì)量百分濃度為80%的硫酸銨溶液使蛋白質(zhì)沉淀， 離心棄上清，蛋白質(zhì)沉淀用濃度為0.02mol/L、 pH為8.0的PBS透析脫鹽，再 用瓊脂糖凝膠(Q-Sepharose)柱進(jìn)行分離純化，收集洗脫液，適當(dāng)濃縮后用葡聚糖凝膠(Sephdex G-25 )柱脫鹽，即得純化的Survivin (氨基酸序列如SEQ ID No.2所示)，取樣進(jìn)行Western Blot鑒定。Western Blot鑒定取純化的Survivin，加入內(nèi)參卩-actin和上樣緩沖液，100 。C加熱3 5分鐘，用質(zhì)量百分濃度為12%的分離膠、質(zhì)量百分濃度為5%的積層 膠進(jìn)行SDS-PAGE,電泳完畢后，將分離產(chǎn)物電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜 上，用質(zhì)量百分濃度為5%的脫脂奶粉溶液封膜，加入鼠抗人Survivin單克隆抗 體和鼠抗人P-actin單克隆抗體，溫度37。C孵育1小時，洗膜，加入辣根過氧化 物酶標(biāo)記的兔抗鼠IgG,溫度37。C孵育1小時，洗膜，顯色；同時設(shè)置陰性對 照(不加入純化的Survivin);結(jié)果見圖1，其中1泳道為純化的Survivin, 2 泳道為陰性對照，可見1泳道除內(nèi)參P-actin條帶外，還有一明顯蛋白條帶，而 2泳道未見相應(yīng)條帶。(5) Survivin-SA的制備取濃度為5mg/ml的SA溶液lml,加入新鮮配制的濃度為2mg/ml的Tmut，s 試劑68.8^1、 10xPBS 0.2ml、濃度為0.5mol/L的EDTA溶液8(al和超純水lml, 混勻，4。C避光反應(yīng)2小時，超濾離心管10KD超濾脫鹽，再用含有l(wèi)xPBS和濃 度為2mmol/L的EDTA的平衡溶液稀釋后繼續(xù)超濾以稀釋Traut，s試劑，得巰基 化修飾的SA溶液；向上述巰基化修飾的SA溶液中，加入濃度為10mg/ml的 Survivin溶液200|il,混勻，4。C反應(yīng)4小時，即得Survivin-SA,用S印harose 4B 柱純化，凍干保存，取樣進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。SDS-PAGE鑒定結(jié)果如圖2所示，其中M泳道為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，1泳 道為Survivin-SA，可見1泳道在18KD處出現(xiàn)電泳帶，與預(yù)期結(jié)果相符。2、 Survivin-Lewis的制備在酶標(biāo)板中，每孔加入濃度為10ng/ml的Lex-PAA-biotin, 4。C包被過夜， 棄去包^皮液，用PBS洗滌后，再加入質(zhì)量百分濃度為2%的BSA溶液(以PBS 為溶劑)，4。C封閉過夜，棄去封閉液，用 洗滌后，加入濃度為10pg/ml 的Survivin-SA溶液，37。C反應(yīng)1小時，再室溫反應(yīng)30分鐘，即得Survivin-Lewis，凍干保存，取樣進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。SDS-PAGE鑒定結(jié)果如圖3所示，其中M泳道為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，1泳 道為Survivin-Lewis，可見1泳道在18KD處出現(xiàn)電泳帶，與預(yù)期結(jié)果相符。二、 Survivin-Lewis促進(jìn)特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答的檢測效應(yīng)細(xì)胞的制備將30只6~8周齡雌性Babl/c小鼠隨機(jī)分為3組實驗組、對照組和空白組(每組10只)，實驗組以濃度為lmg/mL的Survivin-Lewis溶液(以10 x PBS為溶劑)為免疫原，對照組以濃度為lmg/mL的survivin溶液(以10xPBS為溶劑)為免疫原，空白組以10xPBS為免疫原，各組于小鼠背側(cè)尾根部皮下注射免疫原，每只lOO^L,之后每隔1周，以同樣方法加強(qiáng)免疫l次，共免疫3次；末次免疫后l周，斷頸處死各組小鼠，在無菌條件下取脾臟，用100目篩網(wǎng)碾磨，收集細(xì)胞懸液，用聚蔗糖-泛影葡胺分層液密度梯度離心法分離脾淋巴細(xì)胞，用含有質(zhì)量百分濃度為10%的胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1 x 106個/11丄，作為后續(xù)實驗中各組的效應(yīng)細(xì)胞。1 、 ELISPOT法檢測Survivin-Lewis激發(fā)T細(xì)胞分泌IFN-y的能力釆用ELISPOT檢測試劑盒進(jìn)行4全測，具體操作參照試劑盒說明書在96孔培養(yǎng)板中，每孔加入體積百分濃度為70。/。的乙醇100pL，室溫放置10分鐘，用PBS洗滌后，再加入稀釋度為l : 100的IFN-Y捕獲抗體100^L,溫度4。C孵育過夜，用PBS洗滌后，再加入質(zhì)量百分濃度為2Q/。的脫脂奶粉溶液100jiL,室溫封閉2小時，用PBS洗滌后，再加入效應(yīng)細(xì)胞100^L,溫度37。C孵育48小時，用PBST (即含有質(zhì)量百分濃度為0.P/。的吐溫20的PBS)洗滌后，再加入稀釋度為l : 100的biotin標(biāo)記抗IFN-y抗體100^iL，溫度37。C孵育1.5小時，用PBST洗滌后，加入稀釋度為1 : 5000的SA標(biāo)記堿性磷酸酶100(iL，溫度37。C孵育1小時，用PBST洗滌后，拍干培養(yǎng)板，加入即用型BCIP/NBT底物反應(yīng)液100jiL，室溫避光顯色2 10分鐘至斑點形成，用蒸餾水終止反應(yīng)，干燥后檢測斑點數(shù)；同時設(shè)置陰性對照組(不加入效應(yīng)細(xì)胞)，各組斑點凄t以3個復(fù)孔的均值表示。結(jié)果見圖4，實驗組的斑點數(shù)(253個)明顯高于其它3組(對照組為186個，空白組為14個，陰性對照組為3個)，表明本發(fā)明的Survivin-Lewis具有良 好的免疫原性，能夠有效激發(fā)t細(xì)胞分泌IFN-y。2、 51Cr釋放法才企測Survivin-Lewis激發(fā)T細(xì)胞對Survivin陽性腫瘤細(xì)胞的 特異性殺傷效應(yīng)靶細(xì)胞的制備將Survivin陽性的結(jié)腸癌細(xì)胞CT26用含有質(zhì)量百分濃度為 10%的胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基體外培養(yǎng)，收集細(xì)胞，離心洗滌2次后， 用含有質(zhì)量百分濃度為10%的胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1 xl()6個/mL,取lmL置lOmL血清瓶中，加入Na51Cr04 100pCi，溫度37。c孵育 90分鐘，充分洗滌細(xì)胞除去未結(jié)合的51Cr,再用含有質(zhì)量百分濃度為10°/。的胎 牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為lxl()S個/mL,作為草巴細(xì)胞。在96孑L U型板中，每孔分別按效輩巴比(E/T)為100 : 1、 50 : 1和25 : 1 加入效應(yīng)細(xì)胞與耙細(xì)胞，每種效耙比設(shè)3個復(fù)孔，同時設(shè)最大釋放組(用濃度 為2mol/L的鹽酸替代效應(yīng)細(xì)胞)和最小釋放組(用含有質(zhì)量百分濃度為10%的 胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基替代效應(yīng)細(xì)胞)，將96孔板500r/min離心30秒后， 溫度37。c孵育4小時，再1000r/min離心10分鐘，各孔取上清lOO(iL,用y計 數(shù)器測定每分鐘放射活性(cpm值)，按下述公式計算殺傷率殺傷率(％)=[(實 驗組cpm均值-最小釋放組cpm均值)/(最大釋》欠組cpm均值-最小釋放組cpm均 值)]x亂結(jié)果見圖5，實驗組在各效靶比對CT26細(xì)胞均有特異性殺傷作用，且 隨著效靶比增大，特異性殺傷作用逐漸增強(qiáng)，當(dāng)E/T為IOO:I時，殺傷率 為53.4%，而對照組殺傷率為37.2%,空白組對CT26細(xì)胞無特異性殺傷作用， 表明本發(fā)明的Survivin-Lewis能夠有效激發(fā)T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷 效應(yīng)。最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管 通過參照本發(fā)明的優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所 附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍。序 列 表<110〉 中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)<120>生存素與路易斯寡糖的復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用<160〉 4<210〉 1<211> 429<212〉 薩<213> 智人(homo sapiens) <220><221> CDS<222〉 (1)......(429)<400〉 1atg ggt gcc ccg acg ttg ccc cct gcc tgg cag ccc ttt etc aag gac 48Met Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gin Pro Phe Leu Lys Asp15 10 15cac cgc ate tct aca ttc aag aac tgg ccc ttc ttg gag ggc tgc gcc 96His Arg lie Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys Ala20 25 30tgc acc ccg gag egg atg gcc gag get ggc ttc ate cac tgc ccc act 144Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe lie His Cys Pro Thr35 40 45gag aac gag cca gac ttg gcc cag tgt ttc ttc tgc ttc aag gag ctg 192Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gin Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu50 55 60gaa ggc tgg gag cca gat gac gac ccc ata gag gaa cat aaa aag cat 240Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro lie Glu Glu His Lys Lys His65 70 75 80teg tec ggt tgc get ttc ctt tct gtc aag aag cag ttt gaa gaa tta 288Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu Ser Val Lys Lys Gin Phe Glu Glu Leu85 90 95acc ctt ggt gaa ttt ttg aaa ctg gac aga gaa aga gcc aag aac aaa '336Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn Lys100 105 110att gca aag gaa acc aac aat aag aag aaa gaa ttt gag gaa act gcg 384lie Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys Lys Lys Glu Phe Glu Glu Thr Ala115 120 125gag aaa gtg cgc cgt gcc ate gag cag ctg get gcc atg gat tga 429Glu Lys Val Arg Arg Ala lie Glu Gin Leu Ala Ala Met Asp 130 135 140<210〉 2<211> 142<212> PRT<213〉 智人(homo sapiens)<400〉 2Met Gly Ala Pro Thr Leu Pro1 5 His Arg lie Ser Thr Phe Lys 20Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala 35Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala 50 55 Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp65 70 Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu85Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys 100lie Ala Lys Glu Thr Asn Asn 115Glu Lys Val Arg Arg Ala lie 130 135Pro Ala Trp Gin Pro Phe Leu Lys Asp10 15 Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys Ala25 30 Glu Ala Gly Phe lie His Cys Pro Thr40 45 Gin Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu60Asp Pro lie Glu Glu His Lys Lys His 75 80 Ser Val Lys Lys Gin Phe Glu Glu Ixu90 95 Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn Lys105 110 Lys Lys Lys Glu Phe Glu Glu Thr Ala 120 125 Glu Gin Leu Ala Ala Met Asp140<210〉 3<2U〉 33<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 引物Fl<400〉 3
taggatccat gggtgccccg acgttgcccc ctg
<210〉 4
〈211〉 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Rl<400> 4
gcaagcttat ccatggcacc agctgctg
權(quán)利要求
1、生存素與路易斯寡糖的復(fù)合物，其特征在于由生存素與路易斯寡糖-x以非共價鍵結(jié)合而成，所述生存素具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的生存素與路易斯寡糖的復(fù)合物，其特征在于由 生存素與路易斯寡糖-x通過鏈霉親和素與生物素的高親和力結(jié)合而成。
3、 權(quán)利要求l所述的生存素與路易斯寡糖的復(fù)合物的制備方法，其特征在 于包括以下步驟a、 生存素與鏈霉親和素的交聯(lián)物的制備將鏈霉親和素與Traut，s試劑反應(yīng)制得巰基化修飾的鏈霉親和素；將生存素 與巰基化修飾的鏈霉親和素反應(yīng)制得生存素與鏈霉親和素的交聯(lián)物；b、 生存素與路易斯寡糖的復(fù)合物的制備在酶標(biāo)板中加入(路易斯寡糖-x)-聚丙烯酸鈉-生物素溶液，4"C包被過夜，棄 去包被液，用PBS洗滌后，再加入牛血清白蛋白溶液，4。C封閉過夜，棄去封閉 液，用PBS洗滌后，再加入步驟a所得生存素與鏈霉親和素的交聯(lián)物溶液，37 。C反應(yīng)0.5 2小時，再室溫反應(yīng)10 60分鐘，即得生存素與路易斯寡糖的復(fù)合物。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的生存素與路易斯寡糖的復(fù)合物的制備方法，其特 征在于所述步驟a是將鏈霉親和素與Traut，s試劑在含有PBS和乙二胺四乙酸 的水溶液中4。C避光反應(yīng)2小時，超濾脫鹽，再用含有PBS和乙二胺四乙酸的 水溶液稀釋后繼續(xù)超濾以稀釋Traut，s試劑，制得巰基化修飾的鏈霉親和素；向 所得巰基化修飾的鏈霉親和素溶液中，加入生存素溶液，混勻，4。C反應(yīng)4小時， 即得生存素與鏈霉親和素的交聯(lián)物。
5、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的生存素與路易斯寡糖的復(fù)合物的制備方法，其特 征在于所述步驟b是在酶標(biāo)板中加入濃度為10jig/ml的^各易斯寡糖-x)-聚丙烯 酸鈉-生物素溶液，4"C包被過夜，棄去包被液，用PBS洗滌后，再加入質(zhì)量百 分濃度為2%的牛血清白蛋白溶液，4'C封閉過夜，棄去封閉液，用PBS洗滌后，再加入濃度為10i!g/ml的生存素與鏈霉親和素的交聯(lián)物溶液，37。C反應(yīng)1小時， 再室溫反應(yīng)30分鐘，即得生存素與路易斯寡糖的復(fù)合物。
6、權(quán)利要求1所述的生存素與路易斯寡糖的復(fù)合物在制備腫瘤疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了生存素與路易斯寡糖的復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用，該復(fù)合物由生存素與路易斯寡糖-x以非共價鍵結(jié)合而成，所述生存素具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；其制備方法是先制得生存素與鏈霉親和素的交聯(lián)物，再與(路易斯寡糖-x)-聚丙烯酸鈉-生物素通過鏈霉親和素與生物素的高親和力進(jìn)行結(jié)合，即制得生存素與路易斯寡糖的復(fù)合物；本發(fā)明復(fù)合物通過路易斯寡糖-x的導(dǎo)向作用，可成功靶向樹突狀細(xì)胞表面特異性C型凝集素-細(xì)胞間黏附分子3結(jié)合非整合素分子(DC-SIGN)，促進(jìn)生存素特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答，高效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡并抑制腫瘤血管生成，可用于制備腫瘤疫苗，在腫瘤免疫治療領(lǐng)域有著良好的開發(fā)應(yīng)用前景。
文檔編號A61K47/48GK101623503SQ20091010454
公開日2010年1月13日 申請日期2009年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月6日
發(fā)明者吳玉章, 曌 楊 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)