雙唾液酸化四糖的合成方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種化學(xué)可控的酶法合成雙唾液酸化的四糖的合成方法。本發(fā)明還提供了兩種用于合成制備雙唾液酸化四糖的中間體，分別為通式Ⅳ、Ⅴ所示的化合物。本發(fā)明將化學(xué)合成法的靈活性和酶合成法的高區(qū)域選擇性和高效性結(jié)合到一起，首次實(shí)現(xiàn)了用化學(xué)干預(yù)的方法合成雙唾液酸化四糖的合成，解決了目前化學(xué)合成雙唾液酸化四糖的所面臨的底物反應(yīng)活性低、合成步驟繁多、收率低等不足，以及酶法中唾液酸轉(zhuǎn)移酶獲得困難和只對糖肽識別的問題，具有底物反應(yīng)活性高、收率高的優(yōu)點(diǎn)，因而，本發(fā)明為在分子水平上研究唾液酸糖苷的生物功能和發(fā)展以此為基礎(chǔ)的糖藥物具有重要意義。
【專利說明】雙唾液酸化四糖的合成方法【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明涉及糖類物質(zhì)的化學(xué)酶法合成方法，尤其涉及一類腫瘤相關(guān)糖抗原和對神經(jīng)修復(fù)具有促進(jìn)作用的雙唾液酸化四糖的化學(xué)酶法合成方法，屬于糖類藥物領(lǐng)域?！颈尘凹夹g(shù)】[0002]雙唾液酸化四糖Neu5Ac α (2-3) Gal β (1-3) [Neu5Ac α (2-6) ] GalNAc (圖1)廣泛存在于各種類型細(xì)胞表面，并在眾多生理和病理過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。例如，該四糖是人類紅細(xì)胞表面高度糖基化的血型糖蛋白(glycophorin)上最主要的糖鏈,這一糖鏈除了可以避免紅細(xì)胞的聚集外，還參與了紅細(xì)胞所介導(dǎo)的眾多生理過程(J.Parkkinen, G.N.Rogers, T.Korhonen, ff.Dahr, J.Finne.1nfectionandimmolunity, 1986, 54, 37-42)；這一四糖也是腫瘤細(xì)胞過度表達(dá)的黏蛋白MUCII上的特異性腫瘤相關(guān)糖抗原，因而是合成以糖鏈為基礎(chǔ)的腫瘤疫苗的重要組成部分；此外，這一四糖也是神經(jīng)節(jié)苷酯GQlba的組成部分，是髓磷脂相關(guān)糖蛋白(myelin-associatedglycoprotein, MAG)所能識別的最小結(jié)構(gòu)單元，且為其結(jié)合活性最高的天然受體(B.E.Collins, H.1to, N.Sawada, H.1shida, M.Kiso, R.L.Schnaar, J.Biol.Chem.1999, 274, 37637);這一四糖還是促紅細(xì)胞生成素(EPO)上的唯一 O-聚糖鏈。 [0003]圖1是雙唾液酸化四糖的結(jié)構(gòu)。[0004]鑒于上述情況，大量合成這種富含唾液酸的寡糖用于在分子水平上研究其功能是非常有價(jià)值的，同時(shí)一個(gè)高效、便捷的合成方法將極大地促進(jìn)以其為先導(dǎo)化合物的藥物發(fā)現(xiàn)進(jìn)程。然而由于這類天然唾液酸糖苷結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性及其不穩(wěn)定性，給分離純化帶來了極大困難。雖然近年來化學(xué)合成寡糖獲得了快速的發(fā)展，但依然沒有一個(gè)統(tǒng)一、有效的普適性方法?；瘜W(xué)法合成這類四糖需要進(jìn)行反復(fù)的保護(hù)與脫保護(hù)操作，反應(yīng)收率低，立體選擇性不高(J.B.Schwarz, S.D.Kuduk, X.Chen, D.Sames, P.ff.Glunz, andS.J.Danishefsky，J.Am.Chem.Soc.，1999，121，2662-2673)。同時(shí)，九碳糖唾液酸由于其自身獨(dú)特結(jié)構(gòu)，不僅容易形成分子內(nèi)氫鍵，且在Cl位的羧基、C3位的脫氧、C5位的氮雜原子取代等使得唾液酸糖苷鍵的化學(xué)合成一直以來都是糖合成領(lǐng)域的難點(diǎn)(X.Chen.，A.Varki, ACSChem.Biol.，2010，5，2，163-176)。酶法合成這類雙唾液酸化的四糖需要使用 α 2，3唾液酸轉(zhuǎn)移酶和α 2，6唾液酸轉(zhuǎn)移酶來分別將兩個(gè)唾液酸引入不同位置。目前， 僅有的一例酶法合成報(bào)道(0.Blixt, K.Allin, L.Pereira, A.Datta, andj.C.Paulson, J.Am.Chem.Soc.，2002，124，5739-5746)，采用的是哺乳動(dòng)物來源的兩個(gè)唾液酸轉(zhuǎn)移酶來分別引入四糖表位中的兩個(gè)唾液酸。利用哺乳動(dòng)物來源的唾液酸轉(zhuǎn)移酶面臨以下幾方面的困難:(1)哺乳動(dòng)物來源的唾液酸轉(zhuǎn)移酶均為跨膜蛋白，現(xiàn)有技術(shù)手段很難實(shí)現(xiàn)可溶性蛋白的大量表達(dá)；(2)該系列酶往往具有很強(qiáng)的底物專一性，底物適用性窄，例如報(bào)道中的唾液酸轉(zhuǎn)移酶只對糖肽有較高的反應(yīng)活性(0.BI ixt，K.Al I in，L.Pereira, A.Datta, andj.C.Paulson.J.Am.Chem.Soc.2002，124，5739-5746)。近年來發(fā)現(xiàn)細(xì)菌來源的唾液酸轉(zhuǎn)移酶具有表達(dá)量高，底物適應(yīng)性寬等優(yōu)點(diǎn)(J.Yan, X.Chen, F.Wang, H.Ca0.0rg.Biomol.Chem.2013，11，842-848)，但是，其中的α 2, 6唾液酸轉(zhuǎn)移酶卻不能區(qū)分核心二糖 Gal^ (1-3)GalNAc的半乳糖(Gal)或乙酰氨基半乳糖(GalNAc)。為解決這些問題，本發(fā)明首次成功運(yùn)用含有內(nèi)酯的寡糖進(jìn)行化學(xué)酶法的合成，實(shí)現(xiàn)了雙唾液酸化四糖及其類似物的快速、高效合成，解決了目前化學(xué)或酶法合成中的不足。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]針對上述現(xiàn)狀，本發(fā)明首先要面臨的技術(shù)問題是解決酶法合成中使用到的細(xì)菌來源的α 2，6唾液酸轉(zhuǎn)移酶不能區(qū)分核心二糖Galii (1-3)GalNAc的半乳糖(Gal)或乙酰氨基半乳糖(GalNAc)的問題，從而將第二個(gè)唾液酸引入到正確的位置。[0006]本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問題提供一種快速、高效的化學(xué)操縱的酶法合成雙唾液酸化四糖及其類似物的方法。[0007]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的:[0008]一類雙唾液酸化四糖的合成方法，具體步驟如下:[0009](I)利用化學(xué)法合成β -構(gòu)型的N-乙酰氨基半乳糖苷GalNAc β O R1 (如圖2的通式I所示);其中=R1為氫原子、α -或β -構(gòu)型絲氨酸殘基、α -或β -構(gòu)型蘇氨酸殘基、疊氣取代烷基、炔基取代烷基、疏基取代烷基或α _或β _構(gòu)型取代烷基；[0010](2)利用“一鍋雙酶法”將通式I的化合物和半乳糖立體選擇性偶聯(lián)合成二糖 GalP (1-S)GalNAcOR1 (如圖3的通式II所示)，所述”一鍋雙酶法”中先后用到的酶分別為半乳糖激酶(GalK)和己糖磷酸化酶(BiGalHexNAcP);其中=R1為氫原子、α -或β -構(gòu)型絲氨酸殘基、α -或β -構(gòu)型蘇氨酸殘基、疊氮取代烷基、炔基取代烷基、巰基取代烷基或α -或 β-構(gòu)型取代烷基；[0011](3)利用“一鍋雙酶法”合成通式III的三糖(如圖4所示)，所述“一鍋雙酶法”唾液酸化中用到的酶指CMP-唾液酸合成酶(NmCSS)和α 2，3唾液酸轉(zhuǎn)移酶(PmSTl) (J.Yan, X.Chen, F.Wang, H.Ca0.0rg.Biomol.Chem.2013，11，842-848);其中:R1 為氫原子、α -或β-構(gòu)型絲氨酸殘基、α-或β-構(gòu)型蘇氨酸殘基、疊氮取代烷基、炔基取代烷基、巰基取代烷基或α-或構(gòu)型取代烷基；R2為氟原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、羥基或置氣；[0012](4)利用乙?；瓦x擇性脫乙?；姆椒?，合成含唾液酸的內(nèi)酯三糖(如圖5的通式IV所示);其中=R1為氫原子、α -或β -構(gòu)型絲氨酸殘基、α -或β -構(gòu)型蘇氨酸殘基、疊氮取代烷基、炔基取代烷基、巰基取代烷基或α-或β-構(gòu)型取代烷基；R2為氟原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、`羥基或疊氮；[0013](5)利用酶法合成雙唾液酸化的內(nèi)酯四糖(如圖6的通式V所示)，所述酶法唾液酸化中用到的酶指α 2，6唾液酸轉(zhuǎn)移酶；其中=R1為氫原子、α -或β -`構(gòu)型絲氨酸殘基、 α-或β_構(gòu)型蘇氨酸殘基、疊氮取代烷基、炔基取代烷基、巰基取代烷基或α-或β_構(gòu)型取代烷基；R2為氟原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、羥基或疊氮；R3為氟原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、羥基或疊氮；[0014](6)堿性水溶液中水解上述雙唾液酸化四糖的內(nèi)酯，得到雙唾液酸化四糖(如圖7 的通式VI所示)；其中=R1為氫原子、α -或β -構(gòu)型絲氨酸殘基、α -或β -構(gòu)型蘇氨酸殘基、置氣取代烷基、炔基取代烷基、疏基取代烷基或ct -或β -構(gòu)型取代烷基；R2為氣原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、羥基或疊氮；R3為氟原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、羥基或疊氮。[0015]本發(fā)明中，通過步驟(2)和步驟(3)，我們利用α 2，3唾液酸轉(zhuǎn)移酶(PmSTl)和己糖磷酸化酶(BiGalHexNAcP)，高效、快速的實(shí)現(xiàn)了對單唾液三糖的底物積累，對于這兩種酶的底物適應(yīng)性的考察(含R1和R2所列基團(tuán))可見相關(guān)報(bào)道(K.Lau, H.Yu, V.Thon, Z.Khedri, M.E.Leon, B.K.TranandX.Chen, Org.Biomol.Chem., 2011, 9, 2784 ；H.Yu, H.Yu, R.KarpelandX.Chen.Bioorg.Med.Chem.12, 2004, 6427)。但是，基于之前對 α 2, 6 唾液酸轉(zhuǎn)移酶在上述三糖上引入第二個(gè)唾液酸的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)α 2，6唾液酸轉(zhuǎn)移酶不能區(qū)分核心二糖 Galii (1-3) GalNAc的半乳糖(Gal)或乙酰氨基半乳糖(GalNAc)，為解決此關(guān)鍵性問題，我們運(yùn)用化學(xué)手段合成了內(nèi)酯三糖[具體見步驟(4)]，實(shí)現(xiàn)了對非還原末端二糖構(gòu)象的鎖定，使構(gòu)象改變的半乳糖不再是α2，6唾液酸轉(zhuǎn)移酶(PdST)的最適底物；通過步驟(5)，發(fā)現(xiàn)α2，6唾液酸轉(zhuǎn)移酶(PdST)還能以內(nèi)酯三糖作為底物，高效的對還原端的乙酰氨基半乳糖進(jìn)行唾液酸化；通過步驟(6)，實(shí)現(xiàn)了目的雙唾液酸四糖的高效合成。而且，通過步驟(4) 和步驟(5)，擴(kuò)充了 α 2，6唾液酸轉(zhuǎn)移酶的底物適應(yīng)范圍，利用內(nèi)酯進(jìn)行酶法合成也未見相關(guān)報(bào)道。[0016]所述步驟(1)中的β_構(gòu)型的N-乙酰氨基半乳糖苷采用以下方法合成:將半乳糖氨鹽酸鹽與醋酐進(jìn)行反應(yīng)后，將其全部羥基用乙?；Ｗo(hù)；然后在微波條件下進(jìn)行β_構(gòu)型糖苷化反應(yīng)，然后依次疊氮化和脫保護(hù)后即得可作為下步酶反應(yīng)受體的N-乙酰氨基半乳糖苷(圖8)。[0017]所述步驟(2)中的二糖Gaie (1-3) GalNAc O R1合成方法是:將化合物1、半乳糖 (1.5-3.0 當(dāng)量)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP) (1.5-5.0 當(dāng)量),MgCl2 (5-100mmol) ,Tris-HCl 緩沖液(10-500mmol，pH5.0-10.0)配制水溶液，將反應(yīng)體系的pH值調(diào)節(jié)至4.5-8.5，然后添加半乳糖激酶(GalK)和己糖磷酸化酶(BiGalHexNAcP)，待反應(yīng)完成后，純化即可直接獲得二糖化合物II。[0018]所述當(dāng)量是指物質(zhì)相互作用時(shí)的物質(zhì)的量的比值，如:半乳糖(1.5-3.0當(dāng)量)的含義即為:半乳糖與化合物I的物質(zhì)的量的比為1.5-3.0。下同。[0019]所述步驟(3)中的α 2，3唾液酸化二糖的合成方法:將化合物I1、唾液酸(Neu5Ac) (1.5-5.0 當(dāng)量)、胞苷三磷酸(CTP) (0.5-10.0 當(dāng)量)'MgCl2 (5.0-1OOmmol)和 Tris-HCl 緩沖液(10-500mmOl，pH5.0-10.5)配制水溶液，加入CMP-唾液酸合成酶和α 2，3唾液酸轉(zhuǎn)移酶，實(shí)現(xiàn)“一鍋雙酶法”唾液酸化，反應(yīng)完成后，純化即可直接獲得化合物III。[0020]所述反應(yīng)完成采用薄層色譜法(TLC)跟蹤反應(yīng)進(jìn)程，展開劑為 EA:CH3OH:H2O:H0Ac=4:2:1:0.1 來檢測。[0021]所述步驟(4)中α 2，3唾液酸化內(nèi)酯三糖合成方法是:在冰浴的條件下，加入化合物II1、吡啶、醋酐，反應(yīng)5-24小時(shí)后旋蒸蒸干，拌入硅膠，柱分離純化，得到全乙?；幕衔颕V。之后將全乙?；闹虚g體溶于甲醇，加入甲醇鈉粉末，使反應(yīng)體系的pH值保持7-9 大約5-10小時(shí)，然后柱分離純化即得化合物IV。[0022]所述反應(yīng)完成采用薄層色譜法(TLC)跟蹤反應(yīng)進(jìn)程，展開劑為 EA:CH3OH:H2O:H0Ac=4:2:1:0.1 來檢測。
[0023]所述步驟(5)中雙唾液酸化四糖的合成方法是:將化合物IV、CMP-唾液酸(CMP-Neu5Ac) (1.5-5.0 當(dāng)量)、MgCl2 (5.0-lOOmmol)和 Tris-HCl 緩沖液(10-500mmol, pH5.0-10.5)配制水溶液，加入α 2，6唾液酸轉(zhuǎn)移酶，實(shí)現(xiàn)酶法唾液酸化，反應(yīng)完成后，純化即可直接獲得化合物V。[0024]所述步驟(6)中將化合物V溶于氫氧化鈉水溶液(0.1-1mol)中，反應(yīng)2_12小時(shí)， 純化即可直接獲得化合物VI。[0025]當(dāng)然，可以制備本發(fā)明化合物堿加成的鹽，這些鹽包括在發(fā)明之中。[0026]所述步驟(2)中“一鍋雙酶法”中先后用到的酶分別是 Ε.coliK_12galactokinase (GalK)和Bifidobacterium infantis D-galactosyl- β 1-3-Ν-acetyl-D-hexosamine phosphorylase (BiGalHexNAcP),反應(yīng)時(shí)間為 3-72 小時(shí)。[0027]所述步驟(3)中“一鍋雙酶法”唾液酸化中用到的酶是 NeisseriameningitidisCMP-sialic acid synthetase (NmCSS)和 Pasteurella multocida sialyl transferase I (PmSTl)，反應(yīng)時(shí)間為 5 分鐘-30 小時(shí)。[0028]所述步驟(2)和步驟(3)中“一鍋雙酶法”合成中反應(yīng)溫度為0_37°C，轉(zhuǎn)速為 0-240r/min ;所述酶反應(yīng)的停止方法是向反應(yīng)中加入與反應(yīng)液等體積的4°C無水乙醇并在 4°C下孵育0-30分鐘。[0029]本發(fā)明還提供了兩種用于合成制備雙唾液酸化四糖的中間體，分別為通式IV、V 所示的化合物。[0030]本發(fā)明提供了一種高效簡捷的化學(xué)可控的酶法合成雙唾液酸化的四糖的合成方法。本發(fā)明將化學(xué)合成法的靈活性和酶合成法的高區(qū)域選擇性和高效性結(jié)合到一起，首次實(shí)現(xiàn)了用化學(xué)干預(yù)的方法合成雙唾液酸化四糖的合成，解決了目前化學(xué)合成雙唾液酸化四糖的所面臨的底物反應(yīng)活性低、合成步驟繁多、收率低等不足，以及酶法中唾液酸轉(zhuǎn)移酶獲得困難和只對糖肽識別的問題，具有底物反應(yīng)活性高、收率高的優(yōu)點(diǎn)，因而，本發(fā)明為在分子水平上研究唾液酸糖苷的生物功能和發(fā)展以此為基礎(chǔ)的糖藥物具有重要意義?！緦＠綀D】

【附圖說明】[0031]圖1:雙唾液酸化四糖的結(jié)構(gòu)。[0032]圖2:通式I所示化合物。[0033]圖3:通式II所示化合物。[0034]圖4:通式III所示化合物。[0035]圖5:通式IV所示化合物。[0036]圖6:通式V所示化合物。[0037]圖7:通式VI所示化 合物。[0038]圖8:化學(xué)法合成β -構(gòu)型的單糖化合物I的反應(yīng)方程式。[0039]圖9 一鍋雙酶法”合成二糖化合物通式II的反應(yīng)方程式(現(xiàn)有技術(shù))。[0040]圖:10 一鍋雙酶法”合成二糖化合物2的反應(yīng)方程式。[0041]圖11 一鍋雙酶法”合成三糖化合物通式III的反應(yīng)方程式(現(xiàn)有技術(shù))。[0042]圖12 一鍋雙酶法”合成三糖化合物3的反應(yīng)方程式。[0043]圖13:化學(xué)法合成內(nèi)酯三糖4的反應(yīng)方程式。[0044]圖14:酶法法合成內(nèi)酯四糖5的反應(yīng)方程式。[0045]圖15:化學(xué)法合成雙唾液酸四糖6的反應(yīng)方程式。【具體實(shí)施方式】[0046]下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。應(yīng)該說明的是，實(shí)施例僅是示范性的，并不對本發(fā)明構(gòu)成任何限制。[0047]本發(fā)明中所提及的化合物1、2、3、4、5、6分別對應(yīng)于R1為疊氮取代烷基、R2為氮乙酰氨基、R3為氮乙酰氨基的通式1、11、111、1￥、乂、/1的化合物。[0048]下述實(shí)施例中所涉及的反應(yīng)原料、溶劑等，若無特別說明，均為現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)產(chǎn)品，所涉及的合成方法、工藝，若無特別說明，均為所屬領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)手段。[0049]實(shí)施例1化學(xué)酶法合成雙唾液酸化四糖[Neu5Ac α (2-3) Gal β (1-3) [Neu5Ac α (2-6)]GalNAc][0050]步驟如下:[0051 ] (I)化學(xué)法合成β -構(gòu)型的單糖衍生物1:[0052]化合物I (GalNAc β ProN3)的合成[0053]反應(yīng)方程式如圖8所示；[0054]向500mL圓底燒瓶中，加入半乳糖氨鹽酸鹽(8.0g, 37.1mmol)、醋酐(38mL)、批啶(160mL)、二甲氨基吡啶(DMAP，0.3g，2.46mmol)，室溫?cái)嚢?2小時(shí)。薄層色譜檢測 (EA:MeOH=IO:1)反應(yīng)完全后,旋蒸濃縮,之后向反應(yīng)液中加入甲苯20mL,旋蒸濃縮，反復(fù)進(jìn)行3次。所得固體復(fù)溶于300mL甲醇，在4°C條件下靜置12小時(shí)重結(jié)晶。過濾，棄除濾液， 收集所得固體，干燥，獲得白色固體化合物7(11.7g, 84%)。[0055]向容積為IOmL的微波專用反應(yīng)管中，加入化合物7 (1.00g，2.57mmol)、1,2-二氯乙燒(5mL)、1-氯-3-丙醇(0.34mL, 5.14mmol),、硫酸-硅膠(17mg)，磁子攪拌，微波條件下110°C反應(yīng)15分鐘。按照相同的反應(yīng)條件，平行開5組相同的反應(yīng)。之后收集反應(yīng)液，過濾，二氯甲烷沖洗，濾液用飽和碳酸氫鈉溶液萃取兩次，半飽和食鹽水萃取一次，之后分離有機(jī)相，再用無水硫酸鈉干燥有機(jī)相，過濾，蒸干，獲得白色固體化合物8(5.45g, 92%)。[0056]向250mL圓底燒瓶中加入化合物8 (4.82g, 11.4mmol)、N, N-二甲基甲酰胺(70mL)、 疊氮鈉(3.7g, 56.9mmol)，110°C攪拌回流12小時(shí)。薄層色譜檢測(PE:EtOAc=1: 8)反應(yīng)完全后，使用硅藻土過濾，二氯甲烷沖洗，半飽和食鹽水40mL萃取，反復(fù)三次，再用無水硫酸鈉干燥有機(jī)相，旋蒸濃縮，獲得棕色糖漿狀化合物9 (4.4g, 90%)。[0057]向250mL圓底燒瓶中加入化合物9、甲醇(60mL)、甲醇鈉，直至溶液體系pH 值到9.5左右，室溫?cái)嚢?小時(shí)，薄層色譜檢測(EtOAc:MeOH:H2O:H0Ac=4:2:1:0.2) 反應(yīng)完全后，旋蒸濃縮，快速柱分離純化，得到白色固體化合物I (3.96g, 91%)。 參數(shù)如下:1 關(guān)MR(600MHz, D2O) δ 4.40 (d, J=8.4Hz, 1H)，3.94 (dt, J=I0.8，5.6Hz, 1H) , 3.89 (d, J = 3.1 Hz, 1H) , 3.83 (dd, J=19.6, 10.9 Hz, IH), 3.80-3.70 (m, 2H)，3.68 (dd, J=I0.8，3.2Hz, 1H), 3.65 - 3.60 (m, 2H), 3.43 - 3.27 (m, 2H)，2.04 (s, 3H), 1.80 (m, 2H).[0058](2) “一鍋雙酶`法”合成二糖化合物 2 [Gal β (1-3)GalNAc β ProN3][0059]“一鍋雙酶法”的一般操作方法如圖9所示(現(xiàn)有技術(shù)中的方法)；[0060]本發(fā)明的化合物2 [Gal β (1-3) GalNAc β ProN3]的合成[0061 ] 反應(yīng)方程式如圖10所示；[0062]將受體化合物I (200mg)、半乳糖(176mg)、ATP (540mg)、Tris-HCl 緩沖液 (lOOmmol, pH7.5)和氯化鎂(20mmol) (Tris和氯化鎂的用量由最終反應(yīng)液的體積來計(jì)算確定)溶于 50mL 離心管中，加入 GalK (7.2-8.0mg)和 BiGalHexNAcP (8.5 - 11.0mg)，加雙蒸水至總體積30mL后，將反應(yīng)體系置于搖床中，37°C、140r/min孵育48小時(shí)。薄層色譜 EtOAc:MeOH:H2O:EtOH=4:2:1:0.2跟蹤檢測反應(yīng)完成后，加入與反應(yīng)體系等體積的無水乙醇4°C、140r/min孵育30min以終止反應(yīng)。然后將反應(yīng)體系4°C、12000r/min離心10分鐘， 收集上清液，旋蒸濃縮，通過硅膠柱快速柱分離，獲得白色化合物2 (1.03g, 83%)。參數(shù)如下: 1HNMR (600MHz, D2O) δ 4.45 (d, J=8.4Hz, 1H)，4.40 (d, J=7.8Hz, 1H)，4.14 (s, 1H)，3.95 (t, J=9?3Hz, 2H)，3.86 (s, 1H)，3.82 (d, J=I0.8Hz, 1H), 3.79 - 3.68 (m, 4H)，3.65 (d, J=3.5Hz, 2H)，3?62 (s, 1H)，3.57 (d, J=I0.0Hz, 1H)，3.48 (t, J=8.4Hz, 1H)，3.34 (s, 2H)，1.99 (s, 3H)，1.80 (s ，2H).[0063](3) “一鍋雙酶法”合成三糖化合物 3 [Neu5Ac α (2-3) Gal β (1-3) GalNAc β ProN3][0064]“一鍋雙酶法”唾液酸化的一般操作方法如圖11所示(現(xiàn)有技術(shù)中的方法);[0065]本發(fā)明的化合物3 [Neu5Ac α (2-3) Gal β (1-3) GalNAc β ProN3]的合成[0066]反應(yīng)方程式如圖12所示；[0067]向50mL離心管中，加入由“一鍋雙酶法”合成得到的二糖受體2(0.22g, 0.47mmol)、N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac，0.22g)、胞苷三磷酸(CTP, 0.44g)、 Tris-HCl緩沖液(lOOmmol, pH8.5)和氯化鎂(20mmol) (Tris和氯化鎂的用量由最終反應(yīng)液的體積來計(jì)算確定)，加雙蒸水調(diào)節(jié)總體積為20mL，振動(dòng)攪勻后加入酶 NmCSS(3-6mg)和 PmSTl (0.2-0.6mg)，在 37 °C、140r/min 條件下孵育 0.5 小時(shí)。薄層色譜(EA:CH3OH:H2O:H0Ac=4:2:1:0.1)跟蹤檢測反應(yīng)完成后，加入與反應(yīng)體系等體積的無水乙醇，4°C、140r/min孵育0.5h中止反應(yīng)。之后將反應(yīng)體系4°C、12000r/min離心10分鐘，收集上清液。旋蒸濃縮，通過快速柱分離，獲得白色化合物3(1.04g，97%)。參數(shù)如下: 1HNMR (300MHz, D2O) δ 4.54 (d, J=8.4Hz, 1H,), 4.52 (d, 1H, J=7.8Hz)，4.20 (d, J=3.3Hz, 1H)，4.09 (dd, J=9.9，3.1Hz, 1H), 4.06 - 4.01 (m, 1H)，3.99 (d, J=4.1Hz, 1H)，3.95 (d, J=3.1Hz, 1H), 3.91 (dd, J=5.8，2.8Hz, 2H)，3.86 (dd, J=6.0，2.9Hz, 2H), 3.84 - 3.81 (m, 1H)，3.81 -3.77 (m, 2H), 3.77 - 3.50 (m, 13H)，3.41 (t, J=6.6Hz, 2H)，2.77 (dd, J=12.6，4.5Hz, 1H)，2.04 (d, J=5.7Hz, 6H), 1.88 (dd, J=12.8，6.4Hz, 2H), 1.80 (t, J=I 1.7Hz, 1H).[0068]( 4 )化學(xué)法合成內(nèi)酯三糖4[0069]化合物3-疊氮丙基-[5-乙酰氨基-3，5- 二脫氧_D_甘油- α -吡喃九碳酮糖酸-(I ”一 4’)-內(nèi)酯]-(2 — 3) -O- β -D-吡喃半乳糖基-(I — 3) - β -D-2-乙酰氨基_2_脫氧-β -D-吡喃半乳糖苷4的合成[0070]反應(yīng)方程式如圖13所示；[0071]向50mL圓底燒瓶中加入化合物3 (130mg)、醋酐(ImL)、吡啶(2mL)，冰浴條件下攪拌12h。薄層色譜檢測(EA:Me0H=10:1)反應(yīng)完全后，旋蒸濃縮，之后向反應(yīng)液中加入2mL甲苯，旋蒸濃縮，反復(fù)進(jìn)行3次。之后，通過快速柱分離，獲得白色化合物10(160mg，87%)。[0072]向50mL圓底燒瓶中加入化合物IO(IlOmg)、甲醇(5mL),室溫下攪拌溶解，再加入甲醇鈉，薄層色譜(EA:CH30H:H20:H0Ac=4:2:1:0.1)跟蹤檢測反應(yīng)完成后，旋蒸濃縮，通過快速柱分離，獲得白色化合物4 (38mg, 49.4%)。參數(shù)如下:1HNMR (600MHz，D2O) δ 4.53 (d, J=7.8Hz, 1H)，4.46 (d, J=9.0Hz, 1H)，4.32 - 4.19 (m, 2H)，4.08 (s, 1H)，4.01 -3.94 (m, 1H)，3.93 (t, J=5.9Hz, 1H)，3.85 (dd, J=18.5，8.3Hz, 2H), 3.82 - 3.79 (m, 1H)，3.7-8 (d, J = 5.5Hz, 1H) , 3.76 - 3.68 (m, 3H) , 3.64 (dd, J=I0.8, 6.1Hz，2H)，3.62 -3.56 (m, 3H), 3.54 - 3.49 (m, 3H)，3.33 (dd, J=17.0，10.5Hz, 3H)，2.55 (dd, J=13.3，5.2Hz, I H) ,2.12- 1.95 (m, 5H)，1.77 (dt, J=35.8，14.7Hz, 3H).[0073]( 5 )酶法法合成內(nèi)酯四糖5[0074]化合物3-疊氮丙基-[5-乙酰氨基-3，5- 二脫氧_D_甘油-α -2-吡喃九碳酮糖酸-(I ”一 4’)-內(nèi)酯]-(2 — 3) -O- β -D-吡喃半乳糖基-(I — 3) - [ (5-乙酰氨基 _3，5- 二脫氧-D-甘油-β -D-吡喃九碳酮糖酸)-(2 — 6) - β -D-2-乙酰氨基-2-脫氧-β -D-吡喃半乳糖苷5的合成[0075]反應(yīng)方程式如圖14所示；[0076]向50mL離心管中，加入內(nèi)酯三糖受體4(40mg, 0.05mmol)、胞苷二磷酸-N-乙酰神經(jīng)氨酸(CMP-Neu5Ac，0.17mmol )、雙蒸水(4mL)，調(diào)節(jié)溶液pH值至中性，加入酶 PdST (0.75mg)，加雙蒸水調(diào)節(jié)總體積為8mL，在37°C、140r/min條件下孵育2小時(shí)。薄層色譜(EA:CH30H:H20:H0Ac=4:2:1:0.I)跟蹤檢測反應(yīng)完成后，旋蒸濃縮，通過快速柱分離， 獲得白色化合物 5(48mg, 86%)。參數(shù)如下:1HNMR(600MHz, D2O) δ 4.50 (d, J=7.8Hz, 1H), 4.43 (d, J=8.4Hz, 1H), 4.26 - 4.21 (m, 1H)，4.11 (d, J=2.6Hz, 1H)，3.98 - 3.86 (m, 4H)，3.86 -3.79 (m, 4H), 3.78 - 3.69 (m, 4H), 3.68 - 3.55 (m, 9H), 3.55 - 3.46 (m, 5H), 3.36 - 3.27 (m, 2H )，2.67 (dd, J=12.4，4.4Hz, 1H)，2.54 (dd, J=13.4，5.4Hz, 1H)，1.99 (dd, J=16.9，13.5Hz, 7H)，1.86 (s, 9H)，1.82 - 1.71 (m, 3H)，1.64 (t, J=12.6Hz, 1H).[0077](6)化學(xué)法合成雙唾液酸化四糖6[0078]化合物3-疊氮丙基-[(5-乙酰氨基-3，5- 二脫氧_D_甘油- α -吡喃九碳酮糖酸)-(2 — 3) ] - β -D-吡喃半乳糖基-(I — 3) [ (5-乙酰氨基-3，5- 二脫氧-D-甘油-α -吡喃九碳酮糖酸)-(2 — 6) ] - β -D-2-乙酰氨基-2-脫氧-β -D-吡喃半乳糖苷6的合成[0079]反應(yīng)方程式如圖15所示；[0080]向50mL圓底燒瓶中加入化合物5 (35mg, 0.03mmol), ImolNaOH溶液(ImL),攪拌 4小時(shí)，薄層色譜(EA:CH30H:H20:H0Ac=4:2:1:0.I)跟蹤檢測反應(yīng)完成后，加入Imol鹽酸中和反應(yīng)液，之后溶液過0.22 μ m的微孔濾膜，通過Bio-gelP2凝膠分子排阻色譜進(jìn)行組合純化，獲得純品化合物6 (34.8mg, 98%)。參數(shù)如下=1HNMR(300MHz, D2O) 54.51 (dd, J =8.1, 4.2Hz, 2H), 4.21 (d, J=2.9Hz, 1H)，4.13 - 4.05 (m, 1H)，4.05 - 4.00 (m, 1H)，4.00 -3.93 (m, 3H), 3.91 (d, J=2.5Hz, 1H) , 3.91 - 3.87 (m, 3H) , 3.87 - 3.84 (m, 2H) , 3.81 (t, J=3.9Hz, 1H)，3.77 (d, J=3.7`Hz, 1H), 3.75 - 3.70 (m, 4H), 3.70 - 3.57 (m, 9H)，3.54 (dd ，J=7.2，2.5Hz, 1H)，3.39 (dd, J=Il.8，5.1Hz, 2H)，2.85 - 2.67 (m, 2H)，2.05 (s, 9H)，1.87 (dd ，J=12.5，6.1Hz, 2H)，1.80 (t, J=7.9Hz, 1H)，1.70 (dd, J=14.6，9.5Hz, 1H).
【權(quán)利要求】
1.雙唾液酸化四糖的合成方法，其特征在于:所述步驟如下:(1)利用化學(xué)法合成β-構(gòu)型的N-乙酰半乳糖胺，結(jié)構(gòu)如通式I所示，其中=R1為氫原子、α -或β -構(gòu)型絲氨酸殘基、α -或β -構(gòu)型蘇氨酸殘基、疊氮取代烷基、炔基取代烷基、 疏基取代烷基或Ct -或β -構(gòu)型取代烷基；(2)利用“一鍋雙酶法”將通式I的化合物和半乳糖立體選擇性偶聯(lián)合成二糖 Gal^ (l^GalNAcOR1，結(jié)構(gòu)如通式II所示，所述“一鍋雙酶法”中先后用到的酶分別為半乳糖激酶和己糖磷酸化酶；其中=R1為氫原子、α -或β -構(gòu)型絲氨酸殘基、α -或β -構(gòu)型蘇氣酸殘基、置氣取代烷基、炔基取代烷基、疏基取代烷基或α-或β _構(gòu)型取代烷基； (3)利用“一鍋雙酶法”合成通式III的三糖，所述“一鍋雙酶法”唾液酸化中用到的酶指 CMP-唾液酸合成酶和α 2，3唾液酸轉(zhuǎn)移酶；其中=R1為氫原子、α-或β-構(gòu)型絲氨酸殘基、 α-或β-構(gòu)型蘇氨酸殘基、疊氮取代烷基、炔基取代烷基、巰基取代烷基或α-或β-構(gòu)型取代烷基；R2為氟原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、羥基或疊氮；(4)利用乙?；瓦x擇性脫乙?；姆椒?，合成含唾液酸的內(nèi)酯三糖，結(jié)構(gòu)如通式IV所示，其中=R1為氫原子、α-或β-構(gòu)型絲氨酸殘基、α-或β-構(gòu)型蘇氨酸殘基、疊氮取代烷基、炔基取代烷基、疏基取代烷基或ct -或β -構(gòu)型取代烷基；R2為氣原子、氣乙酸氣基、 氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、羥基或疊氮；(5 )利用酶法合成雙唾液酸化內(nèi)酯四糖，結(jié)構(gòu)如通式V所示，所述酶法唾液酸化中用到的酶指α 2，6唾液酸轉(zhuǎn)移酶；其中=R1為氫原子、α -或β -構(gòu)型絲氨酸殘基、α -或β -構(gòu)型蘇氣酸殘基、置氣取代烷基、炔基取代烷基、疏基取代烷基或α-或β_構(gòu)型取代烷基；R2 為氟原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、羥基或疊氮；R3為氟原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、羥基或疊氮；(6)堿性水溶液中水解上述雙唾液酸化四糖的內(nèi)酯，得到雙唾液酸化四糖，結(jié)構(gòu)如通式 VI所示，其中=R1為氫原子、α-或構(gòu)型絲氨酸殘基、α-或構(gòu)型蘇氨酸殘基、疊氮取代烷基、炔基取代烷基、巰基取代烷基或α-或β-構(gòu)型取代烷基；R2為氟原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、羥基或疊氮；R3為氟原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、羥基或疊氮。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙唾液酸化四糖的合成方法，其特征在于:所述步驟(1)中的β -構(gòu)型的N-乙酰半乳糖胺采用以下方法合成:將半乳糖氨鹽酸鹽與醋酐進(jìn)行反應(yīng)后， 將其全部羥基用乙酰基保護(hù)；然后在微波條件下進(jìn)行β_構(gòu)型糖苷化反應(yīng)，然后依次疊氮化和脫保護(hù)后即得。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙唾液酸化四糖的合成方法，其特征在于:所述步驟(2)中的二糖Gal β (1-S)GalNAcOR1合成方法是:將化合物1、半乳糖(1.5-3.0當(dāng)量)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP) (1.5-5.0當(dāng)量)、MgCl2 (5-100mmol)、Tris-HCl緩沖液 (10-500mmol, pH5.0-10.0)配制水溶液，然后將反應(yīng)體系的pH值調(diào)節(jié)至4.5-8.5，然后添加半乳糖激酶和己糖磷酸化酶，待反應(yīng)完成后，純化即可直接獲得二糖化合物II。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙唾液酸化四糖的合成方法，其特征在于:所述步驟(3)中的α 2，3唾液酸化二糖的合成方法:將化合物I1、唾液酸(1.5-5.0當(dāng)量)、胞苷三磷酸 (0.5-10.0 當(dāng)量)、MgCl2 (5.0-1OOmmol)和 Tris-HCl 緩沖液(10-500mmol, ρΗ5.0-10.5)配制水溶液，加入CMP-唾液酸合成酶和α 2，3唾液酸轉(zhuǎn)移酶，實(shí)現(xiàn)“一鍋雙酶法”唾液酸化，反應(yīng)完成后，純化即可直接獲得化合物III。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙唾液酸化四糖的合成方法，其特征在于:所述步驟(4)中 α 2，3唾液酸化內(nèi)酯三糖合成方法是:在冰浴的條件下，加入化合物II1、吡啶、醋酐，反應(yīng) 5-24小時(shí)后旋蒸蒸干，拌入硅膠，柱分離純化，得到全乙?；幕衔颕V ;之后將全乙酰化的中間體溶于甲醇，加入甲醇鈉粉末，使反應(yīng)體系的pH值保持在7-9，反應(yīng)5-10小時(shí),然后柱分離純化即得化合物IV。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙唾液酸化四糖的合成方法，其特征在于:所述步驟(5)中雙唾液酸化四糖的合成方法是:將化合物IV、CMP-唾液酸(1.5-5.0當(dāng)量)、 MgCl2(5.0-1OOmmol)和 Tris-HCl 緩沖液(10-500mmol, ρΗ5.0-10.5)配制水溶液，加入 α 2，6唾液酸轉(zhuǎn)移酶，實(shí)現(xiàn)酶法唾液酸化，反應(yīng)完成后，純化即可直接獲得化合物V。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙唾液酸化四糖的合成方法，其特征在于:所述步驟(6)中將化合物V溶于氫氧化鈉水溶液(0.1-1mol)中，反應(yīng)2-12小時(shí)，純化即可直接獲得化合物 VI。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙唾液酸化四糖的合成方法，其特征在于:所述步驟(2)和步驟(3)中“一鍋雙酶法”合成中反應(yīng)溫度為0-37°C，轉(zhuǎn)速為0-240rpm ;所述酶反應(yīng)的停止方法是向反應(yīng)體系中中加入與反應(yīng)液等體積的4°C無水乙醇并在4°C下孵育0-30分鐘。
9.一種用于制備雙唾液酸化四糖的中間體，其特征在于:結(jié)構(gòu)如通式IV所示，其中，R1 為氫原子、α-或構(gòu)型絲氨酸殘基、α-或構(gòu)型蘇氨酸殘基、疊氮取代烷基、炔基取代烷基、巰基取代烷基或α-或構(gòu)型取代烷基；R2為氟原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、羥基或疊氮。
10.一種用于制備雙唾液酸化四糖的中間體，其特征在于:結(jié)構(gòu)如通式V所示，其中，R1 為氫原子、α-或構(gòu)型絲氨酸殘基、α-或構(gòu)型蘇氨酸殘基、疊氮取代烷基、炔基取代烷基、巰基取代烷基或α-或構(gòu)型取代烷基；R2為氟原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、羥基或疊氮；R3為氟原子、 氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基 、氮疊氮乙酰氨基、羥基或疊氮。
【文檔編號】C07H15/04GK103555796SQ201310508766
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月24日
【發(fā)明者】曹鴻志, 王鳳山, 孟欣 申請人:山東大學(xué)