一種慢性胃炎診斷的唾液蛋白診斷模型及其構(gòu)建方法【專利摘要】本發(fā)明公開了一種慢性胃炎診斷的唾液蛋白診斷模型及其構(gòu)建方法，該慢性胃炎診斷的唾液蛋白診斷模型的構(gòu)建方法包括以下步驟：唾液標(biāo)本的收集和處理；采用WCX磁珠處理唾液樣品；點(diǎn)樣及質(zhì)譜分析；據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；該慢性胃炎診斷的唾液蛋白診斷模型由人唾液蛋白中質(zhì)荷比(m/z)分別為5502.36Da、1441.75Da和3442.47Da的3個(gè)唾液蛋白峰組成。本發(fā)明通過由人唾液蛋白中質(zhì)荷比(m/z)由5502.36Da、1441.75Da和3442.47Da的3個(gè)蛋白峰建立的分類預(yù)測模型，將檢測人唾液中相應(yīng)的蛋白質(zhì)的m/z與模型進(jìn)行分析，可以初步用于慢性胃炎的診斷，識別率為91.67％，預(yù)測能力73.33％。本發(fā)明的模型準(zhǔn)確率為90.63％(29/32)，靈敏度為100％(14/14)，特異度為83.33％(15/18)。本發(fā)明的構(gòu)建方法簡單，合理可行，操作簡便，可批量處理的特點(diǎn)?！緦＠f明】一種慢性胃炎診斷的唾液蛋白診斷模型及其構(gòu)建方法【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明屬于唾液蛋白診斷【
技術(shù)領(lǐng)域：
】，尤其涉及一種慢性胃炎診斷的唾液蛋白診斷模型及其構(gòu)建方法?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]唾液是人體不可缺少的一種重要體液，血液成分如多種激素、氨基酸、電解質(zhì)、免疫球蛋白、肌酐等均可通過毛細(xì)血管壁的唾液血液屏障進(jìn)入唾液。作為人體體液的一部分，其成分含量的變化，受體內(nèi)各種病理生理變化的影響。研究發(fā)現(xiàn)唾液成分與血清相關(guān)，特別是研究證實(shí)作為唾液主要成分的蛋白質(zhì)與血清成正相關(guān)。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們對于臨床診斷指標(biāo)的要求不斷提高，不僅要求正確、敏感，而且要求無創(chuàng)、簡便，唾液不僅取材方便，無創(chuàng)傷性，可隨時(shí)進(jìn)行動態(tài)觀察，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定，方法靈敏度高，重復(fù)性好。隨著生化微量分析技術(shù)的進(jìn)步，使人們開始考慮用唾液代替血液作為診斷指標(biāo)。唾液研究方面走在前列的美國現(xiàn)正致力于開展一項(xiàng)重點(diǎn)研究計(jì)劃--創(chuàng)立唾液診斷學(xué)(salivarydiagnostics)，即在研究正常人唾液中的全部蛋白質(zhì)組分的基礎(chǔ)上，創(chuàng)建以唾液為研究對象、快速實(shí)時(shí)(real-time)反映機(jī)體狀態(tài)的、可檢測各種系統(tǒng)性疾病和口腔疾病的蛋白質(zhì)研究體系，如蛋白質(zhì)芯片等。基于唾液的檢驗(yàn)診斷技術(shù)將會對臨床醫(yī)學(xué)及腫瘤學(xué)、分子生物學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)、病毒學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、流行病學(xué)、法醫(yī)學(xué)、生物芯片以及生物信息學(xué)等多個(gè)學(xué)科的基礎(chǔ)研究產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。[0003]隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究范圍的不斷拓展，唾液蛋白質(zhì)組學(xué)(Salivaryproteomics)作為一個(gè)年輕的新興的研究領(lǐng)域，加上蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的全面推廣[0004]和提聞，其自動化、聞通量、聞靈敏度和可重復(fù)的特點(diǎn)，正在逐漸引起人們的廣泛關(guān)注。唾液蛋白質(zhì)組的分析精度提高，技術(shù)難度降低，從而使得口腔內(nèi)唾液蛋白的研究轉(zhuǎn)移到提高蛋白組的全表達(dá)譜研究和疾病生物標(biāo)記確立，生物靶向治療應(yīng)用研究中去，使其能夠更好的為臨床診斷服務(wù)，為人類疾病治療做貢獻(xiàn)。唾液蛋白質(zhì)組學(xué)旨在以“組學(xué)”的研究思路尋找、發(fā)現(xiàn)和鑒定唾液中與疾病過程和治療過程相關(guān)的生物標(biāo)志物(蛋白質(zhì)、多肽)，致力進(jìn)行唾液蛋白質(zhì)組比較檢測，全譜檢測的一門科學(xué).它的發(fā)展直接影響了唾液分析在臨床診斷中的地位和水平。國外唾液蛋白質(zhì)組學(xué)研究已經(jīng)引起廣泛關(guān)注。長期以來，由于原有的技術(shù)限制了口腔唾液蛋白的通量分析和精確測定，使大多數(shù)唾液蛋白的生物功能處于未知狀態(tài)，唾液在人體疾病中的診斷和預(yù)后判斷中的潛在作用并未顯現(xiàn)。隨著高通量、高精度的蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用，使得唾液蛋白中生物標(biāo)記用于疾病的早期診斷預(yù)防、生物蛋白靶向治療、預(yù)后監(jiān)測判斷等均已成為可能。近幾十年來利用唾液作為檢測人體疾病的手段，用來診斷感染性疾病、免疫性疾病、內(nèi)分泌疾病及腫瘤等眾多疾病方面均已取得不少成果。目前國內(nèi)對開展唾液蛋白組學(xué)的研究僅限于口腔疾病及糖尿病。[0005]基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALD1-T0F-MS)是近年來發(fā)展起來的一種軟電離新型有機(jī)質(zhì)譜，通過引入基質(zhì)分子，使待測分子不產(chǎn)生碎片，解決了非揮發(fā)性和熱不穩(wěn)定性生物大分子解吸離子化的問題，是分析難揮發(fā)的有機(jī)物質(zhì)的重要手段之一，并于2002年獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。從此，MALD1-TOFMS在世界范圍內(nèi)得到了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，并廣泛應(yīng)用于生物技術(shù)和制藥企業(yè)的藥物開發(fā)、科研領(lǐng)域的生物分析和化學(xué)檢測以及安全部門的核輻射、化學(xué)物質(zhì)和生物病原體的監(jiān)測等。[0006]慢性胃炎系指各種病因引起的慢性胃黏膜炎性病變，是一種消化系統(tǒng)常見病，其發(fā)病率在各種胃病中居首位。目前慢性胃炎的確診主要依賴于胃鏡檢查和胃黏膜活檢，存在一定的局限性和損傷性，患者不容易接受。因此從唾液蛋白來探索慢性胃炎的診斷模型是無創(chuàng)傷、無痛苦、簡便易行、重復(fù)性好的一種診斷模式，故較內(nèi)窺鏡和X線鋇餐更易為病人接受。【
發(fā)明內(nèi)容】[0007]本發(fā)明實(shí)施例的目的在于提供一種慢性胃炎診斷的唾液蛋白診斷模型及其構(gòu)建方法，旨在解決現(xiàn)有的慢性胃炎檢測存在的缺少診斷模型和局限性的問題。[0008]本發(fā)明實(shí)施例是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種慢性胃炎診斷的唾液蛋白診斷模型的構(gòu)建方法，該慢性胃炎診斷的唾液蛋白診斷模型的構(gòu)建方法包括以下步驟:[0009]步驟一，唾液標(biāo)本的收集和處理，每個(gè)唾液樣本采集量為2ml?5ml，所有收集的樣品放入冰盒后，立即轉(zhuǎn)送實(shí)驗(yàn)室，4°C冰箱過夜后離心，分裝后于-80°C冰箱保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)由-80°C冰箱取出樣本，常溫解凍，避免反復(fù)凍融；[0010]步驟二，采用WCX磁珠處理唾液樣品，加入穩(wěn)定緩沖液的洗脫液可以用來直接質(zhì)譜分析或凍存-20°C，24小時(shí)之內(nèi)質(zhì)譜分析；[0011]步驟三，點(diǎn)樣及質(zhì)譜分析，將磁珠處理好的多肽樣品溶液各取分別點(diǎn)靶，室溫下干燥后，再各點(diǎn)基質(zhì)溶液，然后將制備好的點(diǎn)樣板置于MALD1-TOF質(zhì)譜儀上進(jìn)行分析，應(yīng)用線性模式；[0012]步驟四，據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用FlexAnalysis3.0軟件進(jìn)行標(biāo)峰和校正峰，用軟件ClinProTools2.1中的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)方法尋找差異蛋白，分析有差異趨勢的多肽，并利用軟件中的遺傳算法結(jié)合KNN建立分類預(yù)測模型；[0013]建立分類預(yù)測模型的具體方法為:[0014]首先使用遺傳算法，設(shè)變異率為0.2，交叉率為0.5，初始染色體個(gè)數(shù)為1000，適應(yīng)度函數(shù)用KNN判定結(jié)果的準(zhǔn)確率，最終經(jīng)過10000次進(jìn)化，遍歷k，最終在差異蛋白中，選用了其中的幾個(gè)蛋白峰，建立模型，計(jì)算模型的特異性、敏感性及平均準(zhǔn)確率用隨機(jī)抽樣方法，隨機(jī)選擇80%樣本建立模型，其余的20%作為驗(yàn)證樣本，運(yùn)行十次，驗(yàn)證模型的有效性，平均特異性、靈敏性及平均正確率，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。[0015]進(jìn)一步，在步驟三中，采集相對分子量范圍IOOODa?lOOOODa，激光能量為20%，累計(jì)400shots，質(zhì)譜信號單次掃描累加50次，獲得肽質(zhì)量指紋圖。[0016]進(jìn)一步，該慢性胃炎診斷的唾液蛋白診斷模型的構(gòu)建方法的步驟為:[0017]第一步，唾液收集時(shí)間為6:00AM?8:00AM，收集前一晚睡前不再進(jìn)食及服用任何藥物，收集前2h開始禁食水，并用清水漱口后靜坐于椅子上，前5min內(nèi)的唾液自然吞下后開始收集，口腔唾液積聚，吐入置于經(jīng)過冰浴預(yù)冷的50ml離心管內(nèi)，每個(gè)唾液樣本采集量為2ml?5ml,米集時(shí)間為20min?30min,每個(gè)樣本米集完立即放入冰盒內(nèi)；[0018]第二步，標(biāo)本處理:所有收集的樣品放入冰盒后，立即轉(zhuǎn)送實(shí)驗(yàn)室，4°C冰箱過夜后3000r/min離心IOmin,再以lOOOOr/min,5min,4°C離心，取50ul唾液分裝在0.5mlEP管中，于-80°C冰箱保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)由-80°C冰箱取出樣本，常溫解凍，所有檢測唾液均避免反復(fù)凍融；[0019]第三步，磁珠選擇:選擇WCX磁珠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；[0020]第四步，磁珠處理步驟:[0021]步驟一，4°C冰箱取出磁珠試劑盒，取出WCX磁珠懸浮液一管，手動上下?lián)u動，完全混勻磁珠懸浮液，I分鐘；[0022]步驟二，取出IOul磁珠結(jié)合緩沖液加入200ul樣品管中，再加入IOul磁珠至樣品管，用加樣槍上下吸打混勻，避免起泡；[0023]步驟三，向樣品管加5ul已處理唾液，用加樣槍上下吸打混勻至少5次，避免起泡；[0024]步驟四，將樣品管室溫下靜置5分鐘；[0025]步驟五，將樣品管放入磁珠分離器，使磁珠貼壁I分鐘，磁珠與懸浮的液體分離，液體應(yīng)清澈；[0026]步驟六，用加樣槍吸去懸浮的液體，槍頭應(yīng)避免接觸到磁珠，避免吸走磁珠；[0027]步驟七，再向樣品管中加入IOOul磁珠清洗緩沖液；[0028]步驟八，在磁珠分離器前后相鄰兩孔間反復(fù)移動樣品管10次；[0029]步驟九，使樣品管在磁珠分離器上靜置，磁珠貼壁，磁珠與懸浮的液體分離，液體應(yīng)清澈；[0030]步驟十，用加樣槍吸去懸浮的液體，槍頭應(yīng)避免接觸到磁珠，避免吸走磁珠；[0031]步驟十一，重復(fù)步驟七-步驟十步驟兩次，最后一次加樣槍吸去懸浮的液體時(shí)，要保證懸浮液完全被吸走；[0032]步驟十二，從磁珠分離器上取下樣品管，并向樣品管中加入5ul磁珠洗脫緩沖液，混勻貼壁的磁珠，反復(fù)吸打10次，吹打過程中應(yīng)避免起泡；[0033]步驟十三，樣品管放入磁珠分離器，磁珠貼壁2min，磁珠與懸浮的液體充分分離后，將上清液移入干凈的0.5ml樣品管；[0034]步驟十四，向0.5ml樣品管中加入5ul穩(wěn)定緩沖液，用加樣槍吸打混勻；[0035]步驟十五，加入穩(wěn)定緩沖液的洗脫液可以用來直接質(zhì)譜分析或凍存_20°C，24小時(shí)之內(nèi)質(zhì)譜分析；[0036]第五步，點(diǎn)樣及質(zhì)譜分析[0037]將磁珠處理好的多肽樣品溶液各取Iul分別點(diǎn)靶，室溫下干燥后，再各點(diǎn)Iul濃度為0.3g/L，[乙醇(色譜級)/丙酮(色譜級)=2/1，新鮮配置]的α—氰基一4一羥基肉桂酸基質(zhì)溶液(溶于50%乙腈，2%三氟乙酸)，然后將制備好的點(diǎn)樣板置于MALD1-T0F質(zhì)譜儀上進(jìn)行分析，應(yīng)用線性模式，采集相對分子量范圍IOOODa?lOOOODa，激光能量為20%，累計(jì)400shots，質(zhì)譜信號單次掃描累加50次，獲得肽質(zhì)量指紋圖；[0038]第六步，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析[0039]使用儀器上配置的由Bruker公司開發(fā)的數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)，系統(tǒng)包括FlexAnalysis3.0和ClinProTools2.1兩個(gè)軟件，用FlexAnalysis3.0軟件進(jìn)行標(biāo)峰和校正峰，用軟件ClinPr0T00ls2.1中的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)方法尋找差異蛋白，分析有差異趨勢的多肽，并利用軟件中的遺傳算法結(jié)合KNN建立分類預(yù)測模型，首先使用遺傳算法，設(shè)變異率為0.2，交叉率為0.5，初始染色體個(gè)數(shù)為1000，適應(yīng)度函數(shù)用KNN判定結(jié)果的準(zhǔn)確率，最終經(jīng)過10000次進(jìn)化，遍歷k，最終在差異蛋白中，選用了其中的幾個(gè)蛋白峰，建立模型，計(jì)算模型的特異性、敏感性及平均準(zhǔn)確率，用隨機(jī)抽樣方法，隨機(jī)選擇80%樣本建立模型，其余的20%作為驗(yàn)證樣本，運(yùn)行十次，驗(yàn)證模型的有效性，平均特異性、靈敏性及平均正確率，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。[0040]本發(fā)明實(shí)施例的另一目的在于提供一種慢性胃炎診斷的唾液蛋白診斷模型，該慢性胃炎診斷的唾液蛋白診斷模型由人唾液蛋白中質(zhì)荷比(m/z)分別為5502.36Da、1441.75Da和3442.47Da的3個(gè)唾液蛋白峰組成。[0041]本發(fā)明提供的慢性胃炎診斷的唾液蛋白診斷模型及其構(gòu)建方法，通過由人唾液蛋白中質(zhì)荷比(m/z)由5502.36Da、1441.75Da和3442.47Da的3個(gè)蛋白峰建立的分類預(yù)測模型，將檢測人唾液中相應(yīng)的蛋白質(zhì)的m/z與模型進(jìn)行分析，可以初步用于慢性胃炎的診斷，識別率為91.67%，預(yù)測能力73.33%。本發(fā)明的模型準(zhǔn)確率為90.63%(29/32)，靈敏度為100%(14/14)，特異度為83.33%(15/18)。本發(fā)明的構(gòu)建方法簡單，合理可行，操作簡便，可批量處理的特點(diǎn)?！緦＠綀D】【附圖說明】[0042]圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的慢性胃炎診斷的唾液蛋白診斷模型的構(gòu)建方法流程圖?！揪唧w實(shí)施方式】[0043]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。[0044]下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步描述。[0045]一種慢性胃炎診斷的唾液蛋白診斷模型主要由人唾液蛋白中質(zhì)荷比(m/z)分別為5502.36Da、1441.75Da和3442.47Da的3個(gè)唾液蛋白峰組成。[0046]如圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例的慢性胃炎診斷的唾液蛋白診斷模型的構(gòu)建方法包括以下步驟:[0047]SlOl:唾液標(biāo)本的收集和處理:每個(gè)唾液樣本采集量為2ml?5ml，所有收集的樣品放入冰盒后，立即轉(zhuǎn)送實(shí)驗(yàn)室，4°C冰箱過夜后離心，分裝后于-80°C冰箱保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)由-80°C冰箱取出樣本，常溫解凍，避免反復(fù)凍融；[0048]S102:采用WCX磁珠處理唾液樣品，加入穩(wěn)定緩沖液的洗脫液可以用來直接質(zhì)譜分析或凍存_20°C，24小時(shí)之內(nèi)質(zhì)譜分析；[0049]S103:點(diǎn)樣及質(zhì)譜分析:將磁珠處理好的多肽樣品溶液各取分別點(diǎn)靶，室溫下干燥后，再各點(diǎn)基質(zhì)溶液，然后將制備好的點(diǎn)樣板置于MALD1-TOF質(zhì)譜儀上進(jìn)行分析，應(yīng)用線性模式；[0050]S104:據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:用FlexAnalysis3.0軟件進(jìn)行標(biāo)峰和校正峰，用軟件ClinProTools2.1中的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)方法尋找差異蛋白，分析有差異趨勢的多肽，并利用軟件中的遺傳算法結(jié)合KNN建立分類預(yù)測模型；[0051]在步驟S103中，采集相對分子量范圍IOOODa?lOOOODa。激光能量為20%，累計(jì)400shots。質(zhì)譜信號單次掃描累加50次，獲得肽質(zhì)量指紋圖(PMF)；[0052]在步驟S104中，建立分類預(yù)測模型的具體方法為:[0053]首先使用遺傳算法，設(shè)變異率為0.2，交叉率為0.5，初始染色體個(gè)數(shù)為1000，適應(yīng)度函數(shù)用KNN判定結(jié)果的準(zhǔn)確率，最終經(jīng)過10000次進(jìn)化，遍歷k，最終在差異蛋白中，選用了其中的幾個(gè)蛋白峰，建立模型，計(jì)算模型的特異性、敏感性及平均準(zhǔn)確率用隨機(jī)抽樣方法，隨機(jī)選擇80%樣本建立模型，其余的20%作為驗(yàn)證樣本，運(yùn)行十次，驗(yàn)證模型的有效性，平均特異性、靈敏性及平均正確率，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。[0054]以下結(jié)合本發(fā)明的具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明:[0055]第一步，唾液收集時(shí)間為6:00AM?8:00ΑΜ，收集前一晚睡前不再進(jìn)食及服用任何藥物，收集前2h開始禁食水，并用清水漱口后靜坐于椅子上，前5min內(nèi)的唾液自然吞下后開始收集，口腔唾液積聚至一定量后，吐入置于經(jīng)過冰浴預(yù)冷的50ml離心管內(nèi)，每個(gè)唾液樣本采集量大約2ml?5ml，采集時(shí)間為20min?30min，每個(gè)樣本采集完立即放入冰盒內(nèi)；[0056]第二步，標(biāo)本處理:所有收集的樣品放入冰盒后，立即轉(zhuǎn)送實(shí)驗(yàn)室，4°C冰箱過夜后3000r/min離心IOmin,再以10000r/min,5min,4°C離心，取50ul唾液分裝在0.5mlEP管中，于-80°C冰箱保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)由-80°C冰箱取出樣本，常溫解凍，所有檢測唾液均避免反復(fù)凍融；[0057]第三步，磁珠選擇:為選擇最適合的磁珠類型，使用三種不同磁珠(離子交換型WCX(弱陽離子)磁珠、疏水型HIC-8磁珠、銅螯合型IMAC-Cu磁珠)對樣品進(jìn)行檢測分析，經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)唾液樣品用WCX磁珠磁珠富集后的峰較多P值較小，說明WCX找到的峰差異較顯著，所以最終選擇WCX磁珠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；[0058]第四步，磁珠處理步驟:[0059]步驟一，4°C冰箱取出磁珠試劑盒，取出WCX磁珠懸浮液一管，手動上下?lián)u動，完全混勻磁珠懸浮液，I分鐘；[0060]步驟二,取出IOul磁珠結(jié)合緩沖液(bindingsolution,BS)加入200ul樣品管中，再加入IOul磁珠至樣品管，用加樣槍上下吸打混勻，避免起泡；[0061]步驟三，向樣品管加5ul已處理唾液，用加樣槍上下吸打混勻至少5次，避免起泡；[0062]步驟四，將樣品管室溫下靜置5分鐘；[0063]步驟五，將樣品管放入磁珠分離器，使磁珠貼壁I分鐘，磁珠與懸浮的液體分離，液體應(yīng)清澈；[0064]步驟六，用加樣槍吸去懸浮的液體，槍頭應(yīng)避免接觸到磁珠，避免吸走磁珠；[0065]步驟七，再向樣品管中加入IOOul磁珠清洗緩沖液(washingsolution,WS)；[0066]步驟八，在磁珠分離器前后相鄰兩孔間反復(fù)移動樣品管10次(注意磁珠在管中的運(yùn)動)；[0067]步驟九，使樣品管在磁珠分離器上靜置，磁珠貼壁，磁珠與懸浮的液體分離，液體應(yīng)清澈；[0068]步驟十，用加樣槍吸去懸浮的液體，槍頭應(yīng)避免接觸到磁珠，避免吸走磁珠；[0069]步驟十一，重復(fù)步驟七-步驟十步驟兩次，最后一次加樣槍吸去懸浮的液體時(shí)，要保證懸浮液完全被吸走；[0070]步驟十二，從磁珠分離器上取下樣品管，并向樣品管中加入5ul磁珠洗脫緩沖液(elutingsolution,ES),混勻貼壁的磁珠,反復(fù)吸打10次,吹打過程中應(yīng)避免起泡；[0071]步驟十三，樣品管放入磁珠分離器，磁珠貼壁2min，磁珠與懸浮的液體充分分離后，將上清液移入干凈的0.5ml樣品管；[0072]步驟十四，向0.5ml樣品管中加入5ul穩(wěn)定緩沖液(Stablesolution,SS),用加樣槍小心吸打混勻；[0073]步驟十五，加入穩(wěn)定緩沖液的洗脫液可以用來直接質(zhì)譜分析或凍存-20°C，24小時(shí)之內(nèi)質(zhì)譜分析；[0074]第五步，點(diǎn)樣及質(zhì)譜分析[0075]將磁珠處理好的多肽樣品溶液各取Iul分別點(diǎn)靶，室溫下干燥后，再各點(diǎn)Iul濃度為0.3g/L，[乙醇(色譜級)/丙酮(色譜級)=2/1，新鮮配置]的α—氰基一4一羥基肉桂酸基質(zhì)溶液(溶于50%乙腈，2%三氟乙酸)，然后將制備好的點(diǎn)樣板置于MALD1-TOF質(zhì)譜儀上進(jìn)行分析，應(yīng)用線性模式，采集相對分子量范圍1000Da~lOOOODa，激光能量為20%,累計(jì)400shots，質(zhì)譜信號單次掃描累加50次，獲得肽質(zhì)量指紋圖(PMF)；[0076]第六步，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析[0077]使用儀器上配置的由Bruker公司開發(fā)的數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)，系統(tǒng)包括FlexAnalysis3.0和ClinProTools2.1兩個(gè)軟件，用FlexAnalysis3.0軟件進(jìn)行標(biāo)峰和校正峰，用軟件ClinProTools〗.1中的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)方法(參數(shù)T-Test和非參數(shù)方法WilcoxonTest)尋找差異蛋白，分析有差異趨勢的多肽，并利用軟件中的遺傳算法結(jié)合KNN(k-nearestneighboure,k=I,3,5，7)建立分類預(yù)測模型,首先使用遺傳算法,設(shè)變異率為0.2，交叉率為0.5，初始染色體個(gè)數(shù)為1000，適應(yīng)度函數(shù)用KNN判定結(jié)果的準(zhǔn)確率，最終經(jīng)過10000次進(jìn)化，遍歷k，最終在差異蛋白中，選用了其中的幾個(gè)蛋白峰，建立模型，計(jì)算模型的特異性、敏感性及平均準(zhǔn)確率，用隨機(jī)抽樣方法(隨機(jī)選擇80%樣本建立模型，其余的20%作為驗(yàn)證樣本，運(yùn)行十次)，驗(yàn)證模型的有效性(平均特異性、靈敏性及平均正確率)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。[0078]結(jié)合以下結(jié)果和份系對本發(fā)明的使用效果做補(bǔ)充說明:[0079]結(jié)果:通過正常對照組與慢性胃炎組比較，除算法選擇問題被排除的樣本共32例，對樣本檢測質(zhì)譜圖進(jìn)行分析比較，兩個(gè)組共得到蛋白質(zhì)峰為74個(gè)，其中通過遺傳算法找到5個(gè)有統(tǒng)計(jì)差異顯著的蛋白峰(P<0.05)，通過WCX磁珠富集之后，ClinProTools得出了最適宜的區(qū)分模式模型，選擇質(zhì)荷比(m/z):5502.36Da、1441.75Da和3442.47Da這3個(gè)相關(guān)峰，通過分析這些差異蛋白峰表達(dá)譜，建立了分類預(yù)測模型，識別率為91.67%，預(yù)測能力73.33%，臨床回代檢驗(yàn)結(jié)果，對研究中14例慢性胃炎患者全部被準(zhǔn)確檢出，18例正常組對照者，15例被正確檢出，該模型的準(zhǔn)確率為90.63%(29/32)，靈敏度為100%(14/14)，特異度為83.33%(15/18)，(表1，2)。[0080]表1慢性胃炎唾液蛋白質(zhì)組診斷模型的臨床符合率【權(quán)利要求】1.一種慢性胃炎診斷的唾液蛋白診斷模型的構(gòu)建方法，其特征在于，該慢性胃炎診斷的唾液蛋白診斷模型的構(gòu)建方法包括以下步驟:步驟一，選擇慢性胃炎和健康對照組，唾液標(biāo)本的收集和處理，每個(gè)唾液樣本采集量為2ml~5ml,所有收集的樣品放入冰盒后,立即轉(zhuǎn)送實(shí)驗(yàn)室,4C冰箱過夜后尚心，分裝后于_80°C冰箱保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)由_80°C冰箱取出樣本，常溫解凍，避免反復(fù)凍融；步驟二，采用WCX磁珠處理唾液樣品，加入穩(wěn)定緩沖液的洗脫液可以用來直接質(zhì)譜分析或凍存_20°C，24小時(shí)之內(nèi)質(zhì)譜分析；步驟三，點(diǎn)樣及質(zhì)譜分析，將磁珠處理好的多肽樣品溶液各取分別點(diǎn)靶，室溫下干燥后，再各點(diǎn)基質(zhì)溶液，然后將制備好的點(diǎn)樣板置于MALD1-TOF質(zhì)譜儀上進(jìn)行分析，應(yīng)用線性模式；步驟四，據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用FlexAnalysis3.0軟件進(jìn)行標(biāo)峰和校正峰，用軟件ClinProTools2.1中的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)方法尋找差異蛋白，分析有差異趨勢的多肽，并利用軟件中的遺傳算法結(jié)合KNN建立分類預(yù)測模型；建立分類預(yù)測模型的具體方法為:首先使用遺傳算法，設(shè)變異率為0.2，交叉率為0.5，初始染色體個(gè)數(shù)為1000，適應(yīng)度函數(shù)用KNN判定結(jié)果的準(zhǔn)確率，最終經(jīng)過10000次進(jìn)化，遍歷k，最終在差異蛋白中，選用了幾個(gè)蛋白峰，建立模型，計(jì)算模型的特異性、敏感性及平均準(zhǔn)確率用隨機(jī)抽樣方法，隨機(jī)選擇80%樣本建立模型，其余的20%作為驗(yàn)證樣本，運(yùn)行十次，驗(yàn)證模型的有效性，平均特異性、靈敏性及平均正確率，P小于0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.如權(quán)利要求1所述的慢性胃炎診斷的唾液蛋白診斷模型的構(gòu)建方法，其特征在于，在步驟三中，采集相對分子量范圍1000Da~lOOOODa，激光能量為20%，累計(jì)400shots，質(zhì)譜信號單次掃描累加50次，獲得肽質(zhì)量指紋圖。3.如權(quán)利要求1所述的慢性胃炎診斷的唾液蛋白診斷模型的構(gòu)建方法，其特征在于，該慢性胃炎診斷的唾液蛋白診斷模型的構(gòu)建方法的步驟為:第一步，唾液收集時(shí)間為6:00AM~8:00AM，收集前一晚睡前不再進(jìn)食及服用任何藥物，收集前2h開始禁食水，并用清水漱口后靜坐于椅子上，前5min內(nèi)的唾液自然吞下后開始收集，口腔唾液積聚，吐入置于經(jīng)過冰浴預(yù)冷的50ml離心管內(nèi)，每個(gè)唾液樣本采集量為2ml~5ml,米集時(shí)間為20min~30min,每個(gè)樣本米集完立即放入冰盒內(nèi)；第二步，標(biāo)本處理:所有收集的樣品放入冰盒后，立即轉(zhuǎn)送實(shí)驗(yàn)室，4°C冰箱過夜后3000r/min離心IOmin,再以10000r/min,5min,4°C離心，取50ul唾液分裝在0.5mlEP管中，于-80°C冰箱保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)由-80°C冰箱取出樣本，常溫解凍，所有檢測唾液均避免反復(fù)凍融；第三步，磁珠選擇:選擇WCX磁珠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；第四步，磁珠處理步驟:步驟一，4°C冰箱取出磁珠試劑盒，取出WCX磁珠懸浮液一管，手動上下?lián)u動，完全混勻磁珠懸浮液，I分鐘；步驟二,取出IOul磁珠結(jié)合緩沖液加入200ul樣品管中，再加入IOul磁珠至樣品管，用加樣槍上下吸打混勻，避免起泡；步驟三，向樣品管加5ul已處理唾液，用加樣槍上下吸打混勻至少5次，避免起泡；步驟四，將樣品管室溫下靜置5分鐘；步驟五，將樣品管放入磁珠分離器，使磁珠貼壁I分鐘，磁珠與懸浮的液體分離，液體應(yīng)清澈；步驟六，用加樣槍吸去懸浮的液體，槍頭應(yīng)避免接觸到磁珠，避免吸走磁珠；步驟七，再向樣品管中加入IOOul磁珠清洗緩沖液；步驟八，在磁珠分離器前后相鄰兩孔間反復(fù)移動樣品管10次；步驟九，使樣品管在磁珠分離器上靜置，磁珠貼壁，磁珠與懸浮的液體分離，液體應(yīng)清澈；步驟十，用加樣槍吸去懸浮的液體，槍頭應(yīng)避免接觸到磁珠，避免吸走磁珠；步驟十一，重復(fù)步驟七-步驟十步驟兩次，最后一次加樣槍吸去懸浮的液體時(shí)，要保證懸浮液完全被吸走；步驟十二，從磁珠分離器上取下樣品管，并向樣品管中加入5ul磁珠洗脫緩沖液，混勻貼壁的磁珠，反復(fù)吸打10次，吹打過程中應(yīng)避免起泡；步驟十三，樣品管放入磁珠分離器，磁珠貼壁2min，磁珠與懸浮的液體充分分離后，將上清液移入干凈的0.5ml樣品管；步驟十四，向0.5ml樣品管中加入5ul穩(wěn)定緩沖液,用加樣槍吸打混勻；步驟十五，加入穩(wěn)定緩沖液的洗脫液可以用來直接質(zhì)譜分析或凍存_20°C，24小時(shí)之內(nèi)質(zhì)譜分析；第五步，點(diǎn)樣及質(zhì)譜分析將磁珠處理好的多肽樣品溶液各取Iul分別點(diǎn)靶，室溫下干燥后，再各點(diǎn)Iul濃度為.0.3g/L，[乙醇(色譜級)/丙酮(色譜級)=2/1，新鮮配置]的α—氰基一4一羥基肉桂酸基質(zhì)溶液(溶于50%乙腈，2%三氟乙酸)，然后將制備好的點(diǎn)樣板置于MALD1-TOF質(zhì)譜儀上進(jìn)行分析，應(yīng)用線性模式，采集相對分子量范圍1000Da~lOOOODa，激光能量為20%，累計(jì)400shots，質(zhì)譜信號單次掃描累加50次，獲得肽質(zhì)量指紋圖；第六步，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用儀器上配置的由Bruker公司開發(fā)的數(shù)據(jù)分析系統(tǒng),系統(tǒng)包括FlexAnalysis3.0和ClinProTools2.1兩個(gè)軟件，用FlexAnalysis3.0軟件進(jìn)行標(biāo)峰和校正峰，用軟件ClinProTools2.1中的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)方法尋找差異蛋白，分析有差異趨勢的多肽，并利用軟件中的遺傳算法結(jié)合KNN建立分類預(yù)測模型，首先使用遺傳算法，設(shè)變異率為0.2，交叉率為.0.5，初始染色體個(gè)數(shù)為1000，適應(yīng)度函數(shù)用KNN判定結(jié)果的準(zhǔn)確率，最終經(jīng)過10000次進(jìn)化，遍歷k，最終在差異蛋白中，選用了幾個(gè)蛋白峰，建立模型，計(jì)算模型的特異性、敏感性及平均準(zhǔn)確率，用隨機(jī)抽樣方法，隨機(jī)選擇80%樣本建立模型，其余的20%作為驗(yàn)證樣本，運(yùn)行十次，驗(yàn)證模型的有效性，平均特異性、靈敏性及平均正確率，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.一種慢性胃炎診斷的唾液蛋白診斷模型，其特征在于，該慢性胃炎診斷的唾液蛋白診斷模型由人唾液蛋白中質(zhì)荷比分別為5502.36Da、1441.75Da和3442.47Da的3個(gè)唾液蛋白峰組成?！疚臋n編號】G01N27/62GK104007166SQ201410234499【公開日】2014年8月27日申請日期:2014年5月29日優(yōu)先權(quán)日:2014年5月29日【發(fā)明者】吳正治,孫珂煥,曹美群申請人:深圳市第二人民醫(yī)院