專利名稱：生存素與熱休克蛋白的復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白復(fù)合物，特別涉及生存素與熱休克蛋白的復(fù)合物，還 涉及該復(fù)合物的制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是嚴(yán)重危害人類健康的常見疾病。目前，惡性腫瘤的三大常規(guī)治
療方法手術(shù)治療、放射治療和化學(xué)治療已取得較大發(fā)展，但是，手術(shù)治療為 局部治療手段，而惡性腫瘤呈浸潤性生長且易經(jīng)過血管和/或淋巴管發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn) 移，中晚期惡性腫瘤患者單純依靠手術(shù)治療很難達(dá)到完全清除腫瘤細(xì)胞的目的； 放射治療也是以局部治療為主，同樣存在手術(shù)治療的缺陷，且許多惡性腫瘤對 放射治療不敏感；化學(xué)治療為全身治療手段，但存在耐藥和毒副作用大等缺點(diǎn)。 近年來，免疫治療作為惡性腫瘤的第四種治療方法受到各國腫瘤學(xué)研究者的廣 泛關(guān)注，腫瘤疫苗的開發(fā)成為研究熱點(diǎn)之一。
生存素(Survivin)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的凋亡抑制因子，具有抑制細(xì)胞 凋亡和維持細(xì)胞有絲分裂的雙重功能。Survivin在正常的終末分化組織中幾乎不 表達(dá)，但在幾乎所有惡性腫瘤組織中高表達(dá)，被視為最具腫瘤特異性的腫瘤共 享抗原。Survivin表達(dá)水平與腫瘤惡性禾呈度成正相關(guān)，若腫瘤組織高表達(dá) Survivin，則腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)下降，對放化療的耐受性增強(qiáng)，預(yù)后差；反之， 若腫瘤組織低表達(dá)或不表達(dá)survivin,則對放化療敏感，預(yù)后良好。近年來研究 發(fā)現(xiàn)，腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞受到某些細(xì)胞因子如血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、堿性成 纖維細(xì)胞生長因子等的刺激后可以高表達(dá)Survivin,而靜止的血管內(nèi)皮細(xì)胞幾乎 不表達(dá)Survivin,因此，Survivin又被-見為一種新的腫瘤新生血管標(biāo)志物。以 Survivin為抗腫瘤靶標(biāo)具有以下獨(dú)特優(yōu)勢(1) Survivin表達(dá)于幾乎所有腫瘤細(xì)
3胞中，尤其在惡性度高、耐放化療的腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，若腫瘤細(xì)胞為逃逸免 疫監(jiān)視而下調(diào)Survivin表達(dá)，則會相應(yīng)增加其凋亡指數(shù)和放化療敏感性；(2) Survivin所誘導(dǎo)的特異性細(xì)胞免疫在殺傷肺瘤細(xì)胞的同時，還可^皮壞腫瘤新生血 管內(nèi)皮細(xì)胞，由此產(chǎn)生協(xié)同抗肺瘤效應(yīng)，即使在部分肺瘤細(xì)胞逃逸免疫監(jiān)視的 情況下，同樣能通過抑制血管生成而達(dá)到打擊腫瘤的目的；(3 ) Survivin的腫瘤 治療譜相對廣泛。但是，單獨(dú)以Survivin作為腫瘤疫苗時，需要與免疫佐劑聯(lián) 合應(yīng)用，而佐劑為外源性物質(zhì)且誘導(dǎo)的天然免疫應(yīng)答特異性低，可能引起一系 列的毒副反應(yīng)；此外，由于主要組織相容性復(fù)合體(MHC)的限制，其使用對 象也相當(dāng)有限。
熱休克蛋白(Heat Shock Protein, HSP )是一類在生物進(jìn)化中高度保守，廣 泛存在于原核和真核生物中的蛋白質(zhì)，具有"分子伴侶"作用，參與胞內(nèi)蛋白 質(zhì)的折疊、裝配和轉(zhuǎn)運(yùn)等過程。HSP按分子量大小分為以下幾個家族HSPllO、 HSP90、 HSP70、 HSP60和小HSP家族。每個家族又由多個成員組成，如HSP70 家族成員有HSP70、熱休克同源蛋白70( HSC70 )、糖調(diào)蛋白(GRP )78和GRP75 等，HSP卯家族成員有HSP90和糖蛋白96 (GP96)等。許多研究結(jié)果證實(shí)， 從肺瘤組織中提取的HSP可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對該腫瘤的免疫應(yīng)答，達(dá)到治療 腫瘤的目的。進(jìn)一步研究表明，從腫瘤組織中提取的HSP實(shí)際為結(jié)合了抗原多 肽的HSP多肽復(fù)合物，其可通過以下幾方面誘導(dǎo)機(jī)體的抗腫瘤免疫(l)HSP 多肽復(fù)合物作為完整抗原，被抗原遞呈細(xì)胞攝取、加工后，與MHC結(jié)合并遞呈 到細(xì)胞表面，從而活化T細(xì)胞，包括CD4+和CD8+T細(xì)胞，特別是細(xì)胞毒性T 細(xì)胞，產(chǎn)生抗腫瘤的特異性細(xì)胞免疫；HSP在此處起到載體或佐劑的作用，誘 導(dǎo)免疫應(yīng)答的是其結(jié)合的抗原多肽；(2) HSP本身具有活化巨噬細(xì)胞和樹突狀 細(xì)胞(抗原遞呈細(xì)胞)的作用，從而增加共刺激因子和MHC的表達(dá)，加強(qiáng)機(jī)體 的抗腫瘤免疫；(3)自然殺傷細(xì)胞和yST細(xì)胞是體內(nèi)重要的抗腫瘤免疫細(xì)胞， 對腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)不受MHC的限制，HSP可直接作為抗原遞呈分子，將抗 原多肽遞呈至細(xì)胞表面，從而活化自然殺傷細(xì)胞和yST細(xì)胞，產(chǎn)生抗腫瘤的非特異性免疫。以HSP多肽復(fù)合物為基礎(chǔ)的腫瘤疫苗具有以下獨(dú)特優(yōu)勢(1)由 于HSP結(jié)構(gòu)上的高度保守，不具有多態(tài)性，可在同種內(nèi)相互使用，不受MHC 的限制；(2) HSP具有免疫佐劑的作用，省略了常規(guī)蛋白免疫需要免疫佐劑的 麻煩。近年來研究發(fā)現(xiàn)，GRP170也是HSP70家族的成員，是一種對較大的抗 原多肽也具有伴侶作用的高分子量HSP,具有強(qiáng)大的免疫佐劑效應(yīng)，因此，其 在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用頗受矚目。目前，以HSP多肽復(fù)合物為基礎(chǔ)的腫瘤疫 苗多采用HSP70、 HSP90和GP96進(jìn)行構(gòu)建，尚未見采用GRP170構(gòu)建肺瘤疫苗 的研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種Survivin與HSP的復(fù)合物。 為達(dá)到此目的，本發(fā)明提供了一種Survivin與HSP的復(fù)合物，由Survivin
與GRP170以非共價鍵結(jié)合而成，所述Survivin具有SEQ ID No.2所示的氨基酸
序列，GRP170具有SEQ ID No.6所示的氨基酸序列。
進(jìn)一步，由Survivin與GRP170以摩爾比為1 : 1結(jié)合而成。
本發(fā)明的目的之二在于提供所述Survivin與HSP的復(fù)合物的制備方法。
為達(dá)到此目的，本發(fā)明提供了所述Survivin與HSP的復(fù)合物的制備方法，
在濃度為O.01mol/L、 pH為7.2~7.4的PBS中，分別加入Survivin和GRP170,
混合均勻，在43。C孵育30分鐘，再在37。C孵育1小時，即得Survivin和HSP
的復(fù)合物。
進(jìn)一步，按摩爾比為1 : 1分別加入Survivin和GRP170,使Survivin和
GRP170的終濃度為3 6[xg/mL。
本發(fā)明的目的之三在于提供所述Survivin與HSP的復(fù)合物的應(yīng)用。 為達(dá)到此目的，本發(fā)明提供了所述Survivin與HSP的復(fù)合物在制備腫瘤疫
苗中的應(yīng)用。
本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明提供的Survivin與HSP的復(fù)合物，能夠誘 導(dǎo)強(qiáng)有力的抗腫瘤免疫，不需要任何佐劑，在同種間應(yīng)用不受MHC的限制，腫瘤治療譜廣，制備方法簡單，可以用于制備腫瘤疫苗，在腫瘤免疫治療領(lǐng)域有 著良好的開發(fā)應(yīng)用前景。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)
明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，其中
圖l為蛋白免疫印跡(Western Blot)筌定Survivin;
圖2為Western Blot鑒定GRP170;
圖3為Western Blot鑒定Survivin-GRP170復(fù)合物；
圖4為酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISPOT)法檢測Survivin-GRP 170復(fù)合物激發(fā)細(xì)胞 毒性T淋巴細(xì)胞(CTL )分泌IFN-y的能力；
圖5為51Cr釋放法4企測Survivin-GRP 170復(fù)合物激發(fā)CTL對結(jié)腸癌細(xì)胞 CT26的特異性殺傷效應(yīng)。
具體實(shí)施例方式
以下將參照附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。優(yōu)選實(shí)施例中 未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第 三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件， 或按照制造廠商所建議的條件。
一 、Survivin-GRP 170復(fù)合物的制備
1、 Survivin的制備
(1 ) Survivin基因的克隆
將高表達(dá)Survivin的白血病細(xì)胞HL-60用RPMI 1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，調(diào) 節(jié)細(xì)胞密度為2 x 1(^個/mL,用濃度為100U/mL的重組人白介素-3溶液刺激24 小時，收集細(xì)胞，PBS洗滌3次，用總RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA,紫 外分光光度法測定RNA的純度和濃度；根據(jù)GenBank登錄號為NM—001168.2的Survivin基因序列，設(shè)計(jì)并合成如下PCR引物以擴(kuò)增Survivin cDNA片段 引物F1: 5，-tagg^atgggtgccccgacgttgccccctg-3， (SEQIDNo.3),下劃線部分為 BamHI酶切4立點(diǎn)；引物Rl: 5,-gcaagcttatccatggcaccagctgctg-3， ( SEQ IDNo.4 ), 下劃線部分為HindIII酶切位點(diǎn)；將提取的細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,再以所 得cDNA為模板進(jìn)行PCR, PCR條件為94'C預(yù)變性3分鐘，然后94'C變性1 分鐘、58。C退火1分鐘，72。C延伸1分鐘，共30個循環(huán)，最后72。C延伸7分鐘； PCR產(chǎn)物經(jīng)濃度為20g/L的瓊脂糖凝膠電泳鑒定、凝膠回收試劑盒切膠回收純 化后，與克隆載體pGEM-T Easy連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì) 胞，用含有氨節(jié)青霉素的LB平板篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，委托上海生工公司 測定基因序列，將序列正確的陽性克隆質(zhì)粒命名為pGEM-T Easy/Survivin。
瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物在約450bp處呈單一特異性條帶，與預(yù) 期結(jié)果相符；測序結(jié)果顯示插入基因序列與Survivin全長編碼基因序列一致。
(2) Survivin基因重組原核表達(dá)載體的構(gòu)建
將步驟(1)所得質(zhì)粒pGEM-T Easy/Survivin和原核表達(dá)載體pET32a(+)分 別用限制性內(nèi)切酶BamHI和HindIII進(jìn)行雙酶切，用凝月交回收試劑盒切膠回收純 化雙酶切后的Survivin cDNA片段和線性載體pET32a(+)，以摩爾比為3 : 1于 16。C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，用含有氨千青霉素 的LB平板篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，用Bamffl和HindIII進(jìn)行雙酶切鑒定，并 委托上海生工公司測定基因序列，序列和閱讀框架正確的陽性克隆質(zhì)粒即為構(gòu) 建成功的Survivin基因重組原核表達(dá)載體，命名為pET32/Survivin。
雙酶切鑒定結(jié)果顯示雙酶切產(chǎn)物在約450bp處出現(xiàn)電泳帶，與插入片^a大 小相符；測序結(jié)果顯示陽性克隆質(zhì)粒的插入基因序列(如SEQIDNo.l所示)無 突變，閱讀框架正確，無移碼。
(3 ) Survivin基因工程菌的構(gòu)建
將步驟(2)所得Survivin基因重組原核表達(dá)載體pET32/Survivin用限制性 內(nèi)切酶SalI酶切使線性化，用電穿孔法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于MD平板，3(TC培養(yǎng)3 4天，挑取白色酵母菌落，分別點(diǎn)接于MD 和MM平板，30。C培養(yǎng)3 6天(每天向MM平板中添加曱醇lOOpL )，挑取 MD平板上生長明顯快于MM平板的酵母菌落，點(diǎn)4妾于含有濃度為4mg/mL的 G418的YPD平板，30。C培養(yǎng)7天，所得酵母菌即為高拷貝Survivin基因工程菌。 (4 ) Survivin的誘導(dǎo)表達(dá)
將步驟(3 )所得高拷貝Survivin基因工程菌于3(TC培養(yǎng)至OD600為2，按 10%接種量接入BMGY培養(yǎng)基中，30。C培養(yǎng)24小時，5000g離心5分鐘，棄上 清，菌體用無菌水洗滌2次后，重懸于等體積的BMMY培養(yǎng)基中，3(TC誘導(dǎo)表 達(dá)3天(每24小時補(bǔ)加i秀導(dǎo)劑曱醇至最終體積百分濃度為0.5%) ， 4°C、 6000g 離心5分鐘，收集上清，加入質(zhì)量百分濃度為80%的硫@吏銨溶液使蛋白質(zhì)沉淀， 離心棄上清，蛋白質(zhì)沉淀用濃度為0.02mol/L、 pH為8.0的磷酸鹽緩沖液(PBS) 透析脫鹽，離心，收集上清，用瓊脂糖凝膠(Q-Sepharose )柱進(jìn)行分離純化， 用濃度為lmol/L的氯化鈉溶液線性梯度洗脫，收集洗脫液，適當(dāng)濃縮后用葡聚 糖凝膠(Sephdex G-25 )柱脫鹽，即得純化的Survivin (序列如SEQ ID No.2所 示)，取樣進(jìn)行Western Blot鑒定。
Western Blot鑒定取純化的Survivin,加入內(nèi)參(3-actin和上樣緩沖液，100 "C加熱3 5分鐘，用質(zhì)量百分濃度為12%的分離膠、質(zhì)量百分濃度為5%的積層 膠進(jìn)行SDS-PAGE,電泳完畢后，將分離產(chǎn)物電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用質(zhì)量百 分濃度為5%的脫脂奶粉溶液封膜，加入鼠抗人Survivin單克隆抗體和鼠抗人 (3-actin單克隆抗體，溫度37。C孵育1小時，洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的 兔抗鼠IgG,溫度37T:孵育1小時，洗膜，顯色；同時設(shè)置陰性對照(不加入 純化的Survivin);結(jié)果見圖1,其中1泳道為純化的Survivin, 2泳道為陰性對 照，可見1泳道除內(nèi)參p-actin條帶外，還有一明顯蛋白條帶，而2泳道未見相 應(yīng)條帶。
2、 GRP170的制備
(1 ) GRP170基因的克隆根據(jù)GenBank登錄號為NM—006389.3的GRP170基因序列和真核表達(dá)載體 pcDNA3.1的多克隆4立點(diǎn)，i殳計(jì)并合成如下PCR引物以擴(kuò)增GRP170 cDNA片^史 引物F2: 5，-accggatcctcgcaaataaaatagt-3， (SEOIDNo.7),下劃線部分為BamHI 酶"t刀4立,泉；引凈勿R2: 5，國gtacagtctagattaatggtgatggtgatgatgtgaaggccgcttctgtcc-3' ( SEQ ID No.8 ),下劃線部分為Xbal酶切位點(diǎn)；以GRP170全長cDNA為模板進(jìn)行 PCR, PCR條件為94。C預(yù)變性4分鐘，然后94。C變性30秒、58。C退火30秒， 72。C延伸2.5分鐘，共30個循環(huán)，最后72。C延伸10分鐘；PCR產(chǎn)物經(jīng)濃度為 8g/L的瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，用凝膠回收試劑盒進(jìn)行切膠回收純化。
瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物在約3000bp處呈單一特異性條帶，與預(yù) 期結(jié)果相符。
(2) GRP170基因重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建
將步驟(1 )所得純化的PCR產(chǎn)物和真核表達(dá)載體pcDNA3.1分別用限制性 內(nèi)切酶Bamffl和Xbal進(jìn)行雙酶切，用凝月交回收試劑盒切月交回收純化雙酶切后 的GRP170cDNA片段和線性載體pcDNA3.1，于16'C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，用含有氨節(jié)青霉素的LB平板篩選陽性克隆，提 取質(zhì)粒，用BamHI和Xbal進(jìn)行雙酶切鑒定，并委托上海生工公司測定基因序 列，序列和閱讀框架正確的陽性克隆質(zhì)粒即為構(gòu)建成功的GRP170基因重組真 核表達(dá)載體，命名為pcDNA3.1/GRP170。
雙酶切鑒定結(jié)果顯示雙酶切產(chǎn)物在3000bp處出現(xiàn)電泳帶，與插入片段大小 相符；測序結(jié)果顯示陽性克隆質(zhì)粒的插入基因序列(如SEQIDNo.5所示)無突 變，閱讀框架正確，無移碼。
(3) GRP170基因工程菌的制備
將步驟(2)所得GRP170基因重組真核表達(dá)載體pcDNA3.1/GRP170用限 制性內(nèi)切酶Sail酶切使線性化，用電穿孔法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞， 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于MD平板，30。C培養(yǎng)3 4天，挑取白色酵母菌落，分別點(diǎn)接于 MD和MM平板，30。C培養(yǎng)3 6天(每天向MM平板中添加曱醇100nL),挑
9取MD平板上生長明顯快于MM平板的酵母菌落，點(diǎn)接于含有濃度為4mg/mL 的G418的YPD平板，3(TC培養(yǎng)7天，所得酵母單菌落即為高拷貝GRP170基 因工程菌。
(4) GRP170的i秀導(dǎo)表達(dá)
將步驟(3 )所得高拷貝GRP170基因工程菌于3(TC培養(yǎng)至OD600為2，按 10%接種量接入BMGY培養(yǎng)基中，30。C培養(yǎng)24小時，5000g離心5分鐘，棄上 清，菌體用無菌水洗滌2次后，重懸于等體積的BMMY培養(yǎng)基中，30。C誘導(dǎo)表 達(dá)3天(每24小時補(bǔ)加誘導(dǎo)劑曱醇至最終體積百分濃度為0.5% ) , 4'C 、 6000g 離心5分鐘，收集上清，加入質(zhì)量百分濃度為80%的硫酸銨溶液使蛋白質(zhì)沉淀， 離心棄上清，蛋白質(zhì)沉淀用濃度為0.02 mol/L、 pH為8.0的PBS透析脫鹽，離 心，收集上清，用Q-Sepharose柱進(jìn)行分離純化，用濃度為lmol/L的氯化鈉溶 液線性梯度洗脫，收集洗脫液，適當(dāng)濃縮后用Sephdex G-25柱脫鹽，即得純化 的GRP170 (序列如SEQ ID No.6所示)，取樣進(jìn)行Western Blot鑒定。
Western Blot鑒定取純化的GRP170，加入內(nèi)參卩-actin和上樣緩沖液，100 。C加熱3 5分鐘，用質(zhì)量百分濃度為12%的分離膠、質(zhì)量百分濃度為5%的積層 膠進(jìn)行SDS-PAGE，電泳完畢后，將分離產(chǎn)物電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用質(zhì)量百 分濃度為5%的脫脂奶粉溶液封膜，加入鼠抗人GRP170單克隆抗體和鼠抗人 P-actin單克隆抗體，溫度37。C孵育1小時，洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的 兔抗鼠IgG,溫度37。C孵育1小時，洗膜，顯色；同時設(shè)置陰性對照(不加入 純化的GRP170);結(jié)果見圖2，其中1泳道為純化的GRP170， 2泳道為陰性對 照，可見1泳道除內(nèi)參P-actin條帶外，還有一明顯蛋白條帶，而2泳道未見相 應(yīng)條帶。
3 、 Survivin-GRP 170復(fù)合物的制備
在濃度為0.01mol/L、 pH為7.2~7.4的PBS (由濃度為137mmol/L的NaCl、 濃度為2.7mmol/L的KC1、濃度為4.3mmol/L的Na2HP04和濃度為1.4mmol/L 的KH2P04組成)中，按摩爾比為1 : 1加入步驟1所得純化的Survivin和步驟2所得純化的GRP170,使Survivin和GRP170的終濃度為3~6pg/mL，混合均勻，在43。C孵育30分鐘，再在37。C孵育1小時，即得Survivin-GRP 170復(fù)合物，取樣進(jìn)行Western Blot鑒定。
Western Blot鑒定取Survivin-GRP 170復(fù)合物，冰上勻漿裂解30分鐘，加入鼠抗人GRP170單克隆抗體，4。C旋渦混合過夜，加入IgG Beads, 4。C旋渦混合5小時，4°C、 5000r/min離心10分鐘，收集上清，加入內(nèi)參(3-actin和上樣緩沖液，95。C加熱5分鐘，用質(zhì)量百分濃度為12%的分離月交、質(zhì)量百分濃度為5%的積層膠進(jìn)行SDS-PAGE，電泳完畢后，將分離產(chǎn)物電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用質(zhì)量百分濃度為5%的脫脂奶粉溶液封膜，加入鼠抗人Survivin單克隆抗體和鼠抗人!3-actin單克隆抗體，溫度37。C孵育1小時，洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠IgG，溫度37。C孵育1小時，洗膜，顯色；同時設(shè)置陰性對照(不加入Survivin-GRP 170);結(jié)果見圖3,其中1泳道為Survivin-GRP 170復(fù)合物，2泳道為陰性對照，可見1泳道除內(nèi)參p-actin條帶外，還有一明顯蛋白條帶，而2泳道未見相應(yīng)條帶。
二、 Survivin-GRP170復(fù)合物的抗肺瘤活性研究
效應(yīng)細(xì)胞的制備將30只6 8周齡雌性Babl/c小鼠隨機(jī)分為3組實(shí)驗(yàn)組、對照組和空白組，每組10只；將Survivin-GRP 170復(fù)合物和OVA-GRP 170復(fù)合物(卵清蛋白與GRP170按前述步驟3方法制得的復(fù)合物)分別用濃度為0.1mol/L、 pH為7.4的PBS溶解制成濃度為0.5mg/mL的溶液；實(shí)驗(yàn)組以濃度為0.5mg/mL的Survivin-GRP 170復(fù)合物溶液為免疫原，對照組以濃度為0.5mg/mL的OVA-GRP170溶液為免疫原，空白組以濃度為0.1mol/L、 pH為7.4的PBS為免疫原；各組于小鼠背側(cè)尾根部皮下注射免疫原，每只lOOpL，之后每間隔1周，以同樣方法加強(qiáng)免疫l次，共免疫3次；末次免疫后l周，斷頸處死小鼠，在無菌條件下取脾臟，用100目篩網(wǎng)碾磨，收集細(xì)胞懸液，用聚蔗糖-泛影葡胺分層液密度梯度離心法分離脾淋巴細(xì)胞，用含有質(zhì)量百分濃度為10%的胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為lxl(^個/mL，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的效應(yīng)細(xì)胞。
1 、 ELISPOT法檢測Survivin-GRP170復(fù)合物激發(fā)CTL分泌IFN-Y的能力 采用ELISPOT檢測試劑盒進(jìn)行檢測，具體操作參照試劑盒說明書在96孔 培養(yǎng)板中，每孔加入體積百分濃度為70。/。的乙醇10(VL，室溫;故置10分鐘，PBS 洗滌，加入IFN-Y捕獲抗體(稀釋度為l : 100) 100pL,溫度4。C孵育過夜，PBS 洗滌，加入質(zhì)量百分濃度為2Q/。的脫脂奶粉溶液100jiL，室溫封閉2小時，PBS洗 滌，加入效應(yīng)細(xì)胞100jjL,溫度37。C孵育48小時，PBST (即含有質(zhì)量百分濃度 為0.1。/。的吐溫20的PBS)洗滌，加入生物素標(biāo)記的抗IFN-Y抗體(稀釋度為1 : 100) 100|iL，溫度37。C孵育1.5小時，PBST洗滌，加入鏈霉親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶 (稀釋度為1:5000) IO(VL,溫度37。C孵育1小時，PBST洗滌，拍干培養(yǎng)板， 加入即用型BCIP/NBT底物反應(yīng)液100|iL,室溫避光顯色2~1 O分鐘至斑點(diǎn)形成， 用蒸餾水終止反應(yīng)，干燥后檢測斑點(diǎn)數(shù)；同時設(shè)置陰性對照組(不加入效應(yīng)細(xì) 胞)，各組斑點(diǎn)數(shù)以3個復(fù)孔的均值表示。
結(jié)果見圖4，實(shí)-驗(yàn)組的斑點(diǎn)數(shù)(278個/105細(xì)胞)明顯高于其它3組(對照 組為174個/105細(xì)胞，空白組為11個/105細(xì)胞，陰性對照組為2個/105細(xì)胞)， 表明本發(fā)明的Survivin-GRP170復(fù)合物具有良好的免疫原性，能夠有效激發(fā)CTL 分泌IFN-y。
2、 51Cr釋》文法才全測Survivin-GRP170復(fù)合物激發(fā)CTL對腫瘤細(xì)胞的特異 性殺傷效應(yīng)
靶細(xì)胞的制備將結(jié)腸癌細(xì)胞CT26用含有質(zhì)量百分濃度為10%的胎牛血清 的RPMI 1640培養(yǎng)基體外培養(yǎng)，收集細(xì)胞，離心洗滌2次后，用含有質(zhì)量百分 濃度為10%的胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1 x 1(^個/mL,取 lmL置10mL血清瓶中，加入100pCi Na51Cr04,溫度37。C孵育90分鐘，充分 洗滌細(xì)胞除去未結(jié)合的51Cr,再用含有質(zhì)量百分濃度為10%的胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為lxl()S個/mL，作為靶細(xì)胞。
在96孔U型板中，每孔分別按效靶比(E/T)為100 : 1、 50 : 1和25 : 1加入效應(yīng)細(xì)胞與耙細(xì)胞，每種效耙比設(shè)3個復(fù)孔，同時設(shè)最大釋放組(用濃度
為2mol/L的鹽酸替代效應(yīng)細(xì)胞)和最小釋放組(用含有質(zhì)量百分濃度為10%的胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基替代效應(yīng)細(xì)胞)；將96孔板500r/min離心30秒后，溫度37。C賻育4小時，1000r/min離心10分鐘，各孔取上清100|iL，用y計(jì)數(shù)器測定每分鐘放射活性(cpm值)，按下述公式計(jì)算殺傷率殺傷率(％)=[(實(shí)驗(yàn)組cpm均值-最小釋放組cpm均值)/(最大釋放組cpm均值-最小釋放組cpm均值)]x100。/。，殺傷率大于15%判為特異性殺傷。
結(jié)果見圖5,實(shí)驗(yàn)組在各效靶比對CT26細(xì)胞均有特異性殺傷作用，且隨著效靶比增大，特異性殺傷作用逐漸增強(qiáng)，當(dāng)E/T為100 : 1時，殺傷率為53.6%,而對照組和空白組對CT26細(xì)胞無特異性殺傷作用，表明本發(fā)明的Survivin-GRP170能夠有效激發(fā)CTL產(chǎn)生對腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷效應(yīng)。
基于以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可得出如下結(jié)論本發(fā)明的Survivin-GRP170復(fù)合物能夠誘導(dǎo)強(qiáng)有力的抗腫瘤免疫，不需要任何佐劑，在同種間應(yīng)用不受MHC的限制，可以作為活性成分，按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制成腫瘤疫苗，在腫瘤免疫治療領(lǐng)域有著良好的開發(fā)應(yīng)用前景。
最后說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過參照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍。序列 表
<110〉 中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)
< 12 0> 生存素與熱休克蛋白的復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用
<160〉 8
<210> 1
<211〉 429
<212〉 DNA
<213> 智人(homo sapiens)<220〉
<221〉 CDS
<222〉 (1)......(429)
<400> 1"g ggt gcc ccgMet Gly Ala Pro1
cac cgc ate tctHis Arg lie Ser20
tgc acc ccg gagCys Thr Pro Glu35
gag aac gag ccaGlu Asn Glu Pro50
gaa ggc tgg gagGlu Gly Trp Glu65
teg tec ggt tgcSer Ser Gly Cys
acc ctt ggt gaaThr Leu Gly Glu100
acg ttg ccc cct gccThr Leu Pro Pro Ala
5
aca ttc aag aac tggThr Phe Lys Asn Trp
25
egg atg gcc gag getArg Met Ala Glu Ala40
gac ttg gcc cag tgtAsp Leu Ala Gin Cys55
cca gat gac gac cccPro Asp Asp Asp Pro70
get ttc ctt tct gtcAla Phe Leu Ser Val85
ttt ttg aaa ctg gacPhe Leu Lys Leu Asp
105
tgg cag ccc tttTrp Gin Pro Phe10
ccc ttc ttg gagPro Phe Leu Glu
ggc ttc ate cacGly Phe lie His45
ttc ttc tgc ttcPhe Phe Cys Phe60
ata gag gaa catlie Glu Glu His75
aag aag cag tttLys Lys Gin Phe90
aga gaa aga gccArg Glu Arg Ala
etc aag gac 48Leu Lys Asp15
ggc tgc gcc 96Gly Cys Ala30
tgc ccc act 144Cys Pro Thr
aag gag ctg 192Lys Glu Leu
aaa aag cat 240Lys Lys His80
gaa gaa Ua 288Glu Glu Leu95
aag aac aaa 336Lys Asn Lys110att gca aag gaa acc aac aat aag aag aaa gaa ttt gag
lie Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys Lys Lys Glu Phe Glu
115 120 125
gag aaa gtg cgc cgt gcc ate gag cag ctg get gcc atg
Glu Lys Val Arg Arg Ala lie Glu Gin Leu Ala Ala Met
130 135 140
gaa act gcg 384Glu Thr Ala
gat tga 429Asp
<210> 2
<211〉 142
<212〉 PRT
<213> 智人(homo sapiens)
5
Thr Phe LysArg Met Ala
<400〉 2
Met Gly Ala Pro Thr Leu Pro1
His Arg lie Ser20
Cys Thr Pro Glu35
Glu Asn Glu Pro50
Glu Gly Trp Glu65
Ser Ser Gly Cys
Thr Leu Gly Glu100
lie Ala Lys Glu115
Glu Lys Val Arg130
Asp Leu Ala55
Pro Asp Asp70
Ala Phe Leu85
Phe Leu Lys
Thr Asn Asn
Arg Ala lie135
Pro
Asn
Glu40Gin
Asp
Ser
Leu
Lys120Glu
Ala
Trp25Ala
Cys
Pro
Val
Asp105Lys
Gin
Trp10Pro
Gly
Phe
lie
Lys90人rg
Lys
Leu
Gin
Phe
Phe
Phe
Glu75Lys
Glu
Glu
Ala
ProLeu
lie
Cys60Glu
Gin
Arg
Phe
Ala140
Phe
Glu
His45Phe
His
Phe
Ala
Glu125Met
Leu Lys Asp15
Gly Cys Ala30
Cys Pro Thr
Lys Glu Leu
Lys Lys His80
Glu Glu Leu95
Lys Asn l>ys110
Glu Thr AlaAsp
<210> 3
<211> 33
<212> DM
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Fl<400〉 3
taggatccat gggtgccccg acgttgcccc ctg
33
<210> 4
<211〉 28
<212> 腿
<213> 人工序列
<220〉
<223> 引物Rl
<400〉 4
gcaagcttat ccatggcacc agctgctg
28
<210> 5
<211〉 3000
<212〉 腿
<213〉 智人(homo sapiens)
<220> <221> 〈222〉
CDS (1).
<400〉 5 atg gca gac Met Ala Asp 1
gcc ttg gtg Ala Leu Val
ctg gca gtg Leu Ala Val 35
att gtc aaa lie Val Lys 50
egg agg纖 Arg Arg Lys 65
匕ys
get Ala 20 atg Met
gtt Val
gtg Val
tct Ser
agg Arg
etc Leu
agg Arg
ttg Leu
gtg gac Val Asp
cct gga Pro Gly
aca ccg Thr Pro
gtg Val
gtg Val 70
ccc Pro 55 ate lie
cag agg Gin Arg
gca Ala
ctg Leu 40 atg Met
gtg Val
gac Asp 25 ggc Gly
gaa Glu
ccg agg Pro Arg
10 ctg ttg Leu Leu
agt gag Ser Glu
att gtc lie Val
acc ctg aaa Thr Leu Lys 75
agg cga Arg Arg
gca ctg Ala Leu
tec atg Ser Met 45
ttg aat lxu Asn
60 gaa aat Glu Asn
gtc tgt tgg 48 Val Cys Trp 15
agt gat aca 96 Ser Asp Thr 30
aag gtg gcc 144 Lys Val Ala
aag gaa tct 192 Lys Glu Ser
gaa aga ttc 240 Glu Arg Phe 80ttt gga Phe Gly
eta cgt Leu Arg
gta get Val Ala
cca cag Pro Gin 130 tea cct Ser Pro 145
get gaa Ala Glu
cca gtc Pro Val
cgt atg Arg Met
act gcc Thr Ala 210 gcc cag Ala Gin 225
ace att Thr lie
cca cag Pro Gin
ctg gag Leu Glu
gac agt Asp Ser
tac Tyr
ctt Leu 115
agg Arg
ttc Phe 100 tac Tyr
cag Gin
ttc Phe
get Ala 195 etc Leu
ttc Phe 180
ggc Gly
age Ser
aa t ate Asn lie
gtg acc Val Thr
ctg Leu
atg Met 275
cag Gin 260 gag Glu
gca Ala 85 cag Gin
gag gaa Glu Glu
gat ttt Asp Phe
gtg Val
gca Ala 165 aac Asn
atg Met
tac Tyr 245 ate
lie
gca Ala
C￡IC
His
age atg Ser Met
etc ctg Leu Leu
cag gcc Gin Ala
act gtg Thr Val
ttg Leu 150 gag Glu
cag Gin
cgc Arg
cac His 135 ggc Gly
etc aaa Leu Lys
tat ggt Tyr Gly
ttc Phe 230 cag Gin
egg Arg
ttc Phe 120 ttt Phe
atg
Met
cag ccc Gin Pro
gcc gag Ala Glu
etc egg Leu Arg
gtg Val
gtc Val 215 tat Tyr
atg Met
gga Gly
ctt Leu
ctg Leu 200 ttc Phe
gac Asp
gtg Val
gta Val
cga Arg 280
gcg Ala
ggg Gly 105 ccg Pro
att lie 90 aag Lys
gag Glu
ate lie
cgc Arg 185 cag Gin
cgc Arg
atg Met
aag act Lys Thr 250 gga ttt Gly Phe 265
gaa Glu
aag aat Lys Asn
cag gca Gin Ala
cac gag His Glu
cca aag Pro Lys
cag ate Gin lie
gtt etc Val Leu
aag Lys 170 cga Arg
etc Leu
egg Arg
ggc Gly
age Ser
aat Asn 155 gat Asp
tcg Ser 140 tat Tyr
gca Ala
gat Asp
ctg Leu 125 cag Gin
get gtg Ala Val
& t c & a t lie Asn
cgc Arg
aaa Lys
tea Ser 235 aag Lys
gac Asp
ctg Leu
aac Asn 110 act Thr
ctg Leu
gat Asp 220 ggc Gly
gaa Glu
cgt Arg
get
Ala
ctg Leu
gac Asp 205 att lie
acc Thr
ggg Gly 285
ctg Leu 270 ctt Leu
get Ala 95 ccc Pro
acg Thr
cat His
ttc gac Phe Asp
cag ttc Gin Phe
tct cgt Ser Arg
gtg ate Val lie
cag Gin 190
Asn
aac Asn
3gc acc Ser Thr
get ggg Ala Gly
tct Ser
acc Thr 175 get Ala
acc Thr
acc Thr
gta Val
atg Met 255
ggg Gly
eta Leu 160 gtg Val
get Ala
gcc Ala
act Thr
tgc Cys 240 cag Gin
ggc Gly
ttc aat Phe Asn
288
336
384
432
480
528
576
624
672
720
768
816
864gag cag Glu Gin 290 gcc atg Ala Met 305
agt gcc Ser Ala
gtg gac Val Asp
gca gac Ala Asp
agt gcc Ser Ala 370 ggg gcc Gly Ala 385
ggc aag Gly Lys
atg ggg Met Gly
aag cc3 Lys Pro
ttc acg Phe Thr 450 aat aaa Asn Lys 465
gtc ate Val lie
cgc Arg
gcc Ala
sac Asn
ttc Phe
ttg Leu 355 gaa Glu
act Thr
gag Glu
gca Ala
ttt Phe 435
agg Arg
egg Arg
Thr
aag Lys
aag Lys
get Ala
aag 匕ys 340 ttt Phe
atg Met
egg Arg
gag Glu
gtg Val 420 gtc Val
gag Glu
gta Val
ttt Phe
ggt cag Gly Gin
ctg Leu
gac Asp 325 gca Ala
gtc Val
ctg Leu 405 tac Tyr
etc Leu
aac Asn 485
ctg Leu 310 cac His
aaa Lys
ccc Pro 390
ggg Gly
cag Gin
ttc Phe 470 cgc Arg
aga Arg 295 cgt Arg
gag egg Glu Arg
agt ctg Ser Leu
gtc cga Val Arg
gtg gag Val Glu
gca Ala
gag Glu
aag gat gtg Lys Asp Val
"g gca Met Ala
gtg act Val Thr
gtg Val
gat Asp 375 aga Arg
cct Pro 360
gag Glu
gtt Val
get Ala
cag Gin
cgt Arg 345
ggg Gly
aag aac Lys Asn
gca get Ala Ala
gat Asp
gag Glu 455 tct Ser
gca Ala 440 gag Glu
egg Arg
aat Asn
att lie 330 gtg Val
cct Pro
cag Gin
ate lie
gcg Ala 425
gtg Val
gag Glu
aat Asn 410 etc Leu
gtc Val
tac age Tyr Ser
atg Met
cat His
egg Arg 315 gaa Glu
gaa Glu
gta Val
ggg Gly
gat Asp 490
ccc Pro 475 Uc Phe
egg 人rg 300 etc Leu
gag Glu
Lys
aac ccg cgt Asn Pro Arg
ggc ctg Gly Leu
ttt gag Phe Glu
att gag cag lie Glu Gin
gtg Val 395 gca Ala
age Ser
tac Tyr
cag Gin
gtg Val 380 ctg Leu
cag Gin 365 ate lie
ctg Leu
acc Thr
atg Met
gag Glu 350 gcc Ala
cct ggg att Pro Gly lie
ccc Pro
cac His 460 tac Tyr
gtc Val
g" Asp 335 ttg Leu
etc Leu
etc Leu 320 gat Asp
tgt Cys
cag Gin
ctg gtg ggt Leu Val Gly
gat gaa Asp Glu
aaa gcc Lys Ala
ate lie 445 age Ser
cct Pro
aag Lys
gca Ala
Ut Phe 430 ctg Leu
gcc Ala
gcc Ala 415 aaa Lys
gtg Val
gtg Val 400 gcc Ala
gtg Val
gag Glu
ctg aag cac Leu Lys His
aac ttc Asn Phe
caa Gin
cac His
cgc Arg
ate lie 495
aaa Hys 480 aac Asn
912
960
1008
1056
1104
1152
1200
1248
1296
1344
1392
1440
1488
18tac ggc gac ctg ggc ttc ctg ggg cct gaa gat ctt egg gta ttt ggc 1536
Tyr Gly Asp Leu Gly Phe Leu Gly Pro Glu Asp Leu Arg Val Phe Gly
500 505 510
tec cag aat ctg acc aca gtg aag cU aaa ggg gtg ggt gac age Uc 1584
Ser Gin Asn Ixu Thr Thr Val Lys Leu Lys Gly Val Gly Asp Ser Phe
515 520 525
aag aag tat cct gac tac gag tec aag ggc ate aag get cac ttc aac 1632
Lys Lys Tyr Pro Asp Tyr Glu Ser Lys Gly lie Lys Ala His Phe Asn
530 535 540
ctg gat gag agt ggc gtg etc agt eta gac agg gtg gag tct gta ttt 1680
Leu Asp Glu Ser Gly Val Leu Ser Leu Asp Arg Val Glu Ser Val Phe
545 550 555 560
gag aca ctg gta gag gac age gca gaa gag gaa tct act etc acc aaa 1728
Glu Thr Leu Val Glu Asp Ser Ala Glu Glu Glu Ser Thr Leu Thr Lys
565 570 575
ctt ggc aac acc att tec age ctg ttt gga ggc ggt acc aca cca gat 1776
Leu Gly Asn Thr lie Ser Ser Leu Phe Gly Gly Gly Thr Thr Pro Asp
580 585 590
gcc aag gag aat ggt act gat act gtc cag gag gaa gag gag age cct 1824
Ala Lys Glu Asn Gly Thr Asp Thr Val Gin Glu Glu Glu Glu Ser Pro
595 600 605
gca gag ggg age aag gac gag cct ggg gag cag gtg gag etc aag gag 1872
Ala Glu Gly Ser Lys Asp Glu Pro Gly Glu Gin Val Glu Leu Lys Glu
610 615 620
gaa get gag gcc cca gtg gag gat ggc tct cag ccc cca ccc cct gaa 1920
Glu Ala Glu Ala Pro Val Glu Asp Gly Ser Gin Pro Pro Pro Pro Glu
625 630 635 640
cct aag gga gat gca acc cct gag gga gaa aag gcc aca gaa aaa gaa 1968
Pro Lys Gly Asp Ala Thr Pro Glu Gly Glu Lys Ala Thr Glu Lys Glu
645 650 655
aat ggg gac aag tct gag gcc cag aaa cca agt gag aag gca gag gca 2016
Asn Gly Asp Lys Ser Glu Ala Gin Lys Pro Ser Glu Lys Ala Glu Ala
660 665 670
ggg cct gag ggc gtc get cca gcc cca gag gga gag aag aag cag aag 2064
Gly Pro Glu Gly Val Ala Pro Ala Pro Glu Gly Glu Lys Lys Gin丄ys
675 680 685
ccc gcc agg aag egg cga "g gta gag gag ate ggg gtg gag ctg gU 2112
Pro Ala Arg Lys Arg Arg Met Val Glu Glu lie Gly Val Glu Leu Val 690 695 700gtt ctg gac ctg cct gac Ug cca gag gat giag ctg get cag teg gtg 2160
Val Ixu Asp Leu Pro Asp Leu Pro Glu Asp Lys Leu Ala Gin Ser Val
705 710 715 720
cag aaa ctt cag gac ttg aca etc cga gac ctg gag aag cag gaa egg 2208
Gin Lys Leu Gin Asp Leu Thr Leu Arg Asp Leu Glu Lys Gin Glu Arg
725 730 735
gaa aaa get gcc aac age Ug gaa gca ttc ata ttt gag acc cag gac 2256
Glu Lys Ala Ala Asn Ser Leu Glu Ala Phe lie Phe Glu Thr Gin Asp
740 745 750
aag ctg Uc cag ccc gag tac cag gaa gtg tec aca gag gag cag cgt 2304
Lys Leu Tyr Gin Pro Glu Tyr Gin Glu Val Ser Thr Glu Glu Gin Arg
755 760 765
gag gag ate tct ggg aag etc age gcc gca tec acc tgg ctg gag gat 2352
Glu Glu lie Ser Gly Lys Leu Ser Ala Ala Ser Thr Trp Leu Glu Asp
770 775 780
gag ggt gtt gga gcc acc aca gtg atg ttg aag gag aag ctg get gag 2400
Glu Gly Val Gly Ala Thr Thr Val Met Leu Lys Glu Lys Leu Ala Glu
785 790 795 800
ctg agg aag ctg tgc caa ggg ctg ttt ttt egg gta gag gag cgc aag 2448
Leu Arg Lys Leu Cys Gin Gly Leu Phe Phe Arg Val Glu Glu Arg Lys
805 810 815
aag tgg ccc gaa egg ctg tct gcc etc gat aat etc etc aac cat tec 2496
Lys Trp Pro Glu Arg Leu Ser Ala Leu Asp Asn Leu Leu Asn His Ser
820 825 830
age atg ttc etc aag ggg gcc egg etc ate cca gag atg gac cag ate 2544
Ser Met Phe Leu Lys Gly Ala Arg Leu lie Pro Glu Met Asp Gin lie
835 840 845
ttc act gag gtg gag atg aca acg tta gag aaa gtc ate aat gag acc 2592
Phe Thr Glu Val Glu Met Thr Thr Leu Glu Lys Val lie Asn Glu Thr
850 855 860
tgg gcc tgg aag aat gca act ctg gcc gag cag get aag ctg ccc gcc 2640
Trp Ala Trp Lys Asn Ala Thr Leu Ala Glu Gin Ala Lys Leu Pro Ala
865 870 875 880
aca gag aag cct gtg Ug etc tea aaa gac att gaa get aag atg atg 2688
Thr Glu Lys Pro Val Leu Leu Ser Lys Asp lie Glu Ala Lys Met Met
885 890 895
gcc ctg gac cga gag gtg cag tat ctg etc aat aag gcc aag ttt acc 2736
Ala Leu Asp Arg Glu Val Gin Tyr Leu Leu Asn Lys Ala Lys Phe Thr
900 905 910aag ccc Lys Pro
ccc etc Pro Leu 930 gca ggc Ala Gly 945
gag act Glu Thr
cct gga Pro Gly
cct ttg Pro Leu
egg Arg 915 aat Asn
ccc Pro
gcc Ala
egg cct aag Arg Pro Lys
cag act Gin Thr
gga Gly
gca Ala
aag Lys 995
tec Ser
gaa Glu 980 aac Asn
agt Ser
gsa Glu
gag Glu 965 cct Pro
gcc Ala
gat Asp 950 cca Pro
gaa Glu
agt Ser 935 gca Ala
gga Gly
cag Gin
gac Asp 920 gac Asp
gac gaa eta Asp Glu Leu
aaa Lys
taa
aag Lys
cag Gin
aat ggg Asn Gly
ggg gag Gly Glu
gag ccc Glu Pro
gac act Asp Thr
gaa Glu 985
att lie
gag Glu 970 caa Gin
tea Ser 955 cct Pro
tcg Ser
3CC
Thr
aag Lys 940 gaa Glu
egg Arg 925 gtc Val
cct Pro
gca gag cca Ala Glu Pro
2784
ate cct cca 2832 lie Pro Pro
ttg gag Leu Glu
aca gga Thr Gly
gag纖gU Glu Lys Val 960
tta gga ggt Leu Gly Gly 975
cag aag egg Gin Lys Arg 990
2880
2928
2976
3000
<210> 6
<211> 999
<212> PRT
<213〉 智人(homo sapiens)
<400> 6 Met Ala Asp
1
Ala Leu Val
Leu Ala Val 35
lie Val Lys 50
Arg Arg Lys
65
Phe Gly Asp
Lys
Ala 20 Met
Pro
Thr
Ser
Leu Arg Tyr Phe 100
Val Arg Arg Gin Arg Pro 5 10 Val Leu Leu Ala Asp Leu
25
Ser Val Asp Ixu Gly Ser 40
Gly Val Pro Met Glu lie 55
Pro Val lie Val Thr Leu 70
Ala Ala Ser Met Ala lie 85 90 Gin His Leu Leu Gly Lys
105
Arg Arg Arg Val
Leu Ala Leu Ser 30
Glu Ser Met Lys 45
Val Leu Asn Lys 60
Lys Glu Asn Glu 75
Lys Asn Pro Lys
Gin Ala Asp Asn 110
Cys 15 Asp
Val
Glu
Trp Thr Ala Ser
Arg Phe 80
Ala Thr
95 Pro HisVal Ala
Pro Gin 130 Ser Pro 145
Ala Glu
Pro Val
Arg Met
Thr Ala 210 Ala Gin 225
Thr lie
Pro Gin
Leu Glu
Glu Gin 290 Ala Met 305
Ser Ala
Val Asp
Ala Asp
Ser Ala 370 Gly Ala 385
Gly Lys
Leu 115 Arg
Glu
Asp
Phe
Ala 195 Leu
Asn
Val
Leu
Met 275 Arg
Ala
Asn
Phe
Leu 355 Glu
Thr
Glu
Tyr
Gin
Glu
Phe
Phe 180 Gly
Ser
lie
Thr
Gin 260 Glu
Lys
Lys
Ala
Lys 340 Phe
Met
Arg
Glu
Gin
Thr
Val
Ala 165 Asn
Leu
Tyr
Met
Tyr 245 lie
Leu
Gly
Leu
Asp 325 Ala
Glu
Ser
Val
Leu 405
Ala
Val
Leu 150 Glu
Gin
Lys
Gly
Phe 230 Gin
Arg
Arg
Gin
Leu 310 His
Lys
Arg
Leu
Pro 390 Gly
Arg
His 135 Gly
Gin
Ala
Val
Val 215 Tyr
Met
Gly
Leu
Arg 295 Arg
Met
Val
Val
Asp 375 Arg
Lys
Phe 120 Phe
Met
Pro
Glu
Leu 200 Phe
Asp
Val
Val
人rg 280 Ala
Glu
Ala
Thr
Pro 360 Glu
Val
Asn
Pro Gin
Val
lie
Arg 185 Gin
Arg
Met
Lys
Gly 265 Glu
Lys
Ala
Gin
Arg 345 Gly
lie
Gin
lie
Glu
lie
Leu
Lys 170 Arg
Leu
Arg
Gly
Thr 250 Phe
人rg
Asp
Asn
lie 330 Val
Pro
Glu
Glu
Asn 410
His
Ser
Asn 155 Asp
Ala
lie
Lys
Ser 235 Lys
Asp
Leu
Val
Arg 315 Glu
Glu
Val
Gin
Val 395 Ala
Glu
Ser 140 Tyr
Ala
Val
Asn
Asp 220 Gly
Glu
Arg
Ala
Arg 300 Leu
Gly
Phe
Gin
Val 380 Leu
Asp
Leu 125 Gin
Ser
Val
Leu
Asp 205 lie
Ser
Ala
Thr
Gly 285 Glu
Lys
Leu
Glu
Gin 365 lie
Leu
Glu
Thr
Leu
Arg
lie
Gin 190 Asn
Asn
Thr
Gly
Leu 270 Leu
Asn
Thr
Met
Glu 350 Ala
Leu
Lys
Ala
Phe Asp
Gin Phe
Ser Leu 160 Thr Val 175
Ala Ala
Thr Ala
Thr Thr
Val Cys 240 Met Gin 255
Gly Gly
Phe Asn
Pro Arg
Val Leu 320 Asp Asp 335
Leu Cys
Leu Gin
Val Gly
Ala Val 400 Ala Ala 415
22Met
Lys
Phe
Asn 465 Val
Tyr
Ser
Lys
Leu 545 Glu
Leu
Ala
Ala
Glu 625 Pro
Asn
Gly
Pro
Val 705
Gly
Pro
Thr 450 匕ys
lie
Gly
Gin
Lys 530 Asp
Thr
Gly
匕ys
Glu 610 Ala
Lys
Gly
Pro
Ala 690 Leu
Ala
Phe 435 Arg
Arg
Thr
Asp
Asn 515 Tyr
Glu
Leu
Asn
Glu 595 Gly
Glu
Gly
Asp
Glu 675 Arg
Asp
Val 420 Val
Glu
Val
Phe
lxu 500 Leu
Pro
Ser
Val
Thr 580 Asn
Ser
Ala
Asp
Lys 660 Gly
Lys
Leu
Tyr
Val
Val
Leu
Asn 485 Gly
Thr
Asp
Gly
Glu 565 lie
Gly
Lys
Pro
Ala 645 Ser
Val
Arg
Pro
Gin
Arg
Glu
Phe 470 Arg
Phe
Thr
Tyr
Val 550 Asp
Ser
Thr
Asp
Val 630 Thr
Glu
Ala
Arg
Asp 710
Ala
Asp
Glu 455 Ser
Tyr
Leu
Val
Glu 535 Leu
Ser
Ser
Asp
Glu 615 Glu
Pro
Ala
Pro
Met 695 Leu
Ala Ala Leu Ser 425
Ala Val Val Tyr 440
Glu Pro Gly lie
Arg
Ser
Gly
Lys 520 Ser
Met
His
Pro 505 Leu
Lys
Gly
Asp 490 Glu
Lys
Gly
Pro 475 Phe
Asp
Gly
lie
Ser Leu Asp Arg 555
Ala Glu Glu Glu 570
Leu Phe Gly Gly 585
Thr Val Gin Glu 600
Pro Gly Glu Gin
Asp Gly Ser Gin 635
Glu Gly Glu Lys 650
Gin Lys Pro Ser 665
Ala Pro Glu Gly 680
Val Glu Glu lie
Pro Glu Asp Lys 715
Pro
His 460 Tyr
Asn
Leu
Val
Lys 540 Val
Ser
Gly
Glu
Val 620 Pro
Ala
Glu
Glu
Gly 700 Leu
Ala
lie 445 Ser
Pro
Phe
Arg
Gly 525 Ala
Glu
Thr
Thr
Glu 605 Glu
Pro
Thr
Lys
Lys 685 Val
Ala
Phe 430 Leu
Leu
Gin
His
Val 510 Asp
His
Ser
Leu
Thr 590 Glu
Leu
Pro
Glu
Ala 670 Lys
Glu
Gin
Lys
Val
Lys
Arg
lie 495 Phe
Ser
Phe
Val
Thr 575 Pro
Ser
Lys
Pro
Lys 655 Glu
Gin
Leu
Ser
Val
Glu
His
Lys 480 Asn
Gly
Phe
Asn
Phe 560 Lys
Asp
Pro
Glu
Glu 640 Glu
Ala
匕ys
Val
Val 720
23Gin Lys
Glu Lys
Lys Leu
Glu Glu 770 Glu Gly 785
Leu Arg
Lys Trp
Ser Met
Phe Thr 850 Trp Ala 865
Thr Glu
Ala Leu
Lys Pro
Pro Leu 930 Ala Gly 945
Glu Thr Pro Gly Pro Leu
Leu
Ala
Tyr 755 lie
Val
匕ys
Pro
Phe 835 Glu
Trp
Lys
Asp
Arg 915 Asn
Gin
Gly
Ala
Lys 995
Gin
Ala 740 Gin
Ser
Gly
Leu
Glu 820 Leu
Val
Lys
Pro
Arg 900 Pro
Ala
Thr
Ser
Glu 980 Asn
Asp 725 Asn
Pro
Gly
Ala
Cys 805 Arg
Lys
Glu
Asn
Val 885 Glu
Arg
Ser
Glu
Glu 965 Pro
Asp
Leu
Ser
Glu
Lys
Thr 790 Gin
Leu
Gly
Met
Ala 870 Leu
Val
Pro
Ala
Asp 950 Pro
Glu
Glu
Thr
Leu
Tyr
Leu 775 Thr
Gly
Ser
Ala
Thr 855 Thr
Leu
Gin
Lys
Ser 935 Ala
Gly
Gin
Leu
Leu
Glu
Gin 760 Ser
Val
Leu
Ala
Arg 840 Thr
Leu
Ser
Tyr
Asp 920 Asp
Glu
Asp Lys
Arg
Ala 745 Glu
Ala
Met
Phe
Leu 825 Leu
Leu
Ala
Lys
Leu 905 Lys
Gin
Pro
Thr
Glu 985
Asp 730 Phe
Val
Ala
Leu
Phe 810 Asp
lie
Glu
Glu
Asp 890 Leu
Asn
Gly
lie
Glu 970 Gin
Leu
lie
Ser
Ser
Lys 795 Arg
Asn
Pro
Lys
Gin 875 lie
Asn
Gly
Glu
Ser 955 Pro
Ser
Glu Phe
Thr
Thr 780 Glu
Val
Leu
Glu
Val 860 Ala
Glu
Lys
Thr
Lys 940 Glu
Leu
Thr
Lys
Glu
Glu 765 Trp
Lys
Glu
Leu
Met 845 lie
Lys
Ala
Ala
人rg 925 Val
Pro
Glu
Gly
Gin
Thr 750 Glu
Leu
Leu
Glu
Asn 830 Asp
Asn
Leu
Lys
Lys 910 Ala
lie
Glu
Leu
Gin 990
Glu 735 Gin
Gin
Glu
Ala
Arg 815 His
Gin
Glu
Pro
Met 895 Phe
Glu
Pro
Lys
Gly 975 Lys
人rg
Asp
Arg
Asp
Glu 800 Lys
Ser
lie
Thr
Ala 880 Met
Thr
Pro
Pro
Val 960 Gly
Arg
<210〉 7 <211> 25<212〉 薩
<213> 人工序列
<220〉
<223〉 引物F2
<400〉 7
accggatcct cgcaaataaa atagt 25
<210〉 8
<211> 51
<212> 腿
<213〉 人工序列
<220>
<223> 引物R2
<■> g"cag
8
tcta gattaatggt gatggtgatg atgtgaaggc cgcttctgtc c
2權(quán)利要求
1、生存素與熱休克蛋白的復(fù)合物，其特征在于由生存素與糖調(diào)蛋白170以非共價鍵結(jié)合而成，所述生存素具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，糖調(diào)蛋白170具有SEQ ID No.6所示的氨基酸序列。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的生存素與熱休克蛋白的復(fù)合物，其特征在于由生存素與糖調(diào)蛋白170以摩爾比為1 : 1結(jié)合而成。
3、 權(quán)利要求1所述的生存素與熱休克蛋白的復(fù)合物的制備方法，其特征在于在濃度為0.01mol/L、 pH為7.2 7.4的PBS中，分別加入生存素和糖調(diào)蛋白170，混合均勻，在43。C孵育30分鐘，再在37。C孵育1小時，即得生存素和熱休克蛋白的復(fù)合物。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的生存素與熱休克蛋白的復(fù)合物的制備方法，其特征在于按摩爾比為1 : 1分別加入生存素和糖調(diào)蛋白170,使生存素和糖調(diào)蛋白170的終濃度為3 6|xg/mL。
5、 權(quán)利要求1所述的生存素與熱休克蛋白的復(fù)合物在制備腫瘤疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了生存素與熱休克蛋白的復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用，該復(fù)合物由生存素與糖調(diào)蛋白170以非共價鍵結(jié)合而成，生存素具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，糖調(diào)蛋白170具有SEQ ID No.6所示的氨基酸序列；本發(fā)明復(fù)合物能夠誘導(dǎo)強(qiáng)有力的抗腫瘤免疫，不需要任何佐劑，在同種間應(yīng)用不受MHC的限制，腫瘤治療譜廣，制備方法簡單，可以用于制備腫瘤疫苗，在腫瘤免疫治療領(lǐng)域有著良好的開發(fā)應(yīng)用前景。
文檔編號A61K47/42GK101670114SQ20091010450
公開日2010年3月17日 申請日期2009年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月31日
發(fā)明者吳玉章, 曌 楊 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)