分泌的熱休克蛋白-90α（Hsp90α）片段作為用于對抗一系列人類實體腫瘤的單克隆抗體藥 ...的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供利用針對來自腫瘤的Hsp90α的不同類型抑制劑來治療HIF-1α過表達人類癌癥、抑制HIF-1α過表達腫瘤侵襲和防止腫瘤轉(zhuǎn)移和/或促進腫瘤預防的方法。
【專利說明】分泌的熱休克蛋白-90a (Hsp90a )片段作為用于對抗一系列人類實體腫瘤的單克隆抗體藥物的疫苗或表位或小分子藥物的靶點
[0001]相關申請交叉引用
[0002]本申請要求2010年10月11遞交的US61/391，776的優(yōu)先權，其內(nèi)容通過引用并入本文。
[0003]政府特許權
[0004]本發(fā)明是在美國國家衛(wèi)生研究院授予的批準號R01GM066193、R01GM067100、GMAR67100-01、AR33625和R01AR46538的政府資助下完成的。美國政府享有本發(fā)明的一定權利。
【技術領域】
[0005]本發(fā)明涉及利用Hsp90 a或其片段的抑制劑治療HIF-1 a過表達(即結構性存在)腫瘤。·
【背景技術】
[0006]本文引用的所有出版物通過引用方式全文并入，其并入程度如同每個單獨的出版物或?qū)＠暾埍粚ｉT且單獨地通過引用方式并入一樣。下面的描述包括對于理解本發(fā)明可能有用的信息。不承認本文中提供的任何信息是要求保護的本發(fā)明的現(xiàn)有技術或與之相關，也不承認任何明確或隱含引用的出版物是現(xiàn)有技術。
[0007]在常氧(約8%的組織氧含量)正常細胞中，組織氧平衡主轉(zhuǎn)錄因子的一個關鍵亞單位即缺氧誘導因子-1 a (HIF-1 a )不斷地合成，然后立即進行O2依賴性脯氨酰羥化。該變性使HIF-1 a蛋白靶向到泛素化蛋白酶體降解機制(23，29)。結果，HIF_1 a的整體穩(wěn)態(tài)水平保持在低水平，防止HIF-1 a與HIF-1 β 二聚。然而，在缺氧條件下，HIF_1 α的羥化反應和隨后的降解受到抑制，導致細胞中的HIF-1 a快速增加。增加的HIF-1 a蛋白隨后與穩(wěn)態(tài)的HIF-1 β (ARNT)二聚形成主轉(zhuǎn)錄復合蛋白HIF-1。HIF-1進而轉(zhuǎn)位到細胞核中并以p300/CBP依賴方式調(diào)節(jié)包含缺氧反應元件(HRE)的基因的表達(I)。
[0008]與此相反，在許多實體腫瘤中發(fā)現(xiàn)的組織缺氧是由于快速增殖的腫瘤細胞在周圍血管網(wǎng)上過度生長導致的，這種過度生長產(chǎn)生比從最近的血液循環(huán)的氧供應的范圍更遠的距離(3，29)。據(jù)推測，在持續(xù)缺血的情況下，腫瘤細胞進行基因改變以適應繼續(xù)生存、擴張和發(fā)展的替代和自支持機制，直到在其周圍構建起新生血管。HIF-1 α的去調(diào)控表達是腫瘤細胞中明確表征的變化(23)，其歸因于HIF-1 a泛素化和降解的癌基因活化、腫瘤抑制基因滅活或酶失活的作用(26)。在動物模型中，去調(diào)控的HIF-1 a對于腫瘤發(fā)生具有關鍵作用。HIF-1a表達下調(diào)或去調(diào)控HIF-1 a活動的抑制減緩了腫瘤生長并使腫瘤更容易通過放療和化療殺死(28)。在人體中，結構性表達的HIF-1 a與大腫瘤體積、高品位的淋巴結陰性轉(zhuǎn)移相關，這使得腫瘤不對放療和化療易感(18)。因此，腫瘤中的HIF-1 a表達水平已經(jīng)成為預測腫瘤轉(zhuǎn)移患者的可能結果的標志。雖然破壞腫瘤細胞中的去調(diào)控HIF-1 a在概念上可以防止腫瘤發(fā)展，但是直接靶向位于細胞內(nèi)的HIF-1 α或調(diào)控HIF-1 α穩(wěn)定性的酶被證明是具有挑戰(zhàn)性的(26，28)。
[0009]人Hsp90伴侶蛋白族包括四個確認的成員，即由不同基因編碼的胞質(zhì)Hsp90a和Hsp90P、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)GRP74和線粒體TRAPl (6)。與腫瘤細胞中的HIF-1 a —樣，Hsp90a也被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中定量過表達或定性過度活化(18)。這些“額外”或“過度活化”的Hsp90 a蛋白被認為結合和保護細胞內(nèi)的癌基因產(chǎn)物的穩(wěn)定性(17，25，41)。這種Hsp90a在腫瘤細胞中比其原癌基因蛋白對應物在周圍正常細胞中看似更高程度的保護被用作開發(fā)抗癌藥物的策略(42)。結合并抑制Hsp90的ATP結合和ATP水解功能的格爾德霉素(GM或苯醌安沙霉素(benzoquinone ansamycin))及其衍生物成為藥物開發(fā)重點已超過十年(25)。GM本身即使在動物模型(36)也被證明毒性過大。一種GM的改性形式17-AAG (苯醌安沙霉素17-烯丙基氨基格爾德霉素)在臨床前研究中表現(xiàn)出在毒性可耐受的劑量范圍內(nèi)的有前途療效并已自1999年起進入了多個階段I和階段2/3的臨床試驗(33，37)。正在進行的臨床試驗正在開發(fā)幾種新一代的化學改性減毒的GM相關藥物。然而，主要障礙仍在于如何選擇性地靶向腫瘤中的Hsp90癌基因保護活動以及保住Hsp90在正常細胞中的生理功能。
[0010]表述“細胞總蛋白的1-2%”已被廣泛用于描述大部分細胞類型中Hsp90蛋白的不尋常豐度。以每細胞約7000蛋白計，Hsp90蛋白的含量會是任何其余細胞蛋白的70-150倍。Csermely和他的同事認為，如果分子伴侶是大自然分配給Hsp90的唯一功能,則這樣的單一蛋白在細胞中的過度產(chǎn)生不可能得到良好的進化耐受(9)。因此，他們推測Hsp90的主要細胞功能是需要這樣的豐富蛋白存儲的另一尚未確認的功能。過去數(shù)年的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，正常細胞對于分泌“存量過多”的Hsp90 α進行組織修復或者腫瘤細胞對于結構性分泌Hsp90 α進行侵襲和轉(zhuǎn)移的出乎意料的需求(7，38)。更重要的是，Hsp90a分泌的關鍵上游調(diào)控因子是缺氧誘導的H IF-1 a。在腫瘤細胞中，使用專門靶向分泌Hsp90 a的不透過細胞膜的Hsp90a抑制劑和顯示出分泌Hsp90a的兩個組是膠質(zhì)瘤、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤的體外侵襲和黑色素瘤細胞體內(nèi)肺定植所需要的(39，42)。由于HIF-1a的去調(diào)控表達在許多實體腫瘤中常見，所以本發(fā)明人推測，在這些腫瘤中HIF-1 a觸發(fā)進行遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移的Hsp90a分泌。在本研究中，本發(fā)明人已經(jīng)確認一種在分泌Hsp90 a中的新的115-氨基酸表位(F-5)，其可能代表一種用于HIF-1 a-陽性的乳腺癌等的新治療靶點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明提供使用Hsp90 a或其片段的抑制劑來治療有此需要的對象中的HIF_1 a過表達癌癥的方法。該方法包括提供包含Hsp90a或其片段的抑制劑的組合物以及將治療有效量的該組合物施用于所述對象以治療所述對象中的HIF-1 a過表達癌癥。
[0012]本發(fā)明還提供使用Hsp90a或其片段的抑制劑來抑制有此需要的對象中的HIF-1a過表達癌癥的方法。該方法包括提供包含Hsp90 a或其片段的抑制劑的組合物以及將治療有效量的該組合物施用于所述對象以抑制所述對象中的HIF-1 a過表達癌癥。
[0013]本發(fā)明還提供用于防止在有此需要的對象中的HIF-1 a過表達癌癥轉(zhuǎn)移的方法。該方法包括提供包含Hsp90 a或其片段的抑制劑的組合物以及將治療有效量的該組合物施用于所述對象以防止所述對象中的HIF-1 a過表達癌癥轉(zhuǎn)移。
[0014]本發(fā)明還提供用于促進在有此需要的對象中的HIF-1 a -過表達癌癥的預防。該方法包括提供包含Hsp90 α或其片段的抑制劑的組合物以及將治療有效量的該組合物施用于所述對象以促進在所述對象中的HIF-1 α過表達癌癥的預防。
[0015]本發(fā)明還提供用于識別Hsp90a抑制劑的方法。該方法包括將Hsp90 a陽性細胞中的Hsp90a或在LRP-1陽性細胞中的LRP-1接觸目標分子(molecule of interest),以及確定所述接觸是否降低或抑制Hsp90 a或其片段與其受體的結合，結合的降低或抑制是目標分子為Hsp90a或其片段的抑制劑的指示。作為替代方案，也可以測試Hsp90a的分泌，其中在目標分子存在下Hsp90a分泌的減少或抑制指示該目標分子為Hsp90 a的抑制劑。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]在參考附圖中示出示例性實施方案。其意圖在于本文公開的實施方案和附圖被認為是說明性的而不是限制性的。
[0017]圖1示出去調(diào)控的HIF-1 a是乳腺癌細胞遷移和侵襲的關鍵。(A)在非轉(zhuǎn)化的乳腺上皮細胞HBL-100 (面板a和b)和乳腺癌細胞MDM-MB-231 (面板c及d)在常氧(21 %
O2，道1)或缺氧(1% O2，道2-5)條件下在指定時間點處的HIF-1a水平的Western印跡分析。注:并列的(side-by-site)所有樣品和所有程序相等負載。(B)在MDA-MB-231細胞中的FG-12慢病毒感染的效率，如通過in-cis CMV啟動的GFP基因的表達，接著進行FACS分析來指示。利用相襯(左)或熒光透鏡(右)示出相同的區(qū)段。(C)FG-12-衍生shRNA對HIF-1a (面板a)或HIF-Ιβ (面板d)的特定下調(diào)，如通過Western蛋白質(zhì)印跡法分析指示。(D)用I型膠原預涂布12孔組織培養(yǎng)板(20yg/ml，2小時)。在無血清培養(yǎng)基中涂布血清饑餓細胞(250000細胞/孔)，2小時內(nèi)附著的細胞>90 %。拍攝傷口閉合，并量化為平均間隙(AG) (40), (η=3, ρ〈0.05)。(E)根據(jù)制造商方案，HIF-1 α或HIF-1 β的下調(diào)抑制MDA-MB-231細胞侵襲通過基底膜屏障(面板b和c對面板a)。注:僅對滲透細胞進行0.D.讀取(590nm處Bio-Rad蛋白 質(zhì)分析)。數(shù)據(jù)表示為平均值土s.d.(n=4, p〈0.05)。
[0018]圖2示出去調(diào)控的HIF-1 α利用分泌的Hsp90 α進行遷移和侵襲。(A)對在常氧(N)或低氧(H)下孵育14小時的HBL-100 (道I和2)或MDA-MB-231細胞(道3和4)的無血清條件培養(yǎng)基(CM)(25y 1，10X濃縮)進行western印跡分析Hsp90a蛋白的存在。(B)對HIF-1 a或HIF-1 β的下調(diào)細胞的CM分析Hsp90 α的存在(道2，3對道I )。將1.0ml的Ix CM濃縮20倍并進行酶譜電泳分析(方法)(b，道1-3)。(C)重新引入HIF-1a基因的wt和CA突變體(道2，3)而不是DN突變體(b，道4)，挽救在HIF-1 a下調(diào)的MDA-MB-231細胞中的Hsp90a分泌(c，道2和3相對道I和4)。(D)膠體金遷移實驗表明，抗Hsp90 a中和抗體以劑量依賴方式阻斷單獨MDA-MB-231的細胞遷移性(面板c，d，e對a，b)。加入過量的重組Hsp90a逆轉(zhuǎn)抗體的抑制(面板f)。MI，遷移率(％) (40)。(E)抗_Hsp90a中和抗體以劑量依賴方式阻斷MDA-MB-231細胞侵襲通過基底膜(面板c，d，e對a，b)。加入過量的重組Hsp90 α逆轉(zhuǎn)抗體的侵襲抑制(面板f)。
[0019]圖3示出在正常細胞對腫瘤細胞中細胞Hsp90a儲存的對比。在指定的不同細胞類型中Hsp90a蛋白相對于總細胞蛋白的百分比(％)是估計的(參見上下文)。A)四種正常細胞類型對重組(recom.)Hsp90 a蛋白的抗Hsp90a抗體印跡(Western)和B)4種腫瘤細胞對重組Hsp90a蛋白的Western印跡。注:含有重組Hsp90a的給定細胞類型中的條帶強度而不是在不同細胞類型之間的條帶強度是相同條件的結果(包括膠片曝光時間)，因而是可對比的。將溶胞產(chǎn)物中Hsp90a條帶的光密度掃描讀數(shù)轉(zhuǎn)換為蛋白的μ g數(shù)，根據(jù)從并列負載的重組Hsp90a的已知μ g數(shù)讀數(shù)制備的標準曲線進行轉(zhuǎn)換。最后，在相同體積的溶胞產(chǎn)物中的給定體積的溶胞產(chǎn)物中的Hsp90 α /總蛋白(μ g) ( μ g) X 100=在給定的細胞類型中的Hsp90a %。多對溶胞產(chǎn)物對重組Hsp90 a的定量結果和三個獨立實驗的結果不于表I。
[0020]圖4示出分泌的Hsp90 a中的F_5表位(epitope,抗原決定基)介導腫瘤細胞的遷移和侵襲。(A)仍保留全長Hsp90 a的全部或部分的促遷移活性(pro-motility activity)的Hsp90a截斷肽的總結。細胞遷移數(shù)據(jù)是膠體金遷移和“劃痕”試驗組合(n=3時，每個試驗，p〈0.05)的總結(％)。(B)用考馬斯亮藍染色的SDS凝膠中觀察FPLC純化的全長度、F-2、F-5、F-7 (道1-4)，用指定量的BSA (牛血清白蛋白)作為對照(道5_7)。F-9是合成肽。(C)測試具有最優(yōu)濃度的五個肽用于挽救HIF-1 α -下調(diào)的MDA-MB-231細胞的侵襲缺陷。(D)侵襲數(shù)據(jù)的定量化(n=3，p〈0.05)。(E)利用抗LRP-1抗體通過Western分析單獨用載體(vector)感染的(道I)或攜帶抗LRP-1受體的shRNA的慢病毒感染的(道2)MDA-MB-231細胞的溶胞產(chǎn)物。(F) LRP-1-下調(diào)的細胞不能如對照細胞那樣侵襲(面板b對a)，并且Hsp90a不能挽救LRP-1下調(diào)細胞的侵襲缺陷(n=4，p〈0.05)。
[0021]圖5示出Hsp90 a信號對于MDA_MB_231細胞肺定植和體內(nèi)腫瘤形成是必不可少的。(A)慢病毒系統(tǒng)、FG-12、介導shRNA-LRP-Ι遞送和MDA-MB-231細胞內(nèi)源性LRP-1下調(diào)(道2對道I)。(B)Western印跡篩查LRP-1受體表達的正常和腫瘤細胞株。(C)在常氧(N)或缺氧(H)條件下MDA-MB-468細胞中HIF-1 a的結構性表達(面板a)。MDA-MB-468細胞的Hsp90 α的結構性表達(面板C)。(D)將單獨用載體感染的(a)或攜帶shRNA-LRP-Ι的載體感染的(b) I X 106熒光素酶工程化的MDA-MB-231細胞或LRP-1-/-MDA-MB-468細胞(c)注入SCID小鼠尾靜脈(n=7/組)。每周一次進行小鼠整個身體的生物發(fā)光成像。小鼠的代表性圖像(2張/組)顯示注入細胞在1、14、28、56和70天的肺定植。(E)在70天至75天(將死于腫瘤的對照MDA-MB-231細胞注入7只小鼠中的4_5只)，小鼠在強制睡眠下移除整個肺并切片進行H & E染色分析。藍色 和綠色箭頭分別指示侵襲的腫瘤結節(jié)與正常肺組織。T，腫瘤結節(jié)山，肺實質(zhì)；比例尺如圖所示。(F)對圖5E所示染色進行單向方差分析(AN0VA)，以比較攜帶MDA-MB-231-載體、MDA-MB-231-LRP-1RNAi和MDA-MB-468細胞的小鼠肺中的腫瘤數(shù)量。*ρ〈0.05, **ρ〈0.003。
[0022]圖6示出作為HIF-1 α陽性癌的潛在靶點的分泌Hsp90 α的模型。在腫瘤中心處經(jīng)常發(fā)現(xiàn)的嚴重缺氧導致HIF-Ια結構性積累。去調(diào)控的HIF-Ια經(jīng)由外來體觸發(fā)Hsp90 α的分泌。分泌的Hsp90 α通過F-5表位結合至細胞表面LRP-1受體，并以自分泌方式促進腫瘤細胞的遷移和侵襲。雖然目前的臨床試驗集中在細胞內(nèi)HIF-1 α，但是本 申請人:認為靶向分泌Hsp90 α的F-5表位對于治療癌癥患者更有效且更安全。
[0023]圖7示出wt-HIF-Ι α和CA-HIF-1 α能夠挽救內(nèi)源性HIF-1 α耗盡的細胞的細胞遷移性缺陷。在十二孔組織培養(yǎng)板上不涂布或涂布I型膠原(40 μ g/ml，2小時)。用HBSS緩沖液洗滌除去未附著的膠原。涂布血清饑餓(18小時)的MDA-MB-231 (25萬個細胞/孔)。在無血清培養(yǎng)基中，使細胞密度在2小時內(nèi)達到90%匯合。用p-200移液管尖端制造“傷口”。拍攝傷口閉合并進行定量化(平均間隙，AG)，如文獻所述(Li等人，2004，MBC,15:294-309))。這里示出的這些結果在三個獨立實驗中是可重復的(n=3，p〈0.05)。
[0024]圖8示出利用DMA治療細胞，DMA是阻斷Hsp90 α分泌的特異性蛋白分泌抑制劑。(A)?5 X IO6個MDA-MB-231細胞培養(yǎng)于三個含4ml無血清培養(yǎng)基的IOcm皿中。向培養(yǎng)基中加入15 μ I的PBS或含BFA (30ηΜ)或DMA (15ηΜ)的PBS。經(jīng)過12小時孵育，收集培養(yǎng)基，濃縮10倍并利用抗HSP90a抗體進行Western印跡分析。(B)在不存在(a和b)和存在BFA (c)或DMA (d, e，f)的條件下對MDA-MB-231細胞進行侵襲實驗。DMA以濃度依賴方式抑制侵襲(n=3, p=0.044, ±s.d.)。
[0025]圖9示出F-5挽救細胞的侵襲缺陷。測試F-5肽的挽救內(nèi)源性HIF-Ιβ下調(diào)MDA-MB-231細胞的侵襲缺陷的能力。面板:(a) Lac-Z-RNAi感染細胞；(b)添加BSA的HIF-1 β -RNAi感染細胞；(c至e)在HIF-1 β -RNAi感染細胞中加入逐漸增加的F-5肽。以0.D.示出定量侵襲數(shù)據(jù)(η=4, ρ〈0.05)。
[0026]圖10示出在遷移和侵襲實驗中，Hsp70、gp96和CRT表現(xiàn)出有限的效果。(A)測試具有最優(yōu)濃度的指定重組蛋白的促進人角質(zhì)細胞遷移(在生理條件下不分泌Hsp90 α )的能力(η=4，*ρ〈0.05)。(B)通過指定的肽/蛋白挽救內(nèi)源性HIF-1 α -下調(diào)的MDA-MB-231細胞的侵襲缺陷。兩個侵襲挽救試驗(n=2)中的一個代表性實驗。*p〈0.05基于三個孔，每個條件，每個實驗，使用作為基線。
【具體實施方式】
[0027]本文引用的所有文獻均通過引用方式全文并入如同完全闡述。除非另有定義，本文使用的技術和科學術語具有本發(fā)明所述【技術領域】的普通技術人員通常理解的相同含義。Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology3rded., J.Wiley & Sons (New York,NY2001) ;March, Advanced Organic ChemistryReactions, Mechanisms and Structure5th ed., J.Wiley & Sons(New York, NY2001);和Sambrook and Russel, Molecular Cloning:A Laboratory Manual3rd ed., Cold SpringHarbor Laboratory Press (C`old Spring Harbor, NY2001)為本領域技術人員提供本申請中所用的許多術語的一般指南。
[0028]本領域技術人員將認識到許多的方法和材料類似或等同于本文所述的那些，它們可以用來實施本發(fā)明。事實上，本發(fā)明決不限于所描述的方法和材料。針對本發(fā)明的目的，下列術語定義如下。
[0029]“有利的結果”可以包括，但決不限于，減輕或緩解疾病的嚴重程度，防止疾病惡化，消除疾病，防止疾病發(fā)展，降低患者疾病發(fā)展的幾率以及延長患者的壽命或預期壽命。
[0030]“病癥”和“疾病”在本文中可以包括，但決不限于，任何形式的癌癥。
[0031]本文所用的“哺乳動物”是指哺乳類的任何成員，包括但不限于:人類和非人類的靈長類動物如黑猩猩和其他猿類和猴物種；家畜，如牛、綿羊、豬、山羊和馬；家養(yǎng)哺乳動物，如狗和貓；實驗室動物，包括嚙齒類動物如小鼠、大鼠、豚鼠等。該術語并不指定特定的年齡或性別。因此，無論雄性還是雌性，成年的和新生的對象以及胎兒均意圖包含在該術語的范圍內(nèi)。
[0032]本文所用的“治療”是指醫(yī)療性治療以及預防性或防備措施，其中目標是防止或減慢(減輕)目標的病理狀態(tài)，防止病理狀態(tài)，追求或取得有益的結果，或即使治療最終不成功也降低個體病癥發(fā)展的幾率。需要治療的那些包括已經(jīng)患有病癥的那些以及易于患上病癥的那些或者意圖防止病癥的那些。
[0033]“癌癥”和“癌性的”是指或描述哺乳動物中的生理病癥，其典型特征是細胞生長失調(diào)。癌癥的實例包括，但不局限于:腦瘤、乳腺癌、結腸癌、肺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、泌尿道癌、甲狀腺癌、腎癌、食道癌、黑色素瘤、頭頸癌、腦癌和前列腺癌，包括但并不限于雄激素依賴性前列腺癌、雄激素非依賴性前列腺癌。
[0034]本文所用的“腫瘤”是指所有的腫瘤細胞生長和增殖，無論是惡性或良性的，以及所有的癌前期和癌性細胞和組織。
[0035]本文所用的“HIF-1”是指缺氧誘導因子-1。HIF-1a-過表達癌癥是指腫瘤細胞中HIF-1a過表達的癌癥。在至少15個器官中的人類共同癌癥的大多數(shù)過表達HIF-1 a(參見 G.L.Semenz a(2007)Drug Discovery Today, Vol.12，Page853_859 中的完整列表)。
[0036]本文所用的“LRP-1”或“LRP1”是指低密度脂蛋白受體相關蛋白1，也稱為α -2-巨球蛋白受體(A2MR)、載脂蛋白E受體(APOER)或分化簇91 (CD91)。LRP-1是一種Hsp90 α受體。
[0037]本文所用的HSP90 α或Hsp90 α是指熱休克蛋白90 α。
[0038]本文所用的“分離的Hsp90 α ”、“純化的Hsp90 α ”、“分離的Hsp90 α片段”或“純化的Hsp90 α片段”是指從非Hsp90 α或其片段表達的或移除的和/或從關聯(lián)或損害Hsp90 α或其片段的活性的細胞結構中移除的Hsp90 α蛋白或其片段。
[0039]缺氧誘導因子-1a (HIF-1 a )的去調(diào)控過表達是許多實體腫瘤的標志。然而，直接靶向HIF-1 a被證明是具有挑戰(zhàn)性的。本 申請人:已經(jīng)預先表明分泌的熱休克蛋白-90 a是HIF-1 a的關鍵下游效應子，提高了使靶向HIF-1 a-過表達腫瘤的分泌Hsp90 a的動作更容易且更特異性的令人激動的可能性。本 申請人:已經(jīng)測試了在HIF-1 a -過表達和轉(zhuǎn)移性乳腺癌細胞MDA-MB-231中的這種可能性。HIF-1a的下調(diào)阻斷Hsp90a分泌和細胞侵襲。將活性的而不是非活性的HIF-1 a基因重新引入內(nèi)源性HIF-1 a耗盡的MDA_MB_231細胞挽救Hsp90a的分泌和侵襲。直接抑制Hsp90a分泌、中和分泌的Hsp90 a的功能或移除分泌的Hsp90 a的細胞表面LRP-1受體均大大減少體外細胞侵襲以及在裸鼠中的肺定植和腫瘤形成。最重要的是，本 申請人:已經(jīng)定位了分泌的Hsp90a中的關鍵表位，稱為F-5。單獨補充F-5肽足以繞過MDA-MB-231細胞中HIF-1 a耗盡的阻斷并恢復侵襲。因為正常細胞只在壓力下分泌Hsp90a，靶向F-5表位將使得人HIF-1 a陽性腫瘤的治療更加有效且毒性下降。
[0040]本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)
[0041]本發(fā)明提供Hsp90a的核酸序列，其可靶向治療HIF_1 a -過表達癌癥、抑制HIF-1 a -過表達癌癥、防止HIF-1 a -過表達癌癥的轉(zhuǎn)移和/或促進HIF_1 a -過表達癌癥的預防。本文提供的核酸序列也可以靶向減輕HIF-1 a-過表達癌癥的影響、降低HIF-1 a -過表達癌癥的嚴重程度、減少HIF-1 a -過表達癌癥的發(fā)展可能性和/或減緩HIF-1 a-過表達癌癥的進程。核酸分子可以是DNA或RNA。在一個實施方案中，全長度Hsp90 a的DNA序列是分離的cDNA序列，如SEQ ID N0:1所示。在另一實施方案中，編碼Hsp90 a的cDNA序列描述在SEQ ID NO:1中，在位置I處以腺苷開始并且在位置2199處以腺苷終止。[0042]本發(fā)明還提供Hsp90a片段的核酸序列，其可靶向治療HIF_1 α -過表達癌癥、抑制HIF-1 α -過表達癌癥、防止HIF-1 α -過表達癌癥的轉(zhuǎn)移和/或促進HIF-1 α -過表達癌癥的預防。本文提供的核酸序列也可以靶向減輕HIF-1 α -過表達癌癥的影響、降低HIF-1 α -過表達癌癥的嚴重程度、減少HIF-1 α -過表達癌癥的發(fā)展可能性和/或減緩HIF-1a-過表達癌癥的進程。核酸分子可以是DNA或RNA。在一個實施方案中，Hsp90 α片段的DNA序列是分離的cDNA序列，如SEQ ID N0:3所示。在另一實施方案中，Hsp90 a片段的DNA序列是分離的cDNA序列，如SEQ ID NO:5所示。
[0043]本文的核酸分子能夠分離Hsp90a同源物，交替分割Hsp90 a蛋白的異形體、等位基因變異和突變形式以及它們的編碼和基因序列。在一個實施方案中，Hsp90a同源物的來源是哺乳動物有機體。本文所述的人Hsp90a或其片段的同源物和天然產(chǎn)生的等位基因變異可與其它哺乳動物、酵母、細菌或植物的Hsp90 a共享高度同源性。相對于SEQID NO:
1、3和/或5中描述的人Hsp90a或其片段，該序列包含至少70%的同源性，優(yōu)選至少80%的同源性，最優(yōu)選至少90 %的同源性。
[0044]本文還提供編碼具有在SEQ ID NO:1、3和/或5的任意一種或更多種中描述的序列的Hsp90 a或其片段的載體。
[0045]本發(fā)明還提供Hsp90 a及其片段的氨基酸序列，其可以靶向治療HIF_1 a -過表達癌癥、抑制HIF-1 a -過表達癌癥和/或防止HIF-1 a -過表達癌癥的轉(zhuǎn)移。在一個實施方案中，全長度Hsp90a的氨基酸序列描述在SEQ ID NO:1和2中。在另一實施方案中，編碼Hsp90 a片段的氨基酸序列描述在SEQ ID NO:3和4中。在又一實施方案中，編碼Hsp90 a片段的DNA序列描述在SEQ ID NO:5和6中。這些序列可以靶向用于例如誘變，以便改變序列并由此改變Hsp90a或其片段的功能。
[0046]本發(fā)明還提供Hsp90a蛋白或其片段，其可以靶向治療HIF_1 a -過表達癌癥、抑制HIF-1 a -過表達癌癥 、防止HIF-1 a -過表達癌癥的轉(zhuǎn)移和/或促進HIF_1 a -過表達癌癥的預防。本文提供的Hsp90a蛋白或其片段也可以靶向減輕HIF-1 a-過表達癌癥的影響、降低HIF-1 a -過表達癌癥的嚴重程度、減少HIF-1 a -過表達癌癥的發(fā)展可能性和/或減緩HIF-1 a-過表達癌癥的進程。在一個實施方案中，Hsp90a蛋白包括732個氨基酸，如SEQID NO:1和2所示，在位置I處以蛋氨酸開始并且在位置732處以天冬氨酸終止。在另一實施方案中，Hsp90a片段包括115個氨基酸，如SEQ ID No:3和4所示，在位置I處以谷氨酸開始并且在位置115處以天冬氨酸終止。在另一實施方案中，Hsp90a片段包括27個氨基酸，如SEQ ID No:5和6所示，在位置I處以絲氨酸開始并且在位置27處以谷氨酸終止。
[0047]本發(fā)明還提供Hsp90a突變體或Hsp90 a片段的突變體。在Hsp90 a或其片段中的突變可能來源于插入、缺失、移碼、基因敲除和/或替代突變。Hsp90a或其片段的突變形式可治療HIF-1 a -過表達癌癥、抑制HIF-1 a -過表達癌癥、防止HIF_1 a -過表達癌癥的轉(zhuǎn)移、促進HIF-1 a -過表達癌癥的預防、減輕HIF-1 a -過表達癌癥的影響、降低HIF-1 a -過表達癌癥的嚴重程度、減少HIF-1 a -過表達癌癥的發(fā)展可能性和/或減緩HIF-1 a -過表達癌癥的進程。
[0048]Hsp90a蛋白和/或其片段，例如由SEQ ID NO:1、2、3、4、5和/或6中的任意一個或多個編碼的那些，可以是分離形式。這些蛋白質(zhì)可以在體內(nèi)或體外表達?？梢允褂枚喾N方法分離和純化Hsp90a蛋白或其片段，這些為本領域技術人員所容易知曉。
[0049]本發(fā)明還提供生產(chǎn)Hsp90a和/或其片段的方法。在一個實施方案中，將Hsp90 a或其片段克隆在與宿主細胞相容的載體中。宿主細胞可以是原核細胞或真核細胞。該方法涉及用編碼Hsp90 a、其衍生物或其片段的載體轉(zhuǎn)染的宿主-載體體系的生長，以在宿主中生產(chǎn)HSp90a分子、其衍生物或其片段，隨后回收Hsp90 a分子、其衍生物或其片段。
[0050]本發(fā)明的治療方法
[0051]本發(fā)明描述使用Hsp90 a抑制劑治療HIF_1 a -過表達癌癥、抑制HIF_1 a -過表達癌癥和/或防止HIF-1 a -過表達癌癥轉(zhuǎn)移的方法和試劑盒。盡管不希望被任何特定理論所約束，但是本發(fā)明人認為他們對于Hsp90 a抑制劑特別是靶向SEQ ID N0.:3、4、5和/或6中所列出的序列的那些抑制腫瘤細胞遷移、侵襲和進展的發(fā)現(xiàn)支持了在臨床設置中施用這些化合物可實現(xiàn)HIF-1 a -過表達癌癥的治療、抑制、防止轉(zhuǎn)移和/或促進預防的觀點。
[0052]本發(fā)明提供使用Hsp90a或其片段的抑制劑治療在有此需要的對象中的HIF-1 a-過表達癌癥的方法。該方法包括提供包含Hsp90a抑制劑的組合物以及向所述對象施用治療有效量的所述組合物以治療所述對象中的HIF-1 a過表達癌癥。所述組合物還可包括其他藥物，包括但不限于:癌癥疫苗和/或其它化學治療劑。在一個實施方案中，所述抑制劑祀向分泌的Hsp90 a。在另一個實施方案中，所述抑制劑防止Hsp90 a的分泌。在又一實施方案中，所述抑制劑靶向如SEQ ID NO:1和/或2中所列出的全長度Hsp90 a。在一個優(yōu)選實施方案中，所述抑制劑靶向在SEQ ID N0.:3、4、5或6中所列出的序列。在另一實施方案中，Hsp90a抑制劑是Hsp90a的衍生物和/或其片段的衍生物。
[0053]本發(fā)明還提供使用Hsp90 a抑制劑抑制在有此需要的對象中的HIF_1 a -過表達癌癥的方法。該方法包括提供包含Hsp90a抑制劑的組合物以及向所述對象施用治療有效量的所述組合物以抑制所述對象中的HIF-1 a過表達癌癥。所述組合物還可包括其他藥物，包括但不限于:癌癥疫苗和/`或其它化學治療劑。在一個實施方案中，所述抑制劑靶向分泌的Hsp90a。在另一個實施方案中，所述抑制劑防止Hsp90 a的分泌。在又一實施方案中，所述抑制劑靶向全長度Hsp90 a JnSEQ ID NO:1和/或2中所列出的。在一個優(yōu)選實施方案中，所述抑制劑靶向在SEQ ID N0.:3、4、5或6中所列出的序列。在另一實施方案中，Hsp90 a抑制劑是Hsp90 a的衍生物和/或其片段的衍生物。
[0054]本發(fā)明還提供防止在有此需要的對象中的HIF-1 a -過表達癌癥轉(zhuǎn)移的方法。該方法包括提供包含Hsp90 a抑制劑的組合物以及向所述對象施用治療有效量的所述組合物以防止所述對象中的HIF-1 a過表達癌癥轉(zhuǎn)移。所述組合物還可包括其他藥物，包括但不限于:癌癥疫苗和/或其它化學治療劑。在一個實施方案中，所述抑制劑靶向分泌的Hsp90 a。在另一個實施方案中，所述抑制劑防止Hsp90 a的分泌。在又一實施方案中，所述抑制劑靶向全長度Hsp90a，如SEQ ID NO:1和/或2中所列出的。在一個優(yōu)選實施方案中，所述抑制劑靶向在SEQ ID N0.:3、4、5或6中所列出的序列。在另一實施方案中，Hsp90 a抑制劑是Hsp90 a的衍生物和/或其片段的衍生物。
[0055]本發(fā)明還提供促進在有此需要的對象中的HIF-1 a -過表達癌癥的預防的方法。該方法包括提供包含Hsp90 a抑制劑的組合物以及向所述對象施用治療有效量的所述組合物以促進在所述對象中的HIF-1 a過表達癌癥的預防。所述組合物還可包括其他藥物，包括但不限于:癌癥疫苗和/或其它化學治療劑。在一個實施方案中，所述抑制劑靶向分泌的Hsp90a。在另一個實施方案中，所述抑制劑防止Hsp90 a的分泌。在又一實施方案中，所述抑制劑靶向全長度Hsp90a，如SEQ ID NO:1和/或2中所描述的。在一個優(yōu)選實施方案中，所述抑制劑靶向在SEQ ID N0.:3、4、5或6中所描述的序列。在另一實施方案中，Hsp90 a抑制劑是Hsp90 a的衍生物和/或其片段的衍生物。
[0056]本發(fā)明還提供減輕HIF-1 a -過表達癌癥的影響、降低HIF_1 a -過表達癌癥的嚴重程度、減少HIF-1 a -過表達癌癥的發(fā)展可能性和/或減緩HIF-1 a -過表達癌癥的進程的方法。該方法包括提供包含Hsp90a抑制劑的組合物以及向所述對象施用治療有效量的所述組合物以減輕HIF-1 a -過表達癌癥的影響、降低HIF-1 a -過表達癌癥的嚴重程度、減少HIF-1 a -過表達癌癥的發(fā)展可能性和/或減緩HIF-1 a -過表達癌癥的進程。所述組合物還可包括其他藥物，包括但不限于:癌癥疫苗和/或其它化學治療劑。在一個實施方案中，所述抑制劑祀向分泌的Hsp90 a。在另一個實施方案中，所述抑制劑防止Hsp90 a的分泌。在又一實施方案中，所述抑制劑靶向全長度Hsp90 a，如SEQ ID NO:1和/或2中所列出的。在一個優(yōu)選實施方案中，所述抑制劑靶向在SEQ ID N0.:3、4、5或6中所列出的序列。在另一實施方案中，Hsp90a抑制劑是Hsp90a的衍生物和/或其片段的衍生物。
[0057]Hsp90 a抑制劑可靶向如SEQ IDN0.:1和/或2中所描述的Hsp90 a。Hsp90 a可以是分泌的或非分泌的Hsp90a。在一個優(yōu)選實施方案中，Hsp90a抑制劑靶向如SEQ IDN0.:3、4、5或6中所列出的Hsp90a的氨基酸。在另一實施方案中，Hsp90 a抑制劑靶向Hsp90 a的受體LRP-1，使得Hsp90a和/或其片段和/或其衍生物不能結合LRP-1，或者可以表現(xiàn)出減少的結合或沒有結合。Hsp90a還可以結合其它靶點，包括MMP2 (基質(zhì)金屬蛋白酶-2)和受體酪氨酸激酶。Hsp90 a抑制劑還可以靶向MMP2和受體酪氨酸激酶。
[0058]在另一實施方案中，Hsp90a抑制劑選自小分子、肽、抗體或其片段和核酸分子。抑制Hsp90a的核酸分子可以是例如siRNA分子。抑制Hsp90 a的抗體可以是單克隆抗體或其片段、多克隆抗體或其片段、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體或單鏈抗體中的任意一種或多種。根據(jù)特定方面，HSp90a抑 制劑可以與其它藥物組合使用，所述藥物包括但不限于癌癥疫苗和/或其它化學治療劑。
[0059]在另一實施方案中，Hsp90a抑制劑抑制Hsp90a的受體并且選自小分子、肽、抗體或其片段和核酸分子。抑制Hsp90a受體的核酸分子可以是例如siRNA分子。抑制Hsp90 a受體的抗體可以是單克隆抗體或其片段、多克隆抗體或其片段、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體或單鏈抗體中的任意一種或多種。根據(jù)特定方面，Hsp90a抑制劑可以與其它藥物組合使用，所述藥物包括但不限于癌癥疫苗和/或其它化學治療劑。
[0060]本發(fā)明的其它實施方案提供導致Hsp90 a抑制的Hsp90a突變。Hsp90a的突變可導致Hsp90a分泌的防止/抑制。作為替代方案，Hsp90a的突變可例如使分泌的Hsp90 a不穩(wěn)定或無法結合其受體LRPl。其它實施方案提供Hsp90 a受體LRPl的突變，使得LRPl不再能夠結合Hsp90 a，從而抑制Hsp90 a。使Hsp90 a失活和/或受抑制的Hsp90 a或其受體的突變包括但不限于插入、缺失、移碼、敲除和/或取代。
[0061]本發(fā)明還提供利用致敏抗原呈遞細胞進行在有此需要的對象中的HIF-1 a -過表達癌癥的治療、抑制，防止轉(zhuǎn)移和/或促進預防的方法。該方法包括提供包括致敏抗原呈遞細胞的組合物，其中所述抗原呈遞細胞被具有在SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列的任意一種或多種肽所敏化，并且向所述對象施用治療有效量的所述組合物以進行在所述對象中的HIF-1 α -過表達癌癥的治療、抑制，防止轉(zhuǎn)移和/或促進預防。在一個實施方案中，抗原呈遞細胞的例子包括樹突細胞、巨噬細胞和B細胞。在另一實施方案中，抗原呈遞細胞的例子包括:成纖維細胞、胸腺上皮細胞、甲狀腺上皮細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、胰腺β細胞和血管內(nèi)皮細胞，所有這些都可通過細胞因子如干擾素Y (IFN Y)共刺激。根據(jù)特定方面，Hsp90a抑制劑可與其它藥物組合使用，所述其它藥物包括但不限于癌癥疫苗和/或其它化學治療劑。
[0062]本發(fā)明還提供利用活化T細胞進行在有此需要的對象中的HIF-1 a -過表達癌癥的治療、抑制，防止轉(zhuǎn)移和/或促進預防的方法。該方法包括提供包含活化T細胞的組合物，其中所述活化T細胞被具有在SEQ ID N0:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列的任意一種或多種肽所活化，并且向所述對象施用治療有效量的所述組合物以進行在所述對象中的HIF-1 a -過表達癌癥的治療、抑制，防止轉(zhuǎn)移和/或促進預防。在一個實施方案中，所述活化T細胞是CD8+T細胞。
[0063]本發(fā)明還提供減輕HIF-1 a -過表達癌癥的影響、降低HIF-1 a -過表達癌癥的嚴重程度、減少HIF-1 a -過表達癌癥的發(fā)展可能性和/或減緩HIF-1 a -過表達癌癥的進程的方法。該方法包括提供包含活化T細胞的組合物,其中所述活化T細胞被具有在SEQ IDNO:3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:6中描述的氨基酸序列的任意一種或多種肽所活化，并且向所述對象施用治療有效量的所述組合物以減輕HIF-1 a -過表達癌癥的影響、降低HIF-1 a -過表達癌癥的嚴重程度、減少HIF-1 a -過表達癌癥的發(fā)展可能性和/或減緩HIF-1 a -過表達癌癥的進程。
[0064]Hsp90 a抑制劑和Hsp90 a受體抑制劑可以靜脈注射、肌肉注射、腹腔注射、口服或經(jīng)吸入服用。
[0065]在要求保護的本發(fā)明中的對象可以是人、非人類靈長類動物、猴、猿、狗、貓、牛、馬、兔、小鼠和大鼠中的任何一種或多種。
[0066]本發(fā)明的劑量
[0067]在本發(fā)明的一些實施方案中，組合物中Hsp90a抑制劑的有效量可以為l_5mg/天、5-lOmg/ 天、10_50mg/ 天、50_100mg/ 天、100-150mg/ 天、150_200mg/ 天、100_200mg/ 天、200_300mg/ 天、300-400mg/ 天、400-500mg/ 天、500-600mg/ 天、600-700mg/ 天、700-800mg/天、800-900mg/ 天、900-1000mg/ 天、1000-1 IOOmg/ 天、1100_1200mg/ 天、1200_1300mg/ 天、1300-1400mg/ 天、1400_1500mg/ 天、1500_1600mg/ 天、1600_1700mg/ 天、1700_1800mg/ 天、1800-1900mg/ 天、1900_2000mg/ 天、2000_2100mg/ 天、2100_2200mg/ 天、2200_2300mg/ 天、2300-2400mg/ 天、2400-2500mg/ 天、2500-2600mg/ 天、2600-2700mg/ 天、2700-2800mg/ 天、2800-2900mg/天或2900_3000mg/天的范圍。在一個優(yōu)選實施方案中，前述劑量的抑制劑靶向在SEQ ID N0.:3、4、5或6中所示的序列。在另一實施方案中，Hsp90a抑制劑是Hsp90a衍生物和/或其片段的衍生物，并且以任何上述劑量給藥。Hsp90a抑制劑可靶向分泌的Hsp90 a或非分泌的Hsp90 a。
[0068]在本發(fā)明的其它實施方案中，與要求保護的方法一起使用的Hsp90 a抑制劑的有效量可以為 l-5mg/kg、5_10mg/kg、10-50mg/kg、50_100mg/kg、100_150mg/kg、150_200mg/kg、100-200mg/kg、200-300mg/kg、300-400mg/kg、400-500mg/kg、500-600mg/kg> 600-700mg/kg> 700-800mg/kg> 800-900mg/kg> 900-1000mg/kg>1000-1100mg/kg、I100_1200mg/kg、1200_1300mg/kg、1300_1400mg/kg、1400_1500mg/kg、1500_1600mg/kg、1600-1700mg/kg>1700-1800mg/kg>1800-1900mg/kg>1900-2000mg/kg>2000-2100mg/kg>2100-2200mg/kg>2200-2300mg/kg>2300-2400mg/kg>2400-2500mg/kg>2500-2600mg/kg>2600-2700mg/kg、2700-2800mg/kg、2800-2900mg/kg 或 2900_3000mg/kg 的范圍。在一個優(yōu)選實施方案中，前述劑量的抑制劑靶向在SEQ ID N0.:3、4、5或6中所示的序列。在另一實施方案中，Hsp90 α抑制劑是Hsp90 α衍生物和/或其片段的衍生物，并且以任何上述劑量給藥。Hsp90 α抑制劑可祀向分泌的Hsp90 α或非分泌的Hsp90 α。
[0069]在本發(fā)明的其它實施方案中，組合物中的Hsp90a受體抑制劑的有效量可以為約 l_5mg/ 天、5-lOmg/ 天、10_50mg/ 天、50_100mg/ 天、100_150mg/ 天、150_200mg/ 天、100_200mg/ 天、200_300mg/ 天、300_400mg/ 天、400_500mg/ 天、500_600mg/ 天、600_700mg/天、700-800mg/ 天、800-900mg/ 天、900_1000mg/ 天、1000-1 IOOmg/ 天、1100_1200mg/ 天、1200-1300mg/ 天、1300_1400mg/ 天、1400_1500mg/ 天、1500_1600mg/ 天、1600_1700mg/ 天、1700-1800mg/ 天、1800_1900mg/ 天、1900_2000mg/ 天、2000_2100mg/ 天、2100_2200mg/ 天、2200-2300mg/ 天、2300-2400mg/ 天、2400-2500mg/ 天、2500-2600mg/ 天、2600-2700mg/ 天、2700-2800mg/ 天、2800_2900mg/ 天或 2900_3000mg/ 天的范圍。
[0070]在其它實施方案中，與要求保護的方法一起使用的Hsp90 a受體抑制劑的有效量可以為 l_5mg/kg、5_10mg/kg、10-50mg/kg、50_100mg/kg、100_150mg/kg、150_200mg/kg、100-200mg/kg>200-300mg/kg>300-400mg/kg>400-500mg/kg>500-600mg/kg>600-700mg/kg、700-800mg/kg、800-900mg/kg、900-1000mg/kg、1000-1100mg/kg、I100-1200mg/kg、1200-1300mg/kg>1300-1400mg/kg>1400-1500mg/kg>1500-1600mg/kg>1600-1700mg/kg>1700_1800mg/kg、1800-1900mg/kg、1900-2000mg/kg、2000-2100mg/kg、2100-2200mg/kg、2200-2300mg/kg、2300-2400mg/kg、2400-2500mg/kg、2500-2600mg/kg、2600-2700mg/kg、2700-2800mg/kg、2800-2900mg/kg 或 2900_3000mg/kg 的范圍。
[0071]當使用已知的治療化合物時，Hsp90a抑制劑有效量的典型劑量可以在生產(chǎn)商所推薦的范圍內(nèi)，也可以如 本領域技術人員通過體外應答或動物模型中的響應所指示的。根據(jù)本發(fā)明的各個實施方案，可以使用相同或相似的劑量，或者對于本發(fā)明的可選實施方案可以使用可選的劑量。實際劑量可取決于醫(yī)生的判斷、患者的病情以及治療方法的有效性，其基于例如相關培養(yǎng)細胞或組織培養(yǎng)的組織樣本的體外響應性或在合適的動物模型中觀察到的反應。
[0072]本發(fā)明的篩選方法
[0073]本發(fā)明的另一方面涉及識別抑制Hsp90 a和/或Hsp90 a受體的化合物的檢測和方法。在一個實施方案中，該方法包括使Hsp90 a陽性細胞中的Hsp90a接觸目標分子以及確定所述接觸是否減少或抑制Hsp90 a與其受體的結合。Hsp90a與Hsp90 a受體的結合的減少或抑制指示目標分子是Hsp90 a抑制劑。在另一實施方案中，該方法包括分別接觸多個待檢測樣品中的每一個，其中所述多個樣品可以是例如超過約IO4個樣本或超過約5X104個樣本。所述抑制劑可靶向如SEQ ID N0.:1或2中所示的Hsp90 a。優(yōu)選地，所述抑制劑靶向在SEQ ID N0.:3、4、5或6中所示的序列。此外，Hsp90a抑制劑是Hsp90 a衍生物(例如突變體)和/或其片段的衍生物。
[0074]在另一實施方案中，用于識別Hsp90 a抑制劑的方法包括使LRP-1陽性細胞中的LRP-1接觸目標分子并確定所述接觸是否減少或抑制Hsp90 α與LPR-1的結合。Hsp90 α與LRP-1的結合的減少或抑制指示目標分子是Hsp90a抑制劑。在另一實施方案中，該方法包括分別接觸多個待檢測樣品中的每一個，其中所述多個樣品可以是例如超過約IO4個樣本或超過約5 X IO4個樣本。在一個實施方案中，所述抑制劑是LRP-1衍生物(例如突變體)，使得Hsp90 a不能結合LRP-1或表現(xiàn)出與LRP-1結合的減少。
[0075]在另一實施方案中，用于識別Hsp90a抑制劑的方法包括使Hsp90 a陽性細胞中的Hsp90a接觸目標分子以及確定所述接觸是否減少或抑制Hsp90 a的分泌。Hsp90 a的分泌的減少或抑制指示目標分子是Hsp90 a抑制劑。在另一實施方案中，該方法包括分別接觸多個待檢測樣品中的每一個，其中所述多個樣品可以是例如超過約IO4個樣本或超過約5X IO4個樣本。所述抑制劑可靶向如SEQ ID N0.:1和2中所示的Hsp90 a。優(yōu)選地，所述抑制劑靶向在SEQ ID N0.:3、4、5或6中所示的序列。此外，Hsp90a抑制劑是Hsp90 a衍生物(例如突變體)和/或其片段的衍生物。
[0076]抑制Hsp90 a和/或LRP-1的目標化合物可以是小分子、肽、抗體或其片段和核酸分子中的任何一個或多個。
[0077]可用于識別抑制Hsp90 a和/或其片段的化合物的試驗分析包括但不限于:微陣列分析、定量PCR、Northern印跡分析、Southern印跡分析、Western印跡分析、免疫組織化學分析、結合分析、凝膠阻滯分析或利用酵母雙雜交系統(tǒng)的分析。本領域技術人員可容易地采用本領域已知的大量方法來確定特定試劑是否抑制Hsp90 a和/或其片段。
[0078]藥物組合物
[0079]在多個實施方 案中，本發(fā)明提供藥物組合物，其包括藥學可接受的賦形劑以及治療有效量的Hsp90a抑制劑。所述抑制劑可靶向如SEQ ID N0.:1或2中所示的Hsp90 a。優(yōu)選地，所述抑制劑靶向在SEQ ID N0.:3、4、5或6中所示的序列。此外，Hsp90a抑制劑是Hsp90 a衍生物(例如突變體)和/或其片段的衍生物。
[0080]“藥學上可接受的賦形劑”是指在制備藥物組合物中有用的賦形劑，所述賦形劑一般是安全無毒并且是所需的，包括獸醫(yī)使用以及人類藥物使用可接受的賦形劑。這樣的賦形劑可以是固體、液體、半固體或在氣溶膠組合物的情況下為氣體。
[0081]在多個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可以配制為經(jīng)由任意給藥途徑遞送?！敖o藥途徑”可指本領域已知的任何給藥途徑，包括但不限于:氣溶膠、經(jīng)鼻給藥、口服、經(jīng)粘膜給藥、經(jīng)皮給藥或非腸道給藥。
[0082]根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物還可以包含任何藥學上可接受的載體。這里所用的“藥學上可接受的載體”是指藥學上可接受的材料、組合物或在從一個組織、器官或身體一部分至另一組織、器官或身體另一部分攜帶或運輸目標化合物中涉及的介質(zhì)。例如，載體可以是液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或包封材料或它們的組合。載體的每個組分必須是“藥學上可接受的”，因為它必須與制劑中的其它成分相容。它還必須適合用于接觸它可能接觸的任何組織或器官，這意味著它必須不具有過度超過其療效的毒性、刺激性、過敏性反應、免疫原性或任何其它并發(fā)癥的風險。
[0083]根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物還可以被包封、壓片或制備成口服給藥的乳劑或糖漿?？商砑铀帉W上可接受的固體或液體載體以增強或穩(wěn)定該組合物，或者便于制備該組合物。液體載體包括糖漿、花生油、橄欖油、甘油、鹽水、乙醇和水。固體載體包括淀粉、乳糖、硫酸鈣二水合物、石膏粉、硬脂酸鎂或硬脂酸、滑石粉、果膠、阿拉伯膠、瓊脂或明膠。該載體也可以包括緩釋材料如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯，單獨或與蠟一起使用。
[0084]該藥物制劑是由以下常規(guī)制藥技術制備，所述常規(guī)制藥技術包括研磨、混合、造粒和壓縮(必要時)以制成片劑形式；或碾磨、混合和填充以制成硬明膠膠囊形式。當使用液體載體時，制劑可以是糖漿、酏劑、乳劑或水性或非水性懸液的形式。這樣的液體制劑可直接口服給藥或填充到軟明膠膠囊中。
[0085]根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可以治療有效量進行遞送。精確的治療有效量是在給定對象的治療效率方面將產(chǎn)生最有效結果的組合物量。這個量會有所不同，這取決于多種因素，包括但并不限于治療化合物的特性(包括活性、藥代動力學、藥效學和生物利用度)、對象的生理條件(包括年齡、性別、疾病類型和階段、一般身體狀況、對給定劑量的反應和藥物類型)、制劑中的藥學上可接受載體的特性和給藥途徑。臨床和藥理學領域的技術人員將能夠通過常規(guī)實驗來確定治療有效量，例如通過監(jiān)視受試者對化合物給藥的反應并相應地調(diào)整劑量。對于額外指導，請參閱Remington:The Science and Practice ofPharmacy(Gennaro ed.20th edition, Williams & Wilkins PA, USA) (2000)。
[0086]本發(fā)明的試劑盒
[0087]本發(fā)明還涉及用于治療HIF-1 過表達癌癥、抑制HIF-1 α -過表達癌癥、防止HIF-1 α -過表達癌癥轉(zhuǎn)移和/或促進預防HIF-1 α -過表達癌癥的試劑盒。本文還提供用于減輕HIF-1 α -過表達癌癥的影響、降低HIF-1 α -過表達癌癥的嚴重程度、減少HIF-1 α -過表達癌癥的發(fā)展可能性和/或減緩HIF-1 α -過表達癌癥的進程的試劑盒。該試劑盒是材料或組分的組合，包括本發(fā)明組合物中的至少一個。因此，在一些實施方案中，該試劑盒包含包括如上所述的Hsp90 α抑制劑的組合物。
[0088]在本發(fā)明的試劑盒中配置的組分的確切性質(zhì)取決于其預定目的。在一個實施方案中，所述試劑盒特別配置用于人類對象。在進一步的實施方案中，該試劑盒被配置用于獸醫(yī)應用，治療對象例如但不限于家`畜、家養(yǎng)動物和實驗室動物。
[0089]試劑盒可以包括使用說明?！笆褂谜f明”通常包括描述在使用試劑盒的組分以實現(xiàn)期望結果例如治療HIF-1 α -過表達癌癥、抑制HIF-1 α -過表達癌癥、防止HIF-1 α -過表達癌癥轉(zhuǎn)移和/或促進預防HIF-1 α -過表達癌癥中所采用的技術的有形表達。任選地，所述試劑盒還包含其它有用的組件，例如測量工具、稀釋劑、緩沖劑、藥學上可接受的載體、注射器或本領域技術人員容易認識的其它有用的用具。
[0090]試劑盒中組裝的材料或組分可提供給從業(yè)者以保持其可操作性和實用性的任何方便和合適的方式儲存。例如，組分可以是溶解、脫水或凍干形式；它們可以在室溫、冷藏或冷凍溫度下提供。組分通常包含在合適的包裝材料中。如本文所用的術語“包裝材料”是指用于容納試劑盒內(nèi)容物例如本發(fā)明的組合物等的一個或多個物理結構。該包裝材料通過公知方法構造，優(yōu)選提供無菌且無污染物的環(huán)境。如本文所用術語“包裝”是指能夠容納單個試劑盒組分的合適固體基質(zhì)或材料，如玻璃、塑料、紙、箔等。因此，例如，包裝可以是用于包含適量的含Hsp90a或其片段的抑制劑的瓶子。包裝材料一般具有外標簽，其指示試劑盒和/或其組分的含量和/或目的。
[0091]實施例
[0092]提供以下實施例以更好地說明所要求保護的本發(fā)明，而不應被解釋為限制本發(fā)明的范圍。在提及的特定材料的范圍內(nèi)，僅僅是為了說明的目的而并非意在限制本發(fā)明。本領域技術人員可開發(fā)不運用本發(fā)明能力并且不脫離本發(fā)明范圍的等同手段或反應物。
[0093]實施例1
[0094]實驗方法
[0095]篩選用于去調(diào)控HIF-1 α表達的細胞系包括:HBL_100人乳腺上皮細胞、四種人乳腺癌細胞株(MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-435 和 MCF_7)、M24 和 M21 人黑色素瘤細胞系、U251和U87人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系、A172人膠質(zhì)母細胞瘤細胞系、PC3人類前列腺癌細胞株和A431人皮膚癌細胞系。原生鼠尾I型膠原蛋白來自BD Biosciences (Bedford, MA)。膠體金(氯化金，G4022)購自 SigmaCSt.Louis, MI)0 編碼 HIF-1 a (wt)、HIF_1 a CA5(結構性活性)和 HIF-la ΔΝΒΔΑΒ(顯性陰性)的 cDNA 是來自 Gregg Semenza 博士(Johns HopkinsUniversity)的禮物并克隆成慢病毒載體pPPLsin.MCS-Deco (20)。在慢病毒FG-12系統(tǒng)中克隆抗人HIF-1a和HIF-1 β的shRNA，如前所述(39)?？笻IF-1 a抗體(#610958)和抗 HIF-1 β 抗體(# 611078)來自 BD Transduction Laboratories (Lexington, KY)。用于Western印跡分析(SPA-840)和用于中和功能(SPS-771)的抗Hsp90 α抗體來自Stressgen(Victoria, BC Canada)。XL-10 金超感應細胞(XL-10 金)來自 StratageneCLa Jolla, CA)。用于在大腸桿菌中蛋白質(zhì)生產(chǎn)的pET系統(tǒng)(pERT15b)購自Novagen (Madison.WI)。菌素A (BFA)和二甲基阿米洛利(DMA)均購自Sigma-Aldrich (St.Louis, MO)?；啄で忠u室(354480)和方案均購自 BD Biosciences (Bedford, MA)。無胸腺 nu/nu 小鼠(4-6 周齡，Harlan, Livermore, CA)用于腫瘤形成實驗。
[0096]無血清條件培養(yǎng)基的缺氧處理及制備
[0097]使用來自BioSpherix, Ltd.(Redfield,NY)的 OxyCycler C42 作為整個本次研究中的氧含量控制器。該設備允許創(chuàng)建任意的氧濃度曲線，具有全范圍的氧(0.1% -99.9%)或CO2控制(0.1% -20.0%)。更重要的是，用于缺氧實驗的所有培養(yǎng)基均在具有指定氧含量的低氧室預孵育16小時， 然后將其用來替代常氧培養(yǎng)基。無血清條件培養(yǎng)基的制備如先前所述進行(8)。
[0098]上調(diào)或下調(diào)靶基因的慢病毒系統(tǒng)
[0099]使用pRRLsinhCMV系統(tǒng)來過表達外源性HIF-1 α。使用FG_12RNAi傳遞系統(tǒng)來遞送對抗HIF-1的shRNAs，如前所述(20)。為了測量內(nèi)源性或外源性基因產(chǎn)物的蛋白質(zhì)水平，對等量(50 μ g總細胞蛋白質(zhì)/樣品)的細胞溶解產(chǎn)物蛋白質(zhì)(由Bio-Rad Protein Assay測定)進行抗體Western印跡分析。結果通過ECL反應進行可視化。使用不飽和曝光的膠片進行掃描光密度分析。計算相同實驗的三種不同曝光的平均值(42)。
[0100]三個細胞遷移試驗和無血清條件培養(yǎng)基
[0101]膠體金細胞遷移試驗的更新方案包括數(shù)據(jù)和統(tǒng)計分析，用于體外傷口愈合試驗的修改方案包括ECM預涂布、涂覆細胞、刮傷和量化遷移數(shù)據(jù)，二者均如前所述(29)。根據(jù)我們在先公開的方案(21)進行內(nèi)皮細胞試驗。無血清條件培養(yǎng)基的制備已在先具體描述
(29)。酶譜法凝膠分析如前所述進行(43)。
[0102]侵襲試驗
[0103]如BD BioCoatTM Matrigel Invasion Ch amb e r (3 5 4 4 8 O ) (BDBiosciences, Bedford, MA)的制造商說明書所詳細描述的。[0104]用Alpha Innotech Fluorchem SP 進行密度測量
[0105]Alpha Innotech Fluorchem SP是專業(yè)用于突光、化學發(fā)光或可見光成像的400萬像素 CCD。在 MultiImage FC Light Cabinet (DE-500FC)中，12 位和 400 萬像素制冷攝像機連接到手動定焦鏡頭，具有干涉濾波器和ML-26雙波長紫外透射器。它采用FluorChemAlphaEase FC32位軟件進行圖像采集、增強、存檔、文件編制和分析。采用一分鐘曝光，光圈設定在1.2，變焦20倍，焦距1.9，使用開放式濾光器和正常的靈敏度和高分辨率。
[0106]重組Hsp90a的生產(chǎn)和純化
[0107]利用基于PCR的克隆技術將8個不同域中的7個域的編碼區(qū)(5個即N’、M_1、M_2、C’ -1和C’ -2如先前報道，文獻8)亞克隆到在BamHl位的組胺酸標記的pET15b載體(EMDbiosciences, Inc., San Diego, CA)。第八個27-氨基酸肽P-9是合成肽。根據(jù)制造商提供的方案，將 pET15b_hsp90 α 結構轉(zhuǎn)化成 BL21_codonPlus (DE3) -RP 感應細胞(Stratagene )。通過將0.25mM IPTG (Sigma, 15502-09)加入細菌培養(yǎng)物(0.D.2 0.8)中并在25 °C下再孵育5小時來誘導蛋白質(zhì)合成。首先根據(jù)制造商程序通過具有HisBind純化試劑盒(EMDbiosciences, Inc .)的N1-NTA柱純化這些組胺酸標記的蛋白質(zhì)。純化的蛋白質(zhì)在AmiconUltra (IOx 或 50x) (Millipore, Billerica, MA)中濃縮至?4ml,過濾(0.22 μ m),接著裝載到 Superdex-200 或 75HiLoad 凝膠過濾柱(GE healthcare, Piscataway, NJ)上，通過 FPLC進行分離。該肽用DPBS緩沖液(1.2ml/分鐘)洗脫，在Centricon YM-50或YM-1O中濃縮至lmg/ml并貯存在_70°C的10%甘油-DPBS中。
[0108]小鼠中的腫瘤形成和生物發(fā)光成像
[0109]將三種不同的細胞系(N=6/細胞系)移植到無胸腺nu/nu小鼠(4_6周齡，Harlan, Livermore, CA)中以確定LRP-1/CD91信令在MDAMB肺定植中的作用，對照為shRNA(抗 Lac-Z)、MDAMB-23ILRP-1-RNAi 和 LRP-1+MDAMB-468。用 2 %異氟醚吸入麻醉氣體使用蒸發(fā)器將小鼠麻醉，使用定制導管經(jīng)由尾靜脈靜脈內(nèi)注射IX IO6個細胞/小鼠來創(chuàng)建轉(zhuǎn)移模型。所有的動物實驗均根據(jù)美國機構動物照護和使用委員會(IACUC)批準的方案進行。光學成像采用IVIS200成像系統(tǒng)(Xenogen Corporation, Alameda, CA)進行，該系統(tǒng)采用冷卻CCD相機來進行最優(yōu)靈敏度的低光水平體內(nèi)成像。在整個研究過程中，用2 %異氟醚吸入氣體麻醉小鼠，然后進行腹腔內(nèi)注射熒光素酶底物、D-熒光素(50mg/kg, Caliper Life Sciences, Alameda, CA)。底物分布進行12分鐘,接著米用以下設定進行生物發(fā)光成像:1分鐘/掃描，bin=8，視場13.1cm和f-光圈=1。在生物發(fā)光信號平臺階段過程中，對小鼠進行背側(cè)和腹側(cè)順序成像，使用Living Image3.1Software (XenogenCorporation, Alameda, CA)進行分析。對小鼠進行每周成像，直到滿足IAOJC終點。所有圖像歸一化成相同圖像偽彩色溫標，并在胸部區(qū)域上繪制圓形關注區(qū)(ROI)以定量化發(fā)光信號。對來自MDA-MB-231載體組的數(shù)據(jù)采用Wilcoxon秩和檢驗進行統(tǒng)計顯著性(p〈0.05)比較，并且定性比較來自MDAMB-231-LRP-1-RNAi和LRP-1-/-MDAMB-468組的信號分布。上述實驗重復三次。
[0110]組織化學
[0111]對有或無原發(fā)腫瘤的全肺進行解剖，將全肺固定在10%福爾馬林(Sigma)中，石蠟包埋，將整個肺切成6微米切片并用蘇木精伊紅染色(H &E)。對膠片進行分析，并利用顯微鏡和定量分析對膠片上的全肺切片計數(shù)腫瘤。[0112]統(tǒng)計分析
[0113]細胞遷移和侵襲的數(shù)據(jù)以均值標準差(s.d.)表示。所有體外細胞實驗利用雙尾學生t檢驗與Cl (置信區(qū)間)>90%來分析。使用雙尾非參數(shù)Mann-Whitney檢驗進行肺定植實驗數(shù)據(jù)(光子/秒)分析。P值小于0.05認為具有統(tǒng)計顯著性。
[0114]實施例2
[0115]HIF-1a的結構性水平對于乳腺癌細胞侵襲是必不可少的
[0116]本 申請人:希望識別具有HIF-1 a去調(diào)控表達的腫瘤細胞系并利用該細胞模型來識別對于體外細胞侵襲和體內(nèi)腫瘤形成必不可少的去調(diào)控HIF-1 a的新的下游效應物。在篩選各種腫瘤細胞系(在材料和方法部分中列舉)后，本 申請人:關注于ER陰性和Ah無反應乳腺癌細胞系MDA-MB-231，其預先從得自51歲患者的胸腔積液中分離出，具有侵襲性和轉(zhuǎn)移性(4)。這種選擇還考慮到以下臨床數(shù)據(jù)一約30%的浸潤性乳腺癌樣本是缺氧的(10，22)。將未轉(zhuǎn)化的人類上皮細胞HBL-100 (13)歸為對照。如圖1A所示，在HBL-100細胞中，常氧下(面板a，道l)HIF-la水平檢測不到。從缺氧細胞中檢測到HIF_1 a蛋白的時間相關積累(道2-5)。然而，在相同的條件下(等蛋白質(zhì)負載，并行操作和ECL過程)，即使在常氧下也可以檢測出MDA-MB-231細胞中的HIF-1 a表達的結構性基礎水平(面板C，道I)。雖然癌細胞的缺氧處理導致HIF-1 a進一步增加，但是這種增長是短暫的。缺氧條件下，3-6小時之間達到平臺，隨后經(jīng)過14小時下降至基礎水平(道2-5，數(shù)據(jù)未顯示)。雖然在MDA-MB-231細胞中這種缺氧反應的短期HIF-1 a誘導的顯著性仍然不明，但是HIF-1 a結構性存在與人類乳腺腫瘤組織樣本的抗HIF-1抗體染色增加相一致(10，22)。
[0117]甚至在無血清條件下(模擬體內(nèi)低氧腫瘤環(huán)境)，MDA-MB-231細胞中HIF_1 a結構性水平足以維持細胞的高 遷移性和侵襲性。本 申請人:采用慢病毒系統(tǒng)FG-12將抗人HIF-1a或HIF-Ιβ的U6啟動子驅(qū)動shRNA遞送至MDA-MB-231細胞中。如圖1B所示，在同一載體中CMV啟動子驅(qū)動GFP (綠色熒光蛋白)基因的表達指示在該細胞系中該系統(tǒng)的基因轉(zhuǎn)導效率超過80% (右側(cè)面板對左側(cè)面板)。因此，如圖1C所示，與對照的抗LacZ的shRNA(道I)相比，本 申請人:實現(xiàn)了幾乎完全下調(diào)的HIF-1ci (面板a，道2)或HIF-1 β (面板d，道2)。此外，在HIF-1a和HIF-1 β之間沒有非特異性的shRNA交叉反應(面板b和e)。當這些HIF-1 a -或HIF-1 β -下調(diào)細胞進行細胞遷移(“從頭開始(scratch)，，)試驗時，如圖1D所示，對照的MDA-MB-231細胞即使在無血清條件下也表現(xiàn)出結構性高遷移性(面板b對面板a)。然而，HIF-1a或HIF-1 β的下調(diào)遏制了細胞遷移(面板d和f對面板c和e)。在相同細胞的侵襲試驗中得到相似的觀察結果。如圖1E所示，對照的MDA-MB-231細胞在無血清條件下強烈滲透基底膜屏障(由層粘連蛋白、IV型膠原、硫酸乙酰肝素蛋白多糖和巢蛋白構成)(面板a)。與之相反，HIF-1a-或HIF-1 β-下調(diào)細胞表現(xiàn)出急劇下降的侵襲性(面板b和c對面板a)。這些結果建立了 MDA-MB-231細胞系作為充分的腫瘤細胞模型以識別去調(diào)控HIF-1a的下游效應物。
[0118]實施例3
[0119]乳腺癌中去調(diào)控HIF-1 a導致結構性Hsp90 a分泌
[0120]本 申請人:基于以下三個標準對去調(diào)控HIF-1 a的靶點進行檢索:I)被MDA_MB_231細胞結構性分泌；2)在去調(diào)控HIF-1 a的直接控制下和3)對于細胞的侵襲性至關重要。本 申請人:基于以下證據(jù)關注于熱休克蛋白90a (Hsp90 a )的分泌。首先,Eustace等人發(fā)現(xiàn)HT-1080纖維肉瘤細胞分泌Hsp90a (12)。其次，缺氧導致正常細胞分泌Hsp90 a (19)。第三，分泌的Hsp90a介導低氧驅(qū)動的細胞遷移(42)。因此，本 申請人:測試了去調(diào)控HIF_1 a導致Hsp90 a分泌進而引起MDA-MB-231細胞的遷移性和侵襲性增加的可能性。對在常氧或低氧下培養(yǎng)的HBL-1OO和MDA-MB-231細胞的無血清條件培養(yǎng)基(CM)分析Hsp90 a的存在。如圖2A所示，從在低氧(道2)而不是常氧(道I)下孵育的HBL-100細胞的CM中檢測到分泌的Hsp90 a。與此相反，從在常氧(道3)或低氧(道4)下培養(yǎng)的MDA-MB-231細胞的CM中檢測到等量的分泌Hsp90 a (secreted Hsp90a)。本 申請人:發(fā)現(xiàn)細胞中的去調(diào)控HIF-1 a導致Hsp90 a的結構性分泌。在圖2B中示出，雖然在Lac-Z-RNAi感染的MDA-MB-231細胞中結構性Hsp90 α分泌保持不受影響(a，道I )，但是從HIF-1 α -或HIF-1 β -下調(diào)的MDA_MB_231細胞的CM中無法檢測到分泌的Hsp90 a (a，道2，道3)。這種抑制的出現(xiàn)是特異性的，因為在相同的條件下，MMP9的分泌反而增加(b，道2和3對道I)。本 申請人:指出，與細胞內(nèi)蛋白質(zhì)(如作為細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)的肌動蛋白或GAPDH)不同，對分泌的蛋白質(zhì)負載對照標記的可靠性有限。通過取出等量的來自相同條件下培養(yǎng)的相同數(shù)量細胞中的CM來證明CM的等負載量。為了進一步驗證HIF-Ια作用的特異性，本 申請人:進行了在內(nèi)源性HIF-1a-耗盡的MDA-MB-231細胞的HIF-1 α基因挽救實驗。如圖2C所示， 申請人:外源性重新引入野生型(wt)和結構性活性(CA)的HIF-1a到這些細胞中，通過抗_HIF_1 α抗體免疫印跡分析進行檢測(面板a，道2和3對道I)。由于DN-HIF-Ια在大多數(shù)商業(yè)化抗HIF_1 a抗體識別區(qū)域中具有大的缺失(20)，所以 申請人:反而利用抗-HA標記抗體印跡法證明了 34-kDaDN-HIF-1 α的表達(面板b，道4)。從這些細胞的CM中，本 申請人:發(fā)現(xiàn)只有wt-HIF_l α和CA-HIF-1 α能夠挽救Hsp90 α的分泌(面板c，道2和3對道I )，但不適用于DN_HIF_1 α(道4)。這些結果表明，分泌的Hsp90a是去調(diào)控HIF-1 α的直接下游靶點。更重要的是，wt-HIF-1 α和CA-HIF-1 α，但不是DN_HIF_1 α，也能夠挽救內(nèi)源性HIF-1 α -耗盡細胞的細胞遷移性缺陷(圖7)。
[0121]接著，本 申請人:試驗分泌的Hsp90a是否介導去調(diào)控HIF_1 a驅(qū)動的MDA_MB_231細胞遷移和侵襲。本 申請人:采取利用抗分泌的(非細胞內(nèi)的)Hsp90a的中和抗體的途徑。為了測試細胞遷移性，本 申請人:切換使用膠體金遷移試驗，因為該試驗測量單個細胞(而不是細胞群)的遷移，并且與自分泌信號機`制的研究特別相關。如圖2D所示，MDA-MB-231細胞即使在無血清條件下也已經(jīng)表現(xiàn)出強烈的遷移性(面板a)。加入對照IgG影響不大(面板b對面板a)。然而，在培養(yǎng)基中加入增加量的抗Hsp90a中和抗體以劑量依賴方式降低MDA-MB-231細胞的結構性遷移性(面板c至e)。加入過量的重組Hsp90 a蛋白逆轉(zhuǎn)由中和抗體導致的細胞遷移抑制(面板f)。更令人信服的是，相同的中和抗體也阻礙MDA-MB-231細胞侵襲滲透基底膜屏障的能力。如圖2E所示，與單獨的培養(yǎng)基(面板a)和具有對照IgG的培養(yǎng)基(面板b)相比，加入增加量的抗體以劑量依賴方式阻止MDA-MB-231細胞的侵襲(面板c至e)。而且，加入過量的重組Hsp90a蛋白逆轉(zhuǎn)由抗Hsp90a抗體導致的MDA_MB_231細胞侵襲的抑制(面板f)。這些發(fā)現(xiàn)通過藥理學途徑得到進一步確認。如圖8所示，用通過外切體蛋白質(zhì)交通路徑(8)的蛋白質(zhì)分泌特異性抑制劑二甲基阿米洛利(DMA)處理細胞，以劑量依賴方式阻止Hsp90a分泌(A，道3對道I)和MDA-MB-231細胞的侵襲(B，面板d、e、f)。與之相反,經(jīng)典的ER-Golgi蛋白質(zhì)交通路徑抑制劑(8)布雷菲德菌素A (BrefeldinA，BFA)表現(xiàn)出對Hsp90a分泌(A，道2對道I)或細胞侵襲(B，面板c)幾乎沒有影響?？偠灾?，歸納為去調(diào)控HIF-1 α控制Hsp90a分泌，并且在沒有任何外源性生長因子的情況下利用分泌的Hsp90 α促進乳腺癌細胞遷移和侵襲。
[0122]實施例4
[0123]腫瘤細胞與正常細胞中儲存的Hsp90a的比較
[0124]從中引用了廣泛使用的說法“1-2%的總細胞蛋白質(zhì)”的三篇原始報告包括摘要和兩篇研究論文(5，14，40)。本 申請人:無法確認該說法的由來。這些出版物均沒有包含任何直接支持這種說法的數(shù)據(jù)。事實上，這些報告中甚至沒有提出這種說法。因為這對于理解腫瘤細胞含有多少Hsp90a是關鍵的，因此本 申請人:采取多步驟方式在四種正常細胞和四種癌細胞中重建相對于總細胞蛋白質(zhì)的Hsp90 a蛋白質(zhì)量(％)。I)本 申請人:使用一系列已知量的牛血清白蛋白(BSA，?55kDa)建立0.D.讀數(shù)對實際蛋白質(zhì)量(μ g)的標準曲線。2)對增加體積的給定細胞類型的總后核提取物進行0.D.讀數(shù)，然后根據(jù)標準曲線將該讀數(shù)轉(zhuǎn)換成蛋白質(zhì)Ug數(shù)。3)對這些具有已知μ g蛋白質(zhì)的細胞提取物和一系列已知Ug的重組人Hsp90a蛋白質(zhì)利用單克隆抗Hsp90 a抗體并行進行SDS-PAGE和Western印跡分析。注=SDS-PAGE電泳的整個過程、轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上、印跡法、一次抗體、二次抗體、洗滌和對給定細胞類型的兩組樣本的ECL反應均在常用的設備、容器和相同的曝光盒中操作，操作時間完全相同。4)如圖3所示，對來自細胞溶解產(chǎn)物和重組Hsp90 a的Hsp90 a蛋白質(zhì)條帶進行具有相同的參數(shù)設定的光密度掃描(Alpha Innotech Fluorchem SP)。本 申請人:隨后使用重組Hsp90a條帶的掃描讀數(shù)建立測量密度法讀數(shù)對重組Hsp90 a蛋白實際量(μ g)的第二標準曲線。6)利用該標準曲線，將來自總細胞提取物的Hsp90 a條帶的掃描讀數(shù)轉(zhuǎn)換成蛋白質(zhì)的量(μ g)。7)最后，將給定體積的細胞提取物中的Hsp90 a量(μ g)除以來自相同提取物的總蛋白質(zhì)(μ g)XlOO=給定細胞類型的總蛋白質(zhì)中的Hsp90 a %。來自至多8組Hsp90 a的計算數(shù)平均值:采取細胞提取物對作為給定細胞類型的Hsp90 a的最終估計值％ (表I)。本 申請人:發(fā)現(xiàn)I)在測試的正常細胞中，Hsp90 a蛋白質(zhì)占總細胞蛋白質(zhì)的2-3%，并且在特定腫瘤細胞系中至多達到7%，以及2)在所有癌細胞中Hsp90 a的細胞內(nèi)水平相對于其正常對應物沒有 升高，例如在MDA-MB-231和HBL-100細胞之間的Hsp90 a差異。
[0125]表I在正常細胞與腫瘤細胞中Hsp90a的估計百分數(shù)*
[0126]
_ 正常細胞__癌細胞 _
名稱__來源 Hsp90a%____來源 Hsp90a%
HKC 人角質(zhì)形 2.35% ±SCC-12 Scrrnwm3.29% 士 °.81
成細胞0.26癌
MC 人黑素細 2.25% ±M 24人H色素 6.76% ± I 06
胞0.62、
HDF 人皮膚成 2.33% ±A4314.53% 士 0.70
/才 ^IXmm
__纖維細胞 0.16____
HBL-100 人乳腺上 3.47% ± MDA-MB-231 人孚識產(chǎn) 3.66% 士 0.21
_ 皮細胞0.24 ___[0127]*每個細胞系的數(shù)據(jù)(％)是三個獨立實驗的計算結果(即，從細胞培養(yǎng)到密度法)。在細胞溶解產(chǎn)物(含有不同分子量的蛋白質(zhì))中的總蛋白質(zhì)量是估計值，因為標準曲線是用單一的55-kDa蛋白質(zhì)(BSA)制備的。根據(jù)低于p〈0.05的統(tǒng)計顯著性，HK與SCC之間和在HBL-100與MDA-MB-231之間的差異并不顯著。
[0128]實施例5
[0129]對于介導去調(diào)控HIF-Ια驅(qū)動的侵襲關鍵的分泌Hsp90 α中治療表位的識別
[0130]為了識別分泌Hsp90 α中的治療祀點，本 申請人:使用系統(tǒng)誘變以縮小人Hsp90 α中的最小功能表位。最初，生成8個重組Hsp90a肽并在無血清條件下測試細胞遷移刺激。8個肽中的5個(FL、F-2、F-5、F-7和F-9)保留了不同程度的全長度Hsp90 α的充分促遷移性，它們示意性地示于圖4Α中并且這些肽的純度用SDS-PAGE進行分析，如圖4Β所示。F-9是27個氨基酸的合成肽(太小以至在SDS凝膠上不能顯示)。由于內(nèi)源性HIF-Ια的下調(diào)阻止Hsp90 α的分泌和MDA-MB-231細胞的基底膜侵襲，所以本 申請人:合理地認為功能肽的補充應該繞過HIF-1下調(diào)的阻斷并挽救細胞的侵襲缺陷。這種挽救方法應該使我們識別分泌Hsp90 α中的最小表位。如圖4C所示，親代和對照的LacZ-RNAi感染的MDA-MB-231細胞表現(xiàn)出強侵襲(面板a和b)，而HIF-1 α -下調(diào)的MDA-MB-231細胞無法侵襲(面板C)。補充BSA不能挽救該侵襲缺陷(面板d)。然而，F(xiàn)L、F-2和F-5在其預定最優(yōu)濃度下能夠部分地挽救細胞的侵襲缺陷(面板e-g)。與之相反，F(xiàn)-7 (面板h)和F-9 (數(shù)據(jù)未示出)表現(xiàn)出極少的挽救作用，即使它們?nèi)匀槐Ｓ酗@著的促遷移活性也是如此。如圖4D所示，定量的數(shù)據(jù)說明FL、F-2和F-5同等有效(條柱e、f、g)。F-7幾乎不能挽救(條柱h)。在HIF-1 β -下調(diào)的MDA-MB-231細胞中獲得了類似的結果，其中F-5挽救了細胞的侵襲缺陷(圖9)。為了進一步確認這些肽的挽救機理是繞過HIF-1 α下調(diào)的阻斷，本 申請人:發(fā)現(xiàn)補充F-5不能挽救具有下調(diào)LRP-1 (細胞外Hsp90 α信令的受體(8、42))的MDA-MB-231細胞的侵襲缺陷。如圖4E所示，本 申請人:實現(xiàn)了通過FG-12系統(tǒng)的幾乎完全的LRP-1下調(diào)(道2對道1)，這導致細胞侵襲性急劇下降(圖4F，面板b對與面板a)。加入F-5不能挽救由于LRP-1下調(diào)導致的侵襲缺陷(面板C)。
[0131]實施例6
[0132]Hsp90 α自分泌信號中斷阻止乳腺癌細胞的肺定植和腫瘤形成
[0133]乳腺癌對各種二級器官的定植取決于腫瘤細胞和基質(zhì)微環(huán)境之間的有效相互作用。裸鼠的肺定植試驗是測試腫瘤細胞的這些能力的公認模型。目前，缺乏針對體內(nèi)分泌Hsp90 α活動的有效和特異性的抑制劑。整個Hsp90a的基因敲減不會區(qū)分細胞內(nèi)和細胞外的Hsp90a。注射不可透過膜的葛爾德霉素(GM)類抑制劑是不穩(wěn)定的并且對動物有毒，藥物一旦加入循環(huán)就很難區(qū)分藥物的直接與間接的影響(39)。考慮到這些限制，本 申請人:采取靶向分泌Hsp90 a的信號LRP-1受體的直接下游步驟。FG-12系統(tǒng)用于對MDA-MB-231細胞中的LRP-1進行永久性敲減。如圖5A所示，在注射前24小時，在確切的MDA-MB-231細胞中驗證幾乎完全下調(diào)的LRP-l(a、道2對道I)。此外，本 申請人:發(fā)現(xiàn)，雖然MDA-MB-231和其它一些細胞系均顯示LRP-1陽性，但是MDA-MB-468乳腺癌細胞失去了 LRP-1表達(圖5B，道4)。然而，與MDA-MB-231細胞一樣，MDA-MB-468細胞也保持結構性HIF-1 α表達和結構性Hsp90a分泌(圖5C，面板a和C)。因此，本發(fā)明人將MDA-MB-468細胞列為天然存在的LRP-1-空細胞。這些細胞系都是預先設計的以穩(wěn)定表達熒光素酶基因，并通過尾靜脈注射到SCID小鼠的循環(huán)系統(tǒng)中。如圖所示，在經(jīng)過對所有三種細胞系(面板1、7和13)的最初肺回巢觀察后，大部分細胞在后續(xù)4周變得可微弱檢測到或檢測不到(面板2和3 ;8和9，14和15)。然后，在7只小鼠/組中的6只在注射后約42天，載體感染的MDA-MB-231細胞恢復發(fā)展肺內(nèi)腫瘤(面板4-6)。與之相反，LRP-1-敲減的MDA-MB-231細胞表現(xiàn)出大大下降的肺定植能力(面板10、11、12)，這只發(fā)生在7只小鼠/組中的2只中。MDA-MB-468細胞表現(xiàn)出在所有小鼠中極少的肺轉(zhuǎn)移。當在70天解剖小鼠時，本 申請人:發(fā)現(xiàn)僅在注射有載體-MDA-MB-231的小鼠的肺中發(fā)現(xiàn)可見的腫瘤，但在注射有LRP-1-敲減MDA-MB-231細胞或MDA-MB-468細胞的小鼠的肺中沒有發(fā)現(xiàn)可見的腫瘤。貫穿整個肺組織的切片的蘇木精和伊紅染色(H & E)，如圖5E所示，示出在注射有載體-MDA-MB-231 (a和b)的小鼠的肺中具有大的侵襲腫瘤，在注射有LRP-1-敲減MDA-MB-231細胞(c和d)的小鼠的肺中腫瘤尺寸和數(shù)目遠遠較小，并且在注射有MDA-MB-468細胞(e和f)的小鼠的肺中沒有可見的腫瘤。這些數(shù)據(jù)的定量化示于圖5F中。LRP-1 (也稱為⑶91)是大的異三聚體蛋白，其由515kDa的細胞外結構域和85-kDa的跨膜亞基(17)組成。除了 Hsp90a外，其它一些細胞外熱休克蛋白被報道也結合LRP-1，包括分泌的鈣網(wǎng)蛋白(CRT)、gp96和Hsp70 (2)。因此，LRP-1-敲減對腫瘤形成的作用不必然證明腫瘤形成減少是特異性地由于分泌的Hsp90 a的經(jīng)LRP-1的信號阻斷所致。為了解決這個問題，本 申請人:測試了重組HSP70、gp96和CRT是否促進細胞遷移，以及它們 是否能如同Hsp90 a那樣挽救HIF-1 a -下調(diào)的MDA_MB_231的侵襲缺陷。在遷移和侵襲試驗二者中，Hsp70、gp96和CRT表現(xiàn)出有限的效果(圖10)?？偠灾@些發(fā)現(xiàn)支持以下假設，即“HIF-1〉分泌Hsp90 a >LRP_1”自分泌循環(huán)在去調(diào)控HIF-1 a -驅(qū)動的腫瘤進程中起著關鍵作用。
[0134]實施例7
[0135]討論
[0136]乳腺癌影響美國約九分之一的婦女，是最常見的女性惡性腫瘤(30)。乳腺癌傳統(tǒng)上根據(jù)其顯微外觀和生長行為分為幾個得到確認的腫瘤類型。例如，乳腺癌的激素狀態(tài)包括雌激素受體(ER)陽性(生長依賴于雌激素)、孕激素受體(PR)陽性(生長依賴于孕激素)和激素受體(HR)陰性(沒有激素受體，所以它的生長并不需要激素)。疾病死亡率在過去十年中已小幅下降，這是由于有多種治療選擇:手術、放療、內(nèi)分泌治療和化療。然而，乳腺癌專家對目前的治療(如激素受體陽性乳腺癌對內(nèi)分泌治療的抗性)的副作用和不可持續(xù)的結果具有越來越多的挫折感。現(xiàn)在很清楚，每種乳腺癌在基因上都是獨一無二的。許多個體腫瘤之間的基因差異影響癌癥復發(fā)的可能性。這些差異部分地與不同組別的癌癥相關基因的表達相關聯(lián)(27)。因此，迫切需要找出更多的共同標志物用于診斷和治療。
[0137]Dales等人對745份乳腺癌樣本冰凍切片進行了抗HIF-1 a免疫組化檢測并發(fā)現(xiàn)在淋巴結陰性和淋巴結陽性的患者中HIF-1 a的表達水平與預后差、總存活率下降和高轉(zhuǎn)移風險相關(10)。利用HIF-1 a表達作為標志物，估計所有浸潤性乳腺癌樣本中的約25-40%是缺氧的，這表明HIF-1 a可作為乳腺癌的更廣泛標志物。在目前的研究中，本 申請人:已經(jīng)識別出在乳腺癌細胞中HIF-1 a的關鍵下游效應物，即分泌的Hsp90a。此外，本 申請人:已確定在Hsp90a中的115-氨基酸肽F-5對于HIF-1 a-介導的乳腺癌細胞侵襲是必要的和充分的。本 申請人:提出Hsp90a的F-5區(qū)域可證明用于治療乳腺癌患者是更有效且毒性更低的。這個假設是基于過去7年的研究。Li等人表明正常皮膚成纖維細胞在常氧下不分泌Hsp90 α并且在缺氧下分泌Hsp90 α (19)。Eustace等人表明腫瘤細胞結構性地分泌Hsp90a (12)?；谶@些發(fā)現(xiàn)，本 申請人:進一步提出將抗癌策略從靶向細胞內(nèi)Hsp90 a如通過17-AAG轉(zhuǎn)移到靶向F-5區(qū)域的分泌Hsp90 a。整個假設示意性地總結在圖6中。
[0138]多年來，毒性與療效是在靶向細胞內(nèi)Hsp90的ATP酶即17-AAG及其衍生物的抗癌藥物的臨床試驗中長期存在的挑戰(zhàn)。這些抑制劑需要選擇性地傷害嵌入在正常組織中的癌細胞中的過度活性或過表達的Hsp90a，同時盡量減少對周圍正常細胞中的Hsp90的生理伴侶功能的任何損害。與之相反，尚未報道需要通過細胞分泌Hsp90 a的生理過程(基因表達、代謝、增殖和發(fā)展)。相反，Hsp90a的分泌似乎是正常細胞對于環(huán)境損傷如組織損傷、缺氧和輻照的“緊急響應”。然而，癌細胞中的基因改變利用結構性表達的HIF-1 a觸發(fā)Hsp90 a分泌并利用分泌的Hsp90a來處理其它對于正常細胞不適宜的環(huán)境(7)。因此，本 申請人:提出，選擇性靶向F-5表位的新抗癌藥物要達到更高的療效和對癌癥患者較低的毒性。
[0139]分泌的Hsp90a的下游祀點是什么？ Eustace和同事們報道，Hsp90 a而不是Hsp90 β通過結合和激活基質(zhì)金屬蛋白酶2 (ΜΜΡ2)來促進腫瘤細胞的遷移和侵襲(12)。Sidera和同事們表明，在乳腺癌細胞中細胞膜結合的Hsp90 α池與HER-2酪氨酸激酶受體相互作用，從而導致ΜΜΡ2活化、細胞遷移和侵襲增加(31)。近來，Gopal和同事們報道，在膠質(zhì)母細胞瘤細胞侵襲過程中，細胞外Hsp90a刺激LRP-1與EphA2受體的結合(15)。Cheng等人利用四種獨立方法(中和抗體、RAP抑制劑、RNAi和體細胞LRP-1陰性突變細胞系)以表明廣泛表達的細胞表面受體LRP-1介導了細胞外Hsp90 a信號(8)。在目前的研究中，本 申請人:表明Hsp90 a不能刺激體外LRP-1-下調(diào)MDA-MB-231細胞的遷移和侵襲，與Song等人的體外膠質(zhì)母細胞瘤細胞遷移和侵襲需要LRP-1的報道相一致(34)。此外，LRP-1-下調(diào)MDA-MB-231或LRP-1-空MDA-MB-468細胞表現(xiàn)出急劇減少的肺定植和體內(nèi)腫瘤形成。理解每個靶蛋白如何對Hsp90a刺激的侵襲作出貢獻將需要在一個共同的細胞系統(tǒng)中同時研究這些分子。
[0140]盡管存在各種實驗方法，但是分泌的Hsp90 a在體內(nèi)腫瘤進展中的作用的揭示可能仍然需要更加穩(wěn)定和特異性的抑制劑`的可用性。Tsutsumi和同事們利用DMAG-N-氧化物、葛爾德霉素/17-AAG-衍生的和不透過細胞膜的Hsp90抑制劑預處理黑色素瘤細胞，以阻止位于細胞外的Hsp90 a，然后將它們注射到裸鼠中。他們報道，經(jīng)DMAG-N-氧化物處理的細胞表現(xiàn)出體外細胞遷移和侵襲下降以及體內(nèi)肺定植減少(39)。這種方法存在幾個限制。首先，17-AAG結合并抑制Hsp90的ATP酶活性。然而，Cheng等人已經(jīng)證明，ATP酶結構域?qū)τ贖sp90的細胞外活動是非必要的(8)。因此，17-AAG的抑制作用不是細胞外Hsp90的功能性表位的直接抑制。其次，很難理解藥物對體外細胞的單一前處理(由于藥物結構在體內(nèi)不穩(wěn)定)如何可在細胞注射到小鼠體內(nèi)后具有所報道的持久效果。Patsavoudi和同事們報道，單克隆抗體4C5在體外中和分泌的Hsp90a和Hsp90 β的發(fā)展。他們報道了黑素瘤或乳腺癌細胞與4C5在體外混合在細胞注射到小鼠體內(nèi)后，相比于與對照抗體混合，表現(xiàn)出肺定植減少(34，38)。然而，難以想象共同注射的4C5在多周實驗的整個時間段內(nèi)通過連續(xù)地結合和中和腫瘤細胞持續(xù)分泌的Hsp90a和Hsp90i3來起效。更加說得通的是，在注射腫瘤細胞之前，在循環(huán)系統(tǒng)中注射和建立穩(wěn)態(tài)量的4C5。本 申請人:表明，缺少LRP-1受體的乳腺癌細胞無法有效地在裸鼠體內(nèi)形成腫瘤。如前所述，下調(diào)LRP-1的作用可能不一定是由于特異性阻斷分泌的Hsp90 α的信號導致的，這是因為LRP-1可能潛在地結合其它身份不明的配體。因此，在分泌的Hsp90a中F-5表位的識別提供了用于設計新的、有效的且更特異性的抑制劑的優(yōu)異靶點，該抑制劑用于研究腫瘤分泌的Hsp90a的作用，甚至是其治療潛力。
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[0186]在申請遞交時本 申請人:已知曉本發(fā)明的各個實施方案，前文描述了該些實施方案并且旨在用于說明和描述的目的。本說明書并非意在窮舉，也不將本發(fā)明限制為所公開的具體形式，在前述教導的啟示下能夠獲得本發(fā)明的許多改進方案和變化方案。所描述的實施方案用于解釋本發(fā)明的原理及其實際應用，以使本領域的其它技術人員能夠以不同的實施方案來實施本發(fā)明，并針對特`定的預期應用進行各種適當?shù)母倪M。因此，本發(fā)明意圖不限于實施本發(fā)明所公開的特定實施方案。
[0187]雖然本發(fā)明的特定實施方案已經(jīng)示出和描述，但本領域技術人員清楚的是，根據(jù)本文的教導，可以在不偏離本發(fā)明及其更寬的范圍的情況下進行修改和改進。本領域技術人員將會理解，通常本文所用的術語一般意圖為“開放式”術語(例如，術語“包括”應解釋為“包括但不限于”，術語“具有”應該被解釋為“至少具有”，術語“包括”應解釋為“包括但不限于”等)。
【權利要求】
1.一種分離肽，包含在 SEQ ID N0.3,SEQ ID N0.4,SEQ ID N0.5 或 SEQ ID N0.6 中列出的序列。
2.一種編碼如權利要求1所述的肽的核酸分子。
3.如權利要求2所述的cDNA分子。
4.一種載體,包含如權利要求3所述的cDNA分子。
5.—種宿主-載體系統(tǒng),包括轉(zhuǎn)染到相容性宿主細胞中的如權利要求4所述的載體。
6.如權利要求5所述的宿主-載體系統(tǒng),其中所述相容性宿主細胞是原核細胞或真核細胞。
7.一種抗體，其識別并結合表位，所述表位包含在SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ IDN0.5和/或SEQ ID N0.6中列出的序列。
8.如權利要求7所述的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體或其片段、多克隆抗體或其片段、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體或單鏈抗體。
9.一種藥物組合物，包括如權利要求7所述的抗體和藥物載體。
10.一種疫苗,包含如權利要求1所述的分離肽。
11.一種用于治療在有此需要的對象中HIF-1 α過表達癌癥的方法，包括: Ca)提供包含Hsp90 α抑制劑的組合物；和 (b)將治療有效量的所述組合物施用于所述對象以治療所述對象中的HIF-1-陽性癌癥。
12.—種用于抑制在有此需要的對象中HIF-1 α過表達癌癥的方法，包括: Ca)提供包含Hsp90 α抑制劑的組合物；和 (b)將治療有效量的所述組合物施用于所述對象以抑制所述對象中的HIF-1-陽性癌癥。
13.一種用于防止在有此需要的對象中HIF-Ια過表達癌癥轉(zhuǎn)移的方法，包括: Ca)提供包含Hsp90 α抑制劑的組合物；和 (b)將治療有效量的所述組合物施用于所述對象以防止所述對象中HIF-1-陽性癌癥的轉(zhuǎn)移。
14.如權利要求11、12或13所述的方法，其中所述Hsp90a抑制劑靶向如在SEQIDN0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5 和 / 或 SEQ ID N0.6 中列出的 Hsp90 a 的氨基酸。
15.如權利要求11、12或13所述的方法，其中所述Hsp90a抑制劑選自小分子、肽、抗體或其片段以及核酸分子。
16.如權利要求11、12或13所述的方法，其中所述Hsp90a抑制劑是Hsp90a受體的抑制劑并且選自小分子、肽、抗體或其片段或核酸分子。
17.如權利要求15或16所述的方法，其中所述核酸分子是siRNA分子。
18.如權利要求15或16所述的方法，其中所述抗體選自單克隆抗體或其片段、多克隆抗體或其片段、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體和單鏈抗體。
19.一種用于在有此需要的對象中HIF-1a過表達癌癥的治療、抑制或防止轉(zhuǎn)移的方法，包括: Ca)提供包括致敏抗原呈遞細胞的組合物，其中所述抗原呈遞細胞被具有在SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:5中列出的氨基酸序列的肽所敏化，和 (b)將治療有效量的所述組合物施用于所述對象以實現(xiàn)所述對象中HIF-1 α -過表達癌癥的治療、抑制或防止轉(zhuǎn)移。
20.如權利要求11、12或13任一項所述的方法，其中所述Hsp90a抑制劑經(jīng)靜脈注射、肌肉注射、腹腔注射、口服或經(jīng)吸入給藥。
21.如權利要求11、12或13任一項所述的方法，其中所述Hsp90a或其片段的抑制劑的治療有效量為大約 l_5mg/ 天、5-10mg/ 天、10_50mg/ 天、50_100mg/ 天、100_150mg/ 天、150_200mg/ 天、100-200mg/ 天、200-300mg/ 天、300-400mg/ 天、400-500mg/ 天、500-600mg/天、600-700mg/ 天、700-800mg/ 天、800_900mg/ 天、900_1000mg/ 天、1000-1 IOOmg/ 天、1100-1200mg/ 天、1200-1300mg/ 天、1300-1400mg/ 天、1400-1500mg/ 天、1500-1600mg/ 天、1600-1700mg/ 天、1700_1800mg/ 天、1800_1900mg/ 天、1900_2000mg/ 天、2000_2100mg/ 天、2100-2200mg/ 天、2200-2300mg/ 天、2300-2400mg/ 天、2400-2500mg/ 天、2500-2600mg/ 天、2600-2700mg/ 天、2700-2800mg/ 天、2800-2900mg/ 天或 2900-3000mg/ 天。
22.—種識別Hsp90a抑制劑的方法，包括: (i)使Hsp90a陽性細胞中的Hsp90a接觸目標分子，以及 (ii)確定所述接觸是否減少或抑制Hsp90a與其受體的結合，結合的減少或抑制指示所述目標分子是Hsp90 a抑制劑。
23.—種識別Hsp90a抑制劑的方法，包括: (i)使LPR-1陽性細胞中的LPR-1接觸目標分子，以及 (ii)確定所述接觸是否減少或抑制Hsp90a與LPR-1的結合，結合的減少或抑制指示所述目標分子是Hsp90 a抑制劑。
24.如權利要求22或23所述的方法，其中所述Hsp90a抑制劑選自小分子、肽、抗體或其片段以及核酸分子。
25.根據(jù)權利要求22或23的篩選方法，其包括分別接觸多個待檢測樣本中的每一個。
26.如權利要求25所述的篩選方法，其中所述多個樣本包括超過約IO4個樣本。
27.如權利要求25所述的篩選方法，其中所述多個樣本包括超過約5X IO4個樣本。
28.如權利要求11、12或13所述的方法，其中所述對象選自人、非人類靈長類動物、猴、猿、狗、貓、牛、馬、兔、小鼠和大鼠。
29.一種用于在有此需要的對象中HIF-1a過表達癌癥的治療、抑制或防止轉(zhuǎn)移的試劑盒，包括: (i)包含Hsp90a抑制劑的組合物，和 (ii)將所述組合物用于HIF-1a過表達癌癥的治療、抑制或防止轉(zhuǎn)移的說明書。
【文檔編號】A61K38/16GK103429254SQ201180059944
【公開日】2013年12月4日 申請日期:2011年10月11日 優(yōu)先權日:2010年10月11日
【發(fā)明者】栗衛(wèi), 戴維·T.·伍德利, 陳梅 申請人:南加利福尼亞大學