專利名稱：受體拮抗劑趨化因子的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及新的tetramic酸型化合物、含有它們的藥物組合物和它們作為CCR-5拮抗劑治療人類免疫缺陷性病毒-1(″HIV-1″)感染的用途。本發(fā)明化合物從CCR-5活性復(fù)合物中分離出來，在控制條件下通過將生物純的微生物培養(yǎng)液(球毛殼霉Kunze SCH 1705 ATCC74489)發(fā)酵來制備復(fù)合物。
M.P.Singh等人在抗生素雜志，1998年十二月，51卷，12號1109-1112頁公開了新的由未知真菌制備的抗生素，它包括在二環(huán)烴骨架上帶有N-甲基tetramic酸部分的LL-49F233d。公開了這個(gè)抗生素對抗萬古霉素和甲氧西林的細(xì)菌有活性，但沒有公開對抗-HIV-1活性。
S.B.Singh等人在四面體雜志，39(1998)2243-2246頁公開了N-甲基tetramic酸的衍生物，從微生物的提取物中分離出來的equisetin和phomasetin為HIV-1整合酶的抑制劑。這兩篇文獻(xiàn)中都未公開本發(fā)明化合物。
A-M.Vandamme等人在抗病毒的化學(xué)和化學(xué)療法，9187-203頁(1998)公開了，現(xiàn)代臨床上治療人類HIV-1感染的方法包括至少三種藥聯(lián)合使用，或稱之為高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(″HAART″)；HAART包括各種的核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(″NRTI″)、無核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(″NNRTI″)和艾滋病病毒蛋白酶抑制劑(″PI″)聯(lián)合使用。在適用的首次用藥的病人中，HAART有效地減少了死亡率和抑制了HIV-1向愛滋病的發(fā)展。然而這種多種藥物療法沒有除去HIV-1，長期治療會導(dǎo)致對多種藥抗性。發(fā)展治療HIV-1的新藥仍然是重點(diǎn)。
人們已經(jīng)認(rèn)識到CCR5趨化因子受體是HIV-1進(jìn)入細(xì)胞的共同受體。因此，妨礙CCR5受體和HIV-1相互作用的CCR5拮抗劑，可以阻止HIV-1進(jìn)入細(xì)胞。
毫無疑問，HIV-1，即愛滋病病原體(AIDS)引起了全球的健康危機(jī)，雖然延緩愛滋病發(fā)展的藥物療法已經(jīng)取得成功，但仍然需要尋找新藥療法來控制HIV-1感染。
發(fā)明概述本發(fā)明包括具有識別球毛殼霉Kunze特征的球毛殼霉Kunze SCF1705，ATCC 74489和它們的突變株和變體。
本發(fā)明另外提供了CCR5活性的復(fù)合物，在pH和溫度控制介質(zhì)中，有碳和氮源的有氧條件下，通過培養(yǎng)生物純的具有識別球毛殼霉KunzeATCC 74489特征的球毛殼霉Kunze SCF 1705得到復(fù)合物，直到該組合物具有抗HIV-1活性。
本發(fā)明也涉及CCR5活性復(fù)合物的基本上化學(xué)純的三個(gè)組分，或它們藥學(xué)上可接受的鹽。即由式I、II和III代表的化合物。2頁圖 或 本發(fā)明涉及化合物式I、II或III的用法，它們可以作為CCR5的拮抗劑單獨(dú)治療，或與pegylated干擾素-α一起使用，治療病人的免疫缺陷病毒1型的感染。
本發(fā)明也涉及治療所有艾滋病病毒-1感染病人的方法，將有效治療量的HAART和有效治療量的化合物式I、II或III聯(lián)合使用，來降低HIV-1-RNA。
本發(fā)明也涉及治療所有艾滋病病毒-1感染病人的方法，將有效治療量的pegylated干擾素-α和有效治療量的化合物式I、II聯(lián)合使用，來降低艾滋病病毒HIV-1-RNA。
本發(fā)明也提供了治療HIV-1感染小兒科病人的方法，它包括將治療有效量的pegylated干擾素-α與治療有效量的CCR5拮抗劑式I、II或III化合物聯(lián)合使用。
本發(fā)明也提供了治療感染了HIV-1和HCV病人的方法，它包括將治療有效量的pegylated干擾素-α與治療有效量的病毒唑和治療有效量的HAART和治療有效量的CCR5拮抗劑聯(lián)合使用，即基本上化學(xué)純式I、II或III化合物或它們藥學(xué)上可接受的鹽。 圖的簡要說明

圖1-9詳細(xì)說明了生物純培養(yǎng)球毛殼霉Kunze SCF 1705在synthetischer nrstoffrmer瓊脂(SNA)上生長。
圖1顯示了通過復(fù)式顯微鏡看到的在子囊殼上盤繞的菌絲。
圖2顯示了在復(fù)式顯微鏡下的單個(gè)子實(shí)體，顯示了由卷曲的和直的菌絲覆蓋的子囊殼。
圖3顯示了實(shí)體在濾紙上生長。
圖4和5顯示了解剖顯微鏡下的單個(gè)子囊殼，顯示了灰色卷曲菌絲覆蓋的黑色子囊殼。
圖6顯示了從子囊殼上浮起的孢子的黑色觸毛。
圖7顯示了在高倍解剖顯微鏡下看到的在子囊殼上盤繞的菌絲。
圖8顯示了卷曲菌絲和結(jié)晶狀的外殼的詳細(xì)情況。
圖9顯示了具有檸檬形狀和終端有單個(gè)氣孔的子囊孢子。
發(fā)明的詳細(xì)說明微生物用于制備CCR5-活性復(fù)合物和式I、II和III化合物的微生物為生物學(xué)純的球毛殼霉Kunze SCF 1705，ATCC 74489。
這個(gè)微生物的培養(yǎng)物放置(于1999年4月21日)在美國標(biāo)準(zhǔn)菌庫(ATCC)10801 Blvd.大學(xué)，Manassas，VA 20110-2209，它的登記號為ATCC 74489。從培養(yǎng)物保藏之日起30年期間，或在最后要求培養(yǎng)物保藏的5年之后，或有由這個(gè)申請引發(fā)的專利有效使用期內(nèi)，如果保藏的培養(yǎng)物丟失、破壞或者不能存活，由申請人或本申請的受讓人來替換培養(yǎng)物。在審理這個(gè)申請期間，當(dāng)專利與商標(biāo)的助理官員在37CFR 1.14和35USC 122條款下要求時(shí)可以得到此培養(yǎng)物，或在這個(gè)申請授予美國專利權(quán)后，公眾可以隨時(shí)得到。微生物的使用取決于美國專利法。
用于制備的微生物從托斯卡納亞利桑那州收集的常綠植物的葉子樣品中分離得到，它是一種未經(jīng)確認(rèn)的真菌。已經(jīng)表征和發(fā)現(xiàn)它具有毛殼屬微觀的、宏觀的和whole cell hydrolysia性質(zhì)。
用于制備的球毛殼霉Kunze SCF 1705 ATCC 74489菌株的說明。形態(tài)學(xué)形態(tài)學(xué)觀測用于制備菌株，它為在SNA(Synthetischernhrstoffrmer瓊脂)的標(biāo)準(zhǔn)化瓊脂上生長的球毛殼霉SCF 1705，瓊脂配制如下KH2PO41.0g，KNO31.0g，MgSO4.7H2O 0.5KCI 0.5g葡萄糖 0.2g蔗糖0.2g瓊脂20.0gdH2O 1000mL在瓊脂固化后，將無菌的濾紙碎片(大約5cm直徑)鋪在表面。圖的詳細(xì)說明室溫下(12小時(shí)黑暗12小時(shí)光照循環(huán)，用近紫外和熒光等混合控制)10天之后，在SNA上的生長出50-70mm直徑的菌群，在表面四處散布著子囊殼(有性的實(shí)體)(參見圖3)，抽提邊緣的酵母和濾紙的邊緣，看到模糊的同心環(huán)向外擴(kuò)展，沒有或難以覺察到氣生菌絲體和沉侵的未染色的菌絲體。子囊殼(參見圖2，4和5)在表面，容易從底物上脫落，單個(gè)散布或連續(xù)地聚集，表面看是橄欖色的，但是事實(shí)上是被直的和卷曲的淺灰色的菌絲所覆蓋，它們超出子囊殼壁300-400uM，形成了橄欖色和多毛的出現(xiàn)，包括表面的毛狀物有700-1250uM長和700-1100uM寬，而除去表面的菌絲有大約300-600×125-350uM。在視圖表面變暗的孢囊被(子囊殼的壁)由褐色細(xì)胞的表層組織(類似于拼板玩具的排列)構(gòu)成，該細(xì)胞有2.5-4uM寬，具有微不規(guī)則的、微厚的壁。菌絲以兩種方式覆蓋著孢囊被，兩者都具有分散的隔膜；第一種是從子囊殼表面直接伸出來；第二種成螺旋形卷曲，有2.5-3.5uM寬(參見圖表1和7)，具有均勻略微增厚并覆蓋有細(xì)小晶體的壁，這樣表面形狀為尖刺狀的和有突起的(參見圖8)。沒有觀察到Asci(包含孢子的結(jié)構(gòu))，假定為已經(jīng)溶解。子囊孢子(有性孢子)，9.5-10.5×8-9uM，橢圓的類似檸檬形狀，橄欖色的，具有平滑的稍微變厚的壁，在一個(gè)終端有大約1uM的氣孔(參見圖9)。子囊孢子聯(lián)合成喇叭狀，為稱之為chirrhi的黑色的集結(jié)(圖6)，有300uM長和50-125uM寬。
術(shù)語″它們藥學(xué)上可接受的鹽″在這里指，式I-III化合物和藥學(xué)上可接受的堿形成的鹽。
在本發(fā)明中藥學(xué)上可接受的堿是適合于與式I、II或III化合物形成藥學(xué)上可接受鹽的化合物，包括適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)和無機(jī)堿。適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)堿主要包括，伯烷基胺、仲烷基胺和叔烷基胺、烷醇胺、芳香族胺、烷基芳香族胺和環(huán)胺。有機(jī)胺的例子包括選自下述的藥學(xué)上可接受的堿，氯普魯卡因、普魯卡因、哌嗪、葡糖胺、N-甲基葡糖胺、N，N-二甲基葡糖胺乙二胺、二乙醇胺、二異丙胺、二乙胺、N-芐基-2-苯乙胺、N-N′-二芐基乙二胺、膽堿、克立咪唑、三(羥甲基)氨基甲烷或右旋葡糖胺。優(yōu)選的有機(jī)堿包括N-甲基葡糖胺(″NMG″)、二乙醇胺和三(羥甲基)氨基甲烷(″TRIS″)。
據(jù)報(bào)道，CCR5基因在抗HIV感染中起著重要的作用。HIV感染是首先通過與細(xì)胞的受體CD4和從屬的趨化因子共同受體分子相互作用，將病毒附著到靶細(xì)胞膜上，然后通過血及其他組織復(fù)制和傳播受感染細(xì)胞。有各種的趨化因子受體，但對于在體內(nèi)感染初期復(fù)制的致病菌株親巨噬細(xì)胞HIV來說，HIV-1進(jìn)入細(xì)胞的主要的趨化因子受體為CCR5。因此，干擾病毒CCR5受體和HIV-1相互作用，可以阻止HIV-1進(jìn)入細(xì)胞。
術(shù)語″CCR5拮抗劑化合物″和″CCR5拮抗劑″在這里指，妨礙病毒CCR5受體和HIV-1相互作用，阻止HIV-1進(jìn)入細(xì)胞的任何化合物。在這里進(jìn)行下述試驗(yàn)，例如CCR5膜結(jié)合試驗(yàn)、HIV-1進(jìn)入和HIV-1進(jìn)入復(fù)制試驗(yàn)，確定化合物可以作為CCR5拮抗劑和它具有CCR5拮抗劑活性。
治療HIV-1感染的病人的方法包括，將治療的有效量的CCR5拮抗劑式I、II或III化合物、治療有效量的pegylated干擾素-α聯(lián)合使用、或和治療有效量的至少一種病毒唑、干擾白細(xì)胞素-2(″IL-2″)、白細(xì)胞間介素-12(″IL-12″)和單獨(dú)的pentafuside聯(lián)合使用，或根據(jù)優(yōu)質(zhì)臨床規(guī)范將HIV-1RNA血漿水平降低到最少，和特別是HAART的抗HIV-1療法聯(lián)合使用。參見實(shí)例A.M.Vandamme等，抗病毒的化學(xué)和化學(xué)療法，9187-203(1998)和內(nèi)科雜志中，39卷(期號1015)″HIV感染的藥物″，1997年，十二月5日，111-116頁。本發(fā)明優(yōu)選的方案為，將pegylated干擾素α和式I到III的CCR5拮抗劑聯(lián)合，給感染HIV-1的病人使用，如果同時(shí)感染HIV-1和HCV，再聯(lián)合病毒唑和HAART。本發(fā)明的特征在于，pegylated干擾素α、CCR5拮抗劑式I到III和HAART的組合物分別在治療HIV-1中的作用機(jī)理不同。本發(fā)明另一個(gè)的特征在于，pegylanotherted干擾素α、式I到IIICCR5拮抗劑之間不互相抵觸，也不和HAART組合物抵觸。根據(jù)本發(fā)明開始使用治療有效量的pegylated干擾素α和病毒唑混合，之后使用結(jié)構(gòu)式I或II或III化合物的CCR5拮抗劑和HAART，之后，治療有效量的pegylated干擾素-α和CCR5拮抗劑式I、II或III化合物聯(lián)合使用。在本發(fā)明的具體實(shí)例中，治療HIV-1感染病人的方法包括2個(gè)治療周期。第一個(gè)治療周期為，將治療有效量的pegylated干擾素-α和CCR5拮抗劑化合物式I、II或III聯(lián)合使用，預(yù)處理一段時(shí)間來降低HIV-1-RNA血漿水平，與最初的HIV1-RNA血漿水平相比降低優(yōu)選10倍，更優(yōu)選至少100倍，即至少102。在第二個(gè)治療周期，繼續(xù)施用治療有效量的pegylated干擾素-α和CCR5拮抗劑結(jié)構(gòu)式I或II或III混合物，根據(jù)優(yōu)質(zhì)臨床規(guī)范使用治療有效量的HAART，降低HIV-1-RNA血漿水平。A.M.Vandamme等，抗病毒的化學(xué)和化學(xué)療法，9187-203(1998)公開了，現(xiàn)代臨床治療HIV-1感染的方法，包括什么時(shí)候使用多藥物療法和與哪種藥聯(lián)合使用。三聯(lián)藥物療法可以包括二個(gè)NRTIs和一個(gè)PI，但對不同的病人，還要考慮許多其它問題來選擇精確的HAART。參見表1和2，和在上文提到的A-M.Vandamme等的圖2。
術(shù)語″感染HIV-1的病人″在這里指任何病人，包括感染HIV-1的小兒科病人，包括第一次治療的病人和經(jīng)受多次治療的感染HIV-1的病人，以及同時(shí)感染HIV-1和丙型肝炎病毒(″HCV″)的第一次治療的病人和經(jīng)受多次治療的病人。
術(shù)語″小兒科的病人″在這里指年齡小于17歲，一般包括從出生到16歲的任何病人。
術(shù)語″第一次治療的病人″在這里指感染HIV-1或同時(shí)感染HIV-1和HCV，從來沒有接受任何抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物治療的病人，抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物例如NRTI、NNRTI、PI或任何干擾素，包括而不是限于干擾素-α，或pegylated干擾素α。
術(shù)語″經(jīng)受多次治療的病人″在這里指感染HIV-1或同時(shí)感染HIV-1和HCV，接受過某種抗HIV治療的病人，包括但不限于HAART或某種形式的抗HCV療法，包括但不限于干擾素-α、pegylated干擾素α或病毒唑。
術(shù)語″感染丙型肝炎病毒的病人″在這里指任何病人，包括感染丙型肝炎病毒的小兒科病人，包括第一次治療的病人和經(jīng)受多次治療的感染丙型肝炎病毒的病人，以及那些患有慢性肝炎的小兒科的、第一次治療的病人和經(jīng)受多次治療的病人。
患有丙型肝炎的病人包括那些感染了多種HCV基因型的病人，包括1型以及那些感染上例如ICV基因型2，3，4，5和/或6及其他可能的HCV基因型的病人。
術(shù)語″第一次治療的感染丙型肝炎的病人″在這里指從來沒有接受病毒唑或任何干擾素治療的患有丙型肝炎的病人，包括而不限于干擾素-α或pegylated干擾素α。
術(shù)語″接受多次治療的感染丙型肝炎的病人″在這里指已經(jīng)接受病毒唑或任何干擾素治療的患有丙型肝炎的病人，包括而不限于干擾素-α或pegylated干擾素α包括復(fù)發(fā)者和沒有應(yīng)答者。
術(shù)語″復(fù)發(fā)者″在這里指經(jīng)過多次治療的感染丙型肝炎的病人，經(jīng)過以前的干擾素單獨(dú)治療或與病毒唑結(jié)合治療后又復(fù)發(fā)。
術(shù)語″無應(yīng)答者″在這里指經(jīng)過多次治療的感染丙型肝炎的病人，經(jīng)過以前的干擾素單獨(dú)治療或與病毒唑結(jié)合治療沒有產(chǎn)生應(yīng)答。
當(dāng)使用pegylated干擾素-α?xí)r使用pegylated干擾素α-2b，根據(jù)本發(fā)明在包括兩個(gè)階段的治療期間內(nèi)，治療有效量的pegylated干擾素α-2b使用范圍大約為每周服用0.1到9.0微克每千克pegylated干擾素α-2b，一次或分開計(jì)量，優(yōu)選一周一次(QW)或每周兩次(BIW)，優(yōu)選的范圍為大約一周一次(QW)服用0.1到大約9.0微克每千克pegylated干擾素α-2b，或每周兩次(BIW)服用大約0.05到大約4.5微克每千克pegylated干擾素α-2b，或每周服用大約0.5到大約3.0微克每千克pegylated干擾素α-2b，優(yōu)選的范圍為一周一次(QW)服用大約0.5到大約3.0微克每千克pegylated干擾素α-2b，或每周兩次服用大約0.25到大約1.5微克每千克pegylated干擾素α-2b，或每周服用大約0.75到大約1.5微克每千克pegylated干擾素α-2b，最優(yōu)選范圍為一周一次服用大約0.75到大約1.5微克每千克pegylated干擾素α-2b或每周兩次服用大約0.375到大約0.75微克每千克pegylated干擾素α-2b。
當(dāng)使用pegylated干擾素-α給小兒科的病人服用時(shí)，使用pegylated干擾素α-2b，根據(jù)本發(fā)明在包括兩個(gè)階段的治療期間內(nèi)，治療有效量的pegylated干擾素α-2b使用范圍為大約0.1到9.0微克每千克pegylated干擾素α-2b，一次或分開計(jì)量，優(yōu)選一周一次(QW)或每周兩次(BIW)，優(yōu)選的范圍為大約一周一次(QW)服用大約0.1到大約9.0微克每千克pegylated干擾素α-2b，或每周服用大約0.05到大約4.5微克每千克pegylated干擾素α-2b，一次或分開計(jì)量服用，優(yōu)選一周一次(QW)或每周兩次(BIW)，更優(yōu)選一周一次服用大約0.05到大約4.5微克每千克pegylated干擾素α-2b，或者優(yōu)選服用大約0.75到大約3.0微克每千克pegylated干擾素α-2b，一次或分開計(jì)量，優(yōu)選一周一次(QW)或每周兩次(BIW)，更優(yōu)選一周一次服用大約0.75到大約3.0微克每千克pegylated干擾素α-2b，或每周兩次服用大約0.375到大約1.5微克每千克pegylated干擾素α-2b，最優(yōu)選范圍為一周一次服用大約2.25到大約2.6微克每千克pegylated干擾素α-2b或每周兩次(BIW)服用大約1.1到大約1.3微克每千克pegylated干擾素α-2b。
當(dāng)使用pegylated干擾素-α?xí)r使用pegylated干擾素α-2a，根據(jù)本發(fā)明在包括兩個(gè)階段的治療期間內(nèi)，治療有效量的pegylated干擾素α-2a使用范圍為一周一次(QW)大約50微克到大約500微克，優(yōu)選一周一次大約200微克到大約250微克，或有效量范圍為每周兩次大約50微克到大約250微克，優(yōu)選每周兩次大約100微克到大約125微克。
當(dāng)使用pegylated干擾素-α給小兒科的病人服用時(shí)，使用pegylated干擾素α-2a，根據(jù)本發(fā)明包括第一階段的治療期間內(nèi)，治療有效量的pegylated干擾素α-2a使用范圍為一周一次(QW)大約50微克到大約500微克，優(yōu)選一周一次大約300微克到大約375微克，或給小兒科病人服用的治療有效量范圍為，每周兩次大約50微克到大約250微克，優(yōu)選一周一次大約150微克到大約190微克。
病毒唑和pegylated干擾素聯(lián)合給病人用藥，也就是說，在pegylated干擾素α之前、之后或同時(shí)給藥。在同一段時(shí)間，使用pegylated干擾素-α的劑量優(yōu)選病人使用的病毒唑的計(jì)量。病毒唑和pegylated干擾素-α同時(shí)，使用的量為每公斤每天大約400到大約1600毫克，優(yōu)選每公斤每天大約600到大約1200毫克或者大約800到大約1200毫克每天，最優(yōu)選每公斤每天大約1000到大約1200毫克。給小兒科病人使用時(shí)，在同一段時(shí)間使用pegylated干擾素-α的劑量優(yōu)選病人使用的病毒唑的計(jì)量。同時(shí)給小兒科病人使用病毒唑和pegylated干擾素α?xí)r，使用量為每公斤每天大約8到大約15毫克，優(yōu)選每公斤每天大約8，12或15毫克，分計(jì)量使用。
口服pegylated干擾素-α制劑效果不好，所以優(yōu)選的方法為腸胃外給藥，優(yōu)選皮下注射、靜脈注射或肌肉注射。病毒唑可以以膠囊、片劑口服給藥，或液態(tài)與pegylated干擾素-α經(jīng)腸胃外給藥。當(dāng)然可以考慮這兩種藥劑的其它給藥形式，例如鼻噴入法、經(jīng)皮、通過栓劑、通過持續(xù)釋放劑型和由肺吸入給藥。只要能夠供給適當(dāng)?shù)膭┝浚黄茐幕钚猿煞挚梢栽试S任何形式給藥。微生物的發(fā)酵在大約24℃到37℃，優(yōu)選24℃到35℃的溫度條件，pH值為大約6.5到8.0，將含水的培養(yǎng)基沉侵在有氧條件下，當(dāng)用于制備的微生物MER-229生長出來，不斷攪拌，直到真正的CCR-5活性傳送到介質(zhì)中，這樣制備出CCR-5活性復(fù)合物。溫度研究表明有機(jī)體在大約24℃迅速生長，因此優(yōu)選在大約24℃的單一的溫度下，進(jìn)行大約48到大約144小時(shí)，優(yōu)選在燒瓶中進(jìn)行大約120小時(shí)。
有機(jī)體生長的紅細(xì)胞壓積、pH值和殘余的葡萄糖濃度間歇地變化，在發(fā)酵期間，CCR-5活性復(fù)合物的制備由CCR-5試驗(yàn)控制。
關(guān)于培養(yǎng)基，可以使用任何適當(dāng)含碳的介質(zhì)，例如可吸收的碳水化合物；含氮源介質(zhì)，例如可吸收的含氮的或蛋白質(zhì)的原料和各種的無機(jī)鹽。
用于發(fā)酵的介質(zhì)包含作為主要氮和碳源的朊蛋白胨、酵母提取物、結(jié)晶葡萄糖和大豆粒。在這個(gè)條件下，當(dāng)使用CCR-5試驗(yàn)檢測發(fā)酵過程時(shí)，微生物MER-229生產(chǎn)出了活性組分。
上文的介質(zhì)是MER229制備活性組分的營養(yǎng)物模板。然而，對于熟知發(fā)酵科學(xué)的人來說，很明顯許多物質(zhì)提供的營養(yǎng)物可以替代上文提到的介質(zhì)，從中獲得各種各樣的，這些營養(yǎng)物質(zhì)和上述闡述的營養(yǎng)物質(zhì)具有同等的功效，而且一般會獲得良好的生長和制備。
一般在發(fā)酵工藝中，在加入酵母前，先對發(fā)酵介質(zhì)進(jìn)行最初的殺菌。在殺菌前，通常將介質(zhì)的pH值調(diào)到7。
將酵母加入液體培養(yǎng)基后啟動發(fā)酵。通常，相對于液體培養(yǎng)基的體積，酵母體積在3.5到7.0％之間。酵母的制備，是將相對于整個(gè)用于制備培養(yǎng)物的液體培養(yǎng)基為5％的樣品酵母加入到初始的適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)中。按克/升算，特別優(yōu)選的初始介質(zhì)包括，變形桿菌蛋白胨#3，5.0；氯化鈉5.0；結(jié)晶葡萄糖20.0；酵母提取物3.0；大豆粒5.0和磷酸鉀鈉(一元的)5.0。發(fā)酵的培菌時(shí)期通常要求從24到120小時(shí)，優(yōu)選72-96小時(shí)，一般在24℃下進(jìn)行，并且攪拌(每分鐘250轉(zhuǎn))。將培養(yǎng)物的5％酵母轉(zhuǎn)移到初始介質(zhì)中，如上述描述的培養(yǎng)，將用這種方法培養(yǎng)的酵母轉(zhuǎn)移到發(fā)酵介質(zhì)中，特別優(yōu)選的發(fā)酵介質(zhì)包括10g/L的新胨、40g/L的結(jié)晶葡萄糖和5g/L的碳酸鈣。發(fā)酵階段一般要求96到144小時(shí)，優(yōu)選120小時(shí)，通常在大約24℃下進(jìn)行，并攪動(每分鐘250轉(zhuǎn))。將溶液的pH值調(diào)到7，如有必要向介質(zhì)中加入例如消泡劑B(Dow Corning)的消泡劑用于控制泡沫。進(jìn)行CCR-5檢測試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)制備出了活性配合物。CCR-5活性物質(zhì)的分離關(guān)于分離工藝的第一步，傳統(tǒng)的乙酸乙酯提取法在pH為6.5-7.2時(shí)，不能從發(fā)酵液體培養(yǎng)基中提取出210791(I)、Sch 210792(II)和Sch 213766(III)。原來使用DZC-18(Diazem)密封材料，小規(guī)模應(yīng)用了固相提取法(SPE)。進(jìn)一步的評估表明I、II和III化合物可以用乙酸乙酯在酸性條件下(pH＝2)進(jìn)行提取。先用濃鹽酸(12N，37％)將發(fā)酵液(4升)調(diào)整到pH為2，然后用12升的乙酸乙酯提取。減壓除去溶劑后，用雙相的溶劑系統(tǒng)(己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶含5％乙酸的水，8∶2∶5∶5)分配粗提物(8g)。將上面部分(800mg)的CCR-5活性復(fù)合物進(jìn)行正相高壓液相色譜分離(YMC半制備的聚醋酸乙烯酯-Sil柱，30×250mm有30×75mm保護(hù)柱，S-5，2％甲醇溶于等濃度的氯丁烷中，24毫升/分鐘，UV＝295nm))，得到純的I(6mg)和III(20mg)和富集的復(fù)合物。進(jìn)一步用反向高壓液相色譜法(YMC半制備的ODS柱，20×250mm，并有20×50mm保護(hù)柱，S-5，用溶于水的70-100％乙腈梯度洗滌15分鐘，12毫升/分鐘，UV＝220nm)提純富集的復(fù)合物，得到純的II(5毫克)。化合物I、II和III的理化性質(zhì)用丙酮/二氯甲烷(1∶1)結(jié)晶化合物I和II，形成結(jié)晶固體。然而除去高壓液相色譜法提純得來的溶劑后，化合物III為膠狀物質(zhì)，用許多溶劑體系都不能使其結(jié)晶。三個(gè)化合物都可以溶于丙酮、乙酸乙酯、乙腈、二氯甲烷和甲醇，但不溶于己烷和水。這些化合物在茚三酮試驗(yàn)中顯陰性，在Rydon試驗(yàn)中顯陽性。這些化合物的理化性質(zhì)概括在表1中。式I、II和III化合物的結(jié)構(gòu)測定通過分析光譜數(shù)據(jù)來解釋式I、II和III化合物的結(jié)構(gòu)，包括UV、IR、MS、1H和13C核磁共振，這些光譜數(shù)據(jù)參見表2和3。
通過相關(guān)光譜學(xué)(COSY)和附著的氫核試驗(yàn)(APT)實(shí)驗(yàn)來分別確定氫核和碳的譜帶歸屬。通過雜環(huán)相關(guān)的(HETCOR)實(shí)驗(yàn)將氫分配到有關(guān)的碳上。通過雜核多重鍵相關(guān)性(HMBC)、異核多級量子相干(HMQC)和選擇使用通過偏振傳遞提高不靈敏核(SINEPT)的實(shí)驗(yàn)來確定氫核和碳的關(guān)系。通過核極化效應(yīng)光譜(NOSEY)來確定相關(guān)的立體化學(xué)。分析化合物II的X射線晶體學(xué)數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)見表4，來進(jìn)一步證明提出的化合物的結(jié)構(gòu)和相關(guān)的立體化學(xué)。三個(gè)化合物都屬于tetramic酸族，該化合物鍵合親油的二環(huán)部分。化合物I和II在手性中心C-23位置為立體異構(gòu)的?；衔颕II在C-25位置是羧酸甲酯。表1式I、II和III化合物的理化性質(zhì)III III溶點(diǎn)℃ 126-128 149-150 -------1ESI-MS (m/z)2446(MH+H)+446(M+H)+460(M+H)+元素分析 C25H35NO6C25H35O6C26H37NO6計(jì)算值 C67.42，H7.87， C67.42，H7.87，NC67.97，H8.06，N3.15 3.15N3.05實(shí)際測量值 C68.23，H7.98， C66.95，H7.51， C67.11，N3.11 N3.58 H7.88，N3.67[]24D(丙酮)+127.5°+40.0°+33.3°UV(甲醇)maxnm 220，290 220，295220，295IR(Kbr)MAXCM-13390，1725， 3436，1710，1645， 3407，1736，1650，1595，1440 1578，1447 1655，1602，14561.大概由于存在兩個(gè)同分異構(gòu)體(烯醇-酮平衡)，化合物III好象是膠狀的軟固體。2、電噴射離子化質(zhì)譜數(shù)據(jù)表2式I、II和IIIa化合物的核磁共振數(shù)據(jù)質(zhì)子# I II III1 3.95dd(8.0，7.0)b3.94dd(8.0，7.0)3.95dd(8.0，7.0)2 3.01dt(8.0，1.0，1.0) 3.00dt(8.0，1.0，1.0) 3.00dt(8.0，1.0，1.0)3 5.67br.s 5.66br.s5.66br.s4 5.67br.s 5.66br.s5.66br.s5 1.85m 1.85m 1.82m6 0.93，1.90m0.95，1.91m 0.95，1.90m7 1.62m 1.63m 1.63m8 0.82，1.64m0.83，1.66m 0.83，1.66m9 1.38m 1.39m 1.39m10 1.40m 1.40m 1.40m11 -- -- --12 1.58br.s 1.57br.s1.59br.s13 5.20dq(6.5，1.0) 5.19dq(6.5，1.0)5.19dd(6.5，1.0)14 1.51br.d(6.5) 1.50br.d(6.5) 1.50br.d(6.5)15 0.92d(6.5) 0.91d(6.5) 0.91d(6.5)16 0.84d(6.5) 0.85d(6.5) 0.84d(6.5)17 -- -- --18 -- -- --19 -- -- --20 4.10dd(10.0，2.5) 3.80dd(10.0，2.5) 4.04(10.0，2.5)21 -- -- --22 1.90dd(14.0，10.0) 1.75dd(14.0，10.0) 1.72dd(14.0，10.0)2.22dd(14.0，2.5) 2.50dd(14.0，2.5) 2.45dd(14.0，2.5)23 -- -- --24 1.49s 1.49s 1.46s5 -- -- --25-OCH3-- -- 3.77sa.在丙酮-d6中400MHz測量，從TMS的化學(xué)位移單位ppmb.偶合常數(shù)單位Hz。CCR5膜結(jié)合試驗(yàn)使用高流量濾網(wǎng)，利用CCR5膜結(jié)合試驗(yàn)確定RANTES結(jié)合的抑制劑。利用表達(dá)人的CCR5趨化因子受體的NIH 3T3細(xì)胞制備膜來進(jìn)行試驗(yàn)，這個(gè)受體可以和它的自然配體RANTES結(jié)合。使用96孔的培養(yǎng)皿，用125I-RANTES培養(yǎng)制備的膜，在有或沒有化合物的情況下培養(yǎng)1小時(shí)。順序地將化合物稀釋到0.001ug/ml到1ug/ml的范圍內(nèi)，并分三份進(jìn)行試驗(yàn)。通過玻璃纖維過濾器獲得反應(yīng)的混合物，并徹底洗滌。求出重復(fù)試驗(yàn)的平均值，作為抑制125I-RANTES結(jié)合50％時(shí)的濃度。進(jìn)一步用亞細(xì)胞為基底HIV-1進(jìn)入和復(fù)制試驗(yàn)來表征，在膜結(jié)合試驗(yàn)中化合物的有效活性。在CCR5膜結(jié)合試驗(yàn)中式II化合物的活性在CCR5膜結(jié)合試驗(yàn)中，評價(jià)式II化合物的活性。這個(gè)試驗(yàn)利用表達(dá)人的CCR5趨化因子受體的NIH 3T3細(xì)胞制備的膜，RANTES(調(diào)節(jié)正常的T細(xì)胞表示和分泌的活性)是CCR5的自然配體。使用96孔的培養(yǎng)皿，在有(和沒有)化合物的情況，將14ug(總蛋白)制備的膜和0.05nM125I Rantes培養(yǎng)1小時(shí)。順序地將化合物II稀釋到0.001ug/ml到1.0ug/ml的范圍內(nèi)，每一濃度試驗(yàn)四次。通過玻璃纖維過濾器獲得反應(yīng)的混合物，并徹底洗滌。求出重復(fù)試驗(yàn)值的平均數(shù)，作為抑制膜結(jié)合125I RANTES達(dá)到50％時(shí)的濃度。式II化合物的IC50值為78.6nM。可以預(yù)計(jì)式I和III化合物的類似活性范圍。
表3式I、II和IIIa化合物的13C NMR數(shù)據(jù)刺菜薊(Carbon)# I II III1 45.8db46.9d45.2d2 47.8d 48.5d48.7d3 128.4d129.4d 126.2d4 133.5d134.5d 134.3d5 40.4d 41.2d38.4d6 41.8t 42.6t42.4t7 32.4d 33.2d33.2d8 45.8t 46.6t46.8d9 39.1d 39.9d35.1d1046.0d 46.9d39.9d11135.3s136.2s 138.2s1215.1q 16.8q16.5q13121.5d122.3d 122.0d1412.9q 13.8q13.8q1521.8q 22.6q22.8q1620.5q 21.4q20.2q17192.8s193.5s 192.9s18100.6s101.4s 100.9s19194.8s194.9s 194.7s2058.9d 60.9d60.7d21175.6s176.6s 176.6s2241.3t 42.7t43.0t2372.9s 75.1s75.3s2425.0q 27.7q28.0q25176.9s177.2s 176.9s25OCH3- -52.9qa.在丙酮-d6中100MHz測量，從TMS的化學(xué)位移ppmb.通過APT數(shù)據(jù)確定多重峰表4.晶體學(xué)數(shù)據(jù)1
1在所有測量中使用Enraf-Nonius CAD-4衍射儀(Cu-Kα射線，石墨單色器)。因?yàn)槁鍌惼澓蜆O化影響校正強(qiáng)度。勞厄?qū)ΨQ性表明這些晶體屬于單斜晶系。沒有規(guī)則和分子是手性的事實(shí)決定了空間群。最后由衍射計(jì)裝置角計(jì)算單位晶胞參數(shù)，在倒易空間大大偏離了25度(25°＜θ＜29°)。
由直接法了解晶體結(jié)構(gòu)(MULTAN11/82)。從一系列通過增加原子數(shù)分階段記錄重量的Fo傅里葉合成法和E-map，可以獲得沒有氫原子的近似坐標(biāo)。通過一些完全的矩陣最小方陣計(jì)算，調(diào)整這些原子的位置和熱力學(xué)參數(shù)(先各向同性和然后各向異性)。大多數(shù)的氫原子通過差值傅里葉合成法確定出了位置，并且通過接下來的最小方陣疊代法插入到預(yù)計(jì)的位置。在后面的時(shí)間，將消光校作為可變的。最后的差值傅里葉合成沒有異常特征。
利用Enraf-Nonius結(jié)構(gòu)測定程序包(SDP)，在PDP11/44和MicroVAX MICROVAX計(jì)算機(jī)上進(jìn)行結(jié)晶的計(jì)算。
所有的結(jié)構(gòu)-因子運(yùn)算、中性原子散射因子和它們的異常色散校正都來自于國際X射線結(jié)晶學(xué)表，IV卷，Kynoch出版社，伯明翰，U.K.，1974。2R＝∑||Fo|-Fc||/∑|Fo|；Rw＝[∑w(|Fo|-|Fc|)2/∑w|Fo|2]；∑wΔ2[w＝1σ2(|Fo|)，Δ＝(|Fo|Fc|)]是最小的。3擬合優(yōu)度＝ [∑wΔ2/(N觀測-N參數(shù))]
權(quán)利要求
1.式I、II或III化合物基本上化學(xué)純形式或藥學(xué)上可接受的鹽。
2.一種藥物組合物包括作為CCR5拮抗劑的有效量權(quán)利要求1化合物和至少一種藥學(xué)上可接受的載體。
3.一種生物純球毛殼霉Kunze SCF 1705和它的突變株和變體培養(yǎng)物，它具有球毛殼霉Kunze SCF 1705，ATCC 74489的特征，所述的培養(yǎng)物在含有碳和氮源和無機(jī)物的水介質(zhì)中，能夠制造任意數(shù)量的式I-III化合物。
4.包括式I、II和III化合物的CCR-5活性復(fù)合物。
5.一種制造權(quán)利要求1式I、II或III化合物的方法，包括在大約24℃到40℃的溫度條件，pH值為大約6.0到8.5，有氧條件下，在包含碳和氮源和無機(jī)物的含水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)球毛殼霉Kunze SCF 1705，ATCC 74489，并不斷攪拌，直到真正的抗CCR-5活性傳送到介質(zhì)中。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的tetramic酸型化合物，它從CCR－5活性復(fù)合物中分離出來，在控制條件下通過將生物純的微生物培養(yǎng)液(球毛殼霉Kunze SCH 1705 ATCC 74489)發(fā)酵來制備復(fù)合物。還涉及含有它們的藥物組合物和它們作為CCR－5拮抗劑治療人類免疫缺陷性病毒－1(“HIV－1”)感染的用途。
文檔編號A61K31/4015GK1422252SQ01807677
公開日2003年6月4日 申請日期2001年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月30日
發(fā)明者M·楚, R·A·米爾茲瓦, J·特拉齊爾諾, M·G·帕特爾 申請人:先靈公司