果糖氨基酸氧化酶、制備方法及含該酶的糖化白蛋白檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種果糖氨基酸氧化酶，具有SEQID.No.1所示的氨基酸序列或與該氨基酸序列有80%以上同源性的果糖氨基酸氧化酶中，其選自以下（a）至（f）中的氨基酸對(duì)應(yīng)的位置上具有一個(gè)或更多的氨基酸殘基進(jìn)行取代，所得的果糖氨基酸氧化酶具有更高的熱穩(wěn)定性：（a）59位的谷氨酸，（b）98位的谷氨酸，（c）225位的甘氨酸，（d）277位的賴氨酸，（e）285位的谷氨酸，（f）355位的天冬氨酸。本發(fā)明還公開了上述酶的制備方法和含有該酶的測(cè)定糖化白蛋白的試劑盒，具有更高的熱穩(wěn)定性并能精確地測(cè)定糖化白蛋白。
【專利說明】果糖氨基酸氧化酶、制備方法及含該酶的糖化白蛋白檢測(cè)試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及體外診斷領(lǐng)域，具體說是提供一種熱穩(wěn)定性高的果糖賴氨酸氧化酶突變體，一種用于測(cè)定糖化白蛋白的方法，一種測(cè)定糖化白蛋白的試劑盒。本發(fā)明可用于臨床檢驗(yàn)，能夠精確地測(cè)定糖化白蛋白。
【背景技術(shù)】
[0002]糖尿病是發(fā)生在高血糖人群中的一類代謝型疾病，可導(dǎo)致機(jī)體多數(shù)系統(tǒng)受到嚴(yán)重的損害，尤其是神經(jīng)及血管。根據(jù)世界衛(wèi)生組織預(yù)計(jì)，中國(guó)糖尿病人數(shù)已居世界第一位。糖尿病將成為未來(lái)50年中國(guó)最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。
[0003]糖化白蛋白(Glycatedalbumin, GA)是指人血清中葡萄糖與白蛋白N末端發(fā)生非酶促糖化反應(yīng)而形成的產(chǎn)物，其中90%與白蛋白鏈內(nèi)的賴氨酸ε -ΝΗ2殘基發(fā)生反應(yīng)，其反應(yīng)原理為兩者首先形成不穩(wěn)定的葡基胺(Glycosylamine)或Schiff堿基(Schiff Base),后者再經(jīng)不可逆的葡糖胺(Amadori)重排反應(yīng)形成穩(wěn)定的氨基酮(酮胺)。因白蛋白的半衰期大約是20天，所以糖化白蛋白檢測(cè)可被用于檢測(cè)過去2-3周平均血糖水平。目前，糖化白蛋白已成為一項(xiàng)糖尿病患者必不可少的檢測(cè)項(xiàng)目，與糖化血紅蛋白相比，其更適合作為評(píng)估糖尿病透析患者住院治療及死亡風(fēng)險(xiǎn)的指標(biāo)。
[0004]所以如何能精確地測(cè)定出人血清中的糖化白蛋白量成為臨床檢測(cè)糖化白蛋白的關(guān)鍵。目前市場(chǎng)主要采用酶法用于檢測(cè)人血清中的糖化白蛋白。其反應(yīng)原理為首先使用蛋白酶將糖化蛋白消化成低分子量的糖化多肽，隨后使用果糖氨基酸酶催化糖化多肽發(fā)生氧化反應(yīng)生成多肽(或氨基酸)，葡萄糖醛酮和H202。釋放的H2O2通過終點(diǎn)反應(yīng)比色法來(lái)測(cè)定，其在600nm處的吸收值與糖化白蛋白的濃度成比例。具體反應(yīng)過程如下:
[0005]
【權(quán)利要求】
1.一種果糖氨基酸氧化酶，其特征在于，具有SEQID.N0.1所示的氨基酸序列或與該氨基酸序列有80%以上同源性的果糖氨基酸氧化酶中，其選自以下(a)至(f)中的氨基酸對(duì)應(yīng)的位置上具有I個(gè)或更多的氨基酸殘基進(jìn)行取代，所得的果糖氨基酸氧化酶；與取代前的具有SEQID.N0.1所示的氨基酸序列或與該氨基酸序列有80%以上同源性的果糖氨基酸氧化酶相比較，具有更高的熱穩(wěn)定性: (a)59位的谷氨酸， (b)98位的谷氨酸， (c)225位的甘氨酸，
Cd) 277位的賴氨酸， Ce) 285位的谷氨酸， Cf) 355位的天冬氨酸。
2.一種果糖氨基酸氧化酶，其特征在于，具有SEQID.N0.1所示的氨基酸序列或與該氨基酸序列有80%以上同源性的果糖氨基酸氧化酶中，其選自以下(g)至(I)中的氨基酸對(duì)應(yīng)的位置被取代為以下(g)至(I)中記載的取代后的氨酸酸殘基，所得的果糖氨基酸氧化酶；與與取代前的具有SEQID.N0.1所示的氨基酸序列或與該氨基酸序列有80%以上同源性的果糖氨基酸氧化酶相比較，具有更高的熱穩(wěn)定性: (g)59位的谷氨酸被取代為L(zhǎng)、1、V、F、M、W、T、C、N、Y、D或H ; (h)98位的谷氨酸酸被取代為A、L、1、V、P、F、S、T、C、N、Y、D或H ; (i)225位的甘氨酸被取代為A、L、F、M、W、S、N或D ; (j ) 277位的賴氨酸被取代為A、L、1、F、S、T、N、Y、R或H ; (k) 285位的谷氨酸被取代為A、L、1、F、M、W、Q或N ; (1) 355位的天冬氨酸被取代為L(zhǎng)、1、V、F、M、W、T、C、Y、R或H。
3.一種果糖氨基酸氧化酶，其特征在于，具有SEQID.N0.1所示的氨基酸序列或與該氨基酸序列有80%以上同源性的果糖氨基酸氧化酶中，其選自以下(m)至(V)中的氨基酸被取代為以下(m)至(V)中記載的取代后的氨酸酸殘基，所得的果糖氨基酸氧化酶；與取代前的具有SEQID.N0.1所示的氨基酸序列或與該氨基酸序列有80%以上同源性的果糖氨基酸氧化酶相比較，具有更高的熱穩(wěn)定性:
(m) 59E — F,98E — C ;
(η) 59Ε — F,225G — D ；
(ο) 59E — F，277K — N ；
(p) 59E — F,285E — F ；
(q) 98E — P,225G — N ；
(r) 98E — P，277K — S ；
(s) 225G — L，277K — A ；
(t) 225G — L,285E — I ；
(u)277K — Y,355D — T ；
(V) 285E — I,355D — W0
4.一種果糖氨基酸氧化酶，其特征在于，具有SEQID.N0.1所示的氨基酸序列或與該氨基酸序列有80%以上同源性的果糖氨基酸氧化酶中，其選自以下(W)至(aa)中的氨基酸被取代為以下(W)至(aa)中記載的取代后的氨酸酸殘基，所得的果糖氨基酸氧化酶；與取代前的具有SEQID.N0.1所示的氨基酸序列或與該氨基酸序列有80%以上同源性的果糖氨基酸氧化酶相比較，具有更高的熱穩(wěn)定性:
5.一種果糖氨基酸氧化酶，其特征在于，具有SEQID.N0.1所示的氨基酸序列或與該氨基酸序列有80%以上同源性的果糖氨基酸氧化酶中，其選自以下(ab)至(ac)中的氨基酸被取代為以下(ab)至(ac)中記載的取代后的氨酸酸殘基，所得的果糖氨基酸氧化酶；與取代前的具有SEQID.N0.1所示的氨基酸序列或與該氨基酸序列有80%以上同源性的果糖氨基酸氧化酶相比較，具有更高的熱穩(wěn)定性:
6.一種果糖氨基酸氧化酶，其特征在于，具有SEQID.N0.1所示的氨基酸序列或與該氨基酸序列有80%以上同源性的果糖氨基酸氧化酶中，其選自以下(ad)中的氨基酸被取代為(ad)中記載的取代后的氨酸酸殘基，所得的果糖氨基酸氧化酶；與取代前的具有SEQID.N0.1所示的氨基酸序列或與該氨基酸序列有80%以上同源性的果糖氨基酸氧化酶相比較，具有更聞的熱穩(wěn)定性:
7.一種果糖氨基酸氧化酶，其特征在于，具有SEQID.N0.1所示的氨基酸序列或與該氨基酸序列有80%以上同源性的果糖氨基酸氧化酶中，其選自以下(ae)中的氨基酸被取代為(ae)中記載的取代后的氨酸酸殘基，所得的果糖氨基酸氧化酶；與取代前的具有SEQID.N0.1所示的氨基酸序列或與該氨基酸序列有80%以上同源性的果糖氨基酸氧化酶相比較，具有更聞的熱穩(wěn)定性:
8.一種果糖氨基酸氧化酶，其特征在于，所述的與具有SEQID.N0.1所示的氨基酸序列有80%以上同源性的果糖氨基酸氧化酶來(lái)自于黑曲霉(Aspergillusniger) CBS513.88,棒曲霉(Aspergillusclavatus) NRRLI,新薩托菌(Neosartoryafischeri) NRRL181 或煙曲霉(Aspergillusfumigatus) Af293。
9.一種編碼上述權(quán)利要求1~8任何一項(xiàng)所述的果糖氨基酸氧化酶的基因。
10.一種包含權(quán)利要求9所述的果糖氨基酸氧化酶基因的重組載體。
11.一種包含權(quán)利要求10所述重組載體的宿主細(xì)胞。
12.—種制備果糖氨基酸氧化酶的方法，其特征在于包括以下步驟: (I)菌體的獲得:培養(yǎng)含有不同突變基因的菌種培養(yǎng)至OD6tltl生長(zhǎng)至0.5~I時(shí)，加入異丙基硫代半乳糖苷誘導(dǎo)5小時(shí)，離心收集菌體，收集的菌體用緩沖液重新懸浮，超聲破碎，離心收集上清液； (2 )硫酸銨沉淀:使用硫酸銨溶液對(duì)步驟(1)所得上清液進(jìn)行分級(jí)沉淀，將最后收集得到的沉淀溶于bufferA中，得到粗提液； (3)親和層析:用bufferA平衡鎳柱，再將步驟(2)得到的粗提液上鎳柱吸附，吸附結(jié)束后，用咪唑溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫液； (4)透析:將步驟(3)中的洗脫液裝至透析袋中，置于4°C透析液中，并磁力攪拌透析過夜； 所述步驟(2)中bufferA為:50mM磷酸鉀緩沖液，pH8.0,500mMNaCl ； 所述步驟(3)中咪唑溶液為:50mM磷酸鉀緩沖液，pH8.0，500mMNaCl，20mM~1000mM咪唑； 所述步驟(4)中透析液為:50mM磷酸鉀緩沖液，pH8.0，500mMNaCl。
13.—種測(cè)定糖化白蛋白的試劑盒，其特征在于:該試劑盒包括試劑I和試劑2，試劑中各組分濃度為: 試劑1: 緩沖液 20~200mmol/L， 蛋白酶 10~100KU/L， 過氧化物酶 10~100KU/L， 4-氛基安替比林 5~50mM/L,` 防腐劑 0.01~0.05% ； 試劑2: 緩沖液 20~200mmol/L， 權(quán)利要求1~8任一權(quán)利所述的果糖氨基酸氧化酶 10~100KU/L， 色原 I ~10mmol/I,, 防腐劑 0.01~0.05%。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的測(cè)定糖化白蛋白的試劑盒，其特征在于:所述的緩沖液為三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液、乙酸-乙酸鈉緩沖液、鄰苯二甲酸-鹽酸緩沖液或甘氨酸-鹽酸緩沖液。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的測(cè)定糖化白蛋白的試劑盒，其特征在于:所述的蛋白酶為胰蛋白酶、嗜堿性蛋白酶、蛋白酶A或蛋白酶K。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的測(cè)定糖化白蛋白的試劑盒，其特征在于:所述的色原為N，N-二(4-磺丁基)-3-甲基苯胺二鈉鹽、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽或N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽。
17.根據(jù)權(quán)利要求13所述的測(cè)定糖化白蛋白的試劑盒，其特征在于:所述的防腐劑為2-甲基-4異喔唑琳-3-麗、proclin300。
18.一種用于測(cè)定糖化白蛋白的方法，其特征在于: (1)利用蛋白酶處理樣本，使之降解生成糖化氨基酸或者糖化多肽； (2)利用上述權(quán)利要求1~8中的任何一項(xiàng)果糖氨基酸氧化酶，將糖化氨基酸或者糖化多肽氧化； (3)通過檢測(cè)產(chǎn)物的生成或底物的消耗來(lái)檢測(cè)樣本中糖化白蛋白的含量。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的用于測(cè)定糖化白蛋白的方法，其特征在于，步驟(1)所述的蛋白酶是胰蛋白酶、嗜堿性蛋白酶、蛋白酶A或蛋白酶K。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的用于測(cè)定糖化白蛋白的方法，其特征在于，步驟(3)所述的產(chǎn)物生成是通過偶聯(lián)過氧 化物酶生成H2O2,再通過Trinder反應(yīng)，生成顏色來(lái)檢測(cè)。
【文檔編號(hào)】C12R1/645GK103695380SQ201310744635
【公開日】2014年4月2日 申請(qǐng)日期:2013年12月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月27日
【發(fā)明者】鄒炳德, 鄒繼華, 汪屹, 賈江花 申請(qǐng)人:寧波美康生物科技股份有限公司