專利名稱：N取代α氨基酸的酶催化拆分方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種外消旋光學(xué)異構(gòu)體生物化學(xué)拆分方法，特別涉及一種N取代α氨基酸外消旋光學(xué)異構(gòu)體的酶催化拆分方法。
背景技術(shù)：
非蛋白氨基酸具有獨特的生物學(xué)功能和藥用價值，使其成為研究和開發(fā)的新方向和熱點之一。N取代α氨基酸是非蛋白氨基酸衍生物中的一類化合物，是合成藥物，農(nóng)藥，液晶材料的重要原料。它通常具有兩個異構(gòu)體，由單一構(gòu)型的N取代α氨基酸出發(fā)，可以為藥物分子引入手性，如(S)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸是手性除草劑異丙甲草胺的關(guān)鍵中間體。
目前制備單一構(gòu)型N取代α氨基酸通常采用化學(xué)拆分方法(5002606；United States Patent；Magden H.M.，Binnigen C.V.；1991)，然而，化學(xué)方法需要消耗較多的有機溶劑、污染環(huán)境、反應(yīng)后處理也比較復(fù)雜。另外反應(yīng)所需要的高溫有可能導(dǎo)致產(chǎn)物的外消旋化、降解等副反應(yīng)的發(fā)生，從而影響N取代α氨基酸的光學(xué)純度。利用酶進(jìn)行高選擇性和高效的有機合成是當(dāng)今合成化學(xué)的熱點之一，其中以酶催化制備單一手性化合物備受矚目，研究相當(dāng)活躍。采用酶法對N取代α氨基酸進(jìn)行拆分同化學(xué)方法相比，具有底物專一性好，立體選擇性強，反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)品易分離等化學(xué)方法所不能比擬的優(yōu)點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種在溫和條件下，酶催化拆分N取代α氨基酸外消旋光學(xué)異構(gòu)體，制備高光學(xué)純和高化學(xué)純的N取代α氨基酸的方法。
本發(fā)明提供的脂肪酶催化拆分N取代α氨基酸外消旋光學(xué)異構(gòu)體方法，按如下步驟進(jìn)行(a)使結(jié)構(gòu)式為 的外消旋N-取代α氨基酸酯、緩沖溶液和脂肪酶，在恒溫攪拌或振蕩下反應(yīng)，達(dá)到最高轉(zhuǎn)化率后，終止反應(yīng)，反應(yīng)混合物含有一種構(gòu)型N取代α氨基酸和未反應(yīng)的另一種構(gòu)型N取代α氨基酸酯；(b)該混合物用乙醚萃取除去未反應(yīng)的另一種構(gòu)型N取代α氨基酸酯；(c)水層酸化到PH5.5，用乙醚萃??；(d)乙醚層用無水硫酸鈉干燥后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到一種構(gòu)型N取代α氨基酸；(e)含未反應(yīng)的另一種構(gòu)型N取代α氨基酸酯的乙醚層經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，進(jìn)一步酶催化水解，加入緩沖液和另行選擇的脂肪酶，在恒溫攪拌或振蕩下反應(yīng)，達(dá)到最高轉(zhuǎn)化率后，終止反應(yīng)；(f)水層酸化到PH5.5，用乙醚萃??；(g)乙醚層用無水硫酸鈉干燥后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到另一種構(gòu)型N取代α氨基酸。
上述(a)的反應(yīng)可用以下反應(yīng)式表示
本發(fā)明所拆分的結(jié)構(gòu)式為 的N-取代α氨基酸酯式中R1和R2分別可以是直鏈烷烴、支鏈烷烴、烷烴衍生物、芳香烴及芳香烴衍生物；R3可以是直鏈烷烴，優(yōu)選C1-C5的直鏈烷烴。
本發(fā)明所選用的脂肪酶可以是動物、微生物等各種來源的脂肪酶。
本發(fā)明所用的脂肪酶可以是游離酶也可以是固定化酶。
本發(fā)明所使用的游離脂肪酶與底物的質(zhì)量比可以是1∶20-1∶1、固定化脂肪酶與底物的質(zhì)量比可以是3∶1-9∶1。
本發(fā)明所使用的緩沖溶液可以是pH7.0-8.5范圍的任何類型緩沖溶液。
本發(fā)明酶催化反應(yīng)時間為4-96小時。
本發(fā)明恒溫溫度可選擇范圍為20-45℃。
本發(fā)明酸化劑可用鹽酸、硫酸、磷酸、醋酸的溶液。
本發(fā)明所用的反應(yīng)裝置可因反應(yīng)量多少設(shè)計，如果在實驗室，可以把反應(yīng)體系設(shè)在0.5mL到1000mL之間，用單頸三角燒瓶、圓底燒瓶，磁力攪拌，熱電耦控溫，或放到恒溫?fù)u床中振蕩；如果在反應(yīng)釜中大量生產(chǎn)，可用機械攪拌，水浴恒溫。
本發(fā)明還提供一種測定N取代α氨基酸轉(zhuǎn)化率和對映體過量值的方法轉(zhuǎn)化率的檢測通過高效毛細(xì)管電泳，以三乙胺/乙酸緩沖液作為背景電解質(zhì)溶液，反向電場強度340V/cm，電泳溫度20℃，樣品濃度50mg/L，紫外檢測器200nm。
對映體過量值檢測通過高效毛細(xì)管電泳，以三乙胺/乙酸緩沖液作為背景電解質(zhì)溶液，采用環(huán)糊精作為手性選擇劑，不需要處理毛細(xì)管柱，反向電場強度340V/cm，電泳溫度20℃，樣品濃度50mg/L，紫外檢測器200nm，就可以使N取代α氨基酸對映體得到較好分離。
本發(fā)明利用脂肪酶催化拆分制備N取代α氨基酸方法具有以下優(yōu)點(1)酶催化拆分反應(yīng)條件溫和，基本沒有副產(chǎn)物生成，可以得到高化學(xué)純和光學(xué)純的目標(biāo)化合物N取代α氨基酸。
(2)拆分反應(yīng)效率高，經(jīng)過兩步酶法拆分過程可以得到高化學(xué)純和光學(xué)純的另一構(gòu)型的N取代α氨基酸，這樣可以降低成本。
(3)實驗操作簡單，不需要減壓蒸餾、柱層析等復(fù)雜的純化過程，僅需要簡單的萃取操作過程，就可以得到高化學(xué)純和光學(xué)純的N取代α氨基酸。而且萃取所需要的有機溶劑—乙醚經(jīng)低溫旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后可重復(fù)使用；(4)反應(yīng)完全在純緩沖溶液體系中進(jìn)行，避免了化學(xué)方法中的大量有機溶劑的使用，減少了環(huán)境污染。
以下實施例旨在說明本發(fā)明實施例一100mL反應(yīng)瓶中，分別加入外消旋2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸芐基酯(5mmol)，磷酸緩沖液(pH7.0)，枯草桿菌脂肪酶(100mg)，37℃恒溫?fù)u床中開始反應(yīng)。反應(yīng)48小時后結(jié)束反應(yīng)，用乙醚萃取除去未反應(yīng)的(S)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸芐基酯，水層用0.1mol/L HCL酸化到pH5.5，然后用乙醚進(jìn)行萃取，乙醚層經(jīng)無水硫酸鈉干燥后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到高化學(xué)純和光學(xué)純的(R)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸產(chǎn)品，產(chǎn)量0.48g，化學(xué)純度94％，旋光純度90％e.e.p。
未反應(yīng)的(S)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸芐基酯(0.5g)加入到含有南極假絲酵母脂肪酶(0.1g)的磷酸緩沖液(pH8.0)中，25℃恒溫?fù)u床中開始反應(yīng)，反應(yīng)4小時后，結(jié)束反應(yīng)，用0.1mol/LHCL酸化到pH5.5，然后用乙醚進(jìn)行萃取，乙醚層經(jīng)無水硫酸鈉干燥后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到高化學(xué)純和光學(xué)純的(S)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸產(chǎn)品，產(chǎn)量0.46g，化學(xué)純度96％，旋光純度92％e.e.p。
以下證明(S)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸的絕對構(gòu)型通過旋光儀測定拆分后得到的2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸的比旋光度同專利(5002606；United States Patent；Magden H.M.，Binnigen C.V.；1991)所報告的(S)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸的比旋光度相比較，可以判定拆分得到的酸的絕對構(gòu)型。
以下方法測定(S)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸的轉(zhuǎn)化率和對映體過量值轉(zhuǎn)化率的檢測通過高效毛細(xì)管電泳，以三乙胺/乙酸緩沖液作為背景電解質(zhì)溶液(100mmol/L，pH＝5.5)，反向電場強度340V/cm，電泳溫度20℃，樣品濃度50mg/L，紫外檢測器200nm。
對映體過量值檢測通過高效毛細(xì)管電泳，以三乙胺/乙酸緩沖液作為背景電解質(zhì)溶液(100mmol/L pH＝5.5)，采用2，6-O-二甲基-β-環(huán)糊精(40mmol/L)作為手性選擇劑，不需要處理毛細(xì)管柱，反向電場強度340V/cm，電泳溫度20℃，樣品濃度50mg/L，紫外檢測器200nm，就可以使2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸對映體得到較好分離。
實施例二100mL反應(yīng)瓶中，分別加入外消旋2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸叔丁酯(5mmol)，碳酸鈉緩沖液(pH8.5)，豬胰脂肪酶(0.4g)，37℃恒溫?fù)u床中開始反應(yīng)，96小時后結(jié)束反應(yīng)，用乙醚進(jìn)行萃取除去未反應(yīng)的(S)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸叔丁酯，水層用0.1mol/L H2SO4酸化到pH5.5，然后用乙醚進(jìn)行萃取，乙醚層經(jīng)無水硫酸鈉干燥后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到高化學(xué)純和光學(xué)純的(R)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸產(chǎn)品，產(chǎn)量0.50g，化學(xué)純度98％，旋光純度94％e.e.p。
未反應(yīng)的(S)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸叔丁酯(0.6g)加入南極假絲酵母脂肪酶(0.1g)，磷酸緩沖液(pH8.0)，25℃恒溫?fù)u床中開始反應(yīng)。反應(yīng)4小時后，結(jié)束反應(yīng)，用0.1mol/L H2SO4酸化到pH5.5，然后用乙醚進(jìn)行萃取，乙醚層經(jīng)無水硫酸鈉干燥后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到高化學(xué)純和光學(xué)純的(S)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸產(chǎn)品，產(chǎn)量0.40g，化學(xué)純度96％，旋光純度92％e.e.p。
拆分得到的酸的絕對構(gòu)型的證明、轉(zhuǎn)化率和對映體過量值測定同實施例三100mL反應(yīng)瓶中，分別加入外消旋2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸甲酯(5mmol)，磷酸緩沖液(pH7.5)，柱狀假絲酵母脂肪酶(0.3g)，40℃恒溫?fù)u床中開始反應(yīng)，反應(yīng)70小時后結(jié)束反應(yīng)，用乙醚萃取除去未反應(yīng)的(R)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸甲酯，水層用0.1mol/L醋酸酸化到pH5.5，然后用乙醚萃取，乙醚層經(jīng)無水硫酸鈉干燥后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到(S)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸產(chǎn)品，產(chǎn)量0.5g，化學(xué)純度99％，旋光純度99％e.e.p。
未反應(yīng)的(R)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸甲酯(0.5g)加入假單胞菌脂肪酶(0.2g)，磷酸緩沖液(pH8.0)，45℃恒溫?fù)u床中開始反應(yīng)。反應(yīng)60小時后結(jié)束反應(yīng)，用0.1mol/L醋酸酸化到pH5.5，然后用乙醚進(jìn)行萃取，乙醚層經(jīng)無水硫酸鈉干燥后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到高化學(xué)純和光學(xué)純的(R)-2-[(2-甲基-6-乙基)苯基氨基]丙酸產(chǎn)品，產(chǎn)量0.4g，化學(xué)純度96％，旋光純度92％e.e.p。
拆分得到的酸的絕對構(gòu)型的證明、轉(zhuǎn)化率和對映體過量值的測定同實施例一。
實施例四100mL反應(yīng)瓶中，分別加入外消旋2-(3-氟甲基苯基氨基)丙酸異丙酯(5mmol)，磷酸緩沖液(pH8.0)，假單胞菌脂肪酶(0.2g)，45℃恒溫?fù)u床中開始反應(yīng)，反應(yīng)60小時后，用乙醚進(jìn)行萃取除去未反應(yīng)的(S)-2-(3-氟甲基苯基氨基)丙酸異丙酯，水層用0.1mol/L HCL酸化到pH5.5，然后用乙醚進(jìn)行萃取，乙醚層經(jīng)無水硫酸鈉干燥后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到(R)-2-(3-氟甲基苯基氨基)丙酸產(chǎn)品，產(chǎn)量0.5g，化學(xué)純度99％，旋光純度92％e.e.p。
未反應(yīng)的(S)-2-(3-氟甲基苯基氨基)丙酸異丙酯(0.5g)加入到含有南極假絲酵母脂肪酶(0.1g)的磷酸緩沖液(pH8.0)中，25℃恒溫?fù)u床中開始反應(yīng)，反應(yīng)4小時后，結(jié)束反應(yīng)，用0.1mol/LHCL酸化到pH5.5，然后用乙醚進(jìn)行萃取，乙醚層經(jīng)無水硫酸鈉干燥后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到高化學(xué)純和光學(xué)純的(S)-2-(3-氟甲基苯基氨基)丙酸產(chǎn)品，產(chǎn)量0.45g，化學(xué)純度96％，旋光純度85％e.e.p。
拆分得到的酸的絕對構(gòu)型的證明、轉(zhuǎn)化率和對映體過量值的測定同實施例一。
實施例五100mL反應(yīng)瓶中，分別加入外消旋2-異丙基氨基丙酸芐基酯(5mmol)，磷酸緩沖液(pH8.0)，南極假絲酵母脂肪酶(0.2g)，25℃恒溫?fù)u床中開始反應(yīng)。反應(yīng)4小時后結(jié)束反應(yīng)，用乙醚萃取除去未反應(yīng)的(R)-2-異丙基氨基丙酸芐基酯，水層用0.1mol/L HCL酸化到pH5.5，然后用乙醚萃取，乙醚層經(jīng)無水硫酸鈉干燥后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到(S)-2-異丙基氨基丙酸產(chǎn)品，產(chǎn)量0.55g，化學(xué)純度99％，旋光純度98％e.e.p。
未反應(yīng)的(R)-2-異丙基氨基丙酸芐基酯(0.5g)加入假單胞菌脂肪酶(0.2g)，磷酸緩沖液(pH8.0)，45℃恒溫?fù)u床中開始反應(yīng)。反應(yīng)60小時后結(jié)束反應(yīng)，用0.1mol/L HCL酸化到pH5.5，然后用乙醚進(jìn)行萃取，乙醚層經(jīng)無水硫酸鈉干燥后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到高化學(xué)純和光學(xué)純的(R)-2-異丙基氨基丙酸產(chǎn)品，產(chǎn)量0.45g，化學(xué)純度99％，旋光純度98％e.e.p。
拆分得到的酸的絕對構(gòu)型的證明、轉(zhuǎn)化率和對映體過量值的測定同實施例一。
實施例六100mL反應(yīng)瓶中，分別加入外消旋2-[(2，6-二甲基)苯基氨基]丁酸甲酯(5mmol)，磷酸緩沖液(pH8.0)，固定化假單胞菌脂肪酶(9.0g，)(假單胞菌脂肪酶以分子篩為載體固定化)，37℃恒溫?fù)u床中開始反應(yīng)，反應(yīng)50小時后結(jié)束反應(yīng)，反應(yīng)混合物濾去酶，用乙醚進(jìn)行萃取除去未反應(yīng)的(S)-2-[(2，6-二甲基)苯基氨基]丁酸甲酯，水層用0.1mol/L HCL酸化到pH5.5，然后用乙醚萃取，乙醚層經(jīng)無水硫酸鈉干燥后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到高化學(xué)純和光學(xué)純的(R)-2-[(2，6-二甲基)苯基氨基]丁酸產(chǎn)品，產(chǎn)量0.52g，化學(xué)純度91％，旋光純度90％e.e.p。
未反應(yīng)的(S)-2-[(2，6-二甲基)苯基氨基]丁酸甲酯(0.5g)加入南極假絲酵母脂肪酶(0.1g)，磷酸緩沖液(pH8.0)，25℃恒溫?fù)u床中開始反應(yīng)，反應(yīng)4小時后，結(jié)束反應(yīng)，用0.1mol/L HCL酸化到pH5.5，然后用乙醚進(jìn)行萃取，乙醚層經(jīng)無水硫酸鈉干燥旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到高化學(xué)純和光學(xué)純的(S)-2-[(2，6-二甲基)苯基氨基]丁酸產(chǎn)品，產(chǎn)量0.5g，化學(xué)純度99％，旋光純度98％e.e.p。
濾出的固定化脂肪酶經(jīng)處理后，可以重復(fù)使用多次。
轉(zhuǎn)化率和對映體過量值的測定同實施例一。
權(quán)利要求
1.一種脂肪酶催化拆分N取代α氨基酸外消旋光學(xué)異構(gòu)體的方法，按如下步驟進(jìn)行(a)使結(jié)構(gòu)式為 外消旋N取代α氨基酸酯，緩沖液和脂肪酶，在恒溫攪拌或振蕩下反應(yīng)，達(dá)到最高轉(zhuǎn)化率后，終止反應(yīng)，反應(yīng)混合物中含有一種構(gòu)型N取代α氨基酸和未反應(yīng)另一種構(gòu)型N取代α氨基酸酯；(b)該混合物用乙醚萃取除去未反應(yīng)的另一種構(gòu)型N取代α氨基酸酯；(c)水層酸化到pH5.5，用乙醚萃??；(d)乙醚層用無水硫酸鈉干燥后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到一種構(gòu)型N取代α氨基酸；(e)含有未反應(yīng)的另一種構(gòu)型N取代α氨基酸酯的乙醚層經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，進(jìn)一步酶催化水解，加入緩沖液和另行選擇的脂肪酶，在恒溫攪拌或振蕩下反應(yīng)，達(dá)到最高轉(zhuǎn)化率后，終止反應(yīng)；(f)水層酸化到pH5.5，用乙醚萃取；(g)乙醚層用無水硫酸鈉干燥后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)可得另一種構(gòu)型N取代α氨基酸。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其中N取代α氨基酸酯結(jié)構(gòu)式中R1和R2分別可以分別是直鏈烷烴、支鏈烷烴、烷烴衍生物、芳香烴及芳香烴衍生物，R3可以是直鏈烷烴。
3.按照權(quán)利要求1或2的方法，其中R3可以是C1-C5的直鏈烷烴。
4.按照權(quán)利要求1的方法，其中脂肪酶可以是動物、微生物等各種來源的脂肪酶。
5.按照權(quán)利要求1或4的方法，所用的酶可以是游離酶也可以是固定化酶。
6.按照權(quán)利要求1或4的方法，其中所使用的游離脂肪酶與底物的質(zhì)量比可以是1∶20-1∶1、固定化脂肪酶與底物的質(zhì)量比可以是3∶1-9∶1。
7.按照權(quán)利要求1的方法，其中恒溫溫度可選擇范圍為20-45℃。
8.按照權(quán)利要求1的方法，其中酶催化反應(yīng)時間為4-96小時。
9.按照權(quán)利要求1的方法，使用的緩沖液可以是pH7.0-8.5范圍的任何類型緩沖溶液。
10.一種測定N取代α氨基酸轉(zhuǎn)化率和對映體過量值的方法(a)轉(zhuǎn)化率的檢測通過高效毛細(xì)管電泳，以三乙胺/乙酸緩沖液作為背景電解質(zhì)溶液，反向電場強度340V/cm，電泳溫度20℃，樣品濃度50mg/L，紫外檢測器200nm；(b)對映體過量值檢測通過高效毛細(xì)管電泳，以三乙胺/乙酸緩沖液作為背景電解質(zhì)溶液，采用環(huán)糊精作為手性選擇劑，不需要處理毛細(xì)管柱，反向電場強度340V/cm，電泳溫度20℃，樣品濃度50mg/L，紫外檢測器200nm，就可以使N取代α氨基酸對映體得到較好分離。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種N取代α氨基酸外消旋異構(gòu)體的酶催化拆分方法。包括如下步驟使N－取代α氨基酸酯在緩沖液中和脂肪酶反應(yīng)，反應(yīng)混合物用乙醚萃取，水層酸化，乙醚萃取，乙醚層干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到一種構(gòu)型N取代α氨基酸；未反應(yīng)的另一種構(gòu)型N取代α氨基酸酯通過酶的第二次拆分可得到另一種構(gòu)型N－取代α氨基酸。該方法條件溫和，基本沒有副產(chǎn)物；操作簡單，拆分反應(yīng)效率高，得到的目標(biāo)化合物具有高化學(xué)純度和光學(xué)純度。本發(fā)明還提供一種測定N取代α氨基酸轉(zhuǎn)化率和對映體過量值的方法。
文檔編號C12P41/00GK1632129SQ20041001123
公開日2005年6月29日 申請日期2004年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月19日
發(fā)明者曹淑桂, 鄭良玉, 張鎖秦, 高貴, 趙麗芳, 楊雪瑩 申請人:吉林大學(xué)