專利名稱：：克服預(yù)存免疫反應(yīng)對(duì)腺病毒載體產(chǎn)品不利影響的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種克服預(yù)存免疫反應(yīng)對(duì)腺病毒載體產(chǎn)品不利影響的方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：腺病毒(Adenoviruses,Ad)是一種特征性的二十面體病毒殼體，它的基因組是線性的雙鏈DNA,約34kb到43kb。Ad的宿主范圍很廣。人源Ad可分為6個(gè)亞群，約51種血清型。目前開(kāi)發(fā)的腺病毒載體主要以5型腺病毒(Ad5)為主，Ad5載體系統(tǒng)作為基因轉(zhuǎn)移載體有如下諸多優(yōu)點(diǎn)1)安全性對(duì)腺病毒(尤其是Ad5和Ad2)基因組和各基因功能及致病情況的研究較其他病毒載體最為透徹；腺病毒不整合到染色體中，無(wú)插入致突變性，不會(huì)干擾其它的宿主基因。5型腺病毒比較溫和，正常人感染后可以自愈；通過(guò)刪除、置換E1區(qū)，可造成腺病毒的復(fù)制缺陷，并且避免了E1基因?qū)?xì)胞的轉(zhuǎn)化作用，因此更加安全。2)有效性腺病毒可以高效的感染處于分裂期與靜息期的細(xì)胞，而且攜帶的外源基因可以長(zhǎng)時(shí)間高水平地表達(dá)；重組腺病毒載體具有很高的容納外源基因的能力，經(jīng)過(guò)改造的腺病毒載體可允許插入長(zhǎng)達(dá)40kb的基因，并且能同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因。3)生產(chǎn)工藝成熟腺病毒可以在宿主細(xì)胞中復(fù)制增長(zhǎng)到很高的滴度(達(dá)到lxlO"pfo/ml)，適于重組疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)；腺病毒的物理化學(xué)性狀比較穩(wěn)定，可以冷凍保存數(shù)月不失去感染能力，所以可以方便地運(yùn)輸、儲(chǔ)存重組腺病毒疫苗成品。由于重組腺病毒具有以上優(yōu)點(diǎn)，因而Ad載體作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體、4重組疫苗和基因治療載體備受青睞。目前全球范圍內(nèi)以腺病毒作為載體治療傳染性疾病、癌癥、心血管疾病、單基因疾病等的臨床實(shí)驗(yàn)有342例之多，在各類載體中占首位(24.8%)。我國(guó)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的世界上第一個(gè)基因治療藥物今又生(重組人p53腺病毒注射液)，使用的也是復(fù)制缺陷型的Ad5載體。然而由于自然感染腺病毒，大多數(shù)人體內(nèi)長(zhǎng)期維持著一定水平的抗腺病毒本身的免疫反應(yīng)，這種預(yù)存的免疫反應(yīng)包括抗腺病毒中和抗體和針對(duì)腺病毒的殺傷性T細(xì)胞(CTL)。研究表明非洲和美洲地區(qū)的人群中Ad5型中和抗體陽(yáng)性率很高，部分國(guó)家陽(yáng)性率甚至超過(guò)90%。我們實(shí)驗(yàn)室的初步數(shù)據(jù)也表明中國(guó)廣東人群中Ad5型中和抗體陽(yáng)性率也高達(dá)75%。有確信的證據(jù)表明這些中和抗體會(huì)對(duì)基于腺病毒載體產(chǎn)品產(chǎn)生中和作用，從而抑制其進(jìn)入機(jī)體細(xì)胞而其所攜帶的目的基因就得不到預(yù)期水平的表達(dá)甚至是完全不表達(dá)，此外具有交叉性的針對(duì)腺病毒載體的CTL反應(yīng)會(huì)殺死已經(jīng)感染了腺病毒載體的靶細(xì)胞從而阻斷外源基因的持續(xù)表達(dá)?？傊A(yù)存的免疫反應(yīng)會(huì)大大降低基于腺病毒載體的疫苗免疫或者基因治療的效率。為了克服預(yù)存免疫反應(yīng)對(duì)腺病毒載體產(chǎn)品的影響，提升腺病毒載體的應(yīng)用范圍，研究者們嘗試了多種方法影響。使用的免疫抑制劑包括環(huán)孢霉素、環(huán)磷酰胺、FK506等。這些研究的缺陷在于這種方式的免疫抑制或者免疫調(diào)節(jié)特異性較差，容易產(chǎn)生副作用，不適用于機(jī)體免疫力較差的群體。2)使用聚乙二醇共價(jià)修飾病毒殼蛋白或者通過(guò)陽(yáng)離子脂質(zhì)體對(duì)病毒顆粒進(jìn)行包裹以掩蓋腺病毒表面的中和抗體結(jié)合位點(diǎn)。研究證實(shí)這種方法在小鼠和猴子中能有效降低機(jī)體對(duì)腺病毒本身的免疫反應(yīng)，因而可以實(shí)現(xiàn)一定程度的重復(fù)利用腺病毒載體。但這種包裹使得病毒顆粒進(jìn)入細(xì)胞后不能有效釋放，轉(zhuǎn)基因的表達(dá)也大為P條低。3)使用嵌合型腺病毒載體以改變腺病毒與宿主細(xì)胞表面的相互作用，這方面的研究主要集中在對(duì)重組腺病毒纖毛(fiber)和纖毛頭節(jié)區(qū)進(jìn)行修飾。但這種嵌合型載體也只能一次性使用，因?yàn)槭褂靡淮魏髾C(jī)體就會(huì)產(chǎn)生針對(duì)改造過(guò)的腺病毒載體的中和抗體。4)使用非人類腺病毒作為載體或使用人群流行率較低的稀有血清型腺病毒作為載體。非人類腺病毒載體主要為猿腺病毒載體，人的稀有血清型腺病毒包括Ad26,Ad35，Ad41等等。這些載體近幾年發(fā)展比較迅速，但這種載體的最大問(wèn)題在于它們的安全性還未得到證實(shí)，而且這種方法也不能從根本上克服再次使用這些載體時(shí)機(jī)體已經(jīng)產(chǎn)生的免疫反應(yīng)。因此開(kāi)發(fā)一種更加安全，有效，且使用方便的克服預(yù)存免疫反應(yīng)對(duì)腺病毒載體產(chǎn)品不利影響的技術(shù)無(wú)疑有著重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。
發(fā)明內(nèi)容為了能更加安全，有效，且使用方便的克服預(yù)存免疫反應(yīng)對(duì)腺病毒載體產(chǎn)品不利影響，本發(fā)明提供了一種克服預(yù)存免疫反應(yīng)對(duì)腺病毒載體產(chǎn)品不利影響的方法(AVIP)及其應(yīng)用。本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下本發(fā)明的一種克服預(yù)存免疫反應(yīng)對(duì)腺病毒載體產(chǎn)品不利影響的方法(AVIP)為將所述腺病毒載體產(chǎn)品體外感染有預(yù)存免疫反應(yīng)的機(jī)體內(nèi)的耙細(xì)胞，再將感染得到的靶細(xì)胞輸回至所述有預(yù)存免疫反應(yīng)的機(jī)體內(nèi)。上述的靶細(xì)胞是指可以在自然情況下以及通過(guò)人為處理后可以被腺病毒感染的宿主細(xì)^>。優(yōu)選的，上述靶細(xì)胞是外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以從機(jī)體的全血，血漿等得到本技術(shù)所用的PBMC細(xì)胞。優(yōu)選的，上述靶細(xì)胞是外周血單個(gè)核細(xì)胞中的單核細(xì)胞。優(yōu)選的，上述單核細(xì)胞為CD14+單核細(xì)胞。優(yōu)選的，上述靶細(xì)胞是從有預(yù)存免疫反應(yīng)的機(jī)體的全血中去除了血漿成分和紅細(xì)月包的白細(xì)月包。優(yōu)選的，上述輸回至所述有預(yù)存免疫反應(yīng)的機(jī)體內(nèi)采用靜脈回輸?shù)姆绞健?優(yōu)選的，上述腺病毒載體產(chǎn)品是攜帶外源基因的重組腺病毒疫苗、重組腺病毒基因治療產(chǎn)品或真核細(xì)胞表達(dá)載體。優(yōu)選的，上述腺病毒載體指本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何腺病毒亞型，分離林或其他動(dòng)物來(lái)源的腺病毒。具體地，可以是5型或2型腺病毒載體。本發(fā)明的克服預(yù)存免疫反應(yīng)對(duì)腺病毒載體產(chǎn)品不利影響的方法應(yīng)用在基于腺病毒載體攜帶抗原基因的預(yù)防性和治療性疫苗中、基于腺病毒載體攜帶治療性基因的基因治療中或基于腺病毒載體在報(bào)告指示系統(tǒng)中。本發(fā)明具有如下有益效果由于在PBMC分離純化過(guò)程中，已將血液中的預(yù)存抗腺病毒中和抗體以及紅細(xì)胞等其他可能影響腺病毒載體感染的因素去掉，因此可以盡可能降低預(yù)存免疫反應(yīng)對(duì)腺病毒載體感染效率的不利影響。此外，由于AVIP的特征還在于整個(gè)感染過(guò)程是發(fā)生在體外，因此可以更有效地控制和增強(qiáng)腺病毒載體產(chǎn)品對(duì)靶細(xì)胞的感染效率。本方法可以普遍用于重組腺病毒疫苗載體、基因治療載體以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)栽體在有預(yù)存腺病毒免疫反應(yīng)機(jī)體中的使用。下面將結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。圖1是通過(guò)攜帶GFP報(bào)告基因的腺病毒載體來(lái)優(yōu)化體外感染PBMC細(xì)胞的條件的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖2是通過(guò)攜帶GFP報(bào)告基因的腺病毒載體來(lái)研究體外感染PBMC細(xì)胞的機(jī)制的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖3是腺病毒載體更易感染從預(yù)存免疫反應(yīng)的恒河猴中分離的PBMC細(xì)胞的證明實(shí)驗(yàn)的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖4是腺病毒載體更易感染從預(yù)存免疫反應(yīng)的人體中分離的PBMC細(xì)胞的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖5是構(gòu)建的腺病毒載體流感疫苗具有良好的免疫原性的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例的實(shí)^r結(jié)果圖；恒河猴中激發(fā)HA特異的細(xì)胞免疫應(yīng)答的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖7是通過(guò)ICS檢測(cè)到AVIP技術(shù)可以有效地在有預(yù)存免疫反應(yīng)的恒河猴中激發(fā)HA特異的細(xì)胞免疫應(yīng)答的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖8是構(gòu)建的腺病毒載體SIV疫苗可以更有效感染從預(yù)存免疫反應(yīng)的恒河猴中分離的PBMC細(xì)胞的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果恒河猴中激發(fā)ENV特異的細(xì)胞免疫應(yīng)答的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖10是通過(guò)ICS檢測(cè)到AVIP技術(shù)可以更有效地在有預(yù)存免疫反應(yīng)的恒河猴中激發(fā)ENV特異的細(xì)胞免疫應(yīng)答的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖11是通過(guò)ELISA4企測(cè)到AVIP技術(shù)可以更有效地在有預(yù)存免疫反應(yīng)的恒河猴中激發(fā)ENV特異的抗體免疫應(yīng)答的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。具體實(shí)施例方式為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1:腺病毒載體在體外感染PBMC細(xì)胞的M優(yōu)化l.PBMC細(xì)胞的獲得采用OptiPrepTM淋巴細(xì)胞分離液(AxisShieldPocAs,Oslo,Norway)分離猴和人的PBMC，方法如下1)用EDTA抗凝管收集新鮮的血液。2)轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，再加入1/8體積的Optiprep淋巴細(xì)胞分離液，上下顛倒數(shù)次以充分混勻。3)在上層液面加入0.5-lmlRPMI1640培養(yǎng)基。4)900g,室溫，水平轉(zhuǎn)頭離心30min。5)吸取中間的淋巴細(xì)胞層，轉(zhuǎn)移到另一支15ml離心管中，加入10mlRPMI1640培養(yǎng)基，混勻，250g(1500rpm)，離心10min，棄上清。6)重復(fù)步驟5)—次后去上清，用l~2mlRPMI1640完全培養(yǎng)基重懸，計(jì)數(shù)。2.腺病毒感染PBMC細(xì)胞的條件優(yōu)化1)取lxl(^個(gè)上述分離的PBMC細(xì)胞，在不同條件下與Ad5-EGFP腺病毒共同孵育。2)離心收集細(xì)胞，用1640液洗滌2次。3)加入lml含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基重懸，37°C,5%C02培養(yǎng)20-24h。4)收集這些感染過(guò)的細(xì)胞，用流式洗液(含1%胎牛血清和0.0r/。NaN3的PBS溶液)洗滌2次。5)在FACScalibur(BDBiosciences,美國(guó))流式細(xì)胞儀上檢測(cè)增強(qiáng)型綠色萸光蛋白(EGFP)的表達(dá)情況，用CellQuest軟件(BDBiosciences,美國(guó))獲取數(shù)據(jù)，用WinMDIv2.9軟件(ScrippsResearchInstitute,LaJolla,CA)分析數(shù)據(jù)。上述步驟l)中的不同條件包括不同的感染劑量；不同的感染溫度；不同的感染時(shí)間；以及感染過(guò)程中有無(wú)施加離心力。如附圖IA和IB所示，Ad5-EGFP幾乎不感染淋巴細(xì)胞群，主要感染PBMC中的非淋巴細(xì)胞群，其中以單核細(xì)胞為主。在37。C條件下，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，感染效率無(wú)明顯變化，感染lh達(dá)到感染峰值；隨著感染復(fù)數(shù)的增加，感染效率也逐步增加，見(jiàn)圖1C。但感染復(fù)數(shù)過(guò)大則會(huì)誘發(fā)大量細(xì)胞死亡(數(shù)據(jù)未顯示)。37。C時(shí)的感染效率比室溫高，但差別不明顯。為了方便實(shí)際應(yīng)用，后續(xù)研究選用室溫條件。更重要的是在感染過(guò)程中加以離心處理提高了感染效率，見(jiàn)圖1C和1D。實(shí)施例2:腺病毒載體感染PBMC細(xì)胞的機(jī)制研究為進(jìn)一步了解AVIP技術(shù)中腺病毒載體感染PBMC細(xì)胞的詳細(xì)信息，本實(shí)施例通過(guò)流式細(xì)胞儀技術(shù)分析Ad5-EGFP感染PBMC細(xì)胞中各種細(xì)胞群的情況。方法如下1)按照實(shí)施例1中的方法用Ad5-EGFP感染PBMC細(xì)胞。2)37°C,5%032培養(yǎng)20-24h。收集這些感染過(guò)的細(xì)胞，用流式洗液洗滌29次。3)加入相應(yīng)的熒光標(biāo)記的細(xì)胞表面分子標(biāo)記的單克隆抗體，混勻室溫避光反應(yīng)20min。本實(shí)施例中以CD3作為T(mén)淋巴細(xì)胞的標(biāo)志，CD19作為B淋巴細(xì)胞的標(biāo)志，CD14作為單核細(xì)胞的標(biāo)志，CD56作為NK細(xì)胞的標(biāo)志。4)用流式洗'液洗滌一次。5)用300ul流式洗液重懸，混勻。6)在FACScalibur(BDBiosciences,美國(guó))流式細(xì)胞儀上分析各個(gè)細(xì)胞群中EGFP蛋白的表達(dá)情況，用CellQuest軟件(BDBiosciences,美國(guó))獲取數(shù)據(jù)，用WinMDIv2.9軟件(ScrippsResearchInstitute,LaJolla,CA)分析數(shù)據(jù)。如附圖2A和2B所示，Ad5-EGFP主要感染CD14+單核細(xì)胞，對(duì)T細(xì)胞和B細(xì)胞幾乎不感染。此外它還可以感染NK細(xì)胞，但比例較低。進(jìn)一步的數(shù)據(jù)分析，參見(jiàn)附圖2C,表明對(duì)各個(gè)細(xì)胞群的感染效率分別為CD14+單核細(xì)胞(87.10%±6.09%,n=24);T細(xì)胞(0.08%±0.017%,n=24)，B細(xì)胞(0.28%±0.060/o,n=24);NK細(xì)胞(13.76%土3.68%,n=4)。除了上述的不同細(xì)胞群被感染比例有差異，附圖2D還表明了那些感染比例高的細(xì)胞群中表達(dá)目的蛋白的水平也較高。本實(shí)施中的目的蛋白的表達(dá)水平(即EGFP)是以平均熒光強(qiáng)度(MFI)來(lái)表示的。總之，本實(shí)施例利用GFP蛋白作為報(bào)告系統(tǒng)，證實(shí)了腺病毒載體可高效率地感染PBMC細(xì)胞中的CD14+單核細(xì)胞。實(shí)施例3:腺病毒載體更易感染從預(yù)存免,M應(yīng)的恒河猴中分離的PBMC細(xì)胞的研究在實(shí)施例1和2中，我們發(fā)現(xiàn)無(wú)論采取何種條件進(jìn)行感染，相比于沒(méi)有預(yù)存腺病毒免疫反應(yīng)的兩只恒河猴的PBMC細(xì)胞，Ad5-EGFP對(duì)兩只預(yù)存腺病毒免疫反應(yīng)的恒河猴的PBMC細(xì)胞的感染效率均要高。為進(jìn)一步聰、〖正這種差別，本實(shí)施例在較大群體的猴子中進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。方法如下1)按照實(shí)施例1中的方法用Ad5-EGFP感染PBMC細(xì)胞。2)37°C,5%032培養(yǎng)20-24h。收集這些感染過(guò)Ad的細(xì)胞，用流式洗液洗滌2次。3)加入熒光標(biāo)記的CD14細(xì)胞表面分子標(biāo)記的單克隆抗體，混勻室溫避光反應(yīng)20min。4)用FACS洗液洗滌一次。5)用300ulFACS吸液重懸，混勻。6)在FACScalibur(BDBiosciences,美國(guó))流式細(xì)胞儀上分析各個(gè)細(xì)胞群中EGFP蛋白的表達(dá)情況，用CellQuest軟件(BDBiosciences,美國(guó))獲取數(shù)據(jù)，用WinMDIv2.9軟件(ScrippsResearchInstitute,LaJolla，CA)分析數(shù)據(jù)。7)本實(shí)驗(yàn)中的數(shù)據(jù)使用JMPv6.0軟件(SAS,USA)結(jié)合Excd2003(Microsoft,USA)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果表示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤，兩組比較采用Student'st檢驗(yàn)，多組兩兩比較采用ANOVA,a=0.05。如附圖3A和3B所示，在15只免疫過(guò)Ad5載體(既有預(yù)存腺病毒免疫反應(yīng))的實(shí)驗(yàn)猴和9只未經(jīng)Ad5感染的實(shí)驗(yàn)猴中進(jìn)行了上述實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ad5-EGFP對(duì)未感染過(guò)Ad5實(shí)驗(yàn)猴的CD14+單核細(xì)胞的感染效率為64.85%±0.78%(n=9)，對(duì)感染過(guò)腺病毒實(shí)驗(yàn)猴的CD14+單核細(xì)胞的感染效率為90.98°/?！?.17%(n=15)，Student'sf檢驗(yàn)兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3A，pO.OOOl)。同樣地，感染過(guò)腺病毒實(shí)驗(yàn)猴的CD14+單核細(xì)胞中的平均熒光強(qiáng)度也顯著地加強(qiáng)(圖3A,p<0.0001)。進(jìn)一步把實(shí)驗(yàn)猴按預(yù)存中和抗體的滴度分為三組高滴度(>4608,n=8);中等滴度(18<滴度<4608，n=7);低水平滴度(滴度<18，n=9)。ANOVA比較各組，發(fā)現(xiàn)無(wú)論是感染效率還是平均熒光強(qiáng)度，組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(感染效率組1與組2，p<0.0001;組1與組3，/<0.0001;組2與組3，；=0.0095。平均熒光強(qiáng)度組1與組2,p=0.0792;組1與組3,pO.0001;組2與組3,p=0.0053)(圖3B)。這表明腺病毒載體更易感染從預(yù)存免疫反應(yīng)的恒河猴中分離的PBMC細(xì)胞。實(shí)施例4:腺病毒載體更易感染從預(yù)存免^^應(yīng)人體中分離的PBMC細(xì)胞的研究由實(shí)施例3可知，相比于沒(méi)有預(yù)存免疫反應(yīng)的實(shí)—瞼猴，腺病毒載體更易感染從預(yù)存免疫反應(yīng)的恒河猴中分離的PBMC細(xì)胞。更重要地是，我們通過(guò)本實(shí)施例，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果在人體PBMC細(xì)胞中亦得到證實(shí)。這些試驗(yàn)數(shù)據(jù)大大支持了AVIP技術(shù)在有預(yù)存腺病毒免疫反應(yīng)機(jī)體中再次使用腺病毒載體產(chǎn)品的臨床可行性。具體方法如下1.試驗(yàn)人群遵循自愿的原則，從本單位34個(gè)同事中各釆集8mlEDTA抗凝的血液。2.PBMC分離與腺病毒感染詳細(xì)方法參見(jiàn)實(shí)施例1，2,3。^旦感染劑量分別為250,1250，6500病毒顆粒/細(xì)胞，這是因?yàn)锳d5腺病毒更易感染人類的PBMC細(xì)胞。檢測(cè)方法同實(shí)施例，但為了更直觀地觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，還采用了在熒光顯微鏡下觀察EGFP的表達(dá)情況。3.定量PCR技術(shù)檢測(cè)腺病毒基因組拷貝數(shù)1)不同人的PBMC細(xì)胞按照前述方法進(jìn)行Ad5-EGFP感染。2)37°C,5。/。C02培養(yǎng)24h，小心吸去上清。3)用20(^1PBS緩沖液小心漂洗細(xì)胞。4)每孔加入100iil去離子水進(jìn)行滲透壓裂解5-10min。5)移液槍吹打數(shù)次后取出裂解液，16000g離心lmin,上清作為PCR模板。6)進(jìn)行定量PCR。使用試劑盒SYBR⑧PremixExTaqTM(Takara),制品中已經(jīng)將DNA聚合酶、Buffer、dNTP、SYBRGreenI等試劑預(yù)混在一起。20pl反應(yīng)體系包括10|il2xSYBRPremixExTaq，上下游引物各lpl(終濃度為200nM),2pl模板以及6pl去離子水(RNA/DNAfree,Tiangen)。PCR反應(yīng)在OpticonTM2(CFD-3220,MJResearch,USA)檢測(cè)儀上進(jìn)行，PCR反應(yīng)程序?yàn)棰?0。C,2min;②95。C，lmin;③95。C,15sec;60°C,50s;80°Cls檢測(cè)熒光,35個(gè)循環(huán)。④熔解曲線，從72。C至90。C每0.3。C讀板一次分析。用OpticonMonitor3軟件(MJResearch,USA)計(jì)算Ct值分析溶解曲線。每個(gè)樣品共有3孔重復(fù)測(cè)定。其中用到的Ad5基因組特異引物序列為上游，TCTGAGTTGGCACCCCTATTC;下游，GTTGCTGTGGTCGTTCTGGTA。4.數(shù)據(jù)處理使用JMPv6.0軟件(SAS,USA)結(jié)合Exce12003(Microsoft,USA)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果表示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤，兩組比較采用Student'st檢驗(yàn)，多組兩兩比較釆用ANOVA，a=0.05。如同在恒河猴中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本實(shí)施例的數(shù)據(jù)也表明腺病毒載體更易感染有預(yù)存腺病毒免疫反應(yīng)人體的PBMC。如附圖4A所示，在不同的感染劑量下，相比與沒(méi)有預(yù)存免疫反應(yīng)的個(gè)體(中和抗體滴度<18,n=ll)，Ad5-EGFP腺病毒對(duì)那些分離自存在中等水平(18<中和抗體滴度<4608,11=15)以及高水平(中和抗體滴度>4608,n-8)抗腺病毒免疫反應(yīng)個(gè)體PBMC中的CD14+細(xì)胞的感染效率明顯更高(/<0.05)。同樣地，感染過(guò)腺病毒人的CD14+單核細(xì)胞中的平均熒光強(qiáng)度也顯著地加強(qiáng)(圖4B,;<0.05)。此外借助熒光顯微鏡，我們也直接觀察到了這種感染效率的差異。(圖4C)。然后用定量PCR的方法檢測(cè)PBMC細(xì)胞中腺病毒基因組的拷貝量，如圖4D所示，與預(yù)期一致，對(duì)從有預(yù)存腺病毒免疫反應(yīng)個(gè)體中分離的無(wú)論是CD14+細(xì)胞還是整體PBMC細(xì)胞中的腺病毒基因組拷貝數(shù)顯著高于從無(wú)腺病毒免疫反應(yīng)個(gè)體細(xì)胞中的拷貝數(shù)。但在CD3+T細(xì)胞中的拷貝數(shù)則沒(méi)有區(qū)別，并且數(shù)量都很低，這進(jìn)一步說(shuō)明腺病毒載體感染的是單核細(xì)胞而并非所有淋巴細(xì)胞。上述數(shù)據(jù)表明在我們的優(yōu)化條件下，重組腺病毒載體可以高效率地感染PBMC細(xì)胞，尤其更加容易感染從有預(yù)存腺病毒免疫反應(yīng)個(gè)體中分離的PBMC。實(shí)施例5:AVIP技術(shù)在預(yù)防性流感疫苗中的應(yīng)用將攜帶高致病性H5N1流感病毒血凝集素(hemagglutinin,HA)的腺病毒(Ad5-HA)通過(guò)AVIP技術(shù)感染猴PBMC,然后靜脈回輸相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)。通過(guò)ELISPOT和ICS技術(shù)檢測(cè)到，相比與普通的肌肉注射單純的Ad5-HA疫苗，利用AVIP方法在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生了針對(duì)HA抗原的更高水平的細(xì)胞免疫反應(yīng)。具體實(shí)驗(yàn)方案如下131.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物15只中國(guó)恒河猴(Afacaca柳w/ato)購(gòu)自廣東省高要市康達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司并委托該公司單籠飼養(yǎng)，體重為3-5kg,年齡為2-4歲，雌雄各半，這些猴子體內(nèi)均有預(yù)存的抗腺病毒免疫反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的操作符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的相關(guān)規(guī)定，分組情況和相關(guān)信息參見(jiàn)附表1。表1為實(shí)驗(yàn)猴子的分組情況及相關(guān)信息。所有實(shí)驗(yàn)經(jīng)中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院(GIBH)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用管理委員會(huì)認(rèn)可。2.PBMC的分離及體外感染詳細(xì)方法參見(jiàn)實(shí)施例1。從每只實(shí)-瞼猴中分離2xl07個(gè)PBMC,以7500個(gè)病毒顆粒/細(xì)胞的感染劑量進(jìn)行離心感染。3.免疫動(dòng)物感染后的PBMC用PBS緩沖液洗滌兩次，用lmlPBS緩沖液重懸。然后將細(xì)胞懸液通過(guò)靜脈注射自體回輸?shù)胶镒芋w內(nèi)。作為對(duì)照組，直接肌肉注射lxlO"vp的Ad5-HA。此外還有不免疫的空白對(duì)照組。4.免疫^(guò)r測(cè)免疫后第2、4、8、12周采集外周血進(jìn)行免疫指標(biāo)檢測(cè)，包括針對(duì)HA的細(xì)胞免疫檢測(cè)(IFN-Y酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)、胞內(nèi)細(xì)胞因子染色技術(shù))和體液免疫檢測(cè)(血凝抑制實(shí)驗(yàn)、微量中和實(shí)驗(yàn))。這些檢測(cè)技術(shù)均為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所已知的，本發(fā)明中不再贅述。如附圖5A所示，Ad5-HA重組腺病毒可以在293細(xì)胞中高水平地表達(dá)HA蛋白，并且可正確地進(jìn)行切割。在小鼠實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)了Ad5-HA具有良好的免疫原性，如附圖5B所示，用Ad5-HA肌肉注射小鼠后，在5天后即可通過(guò)ELISPOT技術(shù)檢測(cè)到高水平的HA特異細(xì)胞免疫反應(yīng)。如附圖6所示，在有預(yù)存抗腺病毒免疫反應(yīng)的實(shí)-瞼猴中，通過(guò)AVIP技術(shù)，以重組腺病毒體外感染PBMC后經(jīng)靜脈自體回輸?shù)姆绞竭M(jìn)行免疫，免疫2周后通過(guò)ELISPOT即可檢測(cè)到針對(duì)HA抗原的較高水平細(xì)胞免疫應(yīng)答，比直接肌肉注射重組腺病毒的免疫方式產(chǎn)生的細(xì)胞免疫應(yīng)答更為迅速，且在一定時(shí)間內(nèi)都14維持著相對(duì)穩(wěn)定的細(xì)胞免疫應(yīng)答水平，本實(shí)施例追蹤到免疫后12周。而且AVIP技術(shù)激發(fā)的細(xì)胞免疫反應(yīng)強(qiáng)度也比直接通過(guò)肌肉注射腺病毒載體的方式免疫相對(duì)較強(qiáng)。此外我們還發(fā)現(xiàn)以重組腺病毒體外感染PBMC后經(jīng)皮下/肌肉注射聯(lián)合的方式自體回輸?shù)膶?shí)驗(yàn)猴幾乎4企測(cè)不到細(xì)胞免疫，因此AVIP技術(shù)的免疫方式優(yōu)選地為靜脈注射。對(duì)照組的2只猴始終未檢測(cè)到這種免疫反應(yīng)。附圖7是通過(guò)ICS技術(shù)對(duì)上述的HA特異的細(xì)胞免疫應(yīng)答進(jìn)行了再次確證。總之，本實(shí)施例證明了相比常規(guī)的肌肉注射使用腺病毒載體產(chǎn)品，AVIP技術(shù)可以在有預(yù)存抗腺病毒免疫反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)猴中激發(fā)更強(qiáng)，更快，更持久的免疫應(yīng)答。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>a:抗腺病毒中和抗體滴度通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的定量檢測(cè)腺病毒中和抗體的方法檢測(cè),表格中的數(shù)值大于18則表明該樣品為中和抗體陽(yáng)性。b:抗腺病毒細(xì)胞免疫反應(yīng)通過(guò)腺病毒顆粒的裂解物來(lái)刺激實(shí)驗(yàn)猴的PBMC細(xì)胞，進(jìn)行ELISPOT檢測(cè)。表格中的數(shù)值代表斑點(diǎn)形成細(xì)胞(spotsformingcells,SFCs)/106PBMCs。實(shí)施例6:AVIP技術(shù)在預(yù)防性和治療性HIV/SIV疫苗中的應(yīng)用為進(jìn)一步證實(shí)AVIP技術(shù)在其他領(lǐng)域中的有效性和可行性，我們進(jìn)行了另一個(gè)實(shí)施例。將攜帶猴艾滋病病毒被膜蛋白(envel叩e,ENV)的腺病毒(AdSENV)通過(guò)AVIP技術(shù)感染猴PBMC，然后靜脈回輸相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)。同樣地，相比與普通的肌肉注射單純的Ad5-ENV疫苗，通過(guò)ELISPOT和ICS技術(shù)檢測(cè)到利用AVIP方法在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生了針對(duì)ENV抗原的更高水平的細(xì)胞免疫反應(yīng)。而且通過(guò)ELISA技術(shù)檢測(cè)到利用AVIP方法在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生了針對(duì)ENV抗原的更高水平的抗體免疫反應(yīng)。此外我們還在進(jìn)行攜帶多種或者全部HIV抗原基因的多價(jià)腺病毒載體疫苗的相關(guān)實(shí)驗(yàn)。1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物同實(shí)施例5所述。2.Ad5-SIVenv感染PBMC的劑量?jī)?yōu)化不同的感染劑量的Ad5-SIVenv病毒與猴PBMC細(xì)胞混合，按照前述方法感染。收集這些細(xì)胞，用Trizol方法提取細(xì)胞RNA。然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，步驟如下取9ulRNA溶液+luloligadT引物，70度5min,冰浴。然后依次加入5ulM-MLVbuffer,5uldNTP，lulRNA酶抑制劑，lulM-MLV酶，3ul無(wú)菌水。接著37度反應(yīng)lh得到逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。以這些產(chǎn)物為才莫豐反進(jìn)行熒光定量PCR(Q-PCR)以測(cè)定ENVmRNA的相對(duì)拷貝數(shù)。Q-PCR的反應(yīng)體系和條件參見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)(Takara)。其中用到的ENV特異引物序列為上游，CAGGAGTCCTGTGACAAGCACTA;下游，TTGGGCATGAAGCCAGAGTAG。Betaactin內(nèi)參的引物序列為上游，GCATTCTCACCCTGAAGTA;下游，GCAGCTCATTGTAGAAGGT。反應(yīng)在儀器OpticonTM2(CFD-3220,MJResearch,USA)上進(jìn)行，數(shù)據(jù)用軟件OpticonMonitor3(MJResearch,USA)分析。3.免疫動(dòng)物從每只實(shí)-驗(yàn)r猴中分離l-3xl07個(gè)PBMC,以7500個(gè)病毒顆粒/細(xì)胞的感染劑量進(jìn)行離心感染。感染后的PBMC用PBS緩沖液洗滌兩次，用lmlPBS緩沖液重懸。然后將細(xì)胞懸液通過(guò)靜脈注射自體回輸?shù)胶镒芋w內(nèi)。作為對(duì)照組，直接肌肉注射lxio"vp的Ad5-SIVenv。此外還有不免疫的空白對(duì)照組。4.免疫檢測(cè)免疫后第2、4、8、12周采集外周血進(jìn)行免疫指標(biāo)檢測(cè)，包括針對(duì)ENV的細(xì)胞免疫檢測(cè)(IFN-yELISPOT,ICS)和體液免疫檢測(cè)(ELISA)。這些4全測(cè):技術(shù)均為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所已知的，本發(fā)明中不再贅述。本實(shí)施例更直接地證明了，在本發(fā)明的優(yōu)化條件下，攜帶目的基因(本實(shí)施例中是SIV病毒的env基因)的腺病毒載體可以有效地從有預(yù)存腺病毒免疫反應(yīng)實(shí)驗(yàn)猴的PBMC細(xì)胞。如本說(shuō)明書(shū)的附圖8A所示，通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)，證實(shí)了Ad5-SIVenv對(duì)猴PBMC的感染效率是呈現(xiàn)劑量依賴性的，隨著感染劑量升高，表達(dá)的目的基因的mRNA水平也相應(yīng)升高。但劑量過(guò)高則導(dǎo)致細(xì)胞大量調(diào)亡，從而目的基因的表達(dá)也受到影響。附圖8B說(shuō)明了Ad5-SIVenv可以高效率地在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)ENV蛋白，即gpl60糖蛋白，并且可以進(jìn)一步切割成gp41和gpl20糖蛋白。在有預(yù)存抗腺病毒免疫反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)猴中，通過(guò)AVIP技術(shù)，以Ad5-SIVenv體外感染PBMC后經(jīng)靜脈自體回輸?shù)姆绞竭M(jìn)行一次免疫。如本說(shuō)明書(shū)的附圖9所示，通過(guò)ELISPOT技術(shù)在免疫2周后即可檢測(cè)到針對(duì)ENV抗原高水平的細(xì)胞免疫應(yīng)答，在第4周達(dá)到高峰，并且可以一直持續(xù)到笫12周。雖然實(shí)驗(yàn)猴之間有較大的個(gè)體差異，但在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)里，相比直接肌肉注射Ad5-SIVenv的免疫方式，AVIP技術(shù)激發(fā)的ENV特異的細(xì)胞免疫應(yīng)答更強(qiáng)(p<0.05)。進(jìn)一步，通過(guò)ICS技術(shù)對(duì)免疫后激發(fā)的ENV特異的細(xì)胞免疫應(yīng)答進(jìn)行了檢測(cè)。如附圖10所示，AVIP技術(shù)激發(fā)了更強(qiáng)的CD4+T和CD8+T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。此外，我們還通過(guò)ELISA技術(shù)檢測(cè)了猴子體內(nèi)的抗SIV病毒特異的抗體應(yīng)答水平，如附圖ll所示，同樣地，實(shí)驗(yàn)猴之間的抗體反應(yīng)個(gè)體差異也很大，但AVEP方式激發(fā)的抗體效價(jià)水平明顯比直接肌肉注射組更高(;<0.01)?？傊?，以上兩個(gè)實(shí)施例證明了AVIP技術(shù)可以有效地克服預(yù)存腺病毒免疫反應(yīng)對(duì)腺病毒載體產(chǎn)品的不利影響，這將大大擴(kuò)展腺病毒載體產(chǎn)品的臨床使用效率和應(yīng)用范圍。最后應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。權(quán)利要求1、一種克服預(yù)存免疫反應(yīng)對(duì)腺病毒載體產(chǎn)品不利影響的方法，其特征在于，將所述腺病毒載體產(chǎn)品體外感染有預(yù)存免疫反應(yīng)的機(jī)體內(nèi)的靶細(xì)胞，再將感染得到的靶細(xì)胞輸回至所述有預(yù)存免疫反應(yīng)的機(jī)體內(nèi)。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的靶細(xì)胞是外周血單個(gè)核細(xì)胞。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的耙細(xì)胞是外周血單個(gè)核細(xì)胞中的單核細(xì)胞。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的單核細(xì)胞為CD14+單核細(xì)胞。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的耙細(xì)胞是從所述有預(yù)存免疫反應(yīng)的機(jī)體的全血中去除了血漿成分和紅細(xì)胞的白細(xì)胞。6、根據(jù)權(quán)利要求1-5之一所述的方法，其特征在于，所述輸回至所述有預(yù)存免疫反應(yīng)的機(jī)體內(nèi)采用靜脈回輸?shù)姆绞健?、根據(jù)權(quán)利要求1-5之一所述的方法，其特征在于，所述腺病毒載體產(chǎn)品是攜帶外源基因的重組腺病毒疫苗、重組腺病毒基因治療產(chǎn)品或真核細(xì)胞表達(dá)載體o8、根據(jù)權(quán)利要求l-5之一所述的方法，其特征在于，所述腺病毒載體是5型或2型腺病毒載體。9、權(quán)利要求1-5之一所述的方法在基于腺病毒載體攜帶抗原基因的預(yù)防性和治療性疫苗中、基于腺病毒載體攜帶治療性基因的基因治療中或基于腺病毒載體在報(bào)告指示系統(tǒng)中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明提供了克服預(yù)存免疫反應(yīng)對(duì)腺病毒載體產(chǎn)品不利影響的方法。將腺病毒載體產(chǎn)品體外感染有預(yù)存免疫反應(yīng)的機(jī)體內(nèi)的靶細(xì)胞，再將感染得到的靶細(xì)胞輸回至該機(jī)體內(nèi)。上述靶細(xì)胞是外周血單個(gè)核細(xì)胞、外周血單個(gè)核細(xì)胞中的單核細(xì)胞或從有預(yù)存免疫反應(yīng)的機(jī)體的全血中去除了血漿成分和紅細(xì)胞的白細(xì)胞。本方法可以有效地克服預(yù)存免疫反應(yīng)對(duì)腺病毒載體產(chǎn)品不利影響，普遍用于重組腺病毒疫苗載體、基因治療載體以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體在有預(yù)存腺病毒免疫反應(yīng)機(jī)體中的使用。文檔編號(hào)A61K35/14GK101474207SQ200910036668公開(kāi)日2009年7月8日申請(qǐng)日期2009年1月15日優(yōu)先權(quán)日2009年1月15日發(fā)明者孫彩軍,凌陳申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院