專利名稱：表達(dá)小干擾rna的va1缺失的腺病毒載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生命科學(xué)領(lǐng)域，是一種用于表達(dá)小干擾RNA的VAl缺失的腺病毒載體系統(tǒng)及其構(gòu) 建方案和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
應(yīng)用研究連續(xù)兩年(2001-2002)被美國《Science》雜志評選為年度10大突破技術(shù)。目前， 小干擾RNA已被廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)調(diào)控、基因功能及疾病的治療研究，并成為針生物學(xué)最熱 點(diǎn)的研究領(lǐng)i或之一。在美國小干擾認(rèn)A已進(jìn)入疾病治療的臨床試驗一、二期階段(如M性黃斑 病，age-related macular degeneration, AMD)。預(yù)計小干擾RNA也將很快進(jìn)入其它疾病(如腫 瘤，病毒性疾病及神經(jīng)退行性疾病等)的臨床i微治療階段。此外，在后基因組時代，小干擾RNA 在基因的功能研究中也將會起到非常重要的作用。目前siRNA的獲得主要是通過化學(xué)合成或載體 的表達(dá)，兩者相比較，載體(尤其是病毒載體)表達(dá)的siRNA在基因功能研究特別是在疾病的 治療研究中具有一些獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，因而受到人們的廣泛關(guān)注。腺病毒載體目前已廣泛用于基因功 能研究及基因治療。腺病毒載體是目前用于小干擾RNA表達(dá)的最為廣泛載體之一，在腫瘤基因治 療中具有重要的作用。VAl是腺病毒中表達(dá)的一種非編碼的RNA，可以抑制小干擾RNA的干擾效率 (Xu S, Cullen BR. Adenovirus窗noncoding諷can inhibit small interfering麗and MicroRNA biogenesis. J Virol. 2004 Dec ;78 (23) :12868-76)。因此VAl缺失的腺病毒載體可提 高其所表達(dá)的小干擾RNA的干擾效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種表達(dá)小干擾RNA的VAl缺失的腺病毒載體。 本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題在于劍共一種表達(dá)小干擾RNA的VAl缺失的腺病毒載體的 構(gòu)建方法。
本發(fā)明所要解決的還有一個技術(shù)問題在于提供一種表達(dá)小干擾RNA的VAl缺失的腺病毒載體 的用途。
解決上述技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是重組腺病毒載體中VAl部分基因缺失，不能產(chǎn)生功能 性VAl基因；插入了 siRNA表達(dá)元件及報告基因。
本發(fā)明的VAl部分基因缺失為基因中31 g^序列缺失，缺失的,序列為
4GGCGGACGACCGGGGTTCGAGCCCCGTATCC。
本發(fā)明的siRNA表達(dá)元件及報告基因位于腺病毒載體的El區(qū)，通過mU6啟動子表達(dá)siRNA。 本發(fā)明的重組腺病毒載體為-
1、 在E3區(qū)插入一個表達(dá)元件。
2、 在E4區(qū)3'端與纖維蛋白的3'端之間插入一個表達(dá)元件。 本發(fā)明的重組腺病毒載體為
1、 用分子量為4000 8000的聚乙二醇化學(xué)修飾的重組腺病毒載體。
2、 腺病毒載體衣殼蛋白的遺傳修飾的重組腺病毒載體。 表達(dá)小干擾RNA的VA1缺失腺病毒載體的構(gòu)建方法由下述步驟組成.-
1、 構(gòu)建VA1缺失的穿梭載體；
2、 用VA1缺失的穿梭載體與腺病毒載體骨架按摩爾比3: 1在￡ w力'^5183中同源重組獲 得VA1基因突變腺病毒載體骨架；
3、 構(gòu)建表達(dá)siRNA的腺病毒El區(qū)穿梭載體；
4、 構(gòu)建魏VA1慢病毒載體，并感染HEK293細(xì)胞，通過潮霉素抗性篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)VA1 基因的重組HEK 293細(xì)胞系；
5、 將VAl基因突變的骨架載體與表達(dá)siRNA的El區(qū)穿梭載體經(jīng)酶切統(tǒng)性化，按摩爾比1: 3 共轉(zhuǎn)染重組HEK293細(xì)胞，擴(kuò)增、分離、純化，得到表達(dá)小干擾RNA的VA1缺失腺病毒載體。
本發(fā)明的步驟5中所說的重組HEK293細(xì)胞為穩(wěn)定表達(dá)VA1的HEK293細(xì)胞系。 本發(fā)明的步驟1中VA1缺失的穿梭載體的下游同源序列跨過了腺病毒骨架載體上位于13255 位的一個Pme I位點(diǎn)。
表達(dá)小干擾RNA的VA1缺失的腺病毒載體與化學(xué)治療藥物或生物毒素或單克隆抗體或細(xì)胞表 面受體的配體化合物組成復(fù)合物。
皿小干擾RNA的VA1缺失的腺病毒載 制備治療腫瘤藥物中的用途。 有效成分表達(dá)小干擾RNA的VA1缺失的腺病毒載體制備治療腫瘤藥物用常規(guī)藥用制劑的形式 來使用。所述的藥用常規(guī)制齊晗作為活性成分的表達(dá)小干擾RNA的VA1缺失的腺病毒載體，該活 性成分在制劑中與藥學(xué)上可接受的載體如適宜于靜脈注射給藥的有機(jī)或無機(jī)固體或液體賦形劑混合。
上述制劑可按照制劑的常規(guī)工藝制成。
含有表達(dá)小干擾RNA的VA1缺失的腺病毒載體治療腫瘤的藥物中含有表達(dá)小干擾RNA的VA1 缺失的腺病毒載體的重量比為0.1% 99. 5%活性成分，優(yōu)選含有重量比為0. 5% 90%的活性成分。基因治療是目前疾病治療的新手段。腺病毒載體是高效的基因運(yùn)載工具，是目前腫瘤基因治 療中最常見的病毒載體之一。采用腺病毒載體表達(dá)小干擾RNA在疾病治療(如腫瘤或神經(jīng)退行性 疾病)及基因功能研究中具有重要價值。本發(fā)明的VA1基因突變的腺病毒載體可提高其所表達(dá)的 小干擾RNA的干擾效率。因lthlt匕類載體對于疾病治療和基因功育統(tǒng)開究的效果會更好。
本發(fā)明的VA1基因突變的腺病毒載體構(gòu)建方法是:首先構(gòu)建VA1缺失的穿梭載體，然后用VA1 缺失的穿梭載體與腺病毒載體骨架按摩爾比3: 1在￡ coW幼5183中同源重組獲得VA1基因突變 腺病毒載體骨架；構(gòu)建表達(dá)siRNA的腺病毒El區(qū)shuttle載體；構(gòu)建表達(dá)VA1慢病毒載體，并感 染HEK293細(xì)胞，通過潮霉素抗性篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)VA1基因的重組HEK 293細(xì)胞系；將VA1基因 突變的骨架載體與表達(dá)siRNA的El區(qū)穿梭載體經(jīng)酶切線性化，按摩爾比1: 3共轉(zhuǎn)染重組HEK293 細(xì)胞，擴(kuò)增、分離、純化，得到表達(dá)小干擾RNA的VA1缺失腺病毒載體。


圖1是VA1基因中31bp缺失示意圖。 圖2是VA1缺失腺病毒載體骨架示意圖。 圖3是建立穩(wěn)定表達(dá)VA1基因細(xì)胞系的示意圖。 圖4 Val在HEK 293-VA1細(xì)胞中的表達(dá)。
圖5表達(dá)siHecl的Val缺失的腺病毒載體對人Hecl的沉默作用。 圖6表達(dá)siPGRN的Val缺失的腺病毒載體對人PGRN的沉默作用。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明不限于這些實施例。 實施例1
以表達(dá)siHecl的VA1缺失腺病毒載體為例其構(gòu)建方法步驟如下 1、構(gòu)建含有VA1基因突變穿梭載體
peGFPNl載體購自CLONTECH公司，經(jīng)過Asel及AflII雙酶切后，經(jīng)DNA瓊脂糖電泳純化回 收后與DNA linker (Asel-Pad-Xbal -Xhol-Afl工I )連接。經(jīng)T4連接酶14. 5 。C連接過夜，然 后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5a。并、凃布于含有100 Mg/ml的氨節(jié)青霉素的LB平板中。挑取菌落，接種 到100ug/ml的氨節(jié)青霉素的LB培養(yǎng)液中，14-16小時后，經(jīng)fl咸性裂解法提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)Pacl 酶切鑒定及測序獲得陽性克隆。由此所獲得的陽性克隆命名為pEML。以腺病毒載體骨架為模板， 通過設(shè)計引物PCR擴(kuò)增VA1基因上游片段(515 bp， 10081-10595)，引物為VA1 up for ATTMTTMCTCATCGGCTGMGCAGGGC; VA1 up back TTCTAGAGTCTAGAGCGTCMCGATTGC 。將此片段亞 克隆到pGEMT載體中，經(jīng)過酶切及測序后將此上游片段經(jīng)Pad及Xbal酶切消化后與經(jīng)同樣酶切
6的pEAAL載體連接，由此所獲得的載體稱之為pEMLVal UPF。采用同樣的方法PCR擴(kuò)增獲得VA1 基因下游片段(3.2kb， 10588-13798)。
所用擴(kuò)增引物VA1 down for
CGCCGTGATCCAT; VA1 down back ACTCGAGGAGTTGTTTAGGTACTCCTCCTCGCCCA。下游片段經(jīng)過亞克隆 到pGEMT載體中，經(jīng)過酶切及測序后將此下游片段經(jīng)Xbal和Xhol酶切消化后與經(jīng)同樣酶切的 pEMLVal UPF載體連接，由此所獲得的載體稱之為pEAALVal delta穿梭載體。在以上穿梭載體 中，VA1基因中存在3H鵬的缺失，因此使之不能產(chǎn)生具有功能的VA1基因。由此所獲得的穿梭 載體即為含有VA1基因突變穿梭載體。VAl中含有31bp的缺失，其缺失的序歹何見圖l，其缺失 序列為GGCGGACGACC GGGGTTCGAGCCCCGTATCC。在腺病毒骨架載體的13255位存在一個Pmel位點(diǎn)， 而上面所述VA1下游片段跨過了骨架載體的Pmel位點(diǎn)約550bp，從而可以通過Pmel將腺病毒骨 架載體線性化后與Pad線性化后的VA1基因突變的穿梭載體同源重組。
2、 構(gòu)建VAl基因突變腺病毒載體骨架
將PacI線性化的含有VAl基因突變shuttle載體與Pmel線性化腺病毒載體共轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì) 胞Bj5183，將菌液涂布在含有100yg/ml的氣節(jié)青毒素的LB平板中，16 24小時后，挑取離， 接種到100ug/ml的氨節(jié)青霉素的LB培養(yǎng)液中，14 16小時后，經(jīng)堿性裂解法提取質(zhì)粒DNA。經(jīng) 酶切及測序鑒定陽性克隆，所獲得的陽性克隆即為VA1基因突變腺病毒載體骨架，命名為pAd5 backbone Val delta載體。VA1缺失腺病毒載體骨架可見圖2。圖2中，黑色加寬部分代表31bp 缺失的VA1基因。
3、 構(gòu)建泰逸siRNA的腺病毒El區(qū)穿梭載體
將篩選獲得的針對人Hecl基因的小干擾RNA片段通過以下序列合成弓卿 PI: Xho I: CAGMGGCTCGAGMGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCG, P2: Spe I: CTAAAGTAGCCCCTTACTAGTCGAGGCAG AGGCA' P3: 5' TGCTGTTGACAGTGAGCGAGCCAT TCTTGACCAGAMTTAGGMGCCACAGATGTMTTTCTGGTCMGMTGGCGTGCCTACTGCTCGGA 3'。 以P3引物為模板，Pl及P2弓l物經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得針對人Hecl的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。PCR擴(kuò)增條件是 94 °C 、 2^H中，94 。C、 30秒，55 。C 、 30秒，72 。C、 30秒，30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量濃度 為1.5%的瓊脂糖電泳后回收PCR片段。將PCR片段ililXhoI及EcoRI酶切消化，電泳純化，將 酶切PCR產(chǎn)物片段與用同樣的酶切處理后的中間載體pMicro30進(jìn)1話接，連接翻牛是酶 切純化片段，1)4 10x T4連接酶緩沖液，114酶切載體，0. T4連接酶，5. 三蒸水，16°C 連接過夜。pMicro30中間載體為已經(jīng)構(gòu)建好的包含人mU6啟動子和Micro30骨架的高效siRNA表 達(dá)載體。然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)的DH5a細(xì)胞，并涂布于含有100Mg/ml的氨節(jié)青霉素的LB平板中。挑取m接種到含有100M/ml的氨^t霉素的LB培養(yǎng)液中，14 16小時后，經(jīng)堿性裂 解法提取質(zhì)粒DNA， iia酶切及測序鑒定陽性克隆。將所獲得陽性克隆命名為pMicro30/siHecl。 將siHecl表達(dá)元件從pMicro30/siHecl上經(jīng)BglII和Xbal酶切下來，質(zhì)量濃度為1. 5%的瓊脂糖 電泳純化后與用Banffl和Spel酶切處理的攜帶eGFP報告基因的腺病毒El區(qū)穿梭載體進(jìn)fi^接， 連接^#是酶切純化片段，10x T4連接酶緩沖液，114酶切載體，0.T4連接酶， 三蒸水。采用同樣的方法轉(zhuǎn)化、提取質(zhì)粒DNA、酶切鑒定獲得陽性克隆pAd5 El siHecl。 從而獲得了表達(dá)siRNA的腺病毒El區(qū)穿梭載體。
4、 構(gòu)建表達(dá)VA1慢病毒載體，并感染HEK293細(xì)胞，通過潮霉素抗性篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)VA1 基因的重組HEK 293細(xì)胞系
以腺病毒骨架載體為模版PCR擴(kuò)增VA1^:基因，其包括VaI啟動子，擴(kuò)增引物為VA1 for TGG ACA TCC AGG TGA TGC CG ; VA1 back MC CGC TTA CGC TGC GCG CG。然后將其克隆到pGEMT 載體中，經(jīng)過酶切及測序鑒定陽性克隆，其陽性克隆命名為pGREMT/VAl。然后將Val基因經(jīng)BainH I及Not I雙酶切后，經(jīng)質(zhì)量濃度為1. 2%瓊脂糖電泳純化回收后與經(jīng)相同酶切的慢病毒載體連接。 連接剝牛是2rt酶切純化片段，10x T4連接酶緩沖液，114酶切載體，0. 5)4 T4連接酶， 5. 三蒸水。16°C連接過夜。然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)的DH5 a細(xì)胞，并涂布于含有100 Mg/ml 的氨節(jié)青霉素的LB平板中。挑取菌落接種到含有100 Mg/ml的氨節(jié)青霉素的LB培養(yǎng)液中，14 16小時后，經(jīng)堿性裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過酶切及測序鑒定陽性克隆。所獲得陽性克隆命名為 pLenti-Val-hygro載體。此載體含有潮霉素抗性基因，可以用于潮霉素的抗性篩選。將 pLenti-Val-hygro載體、pCMV-VSVG及pCMV-Gag pol載體共轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞，然后分別于24、 48、 72小時收獲慢病毒上清，經(jīng)過7400rpm， 12 16小時離心純化獲得表達(dá)VA1慢病毒載體。將 所獲得的毅VA1基因的慢病毒載體感染HEK293細(xì)胞。然后通過潮霉素抗性篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)VA1 基因的重組HEK 293細(xì)胞系。細(xì)皿建立的過程見圖3。
為了檢測細(xì)胞系中VA1的表達(dá)，采用TRIZOL法提取細(xì)胞系中總RNA，然后采用RT-PCR方法 檢測VA1基因的表達(dá)。結(jié)果見圖4，圖4中1為HEK 293細(xì)胞系，作為陰性對照，經(jīng)RT-PCR檢測 表明，HEK293細(xì)胞系不表達(dá)VA1基因；2為重組HEK 293細(xì)胞系，經(jīng)RT-PCR檢測表明，重組HEK 293細(xì)胞系表達(dá)VA1基因。
5、 將VA1基因突變的骨架載體與表達(dá)siRNA的El區(qū)穿梭載體經(jīng)酶切線性化，共轉(zhuǎn)染重組 HEK293細(xì)胞，擴(kuò)增、分離、純化，得到表達(dá)小干擾RNA的VA1缺失腺病毒載體。
采用磷MI丐法將PacI線性化的表達(dá)siHecl的腺病毒穿梭載體與經(jīng)Pad線性化的VA1缺失 的腺病毒骨架共轉(zhuǎn)染HEK293Val細(xì)胞系。經(jīng)過7 10天后，可見明顯的細(xì)胞病變，然后經(jīng)過離心收獲病毒原液，經(jīng)過2 3輪的病毒擴(kuò)增后，進(jìn)一步將所獲得的病毒原液感染10個150cm的細(xì) 胞土咅養(yǎng)平皿，從而擴(kuò)增獲得足夠量的病毒原液用于后續(xù)的進(jìn)一步純化。感染的病毒的細(xì)胞經(jīng)過反 復(fù)凍融3次(37。C/酒精干冰)后經(jīng)3500 rpm離心15射中，通過兩次氯化銫密度梯度超速離心 獲得純化的表達(dá)siHecl的VA1缺失的腺病毒載體。將所獲得的表達(dá)siHecl的VA1缺失的腺病毒 載鵬染人Hela細(xì)胞，72小時后，通過RT-PCR方法檢測表達(dá)siHecl的VA1缺失的腺病毒載體 對人Hecl基因的沉默效果，檢測結(jié)果見圖5。圖5是采用TRIZ0L法提取細(xì)胞系中總RNA，采用 RT-PCR方法檢測VA1缺失的腺病毒載體表達(dá)siHecl對人Hecl基因的沉默效果。圖中，3為表達(dá) siHecl的腺病毒感染人Hela細(xì)胞系，作為陰性對照，4為表達(dá)siHecl的Val缺失的腺病毒感染 人Hela細(xì)胞系，經(jīng)RT-PCR檢測，相比對照組，Val缺失的腺病毒載體所表達(dá)的siHecl對人Hecl 的沉默效果更為明顯。 實施例2
以表達(dá)siPGRN的VA1缺失腺病毒載體為例其構(gòu)建方法歩驟如下
1、構(gòu)建表達(dá)針對人PGRN (Progranulin)基因的小干擾RNA( siPGRN)的腺病毒El區(qū)穿梭
載體
以P3弓嫩為模板，Pl及P2弓嫩經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得針對人PGRN的發(fā)夾結(jié)構(gòu)如下 Pl: Xhol: CAGMGGCTCGAGMGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCG， P2: Spel: CT雄GTAGCCCCTTACTAGT CGAGGCAGAGGCA， P3:5' TGCTGTTGACAGTGAGCGAAGGGCGTCTGTTGTGCTGATCGTAGTGAAGCCACAGATGTAC GATCAGCACMCAGACGCCCTGTGCCTACTGCCTCGGA 3'。
以P3弓嫩為模板，Pl及P2弓嫩經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得針對人PGRN的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。PCR擴(kuò)增^f牛是 94 。C 、 2 ^H中，94 。C、 30秒，55 。C 、 30秋72 。C、 30秒,30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量濃度 為1. 5%的瓊脂糖電泳后回收PCR片段。將PCR片段通過Xhol及EcoRI酶切消化，質(zhì)量濃度為1. 5% 的瓊脂糖電泳純化，將酶切PCR產(chǎn)物片段與用同樣的酶切處理后的中間載體pMicro30進(jìn)fi^接， 連接^f牛是酶切純化片段，lrt 10x T4連接酶緩沖液，l"l酶切載體，0. T4連接酶， 5.514三蒸7K，16。C連接過夜。pMicro30中間載體為已經(jīng)構(gòu)建好的包含人mU6啟動子和Micro30骨 架的高效siRNA表達(dá)載體。然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)的DH5 a細(xì)胞，并涂布于含有100 Mg/ml 的氨節(jié)青霉素的LB平板中。挑取菌落接種至晗有100 Mg/ml的氨節(jié)青霉素的LB培養(yǎng)液中，14-16 小時后，經(jīng)堿性裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過酶切及測序鑒定陽性克隆。將所獲得陽性克隆命名為 pMicro30/siPGRN。將siPGRN表達(dá)元件從pMmicro30/siPGRN上經(jīng)BglII和Xbal酶切下來，電泳 純化后與用Banffi和SpeI酶切處理的腺病毒El區(qū)穿梭載體進(jìn)行連接，連接斜牛是酶切純 化片段，10x T4連接酶緩沖液，酶切載體，0.5(4 T4連接酶，5.514三蒸水。采用同樣的方法轉(zhuǎn)化、提取質(zhì)粒DNA、酶切鑒定獲得陽性克隆，命名為pAd5 El siPGRN。
該步驟中的其它步驟與實施例1相同，獲得了表達(dá)siRNA的腺病毒El區(qū)穿梭載體。 其它步驟與實施例1相同，得到表達(dá)siPGRN的VA1缺失腺病毒載體。. 將所獲得的表達(dá)siPGRN的VA1缺失的腺病毒載體感染人Hela細(xì)胞，72小時后，通過RT-PCR 方法檢測表達(dá)siPGRN的VA1缺失的腺病毒載體對人PGRN基因的沉默效果。檢測染結(jié)果如圖6所 示采用TRIZ0L法提取細(xì)胞系中總RNA，然后采用RT-PCR方法檢測VA1缺失的腺病毒載體表達(dá) siPGRN對人PGRN基因的沉默效果。圖中，5為表達(dá)siPGRN的腺病毒感染人Hela細(xì)胞系，作為陰 性對照。6為表達(dá)siPGRN的Val缺失的腺病毒感染人Hela細(xì)胞系，經(jīng)RT-PCR檢測，相比對照組， Val缺失的腺病毒載體所表達(dá)的siPGRN對人PGRN的沉默效果更為明顯。 實施例3
以在表達(dá)siHecl的VA1缺失的腺病毒載體的E3區(qū)插入Trail基因為例其構(gòu)建方法如下
1、 構(gòu)建表達(dá)Trail的腺病毒E3區(qū)穿梭載體
以人cDNA文庫為模板，通過設(shè)計弓胸PCR擴(kuò)增人Trail基因胞外段，即氨基,列114-281， 引物為 Trail Clal for : MTCGATGTGAGAGAMGAGGTCCTCAG ; Trail Xbal back : TATCTAGATTAGCCMCTAAAAAGGCC。將此片段亞克隆到pGEMT載體中，經(jīng)過酶切及測序鑒定后，將陽 性克隆經(jīng)Clal和Xbal酶切消化后與經(jīng)同樣酶切的E3區(qū)穿梭載體Ad E3連接，連接^j牛是:酶 切純化片段，IrtL 10xT4連接酶緩沖液，mi酶切載體，連接酶，三蒸水，16°C 連接過夜。隨后經(jīng)過轉(zhuǎn)化、提^M粒DNA、酶切鑒定獲得陽性克隆就是表達(dá)Trail的腺病毒E3區(qū) 穿梭載體，命名為pAd E3 Trail。
2、 構(gòu)建E3區(qū)表達(dá)Trail基因的VA1缺失的腺病毒載體
將Pad統(tǒng)性化pAd E3 Trail與Swal統(tǒng)性化實施例1中構(gòu)建好的VA1缺失的腺病毒骨架載體， 共轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BJ5183進(jìn)行同源重組，將菌液涂布在含有100tig/ml的氨節(jié)青霉素的LB平板 中，16 24小時后，挑取菌落，接種到100txg/ml的氨節(jié)青霉素的LB培養(yǎng)液中，14 16小時后， 經(jīng)堿性裂解法提取質(zhì)粒DNA。經(jīng)酶切及測序鑒定陽性克隆，所獲得的陽性克隆即為E3區(qū)表達(dá)Trail 基因的VA1缺失的腺病毒載體，命名為Ad Val E3 Trail。
其它步驟與實施例1相同3，構(gòu)建獲得在E3表達(dá)Trail基因，在El區(qū)表達(dá)siHecl的VA1缺 失的腺病毒載體。
實施例4
以表達(dá)E3區(qū)表達(dá)Trail基因、E4-Fiber區(qū)皿IL_24、 El區(qū)表達(dá)siPGRN的VA1缺失的腺病 毒載體為例其構(gòu)建方法步驟如下1、 構(gòu)建表達(dá)IL-24的腺病毒E4-Fiber區(qū)穿梭載體
以人cDNA文庫為模板，艦設(shè)計引物PCR擴(kuò)增人IL-24基因，弓嫩為IL-24 Clal For: ATCGATATGAATTTTCMCAGAGGC， IL-24 Spel Back TACTAGTTCAGAGCTTGTAGMT TTC。將此片段亞克 隆到pGEMT載體中，經(jīng)過酶切及測序鑒定后，將陽性克隆經(jīng)Clal和Xbal酶切消化后與經(jīng)同樣酶 切的E4-Fiber區(qū)穿梭載體Ad E4-Fiber連接，隨后經(jīng)過轉(zhuǎn)化、提取質(zhì)粒DNA、酶切鑒定獲得陽性 克隆就是表達(dá)IL-24基因的腺病毒E4-Fiber區(qū)穿梭載體，命名為pAd5 E4-Fiber IL-24。
2、 構(gòu)建E3區(qū)表達(dá)Trail基因，E4-Fiber區(qū)表達(dá)IL-24的VA1缺失的腺病毒骨架載體 在實施例3中，通過E3區(qū)穿梭載體與骨架載體的重組在插入Trail基因，同時在E4-Fiber
區(qū)間也引入了一個Swal位點(diǎn)。Swal線性化的E3區(qū)表達(dá)Trail基因的腺病毒載體Ad5ValE3Trail 與Xhol線性化的表達(dá)IL-24基因的E4-Fiber區(qū)穿梭載體pAd E4-FiberIL-24共轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞 BJ5183進(jìn)行同源重組，將菌液涂布在含有100ug/ml的氨節(jié)青霉素的LB平板中，16 24小時后， 挑取菌落，接種到100yg/ml的氨節(jié)青霉素的LB培養(yǎng)液中，14 16小時后，經(jīng)堿性裂解法提取 質(zhì)粒DNA。經(jīng)酶切及測序鑒定陽性克隆，所獲得的陽性克隆即為E3區(qū)表達(dá)Trail基因，E4-Fiber 區(qū)表達(dá)IL-24的VA1缺失的腺病毒載體，命名為Ad5Val Trail-IL-24。
其它步驟與實施例1相同，構(gòu)建獲得E3區(qū)表達(dá)Trail基因，E4-Fiber區(qū)表達(dá)IL-24基因，El 區(qū)表達(dá)siPGRN的VA1缺失的腺病毒表達(dá)載體。
實施例5
以RGD修飾的表達(dá)siHecl的VA1缺失的腺病毒載體為例其構(gòu)建方法步驟如下
1、 構(gòu)建RGD修飾的VA1缺失的穿梭載體 該步驟方法與施例1完全相同。
2、 用RGD l針布的VA1缺失的穿梭載體與腺病毒載體骨架按摩爾比3: 1在￡ cWi 5J5183中 同源重組獲得RGD lit布的VA1基因突刻泉病毒載體骨架
該步驟方法與施例1完全相同。
3、 構(gòu)建表達(dá)siHecl的腺病毒E1區(qū)穿梭載體 該步驟方法與施例1完全相同。
4、 構(gòu)建,VA1慢病毒載體，并感染HEK293細(xì)胞，通過潮霉素抗性篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)VA1 基因的重組HEK 293細(xì)胞系
該步驟方法與施例1完全相同。
5、 RGD修飾的表達(dá)siHecl的VA1缺失的腺病毒載體
該步驟與實施例1相同，將上面構(gòu)建好的RGD修飾的VA1缺失的腺病毒骨架載體Ad5 Val RGD與實施例1中表達(dá)siHecl的El區(qū)穿梭載體均用Pad統(tǒng)性化，采用磷MI丐法共轉(zhuǎn)染重組HEK 293 細(xì)胞系。獲得RGD修飾的表達(dá)siHecl的VAl缺失的腺病毒載體，命名為Ad5Val RGD siHecl。核苷酸序列
核苷鵬列表 <110〉陜西師范大學(xué)
<120>表達(dá)小干擾RNA的VA1缺失的腺病毒載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用 〈160〉 4
〈210> 1 〈211〉 31 〈212〉腿 <213〉人腺病毒 <220〉
<221〉 misc_recomb 〈400〉 1
ggcgg acgac cgggg ttcga gcccc gtatc c 1611 16 21 26 31
〈210〉 2 〈211〉 515 〈212〉 DNA <213〉人腺病毒 〈220〉
<221> misc—recomb 〈400〉 2
ctcatcggct gaagcagggc taggtcggcg acaacgcgct cggctaatat ggcctgctgc 60 acctgcgtga gggtagactg gaagtcatcc atgtccacaa agcggtggta tgcgcccgtg 120ttgatggtgt aagtgcagtt ggccataacg gaccagttaa cggtctggtg acccggctgc 180
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ggtcagatgctagtagcccatttccaagcttgatagggtctcttaccagcactcgcacca3060
cccgcccgcgcctgctgggcac c t aaaco3etc310權(quán)利要求
1、一種表達(dá)小干擾RNA的VA1缺失的腺病毒載體，其特征在于重組腺病毒載體中VA1部分基因缺失，不能產(chǎn)生功能性VA1基因；插入了siRNA表達(dá)元件及報告基因。
2、 按照權(quán)利要求1所述的表達(dá)小干擾RNA的VA1缺失的腺病毒載體，其特征在于所說的VA1 部分基因缺失為基因中31鵬序列缺失，缺失的鵬序列為GGCGGACGACC GGGGTTCGAGCCCCGTATCC。
3、 按照權(quán)利要求1所述的表達(dá)小干擾RNA的VA1缺失的腺病毒載體，其特征在于:所說的siRNA 表達(dá)元件及報告基因位于腺病毒載體的El區(qū)，通過mU6啟動子表達(dá)siRNA。
4、 按照權(quán)利要求1或3所述的表達(dá)小干擾RNA的VA1缺失腺病毒載體，其特征在于所說的重 組腺病毒載體為(1) 在E3區(qū)插入一個表達(dá)元件；(2) 在E4區(qū)3'端與纖維蛋白的3'端之間插入一個表達(dá)元件；
5、 按照權(quán)利要求1或3所述的表達(dá)小干擾RNA的VA1缺失腺病毒載體，其特征在于所說的重 組腺病毒載體為(1) 用分子量為4000 8000的聚乙二醇化學(xué)修飾的重組腺病毒載體；(2) 腺病毒載體衣殼蛋白的遺傳^t布的重組腺病毒載體。
6、 一種表達(dá)小干擾RNA的VA1缺失腺病毒載體的構(gòu)建方法，其特征在于它是由下述步驟組成:(1) 構(gòu)建VA1缺失的穿梭載體；(2) 用VA1缺失的穿梭載體與腺病毒載體骨架按摩爾比3: 1在￡ "力'幼5183中同源重組 獲得VA1基因突刻泉病毒載體骨架；(3) 構(gòu)建表達(dá)siRNA的腺病毒El區(qū)shuttle載體；(4) 構(gòu)建表達(dá)VA1慢病毒載體，并感染HEK293細(xì)胞，通過潮霉素抗性篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)VA1 基因的重組HEK 293細(xì)胞系；(5) 將VA1基因突變的骨架載體與表達(dá)siRNA的El區(qū)穿梭載體經(jīng)酶切線性化，按摩爾比1: 3共轉(zhuǎn)染重組HEK293細(xì)胞，擴(kuò)增、分離、純化，得到表達(dá)小干擾RNA的VA1缺失腺病毒載體。
7、 按照權(quán)利要求6所述的表達(dá)小干擾RNA的VA1缺失腺病毒載體的構(gòu)建方法，其特征在于 步驟(5)中所說的重組HEK293細(xì)胞為穩(wěn)定表達(dá)VA1的HEK293細(xì)胞系。
8、 按照權(quán)利要求6所述的表達(dá)小干擾RNA的VA1缺失腺病毒載體的構(gòu)建方法，其特征在于 所說的步驟(1)中VA1缺失的穿梭載體的下游同源序列跨過了腺病毒骨架載體上位于13255位的一個PmeI位點(diǎn)。
9、 一種藥物組合物，含有權(quán)利要求1 5表達(dá)小干擾RNA的VA1缺失的腺病毒載體與化學(xué)治 療藥物或生物毒素或單克隆抗體或細(xì)胞表面受體的配體化合物組成復(fù)合物。
10、 權(quán)利要求1表達(dá)小干擾RNA的VA1缺失的腺病毒劍枯制備治療腫瘤藥物中的用途。
全文摘要
一種表達(dá)小干擾RNA的VA1缺失腺病毒載體，重組腺病毒載體中VA1部分基因缺失，不能產(chǎn)生功能性VA1基因，插入了siRNA表達(dá)元件及報告基因。其構(gòu)建方法為構(gòu)建VA1缺失的穿梭載體，用VA1缺失的穿梭載體與腺病毒載體骨架按摩爾比3∶1在E.coli BJ5183中同源重組獲得VA1基因突變腺病毒載體骨架，構(gòu)建表達(dá)siRNA的腺病毒E1區(qū)shuttle載體，構(gòu)建表達(dá)VA1慢病毒載體并感染HEK293細(xì)胞以及通過潮霉素抗性篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)VA1基因的重組HEK 293細(xì)胞系，構(gòu)建表達(dá)小干擾RNA的VA1缺失腺病毒載體。表達(dá)小干擾RNA的VA1缺失的腺病毒載體在制備治療腫瘤藥物中的用途。
文檔編號A61K45/00GK101560521SQ200910022759
公開日2009年10月21日 申請日期2009年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月1日
發(fā)明者夏海濱, 張偉鋒, 王東陽, 趙俊麗, 鄭曉晶 申請人:陜西師范大學(xué)