專利名稱：：體內(nèi)抑制在靈長類亨廷頓基因表達的方法和序列的制作方法
技術(shù)領域：
：本發(fā)明涉及抑制亨廷頓舞蹈癥基因在靈長類，包括恒河猴(獼猴)和人(人類)表達的抑制性核酸分子及其使用方法。
背景技術(shù)：
：亨廷頓舞蹈癥是一種神經(jīng)退行性腦障礙，青少年或成年發(fā)病。它能緩慢破壞患者個體的行走、思考、語言和推理能力。癥狀包括認知能力的改變諸如短期記憶受損和注意力下降；情緒改變諸如情緒搖擺(moodswings)、.抑郁和易怒；協(xié)調(diào)和身體運動改變諸如笨拙、非自主運動和抽搐等。這些癥狀逐漸惡化直至HD患者死亡，自發(fā)病開始大約要15到20年。雖然HD的生物化學原因還不完全清楚，但是目前已經(jīng)清楚，HD是常染色體顯性遺傳性的。這種遺傳特征意味著，每一從任一雙親那里遺傳了突變的(倍增的,expended)HD基因的個體都會發(fā)展成這種疾病。關于HD研究的一個突破就是鑒定了引起HD的突變基因。基于這項突破，研究人員和醫(yī)生可以預測哪些個體會發(fā)展成HD。具體地說，研究人員和醫(yī)生可以通過計算存在于某一個體HD基因中"CAG重復"序列的數(shù)目來預測哪些個體會發(fā)展成HD。如果一個人兩個HD基因中都具有35個或更少的CAG重復序列，那么這個人將不會發(fā)展成HD。如果一個人兩個HD基因中的任何一個具有多于35個的CAG重復序列，那么這個人將會發(fā)展成該病。CAG重復序列比35多的越多，該人顯示HD癥狀越早。編碼該HD基因的蛋白稱為"亨廷頓蛋白"(也稱"htt")。亨廷頓蛋白的確切功能不清楚。然而，突變體——倍增的亨廷頓蛋白的表達已知是HD的原因。某些證據(jù)使科學家得出這種結(jié)論，這些證據(jù)包括小鼠研究表明小鼠中倍增HD轉(zhuǎn)基因的引入會引起HD的病理學和行為學特征，而其去除則會消除這些影響。因此，抑制腦中亨廷頓蛋白的表達可以防止或減輕HD癥狀的出現(xiàn)。4近期遺傳技術(shù)的進展使得某種蛋白如亨廷頓蛋白的選擇性抑制成為可能。為了了解這些技術(shù)的潛在影響需要一些本
技術(shù)領域：
的
背景技術(shù)：
。通常，為了使一種蛋白發(fā)揮作用，將要使用該蛋白的細胞必須產(chǎn)生它。為了產(chǎn)生一種蛋白，細胞首先在該細胞的核中制備該蛋白基因序列的拷貝。編碼該蛋白的基因序列的拷貝(稱信使RNA("mRNA"))離開細胞核并且被運輸?shù)皆摷毎泻颂求w的區(qū)域。核糖體讀取mRNA的序列并產(chǎn)生它所編碼的蛋白。這種新蛋白合成的過程稱為翻譯。多種因素影響翻譯的速率和效率。在這些因素中最重要的因素是mRNA自身的內(nèi)在穩(wěn)定性。如果mRNA在細胞內(nèi)被迅速降解(諸如在其到達核糖體前)，它就不能作為新蛋白翻譯的模板，因此降低細胞產(chǎn)生它所編碼的蛋白的能力?；谇笆龀霈F(xiàn)了RNA干擾技術(shù)("RNAi")。RNA干擾實際上是一種自然發(fā)生的抑制基因表達和后來的蛋白翻譯的機制。RNA干擾或者通過在mRNA被翻譯前將其降解，或者通過結(jié)合該mRNA直接抑制其翻譯來抑制蛋白表達。這種自然發(fā)生的RNA干擾還可以在細胞中人為誘導發(fā)生。例如，RNA干擾可以通過在細胞中引入與所要抑制的基因的mRNA相應的雙鏈短核酸寡核苷酸來完成，或者通過在細胞中引入一個DNA序列，該序列編碼短發(fā)夾核酸轉(zhuǎn)錄本，該核酸轉(zhuǎn)錄本能自身折疊并且在細胞中進一步加工后能形成雙鏈短核酸寡核苷酸。這種技術(shù)提供了一種抑制亨廷頓蛋白在細胞中的方法。在細胞中抑制亨廷頓蛋白可以用于HD的病因?qū)W研究。抑制患者亨廷頓蛋白還可以預防和減輕HD癥狀。發(fā)明概述本發(fā)明描述了采用RNA干擾("RNAi")抑制HD基因表達的方法、核酸序列和分子、表達盒(expressioncassette)和載體。抑制HD基因表達可以降低細胞內(nèi)亨廷頓蛋白的水平。這種抑制和降低在HD的病因?qū)W研究中是有益的。這種抑制和降低還可以用于預防和治療HD癥狀。具體地說，RNAi是由雙鏈RNA("dsRNA")、短發(fā)夾RNA("ShRNA")或其它具有類似特征的核酸分子介導的。這些核酸分子通過包括Dicer酶和Drosha酶的細胞酶的作用被加工或切割成此小片段。然后這些核酸分子的小片段可以被介導mRNA降解的蛋白復合體(稱為RNA-誘導沉默復合體，RISC復合體)攝取。該RISC復合體將會降解與它所攝取的與該核酸互補堿基配對的mRNA。mRNA以這種方式被特異性地毀壞，因此預防該mRNA編碼的蛋白的產(chǎn)生。目前，對RNAi機制的理解允許遺傳學家們創(chuàng)造出具有與已知基因序列同源的序列的核酸分子來抑制某種蛋白在細胞中的表達或形成。在本發(fā)明中，與靈長類HDmRNA序列同源的核酸序列和分子被引入到細胞中來抑制亨廷頓蛋白的表達。這些核酸序列和分子能特異性地抑制編碼靈長類(包括恒河猴和人類)亨廷頓蛋白序列的表達。這種蛋白表達的抑制可以用于HD的病因?qū)W研究。這種抑制對于HD的預防和/或表達也是有益的。在本發(fā)明的一個實施方式中，本發(fā)明包括一種核酸分子，該核酸分子包括一個第一鏈和一個第二鏈，其中該第一鏈含有一種核苷酸序列，其中第二鏈含有一種與該第一鏈相反互補的序列，其中該核酸分子既能抑制獼猴又能抑制人類編碼亨廷頓蛋白的mRNA序列的表達。5在本發(fā)明的另一個實施方式中，本發(fā)明包括一種離體的雙鏈(duplex)核酸，該核酸分子包括一個第一鏈核酸和一個第二鏈核酸，其中第一鏈含有由序列SEQ.ID.NO:1編碼的至少19個連續(xù)核苷酸，其中第二鏈核酸與第一鏈至少有15個連續(xù)核苷酸互補。在本發(fā)明的另一個實施方式中，本發(fā)明包括一種離體的雙鏈核酸，該核酸分子包括一個第一鏈核酸和一個第二鏈核酸，其中第一鏈含有由序列SEQ.ID.NO:2編碼的至少19個連續(xù)核苷酸，其中第二鏈核酸與第一鏈至少有15個連續(xù)核苷酸互補。在本發(fā)明的另一個實施方式中，本發(fā)明包括一種離體的雙鏈核酸，該核酸分子包括一個第一鏈核酸和一個第二鏈核酸，其中第一鏈含有由序列SEQ.ID.NO:3編碼的至少19個連續(xù)核苷酸，其中第二鏈核酸與第一鏈至少有15個連續(xù)核苷酸互補。在本發(fā)明的另一個實施方式中，本發(fā)明包括一種離體的雙鏈核酸，該核酸分子包括一個第一鏈核酸和一個第二鏈核酸，其中第一鏈含有由序列SEQ.ID.NO:4編碼的至少19個連續(xù)核苷酸，其中第二鏈核酸與第一鏈至少有15個連續(xù)核苷酸互補。在本發(fā)明的另一個實施方式中，本發(fā)明包括一種離體的雙鏈核酸，該核酸分子包括一個第一鏈核酸和一個第二鏈核酸，其中第一鏈含有由序列SEQ.ID.NO:5編碼的至少19個連續(xù)核苷酸，其中第二鏈核酸與第一鏈至少有15個連續(xù)核苷酸互補。在本發(fā)明的另一個實施方式中，本發(fā)明包括一種離體的雙鏈核酸，該核酸分子包括一個第一鏈核酸和一個第二鏈核酸，其中第一鏈含有由序列SEQ.ID.NO:6編碼的至少19個連續(xù)核苷酸，其中第二鏈核酸與第一鏈至少有15個連續(xù)核苷酸互補。在本發(fā)明的另一個實施方式中，本發(fā)明包括一種離體的雙鏈核酸，該核酸分子包括一個第一鏈核酸和一個第二鏈核酸，其中第一鏈含有由序列SEQ.ID.NO:7編碼的至少19個連續(xù)核苷酸，其中第二鏈核酸與第一鏈至少有15個連續(xù)核苷酸互補。在本發(fā)明的另一個實施方式中，本發(fā)明包括一種離體的雙鏈核酸，該核酸分子包括一個第一鏈核酸和一個第二鏈核酸，其中第一鏈含有由序列SEQ.ID.NO:8編碼的至少19個連續(xù)核苷酸，其中第二鏈核酸與第一鏈至少有15個連續(xù)核苷酸互補。在本發(fā)明的另一個實施方式中，本發(fā)明包括一種離體的雙鏈核酸，該核酸分子包括一個第一鏈核酸和一個第二鏈核酸，其中第一鏈含有由序列SEQ.ID.NO:9編碼的至少19個連續(xù)核苷酸，其中第二鏈核酸與第一鏈至少有15個連續(xù)核苷酸互補。在本發(fā)明的另一個實施方式中，本發(fā)明包括一種離體的雙鏈核酸，該核酸分子包括一個第一鏈核酸和一個第二鏈核酸，其中第一鏈含有由序列SEQ.ID.NO:IO編碼的至少19個連續(xù)核苷酸，其中第二鏈核酸與第一鏈至少有15個連續(xù)核苷酸互補。在本發(fā)明的另一個實施方式中，本發(fā)明包括一種離體的雙鏈核酸，該核酸分子包括一個第一鏈核酸和一個第二鏈核酸，其中第一鏈含有由序列SEQ.ID.NO:11編碼的至少19個連續(xù)核苷酸，其中第二鏈核酸與第一鏈至少有15個連續(xù)核苷酸互補。在本發(fā)明的另一個實施方式中，本發(fā)明包括一種離體的雙鏈核酸，該核酸分子包括一個第一鏈核酸和一個第二鏈核酸，其中第一鏈含有由序列SEQ.ID.NO:12編碼的至少19個連續(xù)核苷酸，其中第二鏈核酸與第一鏈至少有15個連續(xù)核苷酸互補。在本發(fā)明的另一個實施方式中，本發(fā)明包括一種離體的雙鏈核酸，該核酸分子包括一個第一鏈核酸和一個第二鏈核酸，其中第一鏈含有由序列SEQ.ID.NO:13編碼的至少19個連續(xù)核苷酸，其中第二鏈核酸與第一鏈至少有15個連續(xù)核苷酸互補。在本發(fā)明的另一個實施方式中，本發(fā)明包括一種離體的雙鏈核酸，該核酸分子包括一個第一鏈核酸和一個第二鏈核酸，其中第一鏈含有由序列SEQ.ID.NO:14編碼的至少19個連續(xù)核苷酸，其中第二鏈核酸與第一鏈至少有15個連續(xù)核苷酸互補。在本發(fā)明的另一個實施方式中，本發(fā)明包括一種離體的雙鏈核酸，該核酸分子包括一個第一鏈核酸和一個第二鏈核酸，其中第一鏈含有由序列SEQ.ID.NO:15編碼的至少19個連續(xù)核苷酸，其中第二鏈核酸與第一鏈至少有15個連續(xù)核苷酸互補。在本發(fā)明的另一個實施方式中，本發(fā)明包括一種離體的雙鏈核酸，該核酸分子包括一個第一鏈核酸和一個第二鏈核酸，其中第一鏈含有由序列SEQ.ID.NO:9編碼的至少27個連續(xù)核苷酸，其中第二鏈核酸與第一鏈至少有23個連續(xù)核苷酸互補。在本發(fā)明的另一個實施方式中，本發(fā)明包括一種離體的雙鏈核酸，諄核酸分子包括一個第一鏈核酸和一個第二鏈核酸，其中第一鏈含有由序列SEQ.ID.NO:10編碼的至少27個連續(xù)核苷酸，其中第二鏈核酸與第一鏈至少有23個連續(xù)核苷酸互補。在本發(fā)明的另一個實施方式中，本發(fā)明包括一種離體的雙鏈核酸，該核酸分子包括一個第一鏈核酸和一個第二鏈核酸，其中第一鏈含有由序列SEQ.ID.NO:11編碼的至少27個連續(xù)核苷酸，其中第二鏈核酸與第一鏈至少有23個連續(xù)核苷酸互補。在本發(fā)明的另一個實施方式中，本發(fā)明包括一種離體的雙鏈核酸，該核酸分子包括一個第一鏈核酸和一個第二鏈核酸，其中第一鏈含有由序列SEQ.ID.NO:12編碼的至少27個連續(xù)核苷酸，其中第二鏈核酸與第一鏈至少有23個連續(xù)核苷酸互補。在本發(fā)明的另一個實施方式中，本發(fā)明包括一種離體的雙鏈核酸，該核酸分子包括一個第一鏈核酸和一個第二鏈核酸，其中第一鏈含有由序列SEQ.ID.NO:13編碼的至少27個連續(xù)核苷酸，其中第二鏈核酸與第一鏈至少有23個連續(xù)核苷酸互補。在本發(fā)明的另一個實施方式中，本發(fā)明包括一種離體的雙鏈核酸，該核酸分子包括一個第一鏈核酸和一個第二鏈核酸，其中第一鏈含有由序列SEQ.ID.NO:14編碼的至少27個連續(xù)核苷酸，其中第二鏈核酸與第一鏈至少有23個連續(xù)核苷酸互補。在本發(fā)明的另一個實施方式中，本發(fā)明包括一種離體的雙鏈核酸，該核酸分子包括一個第一鏈核酸和一個第二鏈核酸，其中第一鏈含有由序列SEQ.ID.NO:15編碼的至少27個連續(xù)核苷酸，其中第二鏈核酸與第一鏈至少有23個連續(xù)核苷酸互補。在本發(fā)明的一個實施方式中，該雙鏈核酸的長度為1930個堿基對。在本發(fā)朗的另一個實施方式中，該雙鏈核酸的第一鏈和/或第二鏈還包括一個突出區(qū)。在本發(fā)明的另一個實施方式中，該雙鏈核酸的第一鏈和/或第二鏈包括一個3'突出區(qū)、一個5'突出區(qū)(overhangregion)，或既有3'突出區(qū)又有5'突出區(qū)。在本發(fā)明的另一個實施方式中，該雙鏈核酸的第一鏈和/或第二鏈還包括一個突出區(qū)，突出區(qū)的長度為110個核苷酸。在本發(fā)明的另一個實施方式中，該雙鏈核酸的第一鏈和第二鏈通過一個核酸環(huán)鏈可操作性地連接，形成一個發(fā)夾結(jié)構(gòu)，該發(fā)夾結(jié)構(gòu)含有一個雙鏈結(jié)構(gòu)和一個環(huán)結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明的另一個實施方式中，該雙鏈核酸的第一鏈和第二鏈通過一個核酸環(huán)鏈可操作性地連接，該環(huán)結(jié)構(gòu)含有410個核苷酸。在本發(fā)明的另一個實施方式中，該發(fā)明包括一個表達盒(expressioncassette)。在一個實施方式中，該表達盒含有一個編碼序列SEQIDNO:l的核酸序列。在另一個實施方式中，該表達盒含有一個編碼序列SEQIDNO:2的核酸序列。在另一個實施方式中，該表達盒含有一個編碼序列SEQIDNO:3的核酸序列。在另一個實施方式中，該表達盒含有一個編碼序列SEQIDNO:4的核酸序列。在另一個實施方式中，該表達盒含有一個編碼序列SEQIDNO:5的核酸序列。在另一個實施方式中，該表達盒含有一個編碼序列SEQIDNO:6的核酸序列。在另一個實施方式中，該表達盒含有一個編碼序列SEQIDNO:7的核酸序列。在另一個實施方式中，該表達盒含有一個編碼序列SEQIDNO:8的核酸序列。在另一個實施方式中，該表達盒含有一個編碼序列SEQIDNO:9的核酸序列。在另一個實施方式中，該表達盒含有一個編碼序列SEQIDNO:10的核酸序列。在另一個實施方式中，該表達盒含有一個編碼序列SEQIDNO:11的核酸序列。在另一個實施方式中，該表達盒含有一個編碼SEQIDNO:12的核酸序列。在另一個實施方式中，該表達盒含有一個編碼序列SEQIDNO:13的核酸序列。在另一個實施方式中，該表達盒含有一個編碼序列SEQIDNO:14的核酸序列。在另一個實施方式中，該表達盒含有一個編碼序列SEQIDNO:15的核酸序列。在本發(fā)明另一個實施方式中，該表達盒還含有一個啟動子。在本發(fā)明另一個實施方式中，該表達盒含有一種可調(diào)節(jié)啟動子(regulatorypromoter)。在本發(fā)明另一個實施方式中，該表達盒含有一個組成型啟動子。在本發(fā)明另一個實施方式中，該表達盒含有一個啟動子，該啟動子是巨細胞病毒("CMV")啟動子。在本發(fā)明另一個實施方式中，該表達盒含有一個啟動子，該啟動子是勞斯肉瘤病毒("RSV")啟動子。在本發(fā)明另一個實施方式中，該表達盒含有一個使用RNA聚合酶II的啟動子。在本發(fā)明另一個實施方式中，該表達盒含有一個使用RNA聚合酶III的啟動子。在本發(fā)明另一個實施方式中，該表達盒還含有一個多聚腺苷酸化的信號。在本發(fā)明另一個實施方式中，該表達盒還含有一個多聚腺苷酸化的信號，該信號是合成的最小限度的多聚腺苷酸化的信號。在本發(fā)明另一個實施方式中，該表達盒含有一個標記基因。在本發(fā)明一個實施方式中，本發(fā)明包括一個含有上述的一個或多個上述表達盒的載體。在本發(fā)明另一個實施方式中，該載體含有第一個表達盒和第二個表達盒。在一個實施方式中，該載體的第一個表達盒編碼一個編碼序列SEQIDNO.1的核酸序列，該載體的第二個表達盒編碼與序列SEQIDNO.1至少有15個連續(xù)核苷酸互補的核酸序列。在另一個實施方式中，該載體的第一個表達盒編碼一個編碼序列SEQIDNO.2的核酸序列，該載體的第二個表達盒編碼與SEQIDNO.2至少有15個連續(xù)核苷酸互補的核酸序列。在另一個實施方式中，該載體的第一個表達盒編碼一個編碼序列SEQIDN0.3的核酸序列，該載體的第二個表達盒編碼與SEQIDNO.3至少有15個連續(xù)核苷酸互補的核酸序列。在另一個實施方式中，該載體的第一個表達盒編碼編碼序列SEQIDN0.4的核酸序列，該載體的第二個表達盒編碼與SEQIDNO.4至少有15個連續(xù)核苷酸互補的核酸序列。在另一個實施方式中，該載體的第一個表達盒編碼一個編碼序列SEQIDN0.5的核酸序列，該載體的第二個表達盒編碼與SEQIDNO.5至少有15個連續(xù)核苷酸互補的核酸序列。在另一個實施方式中，該載體的第一個表達盒編碼一個編碼序列SEQIDNO.6的核酸序列，該載體的第二個表達盒編碼與SEQIDNO.6至少有15個連續(xù)核苷酸互補的核酸序列。在另一個實施方式中，該載體的第一個表達盒編碼一個編碼序列SEQIDN0.7的核酸序列，該載體的第二個表達盒編碼與SEQIDNO.7至少有15個連續(xù)核苷酸互補的核酸序列。在另一個實施方式中，該載體的第一個表達盒編碼一個編碼序列SEQIDNO.8的核酸序列，該載體的第二個表達盒編碼與SEQIDN0.8至少有15個連續(xù)核苷酸互補的核酸序列。在另一個實施方式中，該載體的第一個表達盒編碼一個編碼序列SEQIDNO.9的核酸序列，該載體的第二個表達盒編碼與SEQIDN0.9至少有15個連續(xù)核苷酸互補的核酸序列。在另一個實施方式中，該載體的第一個表達盒編碼一個編碼序列SEQIDNO.10的核酸序列，該載體的第二個表達盒編碼與SEQIDNO.10至少有15個連續(xù)核苷酸互補的核酸序列。在另一個實施方式中，該載體的第一個表達盒編碼一個編碼序列SEQIDNO.11的核酸序列，該載體的第二個表達盒編碼與SEQIDNO.11至少有15個連續(xù)核苷酸互補的核酸序列。在另一個實施方式中，該載體的第一個表達盒編碼一個編碼序列SEQIDNO.12的核酸序列，該載體的第二個表達盒編碼與SEQIDNO.12至少有15個連續(xù)核苷酸互補的核酸序列。在另一個實施方式中，該載體的第一個表達盒編碼一個編碼序列SEQIDNO.13的核酸序列，該載體的第二個表達盒編碼與SEQIDNO.13至少有15個連續(xù)核苷酸互補的核酸序列。在另一個實施方式中，該載體的第一個表達盒編碼一個編碼序列SEQIDNO.14的核酸序列，該載體的第二個表達盒編碼與SEQIDNO.14至少有15個連續(xù)核苷酸互補的核酸序列。在另一個實施方式中，該載體的第一個表達盒編碼一個編碼序列SEQIDNO.15的核酸序列，該載體的第二個表達盒編碼與SEQIDNO.15至少有15個連續(xù)核苷酸互補的核酸序列。在另一個實施方式中，該載體的第一個表達盒編碼一個編碼序列SEQIDNO.9的核酸序列，該載體的第二個表達盒編碼與SEQIDNO.9至少有23個連續(xù)核苷酸互補的核酸序列。在另一個實施方式中，該載體的第一個表達盒編碼一個編碼序列SEQIDNO.10的核酸序列，該載體的第二個表達盒編碼與SEQIDNO.10至少有23個連續(xù)核苷酸互補的核酸序列。在另一個實施方式中，該載體的第一個表達盒編碼一個編碼序列SEQIDNO.110的核酸序列，該載體的第二個表達盒編碼與SEQIDNO.ll至少有23個連續(xù)核苷酸互補的核酸序列。在另一個實施方式中，該載體的第一個表達盒編碼一個編碼序列SEQIDNO.12的核酸序列，該載體的第二個表達盒編碼與SEQIDN0.12至少有23個連續(xù)核苷酸互補的核酸序列。在另一個實施方式中，該載體的第一個表達盒編碼一個編碼序列SEQIDNO.13的核酸序列，該載體的第二個表達盒編碼與SEQIDNO.13至少有23個連續(xù)核苷酸互補的核酸序列。在另一個實施方式中，該載體的第一個表達盒編碼一個編碼序列SEQIDNO.14的核酸序列，該載體的第二個表達盒編碼與SEQIDN0.14至少有23個連續(xù)核苷酸互補的核酸序列。在另一個實施方式中，該載體的第一個表達盒編碼一個編碼序列SEQIDNO.15的核酸序列，該載體的第二個表達盒編碼與SEQIDNO.15至少有23個連續(xù)核苷酸互補的核酸序列。在本發(fā)明的一個實施方式中，該載體是病毒載體。在本發(fā)明的另一個實施方式中，該載體是腺病毒載體。在本發(fā)明的另一個實施方式中，該載體是慢病毒(lentWiralvirus)載體。在本發(fā)明的另一個實施方式中，該載體是腺相關病毒(AAV)載體。在本發(fā)明的另一個實施方式中，該載體是脊髓灰質(zhì)炎病毒載體。在本發(fā)明的另一個實施方式中，該載體是腺相關病毒(AAV)載體。在本發(fā)明的另一個實施方式中，該載體是單純皰疹病毒載體。在本發(fā)明的另一個實施方式中，該載體是腺相關病毒(AAV)載體。在本發(fā)明的另一個實施方式中，該載體是貓免疫缺陷病毒(FIV)載體。在本發(fā)明的另一個實施方式中，該載體是小鼠馬隆尼的病毒載體(Maloney-basedviralvector)。在本發(fā)明的另一個實施方式中，該載體含有啟動子。在本發(fā)明的另一個實施方式中，該載體含誘導型啟動子。在本發(fā)明的另一個實施方式中，本發(fā)明包括含有前述表達盒的細胞。在本發(fā)明的另一個實施方式中，該細胞是哺乳動物細胞。在本發(fā)明的另一個實施方式中，包括含有前述表達盒的非人哺乳動物細胞。在本發(fā)明的實施方式還包括方法。本發(fā)明的一個方法包括抑制細胞中亨廷頓蛋白累積的方法，該方法包括在細胞中引入一種其量足以抑制亨廷頓蛋白累積的前述雙鏈核酸。本發(fā)明的另一個方法，至少抑制10%亨廷頓蛋白累積。本發(fā)明的另一個方法包括防治細胞中突變的亨廷頓蛋白細胞毒性的方法，該方法包括在細胞中引入一種其量足以抑制亨廷頓蛋白累積的前述雙鏈核酸以致該雙鏈核酸能防治細胞中突變的亨廷頓蛋白細胞毒性。本發(fā)明的另一個方法包括抑制細胞中亨廷頓蛋白基因表達的方法，該方法包括在細胞中引入一種其量足以抑制亨廷頓蛋白累積的前述雙鏈核酸以致該雙鏈核酸能抑制亨廷頓蛋白表達。本發(fā)明的另一個方法包括抑制獼猴或人類亨廷頓蛋白表達的方法，該方法提供一種含一種含有并表達亨廷頓基因并對核酸干擾敏感的神經(jīng)元細胞的獼猴或人類，以及使該獼猴或人類與前述雙鏈核酸接觸因而抑制亨廷頓基因的表達。本發(fā)明的另一個方法，亨廷頓蛋白的表達至少10%被抑制。本發(fā)明的另一個方法包括一種防治獼猴或人類亨廷頓舞蹈癥("HD")細胞毒性作用的方法，包括在細胞中引入一種其量足以HD相關蛋白累積的前述雙鏈核酸以致得到的雙鏈核酸能防治細胞中突變的亨廷頓蛋白細胞毒性。本發(fā)明的另一個方法包括抑制獼猴或人類亨廷頓蛋白基因表達的方法，該方法包括在細胞中引入一種其量足以抑制亨廷頓基因表達的前述載體，以致得到的雙鏈核酸能抑制亨廷頓蛋白表達。本發(fā)明的另一個方法包括抑制獼猴或人類亨廷頓蛋白表達的方法，該方法提供一種含一種含有并表達亨廷頓基因并對核酸干擾敏感的神經(jīng)元細胞的獼猴或人類；以及使該獼猴或人類與前述載體接觸因而抑制亨廷頓基因的表達。本發(fā)明的另外一個方法包括防治獼猴或人類亨廷頓舞蹈癥("HD")細胞毒性作用的方法，包括在細胞中引入一種其量足以HD相關蛋白累積的離體的雙鏈核酸，它含序列SEQ.ID.NO:1或序列SEQ.ID.NO:4，其中的雙鏈核酸能防治HD的細胞毒性作用。本發(fā)明的另外一個方法包括抑制獼猴或人類亨廷頓蛋白表達的方法，包括在細胞中引入一種其量足以HD相關蛋白累積的離體的雙鏈核酸，它含序列SEQ.ID.NO:1或序列SEQ.ID.NO:4，其中的雙鏈核酸能抑制HD蛋白表相關蛋白的表達。在本發(fā)明的一個實施方式中，該雙鏈核酸或載體是在脊髓的鞘內(nèi)給藥。在本發(fā)明的另一個實施方式中，該雙鏈核酸或載體在大腦的一個或多個腦室中給藥到腦脊液。在本發(fā)明的另一個實施方式中，該雙鏈核酸或載體直接給藥到腦組織或大腦皮層。在本發(fā)明的另一個實施方式中，該雙鏈核酸或載體直接給藥到基底神經(jīng)節(jié)。在本發(fā)明的另一個實施方式中，該雙鏈核酸或載體特異性地給藥到尾狀核或殼核。圖1顯示描述HEK293細胞中核酸序列的耙質(zhì)粒。圖2顯示體內(nèi)siNA序列抑制HEK293細胞中外獼猴HDmRNA。圖3顯示兩種不同劑量的siNA抑制4MBR5細胞中內(nèi)源性獼猴HD基因。圖4顯示使用五種不同劑量的長度為19個核苷酸和27個核苷酸的siNA抑制4MBR5細胞中內(nèi)源性獼猴HD基因。圖5和圖6顯示使用長度為19個核苷酸和27個核苷酸的siNA抑制LLC-MK2細胞中內(nèi)源性獼猴HD基因。圖7也顯示使用不同劑量的長度為19個核苷酸和27個核苷酸的siNA抑制LLC-MK2細胞中內(nèi)源性獼猴HD基因。圖8A-8D顯示使用四種不同劑量的siNA抑制HeLa細胞中內(nèi)源性獼猴HD基因。圖9顯示抑制外源性獼猴亨廷頓蛋白在LLC-MK2細胞中的表達。圖10和11顯示抑制內(nèi)源性獼猴亨廷頓蛋白在LLC-MK2細胞中的表達。圖12描述了一種抗HD的結(jié)構(gòu)及其構(gòu)建(圖12A)及其對照(圖12B)shNA序列(按順序分別顯示如序列SEQ.ID.NOS.28和29公開的反義鏈)。圖13A-F顯示根據(jù)本發(fā)明在實施例中使用的其它shNA序列(按顯示順序分別是序列SEQ.ID.NOS.30-35公開的反義鏈)。圖14顯示在被具有EB4或mir23環(huán)結(jié)構(gòu)、表達19或27個核苷酸長度的shNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的LLC-MK2細胞中內(nèi)源性猿猴HD基因的抑制。圖15顯示pSilencer1.0-U6質(zhì)粒的示意圖，該質(zhì)?？杀挥糜诳?HD和調(diào)控shNA序列的制備。圖16顯示AAV病毒構(gòu)建體的一個示例性的形式。圖17顯示根據(jù)本發(fā)明用于構(gòu)建pAAV載體產(chǎn)生AAV的質(zhì)粒。圖18A-B顯示根據(jù)本發(fā)明在實施例中使用的其它shNA序列(按顯示順序分別是如SEQ.ID.NOS.36和37公開的反義鏈)。圖19顯示pAAV質(zhì)粒對外源性獼猴HD的抑制。圖20顯示用重組腺相關病毒(AAV)表達抗-HDshNA在HEK293T細胞中對內(nèi)源性人HD的抑制。圖21和22顯示用重組腺相關病毒(AAV)表達抗-HDshNA對獼猴HD基因表達的體內(nèi)抑制。本發(fā)明的具體描述術(shù)語"SEQIDN0:X"(其中X是1到15間的任意數(shù)字)是指，在一個實施方式中，每個數(shù)字的序列如表1定義(標識序列)。SEQIDNO:X還應當解讀為包括能與序列SEQIDNOS:1-15列出的序列的互補鏈雜交，并能減少選自但不限于HEK293細胞、4MBR5細胞、LLC-MK2細胞、HeLA細胞或任何其它獼猴或人類細胞中特定的SEQIDNO的靶mRNA的序列。在這種定義下，要求權(quán)利保護的序列可以包括與標識序列至少99%同源的序列、與標識序列至少98%同源的序列、與標識序列至少95%同源的序列、與標識序列至少90%同源的序列，或者與標識序列至少85%同源的序列。術(shù)語"核酸"或"核酸分子"是指單鏈或雙鏈的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物，由含有糖、磷酸和堿基(嘌呤或嘧啶)的單體(核苷酸)組成。如果不是特別限定，該術(shù)語包括含有天然核苷酸的已知類似物的核酸，這些核酸具有所提到的核酸相似的結(jié)合特性，并以一種和天然核酸相似的方式代謝。除非另外指出，一個具體的核酸序列還包括其適當修飾的變異體。本發(fā)明的核酸分子可以包括能介導RNA干擾的任何類型的核酸分子，諸如，但不限定于，短干擾核酸(siNA)、短發(fā)夾核酸(shNA)、短干擾RNA(siRNA)、短發(fā)夾RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)和雙鏈RNA(dsRNA)。本發(fā)明的核酸分子還包括類似的DNA序列。另外，本發(fā)明的核酸和核酸分子還可以包括非修飾或修飾核苷酸。修飾核苷酸是指含有在核苷酸堿基、糖和/或磷酸化學結(jié)構(gòu)上含一種修飾的核苷酸?？梢赃M行這種修飾來改善核酸分子的穩(wěn)定性和/或功效，諸如如下專利和文獻所公并美國專利號("USPN")6,617,438,USPN5,334,711;USPN5,716,824;USPN5,627,053;美國專利申請?zhí)?0/082,404,國際專利合作條約公開號("PCTPN")WO98/13526;PCTPNWO92/07065;PCTPNWO03/070897;PCTPNWO97/26270;PCTPNWO93/15187;Beigelmanetal.，1995，J.Biol.Chem.,270，25702;UsmanandCedergren,1992，TIBS.17，34，-Usmanetal.，1994，NucleicAcidsSymp.Ser.31,163;Burginetal.,1996，Biochemistry,35，14090;Perraultetal.Nature,1990,344,565-568;Piekenetal.Science,1991，253,314-317;Usman.andCedergren,TrendsinBiochem.Sci"1992,17,334-339;Karpeiskyetal.，1998,TetrahedronLett,39,1131，EarnshawandGait，1998,Biopolymers(NucleicAcidSciences),48,39-55;VermaandEckstein,1998，Annu.Rev.Biochem.,67，99-134;Burlinaetal…1997,Bioorg.Med.Chem.，5,1999-2010;Limbachetal.,1994,NucleicAcidsRes.22，2183;andBurginetal.,1996,Biochemistry,35，14090。這些專利和文獻描述了修飾核酸分子的通用方法和策略，在此并入本文作為參考。此處所用"表達盒"一詞是指能指導特定核苷酸序列在合適的宿主中表達的核酸序列，該序列還具有能幫助目的核酸序列適當轉(zhuǎn)錄的序列。除了目的核酸序列，表達盒還可以包括可操作性地連接到目的核苷酸序列的啟動子，目的核酸序列還可以可操作性地連接到終止信號。表達盒還可以包括表達增強子。包括目的序列的表達盒可以是嵌合體。表達盒還可以是自然發(fā)生表達盒，但是被以有益于異源表達的重組形式獲得的。核酸序列在表達盒中的表達可以是組成型啟動子調(diào)控的，也可以是可調(diào)節(jié)啟動子調(diào)控的，它只有在宿主細胞暴露于某些特定刺激時才被發(fā)動轉(zhuǎn)錄。對于多細胞生物，啟動子還可以是組織或器官或發(fā)育階段特異性的。術(shù)語"啟動子"是指通常位于目的核苷酸序列上游的(5'端)核苷酸序列，它通過提供正確轉(zhuǎn)錄所需要的RNA聚合酶的識別為點和其它因子，指導和/或調(diào)控目的核酸序列的表達。此處所用的術(shù)語"啟動子"包括(但不限于)一段短DNA序列的最小限度的啟動子，由TATA框和其它能識別轉(zhuǎn)錄起始位點(調(diào)節(jié)元件通過與該位點結(jié)合而調(diào)控表達)的序列組成。術(shù)語"啟動子"還指包括最小限度的啟動子和能調(diào)控編碼序列或功能RNA表達的調(diào)節(jié)元件的核酸序列。這種類型的啟動子由近端和較遠端的上游元件組成，后者元件常常被稱為增強子。術(shù)語"增強子"是指可以刺激啟動子活性的一段DNA序列，可以是該啟動子的固有元件或插入到啟動子增強其組織特異性或水平的異源元件。增強子能雙向(正常的或flipped)調(diào)控，被移動到不管是啟動子的上游或下游都能發(fā)揮作用。增強子和其它上游啟動子元件結(jié)合到能介導其作用的序列特異性DNA結(jié)合蛋白。啟動子可以從天然基因以其完整形式被驅(qū)動，或者由被不同的啟動子驅(qū)動的不同的天然元件組成，或者甚至由合成的DNA片段組成。啟動子還可以含有參與蛋白因子結(jié)合的DNA序列，蛋白因子根據(jù)生理或發(fā)育狀況調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始效力。根據(jù)本發(fā)明的特異性的啟動子包括，例如但不限于polII啟動子(包括但不限于巨細胞病毒("CMV")啟動子，雞P-肌動蛋白("CBA")啟動子、勞氏肉瘤病毒("RSV")啟動子和神經(jīng)元特異性烯醇酶("NSE")啟動子)。另外，根據(jù)本發(fā)明所用的特異性啟動子可以包括，但不限于例如polIII啟動子(包括但不限于人Hl和人或小鼠U6啟動子，以及如美國專利申請?zhí)?005/0064489描述的以可調(diào)控的方式工程表達的Hl和U6啟動子)。術(shù)語"載體"被定義為包括病毒、質(zhì)粒、粘端質(zhì)粒(cosmid)、噬菌體、雙元載體(binaryvector)或雙鏈或單鏈線狀或環(huán)狀核酸片段(DNA或RNA)，其自身可以或不可以傳遞的或移動(mobilizable)，并且可以或者通過整合到細胞基因組中或者存在于染色體外(具有復制元點的自主復制質(zhì)粒)而轉(zhuǎn)化真核宿主細胞。與亨廷頓舞蹈癥("HD")(IT-15)相關的基因位于4號染色體短臂末端。這種基因編碼亨廷頓蛋白(也稱"htt")。造成HD的HD基因的突變是該基因編碼區(qū)不穩(wěn)定的倍增的(expanded)CAG三核苷酸重復。這種突變產(chǎn)生一種具有倍增的谷氨酰胺序列的亨廷頓蛋白。雖然亨廷頓蛋白正常或異常的功能還不清楚，但該亨廷頓蛋白突變形式的存在與HD癥狀的出現(xiàn)具有相關性。另外，異常亨廷頓蛋白突變看起來是在神經(jīng)元核中異常累積的。因此，阻滯亨廷頓蛋白的表達提供了一種研究HD病因?qū)W的有用的機制，也可以提供一種HD的潛在治療手段。Harperetal己經(jīng)在小鼠中表明抑制突變亨廷頓蛋白表達可以治療HD的原理驗證，他們表明使用RNA干擾抑制突變HD轉(zhuǎn)基因小鼠能導致轉(zhuǎn)基因小鼠疾病顯型的改善。ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2005,102(16)5820-5825。然而，應當注意，本發(fā)明和該現(xiàn)有技術(shù)的不同之處在于，Harperetal.使用和公開的shNA序列和本發(fā)明的任何一個和所有的核酸序列都不同。另外，Haiperetal.沒有指出其研究的核酸序列是否既與獼猴HD基因又與人類HD基因具有同源性，而本發(fā)明的核酸序列則既與恒河猴(獼猴)HD基因又與人(人類)HD基因具有同源性。因此，本發(fā)明的一個重要的益處就是同樣的核酸序列可以用于在非人靈長類獼猴中研究和描述其毒性和藥理學特性以及安全性，之后，無需改造，也可以用于人類的治療之用。為了使用RNA干擾("RNAi")來抑制恒河猴或人亨廷頓蛋白的表達，首先有必要識別出能有效抑制人和恒河猴亨廷頓蛋白的核酸序列。為了達到這個目的，采用PCR策略來克隆和裝配3437堿基對(bp)的恒河猴HD基因的5'部分。簡言之，基于通過人(NM一002111)和豬(AB016793)cDNA序列的比對，鑒定出進化上的保守序列，設計了一系列聚合酶鏈式反應(PCR)中預測能和恒河猴HDcDNA退火的引物。使用這些引物，用高保真的DNA聚合酶從用恒河猴腦和腎組織制備的第一鏈cDNA(分別是BioChainInstitute,Inc公司；C1534035和C1534142)擴增恒河猴HD基因的部分重疊部分?；厥盏腜CR產(chǎn)物被克隆到pCR-Blunt-TOPO(Invitrogen公司)質(zhì)粒并使用標準方法測序。在多個獨立衍生來的克隆間進行序列比對分析以保證消除潛在的PCR和測序錯誤。這種序列信息也用于設計其它引物來克隆HDcDNA序列的缺口。采用PCR和傳統(tǒng)克隆技術(shù)合成了含3437bp恒河猴HDcDNA的單個合成的克隆。然后，使用在線軟件(http://www.dharmacon.com/)鑒定了潛在的恒河猴亨廷頓蛋白的合成核酸抑制物序列并從Dharmacon(DharmaconResearch,Inc.公司，Boulder,CO波爾得，科羅拉多)獲得，它與人序列的某些部分相一致.(即靶基因是恒河猴和人HD基因)。這些核酸序列包括如下表l的序列表1siRNA序列<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>注意，正如本領域的技術(shù)人員所理解的那樣，本發(fā)明的核酸分子包括如上表中的序列、這些序列的反向互補序列和包括用尿嘧啶替代表中胸腺啼啶的基于RNA的序列。因此，上表中的序列可以和包括在本發(fā)明地核酸分子序列一樣被認為是靶序列。序列SEQIDNOS.1-8是19個核苷酸堿基序列。序列SEQIDNO.9-15是同樣的序列延長到27個核苷酸堿基序列。被標識為SEQIDNO.7的序列沒有延長到27個核苷酸堿基序列，因為延長該序列會導致恒河猴和人HD序列的錯配。調(diào)控序列也進行了選擇。調(diào)控序列包括一個無義無序?qū)φ?SEQIDNO.19;TAGCGACTAAACACATCAA)和一個腫瘤壞死因子a(TNFa)序列(SEQIDNO.16;AATCCTCCTTCGTATTATA),二者皆購自Dharmacon。為了識別如上識別的19個核苷酸的核酸序列哪個能最有效地抑制恒河猴亨廷頓蛋白的表達,開發(fā)了體外共轉(zhuǎn)染檢驗系統(tǒng)。參見圖l，恒河猴HD基因序列被亞克隆到pTracerTM-CMV2質(zhì)粒(Invitrogen,公司，卡爾斯巴德，加拿大)，產(chǎn)生質(zhì)粒pTracer-rhuntington(pTRACER-rhHD)。該重組質(zhì)粒還包括一個綠色熒光蛋白-Zeocin(GFP-Zeocin)抗生素報告基因以使轉(zhuǎn)染效率歸一化。CMV啟動子指導靶基因(恒河猴HD基因)組成型表達，而EFl啟動子則指導GFP-Zeocin報告基因的組成型表達。所產(chǎn)生的重組質(zhì)粒通過共轉(zhuǎn)染到真核細胞系用于幫助核酸序列的篩選。具體地說，HEK293細胞培養(yǎng)物在60-70%匯合時用適當?shù)陌匈|(zhì)粒共轉(zhuǎn)染(2pg/孔，6孔培養(yǎng)皿)并檢測抗恒河猴HD的核酸序列(100nM)(序列SEQIDNO:1至ljSEQIDNO:8)，TNFa作為對照(SEQIDNO.16)或無義無序?qū)φ?SEQIDNO.19)。轉(zhuǎn)染48小時后，從細胞中收獲總細胞RNA用于采用標準方法制備cDNA。采用實時PCR方法檢測cDNA耙基因(HD)和報告基因(GFP)表達水平。這些數(shù)據(jù)用GFP表達水平歸一化以調(diào)整轉(zhuǎn)染效率差異。圖2顯示恒河猴HD轉(zhuǎn)染研究的結(jié)果，這些結(jié)果與每個待測核酸序列抑制恒河猴HDmRNA能力相關。正如實時PC'R測定，與相似處理的對照細胞(設定為100%表達)相比，所有非對照序列都能有效抑制HD基因的表達。因為本實驗中評價的核酸序列與人HD基因的某些部分具有完全相同的序列，所以可以合理預期它們也能抑制人HD基因的表達，因而抑制人亨廷頓蛋白的產(chǎn)生。其次，還評價了兩個不同劑量(100nM和10nM)的19個核苷酸序列的亞組抑制內(nèi)源性恒河猴HD基因表達的能力。具體地說，從美國典型培養(yǎng)物中心("ATCC")獲得的4MBr5細胞系培養(yǎng)物(來自恒河猴肺細胞系的細胞)，在70-80%匯合時用100nM或10nM導向恒河猴HDmRNA的待測核酸序列(序列SEQIDNO:1;SEQIDNO:2;SEQIDNO:4;SEQIDNO:6;和SEQIDNO:7)轉(zhuǎn)染，或用100nM的對照序列(SEQIDNO:19(無序序列)或序列SEQIDNO:16(耙標以外的TNFacontrol))轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48小時后，從細胞中收獲總細胞RNA用于采用標準方法制備cDNA。采用實時PCR方法檢測cDNA用于分析耙基因(HD)和對照基因表達。實施單獨的實時PCR方法評價恒河猴GAPDH的表達水平。所有這些表達數(shù)據(jù)用GAPDH表達水平歸一化以容許估算恒河猴細胞中siNA介導的恒河猴HD的敲除效率。如圖3所示，與對照相比，兩個劑量的導向恒河猴HDmRNA的所有序列都能抑制恒河猴HD基因的表達。其次，還進行了實驗評價恒河猴HDmRNA的抑制對所提供核酸的長度和劑量的依賴性。具體地說，如上所述的4MBr5細胞系用100nM、10nM、1.0nM、0.2nM或0.05nM的序列SEQIDNO:4(19個核苷酸的序列)；100nM、10nM、1.0nM、0.2nM或0.05nM的序列SEQIDNO:12(相應的27個核苷酸的序列)；100nM的序列SEQIDNO:19(無序序列)或100nM的序列SEQIDNO:16(靶標以外的TNFa對照)。如圖4所示，與對照相比，所有劑量的兩個序列長度都能抑制恒河猴HD基因表達。雖然所有劑量在4MBr5細胞中都有效，但是抑制恒河猴HD基因表達最有效的劑量是100nM、lOnM和lnM，且與序列長度無關。隨后的試驗評價了siNA抑制內(nèi)源性fe河猴HD基因表達的能力，檢測了27個核苷酸序列與前面在LLC-MK2細胞中評價的19個核苷酸序列相比的效果。在這個實驗中，LLC-MK2(一種恒河猴腎細胞系，也獲自ATCC)70-80%匯合時，用待測核酸序列(序列SEQIDNO:4和SEQIDNO:12)(10nM或0.2nM這兩個劑量中的一個)轉(zhuǎn)染，也用100nM的對照(序列SEQIDNO:19和SEQIDNO:16)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48小時后，從細胞中收獲總細胞RNA用于采用標準方法制備cDNA。采用實時PCR方法檢測cDNA用于分析耙基因(HD)和對照基因表達。實施單獨的實時PCR方法評價恒河猴GAPDH的表達水平。這些表達數(shù)據(jù)用GAPDH表達水平歸一化以容許估算恒河猴細胞中siNA介導的恒河猴HD的敲除效率。如圖5所示，與對照相比，兩個劑量的導向恒河猴HDmRNA的所有序列都能抑制恒河猴HD基因的表達。隨后，進行了與上段所述同樣的實驗，除了增加更低劑量的序列SEQIDNOS:4和12(0.05nM)，與0.2nM劑量的對照序列SEQIDNO:19(100nM)的效果進行比較。如圖6所示，所有序列和劑量都能抑制LLC-MK2細胞內(nèi)源性恒河猴HD基因的表達。使用序列SEQIDNO:l和9，也比較了不同長度和劑量的效果。按照前述兩個實驗相同的程序，用100nM、10nM、1.0nM、0.1nM或0.01nM的序列SEQIDNO:1(19個核苷酸的序列)；100nM、10nM、1.0nM、0.1nM或0.01nM的序列SEQIDNO:9(相應的27個核苷酸的序列)；100nM的序列SEQIDNO:19或16(100nM)轉(zhuǎn)染LLC-MK2細胞。如圖7所示，與對照相比，所有劑量的兩個序列在LLC-MK2細胞中都能抑制內(nèi)源性恒河猴HD基因表達，而1nM或更高劑量的序列SEQIDNOS:1和9則提供了最有效的抑制。另外，從該實驗中還估計了這兩種siNA的IC50(50%抑制所需要的抑制劑的濃度)分別為10pM和75pM。其次，還測定了所鑒定的siNA序列的亞組中所選擇的序列抑制內(nèi)源性人HD基因的能力。在這個實驗中，HeLa(來自ATCC)70-80%匯合時用100nM待測核酸序列(序列SEQIDNO:1;SEQIDNO:2;SEQIDNO:4;SEQIDNO:6;或SEQIDNO:7)或?qū)φ?序列SEQIDNO:19)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48小時后，從細胞中收獲總細胞RNA用于采用標準方法制備cDNA。采用實時PCR方法檢測cDNA用于分析靶基因(HD)和對照基因表達。實施單獨的實時PCR方法評價恒河猴GAPDH的表達水平。這些這些表達數(shù)據(jù)用GAPDH表達水平歸一化以容許估算HeLa細胞中siNA介導的人HD的敲除效率。如圖8A所示，與對照相比，所有導向人HDmRNA的序列都能抑制人HD基因的表達。繼之使用1nM、0.1nM或0.01nM的序列SEQIDNOS.1,2,4,6或7或用100nM對照序列SEQIDNO:19重復剛剛描述的實驗。如圖8B-BD所示，序列SEQIDNOS.1,2，4,6和7所有劑量的每一個都能有效抑制內(nèi)源性人HD基因在HeLa細胞的表達。只有一種情況，即序列SEQIDNO:2在低劑量時(O.OlnM)沒有觀察到對人HD抑制作用。按照前述實驗，進行了測定本發(fā)明的序列是否可以抑制外源性亨廷頓蛋白表達的研究。在第一個蛋白抑制實驗中，用Western雜交分析測定了如圖1所描述的pTRACER質(zhì)粒表達的部分恒河猴亨廷頓蛋白的抑制作用。具體地說，LLC-MK2細胞用pTRACER-rhHD質(zhì)粒(2Hg/孔,6孔培養(yǎng)皿)和100nM序列SEQIDNO:19(對照)、SEQIDNO:1或SEQIDNO:4中的一個共轉(zhuǎn)染。本實驗中的對照還包括只用pTRACER-rhHD質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的LLC-MK2細胞。轉(zhuǎn)染48小時后收獲蛋白，進行Western雜交分析。在分析中，每孔加入10嗎總蛋白。恒河猴亨廷頓蛋白表達用(ChemiconInternational公司，德美古拉，加拿大)亨廷頓蛋白抗體MAB2168測定，P-肌動蛋白用abeam公司的(劍橋，馬薩諸塞)抗體20272-100測定。為了定量亨廷頓蛋白的表達，用濃度儀測定了Western雜交放射自顯影中亨廷頓蛋白和P-肌動蛋白的濃度。亨廷頓蛋白表達量用P-肌動蛋白表達量歸一化。如圖9所示，和用pTRACER-rhHD質(zhì)粒和SEQIDNO:19轉(zhuǎn)染的或單獨用pTRACER-rhHD質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的對照相比，序列SEQIDNO:1和SEQIDNO:4都能有效抑制外源性亨廷頓蛋白表達。其次，又用Western雜交分析檢測了序列SEQIDNO:1禾HSEQIDNO:4在LLC-MK2細胞抑制內(nèi)源性蛋白表達的能力。LLC-MK2細胞用100nM序列SEQIDNO:1、SEQIDNO:4或SEQIDNO:19轉(zhuǎn)染。另外的對照由非轉(zhuǎn)染細胞提取物組成。轉(zhuǎn)染48小時后收獲蛋白并分析，在每個Western雜交孔加入10嗎總蛋白。恒河猴亨廷頓蛋白表達用ChemiconInternational公司(德美古拉，加拿大)的亨廷頓蛋白抗體MAB2168測定，(3-肌動蛋白用abcan^公司(劍橋，馬薩諸塞)抗體20272-100測定。亨廷頓蛋白和p-肌動蛋白的Western雜交如圖10所示，顯然序列SEQIDNO:1和SEQIDNO:4二者都能抑制亨廷頓蛋白的表達。為了量化蛋白抑制的量，恒河猴亨廷頓蛋白表達水平用P-肌動蛋白表達歸一化。為此，用濃度儀測定了Western雜交放射自顯影條帶的濃度(圖10)。如圖11可見，和用對照序列序列SEQIDNO:19轉(zhuǎn)染的細胞或與非轉(zhuǎn)染細胞提取物相比，序列SEQIDNO:1和SEQIDNO:4二者都能抑制內(nèi)源性亨廷頓蛋白的表達。有效的核酸序列被如上述鑒定之后，有效序列可以被轉(zhuǎn)變?yōu)槎贪l(fā)夾核酸("shNA")結(jié)構(gòu)。圖12顯示序列SEQIDNO:4被重新格式化和構(gòu)建成抗亨廷頓蛋白shNA序列(序列SEQIDNO:17;圖12A)。圖12還顯示了一種對MshNA序列(序列SEQIDNO:18;圖12B)。shNA序列含有siNA核酸序列(框中黑色序列，圖12A，一種原本有效的核酸序列)、一個9個寡核苷酸的環(huán)(下面劃線的)、框中核酸序列的反向互補序列(斜體的)和一個PolIII終止子序列(TTTTTT(黑體字))。4個部分重疊的合成的寡核苷酸(圖12A中的-Al、-A3、-A2和-A4以及圖12B中的-Bl，-B3,B2和-B4)可以用于裝配該shNA。在兩個獨立的反應中，每個shNA有1/3和2/4的寡核苷酸被退火。參見圖12A和12B，Al和Bl寡核苷酸包括框中序列。A2和B2核苷酸包括下面劃線的9個寡核苷酸環(huán)，分別為寡核苷酸Al和Bl的反向互補序列、黑體的PolIII終止子序列(TTTTTT)和EcoRI酶切位點的第一個G均描述在這些圖中。圖12A和12B中的A3和B3寡核苷酸分別包括Apal突出區(qū)、框中A1/B1的反向互補序列、下面劃線的9個寡核苷酸環(huán)的反向互補序列。A4和B4寡核苷酸分別包括A2和B2斜體部分的反向互補序列和黑體的PolIII終止子序列的反向互補序列(AAAAAA)。最后，A4和B4寡核苷酸含有EcoRI突出區(qū)。該shNA結(jié)構(gòu)A包括pal和EcoRI限制性酶切位點相容性末端以定向亞克隆到包含小鼠U6啟動子的穿梭載體(pSilencerl.0-U6;Ambion公司，奧斯汀，得克薩斯；圖15)。全長shNA(序列SEQIDNOS:17和18)可以使用三向連接反應被克隆到一個Apal/EcoRI消化的pSilencer載體。使用U6啟動子(小鼠或人)核酸序列組成型高水平表達。為了本發(fā)明的目的，還可以使用人Hl啟動子。一個含人U6啟動子的非限制性的穿梭載體的例子是psiSTRIKETMhmGFP(Promega公司，麥迪遜，威斯康星)。一個含人Hl啟動子的非限制性的穿梭載體的例子是pSilencer3.0-Hl(Ambion公司，奧斯汀，得克薩斯)。雖然這個實施例提供了一個本發(fā)明的shNA形式的核酸序列及其制備方法的實施方式，其它的結(jié)構(gòu)和方法也在落在本發(fā)明的范圍。例如，在一個實施方式中，shNA發(fā)夾的環(huán)結(jié)構(gòu)長度為410核苷酸。在另一個實施方式中，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的臂長度小于約30個核苷酸。在另一個實施方式中，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的臂長度為1927核苷酸。因此，雖然給出了具體的實施例，該實施例不應理解為限制本發(fā)明的范圍。在下一個描述的實驗中，檢驗了表達shNA的質(zhì)粒抑制恒河猴HD基因表達的能力。LLC-MK2細胞用含兩個莖長度中的一個(序列SEQIDNO:4(19個核苷酸)或SEQIDNO:12(27個核苷酸))或兩個不同的環(huán)結(jié)構(gòu)中的一個(EB4或mir23)的psiSTRIKEhmGFP質(zhì)粒(Promega公司，麥迪遜，威斯康星)轉(zhuǎn)染。對于每個環(huán)結(jié)構(gòu)也制備無序?qū)φ?。具體地說，這些無序?qū)φ招蛄幸粋€包括27個核苷酸對照(SEQIDNO:20)(EB4的對照，圖13A)和一個19個核苷酸對照(SEQIDNO:21)(mir23的對照(圖13B;序列SEQIDNO:21是對照序列SEQIDNO:18的修飾版))。因此，本研究中的整個轉(zhuǎn)染序列包括序列SEQIDNO.20;SEQIDNO.21;SEQIDNO.22(圖13C;修飾的SEQIDNO:17-EB4(正如本領域技術(shù)人員公認的，序列SEQIDNO:22包括序列SEQIDNO:17，具有修飾的能亞克隆到不同載體的突出區(qū))；SEQIDNO:23(圖13D;修飾的SEQIDNO:17-mir23);SEQIDNO:24(圖13E;shNA-修飾的SEQIDNO:12-EB4);禾QSEQIDNO:25(圖13F;shNA-修飾的SEQIDNO:12-mir23)。如圖14所示，和對照質(zhì)粒相比，所有被測質(zhì)粒都能抑制恒河猴HD基因表達。其次還描述了制備病毒生產(chǎn)質(zhì)粒的方法。這種方法是基于制備上述的shNA形式的核酸序列的方法。正如本領域技術(shù)人員理解的那樣，所述技術(shù)的多種己知的修飾形式都會落到本發(fā)明的范圍。首先，從每個pSilencer穿梭載體(亨廷頓蛋白和對照)中回收了含shNA表達盒(小鼠U6啟動子、shNA序列和PolIII終止子序列)的BamHI片段(圖15)，用T4DNA聚合酶補平，亞克隆到AAVl/2表達載斷deprAVETM;GeneDetect有限公司，布雷登頓，佛羅里達)。如圖16所示，在這個實施例中，最終的病毒表達載體(用于病毒生產(chǎn))、U6啟動子(小鼠或人)可以驅(qū)動shNA的表達，土撥鼠增強子/雞(3-肌動蛋白啟動子可以驅(qū)動增強的綠色熒光蛋白的表達(WPRE/CAG-eGFP)。這些表達盒可以被病毒反向重復末端(ITR)側(cè)面相接。這種土撥鼠轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(WPRE)和小牛生長因子(BGH)多腺苷序列的存在，保證了細胞轉(zhuǎn)導后的的高效轉(zhuǎn)錄。在本發(fā)明可選的方法中，表達盒還含有多聚腺苷化信號，諸如合成的最小限度的多腺苷化信號。在本發(fā)明另一個可選擇的實施方式中，可以使用H1啟動子。圖17描述了一種不同的質(zhì)粒，該質(zhì)粒用于構(gòu)建以下實驗所用的pAAV載體生成AAV(pAAV-hrGFP，Stratagene，拉荷亞市，加拿大)。構(gòu)建了6種不同的質(zhì)粒；3個使用HI啟動子，3個使用U6啟動子(人H1啟動子，Ambion，奧斯汀，得克薩斯)和人U6啟動子，Promega公司，(麥迪遜，威斯康星)。具體地說，以下被亞克隆到所述載體(1)U6-SEQIDNO:17;(2)U6-SEQIDNO:26(SEQIDNO:26是SEQIDNO:1的shRNA形式；見圖18A);(3)Hl-SEQIDNO:17;(4)Hl-SEQIDNO:26;(5)U6-SEQIDNO:18(無序shNA對照)；和(6)Hl-SEQIDNO:27(SEQIDNO:27是無序SEQIDNO:1shNA對照；見圖18B)。在這里例子中，這是通過從合適的shNA表達載體psiSTRIKETM或pSilencer3.0用PvuII去除含有啟動子和shNA序列來實現(xiàn)的。然后該PvuII片段被亞克隆到pAAV-hrGFP(Stratagene,拉荷亞市，加拿大)補平的Miul位點。方向是通過限制性酶切消化圖和序列分析證實的。這6個pAAV質(zhì)粒和pTRACER-rhHD(圖1)被共轉(zhuǎn)染到HEK293T細胞。兩個siRNA(序列SEQIDNOS:1或4)和無義無序?qū)φ?序列SEQIDNO:19)作為對照也被轉(zhuǎn)染到HEK293T細胞。pTRACER-rhHD被單獨轉(zhuǎn)染作為對照。轉(zhuǎn)染后48小時，收集RNA，用實時PCR測定恒河猴HD基因表達(在pTRACER質(zhì)粒上)的抑制并用pTRACER-rhHD表達GFP的量歸一化。如圖19所示，含U6-SEQIDNO:17;U6-SEQIDNO:26;H1-SEQIDNO:17;和H1-SEQIDNO:26的pAAV質(zhì)粒，和前面測定的SEQIDNO:1和SEQIDNO:4—樣，能有效抑制外源性HD基因表達。表達無序?qū)φ招蛄械膒AAV質(zhì)粒不能抑制外源性恒河猴HD基因表達。其次，所述的pAAV質(zhì)粒和必需的pHELPER質(zhì)粒和REPCAP質(zhì)粒一起被用于產(chǎn)生重組1型血清型腺相關病毒(AAV)。產(chǎn)生了5個獨立的AAV病毒。這些病毒被工程化來表達U6-SEQIDNO:26;U6-SEQIDNO:17;Hl-SEQIDNO:26;U6-SEQIDNO:18(shNA對照;)或Hl-SEQIDNO:27(shNA對照)。檢查了這些病毒在HeLa細胞和HEK293T細胞中抑制內(nèi)源性人HD基因表達的能力。6孔培養(yǎng)皿中，5"05細胞/孔，通過將病毒直接加入孔中的細胞(lml添加了2。/。胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM))，用5xl(^病毒顆粒轉(zhuǎn)導。培養(yǎng)皿在37'C,5%<:02孵育2小時，每30分鐘輕搖混合。孵育2小時之后，每孔加入lml添加了18%FBS的DMEM細胞培養(yǎng)基，最終FBS濃度為10%。轉(zhuǎn)導細胞在37°C，5%C02的條件下繼續(xù)生長。轉(zhuǎn)導后72小時收集RNA用于采用標準方法制備cDNA。cDNA用于采用實時PCR方法分析HD和GAPDH表達水平。內(nèi)源性HD表達用內(nèi)源性GAPDH表達歸一化。如圖20所示，U6-SEQIDNO:26和U6-SEQIDNO:17能有效抑制內(nèi)源性人HD基因表達。P值通過與采用假性轉(zhuǎn)導測定的數(shù)據(jù)比較設定。在此實驗中，即使Hl-SEQIDNO:26不能顯著抑制內(nèi)源性人HD體外表達，也不能低估其潛在的體內(nèi)效果，特別是根據(jù)文獻體外體內(nèi)活性相互割裂的指示，如Wooddelletal.，334Biochem.andBiophys.Res.Comm.117-27(2005)。本發(fā)明的siNA序列和分子可以通過處理增強其被RISC復合物的攝取。具體而言，處理其有義鏈3'引物末端核苷酸可以很有益處。優(yōu)選地，前導鏈或者說反義鏈進入RISC可以通過在正義鏈引入3'引物錯配而在反義鏈5'引物末端端保持完好的堿基配對(反義鏈和目的靶mRNA)來實現(xiàn)。這種使得RISC復合物的進入最佳化，同時也減少了正義鏈潛在的脫耙抑制。將核酸分子和/或其載體(例如，載體)引入到真核細胞的物理學方法是本領域所知悉的。這些方法包括但不限于，磷酸鈣或氯化鈣共沉淀法、DEAE-右旋糖苷介導的轉(zhuǎn)染、陽離子脂質(zhì)介導的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、顆粒轟擊、顯微注射、脂質(zhì)體融合、基因槍和其它適合的方法，例如可見于Sambrook,etal.(MolecularCloning:ALaboratoryManual,2nd，ed,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor，N.Y.,1989)，和其它實驗手冊。另外，將核酸分子引入細胞的生物學方法包括使用病毒載體。病毒載體，特別是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，已經(jīng)成為使用最廣泛的將基因插入到哺乳動物細胞(如恒河猴或人細胞)進行哺乳動物基因治療的方法。其它病毒載體可以衍生于脊髓灰質(zhì)炎病毒、I型單純皰疹病毒、腺病毒和腺相關病毒等(見例如Boenischetal.，美國專利號5,350,674和Wilsonetal.,美國專利號5，585，362，此處并入本文作為參考)。本發(fā)明的實施方式還可以通過使用脂質(zhì)體、聚乙烯亞胺、離子導入遞送，也可以通過整合到其它運載工具諸如水凝膠、環(huán)糊精、生物可降解納米膠囊和生物粘合性微球來遞送。核酸分子還可以使用或不使用上述運載工具直接遞送到細胞或組織。核酸分子/運載工具聯(lián)合可以通過導管和藥物泵系統(tǒng)局部遞送，通過直接局部注射遞送或通過使用聚合物和/或藥物洗脫支架遞送。本領域的普通技術(shù)人員可以理解，除了本申請所描述的方法以外，還存在著多種方法來定位患者腦中的預期位置。術(shù)前核磁共振成像(MRI)只是合適的方法中的一種。例如，包括術(shù)中映射器件的系統(tǒng)也是可以想見的。在這種系統(tǒng)的一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明任一實施例的雙鏈核酸是通過一種遠端具有標記物的裝置(如導管)遞送的。該標記物不會干擾成像技術(shù)。因此，該標記物的本質(zhì)依賴于導管遠端，當其安放在預定區(qū)域(如尾狀核或殼核)時所用的顯示技術(shù)。如果接入和定位使用某種形式的x射線放射完成的，則標記物優(yōu)選為射線不能透過的。射線不能透過的標記物至少是遠端尖部的一部分X射線不能透過，使尖端在接入和放置過程中通過熒光鏡或通過x線能被觀察到。在一個實施方式中，該射線不能透過的標記物包括鉭粉，它分散在由生物相容性粘合劑(諸如如上討論的)組成的基質(zhì)中。其他可能適合作為射線不能透過的標記物46的材料諸如鋇或鉑材料。選擇性地，放射成像標記物可以選擇那些具有足夠放射濃度以便在成像過程中可視，而在導管尖端鑄造時以粉狀形式分散在導管遠端尖部的材料?？蛇x擇地，標記物還可以由適合核磁共振成像(MRI)的材料組成以便遠端尖部在MRI掃描時可被檢測到。這種標記物優(yōu)選的材料是鉑，雖然鋇、鉭等材料也可用。不管是否使用放射成像或MRI，提供這種成像標記物的目的是使術(shù)者能精確地檢測到間斷的確切位置，有助于放置以及以后驗證導管遠端的完整性和位置。在另外一個實施方式中，例如，導管遠端的放置的驗證可以通過術(shù)中使用MRI實施，MRI可使用術(shù)中MR成像導向系統(tǒng)諸如PoIeStariMRINavigationSuite或與之相當?shù)南到y(tǒng)。在另外一個例子中，在接入和放置過程中定位遠端的方法是使用暫時性地附著到導管近端部分或外科醫(yī)生正在使用的將導管插入到患者腦內(nèi)的手術(shù)儀器上的紅外光反射小球。手術(shù)室中的紅外照相機安放在手術(shù)臺附近，發(fā)射和追蹤從這些小球反射的紅外信號。檢測到的反射使得軟件和計算機系統(tǒng)(諸如StealthStatioi^)能夠計算和顯示導管遠端的位置，在術(shù)中實時地疊加到之前捕獲的、該具體患者的MRI成像。(這是可能的，因為該導管的遠端和該導管近端的距離是巳知的，成線性，而紅外光反射球就是暫時附著在近端的)。在另外一個例子中，在接入和放置過程中定位遠端的方法是使用暫時性地附著到導管近端部分或外科醫(yī)生正在使用的將導管插入到患者腦內(nèi)的手術(shù)儀器上的紅外發(fā)射發(fā)光二極管(LED)。手術(shù)室中的紅外照相機安放在手術(shù)臺附近，發(fā)射和追蹤從這些LED發(fā)射的的紅外信號。檢測到的反射使得軟件和計算機系統(tǒng)(諸如StealthStatioi^)能夠計算和顯示導管遠端的位置，在術(shù)中實時地疊加到之前捕獲的、該具體患者的MRI成像。(這是可能的，因為該導管的遠端和該導管近端的距離是已知的，成線性，而LED就是暫時附著在近端的)。不管是使用被動反射的紅外光還是使用主動發(fā)射的紅外光來計算導管的位置或術(shù)者所用的將導管插入患者腦內(nèi)的手術(shù)一起的位置，使用紅外三角法的目的是使術(shù)者精確地測定尖端的確切位置，幫助放置和在術(shù)中驗證導管遠端的完整性和位置。本發(fā)明的核酸序列、分子、表達盒和載體可以用于抑制HD基因表達和產(chǎn)生的亨廷頓蛋白形成。本發(fā)明的核酸序列、分子、表達盒和載體還可以用于研究HD的病因?qū)W。進一步，本發(fā)明的核酸序列、分子、表達盒和載體還可以用于給予預防和治療HD癥狀。當用于作為潛在的治療時，這些藥物所給予的量和遞送時間依賴于多種因素，例如包括但不限于所選擇的組合物、患者的體重、身體狀態(tài)和年齡，和用于預防還是治療以及其它熟練的操作者知曉的因素。這些治療藥物的給藥可以是連續(xù)的或間斷的。根據(jù)本發(fā)明的藥物的給藥在預選的一段時間內(nèi)可以基本上是連續(xù)的或一系列間隔的劑量。另外，在本發(fā)明范圍內(nèi)，局部給藥或系統(tǒng)給藥都是適合的。這些因素可以由研究人員或者治療醫(yī)生來確定。在正常成年恒河猴大腦進行了抑制亨廷頓蛋白表達抑制安全性的臨床前研究。在該項研究中，一個重量大約為3.9kg的6歲齡的雌性恒河猴被麻醉，通過定向注射雙側(cè)注入含抗-HDshRNA/GFP的重組腺相關病毒(AAV)(AAV-U6-SEQIDNO:17(血清型AAV1;2.07xl012vg/ml;批號J0531))。定向靶標通過術(shù)前MRI測定，包括殼核(AP=17;L=ll;DV1=20和DV2=17)和尾狀核(AP=20.5;L=5.6;DV=17)位置。注射用Hamilton注射器(100pi)(裝有27Ga壓縮針頭)采用單針頭管道在殼核的2個位點(50pl/位點)和尾狀核的1個位點(50pl，速度lpl/分鐘)實施。注射后，針頭留在適當位置至少20分鐘，然后以lmm/分鐘的速率拔出。二十八天以后，動物用苯巴比妥(1.5ml肌注;2ml,靜注)深部麻醉，心臟灌注肝素化的冰冷的鹽水(4-6L)。灌注和切除后，大腦被放置在裝有冰冷的鹽水容器中。右腦半球被切成14個4mm厚的冠向切片并且編號為1-14(從頭側(cè)往尾側(cè)(rostraltocaudal))。然后用一個14G活組織針從不同的大腦區(qū)域采集組織環(huán)切塊。從右半球共采集103塊組織環(huán)切塊。每塊組織塊含大約6mg組織，在液氮中速凍并保存在-80'C直至RNA被分離。表2組織環(huán)切塊來源概要尾狀核；20個環(huán)切塊(3厚片)殼核；20個環(huán)切塊(3厚片)黑質(zhì)；5個環(huán)切塊(l厚片)伏核(Accumbens);8個環(huán)切塊(2厚片)蒼白球(GP);5個環(huán)切塊(1厚片)前額葉皮層(Front.Cx):9個環(huán)切塊(l厚片)小腦；6個環(huán)切塊(l厚片)枕葉皮層(Ocipitalcx):9個環(huán)切塊(l厚片)運動皮層(Motorcx):9個環(huán)切塊(1厚片)丘腦;6個環(huán)切塊(l厚片)海馬(Hippocampus):6個環(huán)切塊(l厚片)總計=103個環(huán)切塊用RNeasyLipidKit(Qiagen(巴倫西亞Valencia,加拿大))從組織環(huán)切塊中分離RNA。使用Stratascript*第一鏈cDNA合成試劑盒(Stratagene，拉荷亞市，加拿大)從總RNA生成cDNA。該ThecDNA用于通過實時PCR分析恒河猴HD和GAPDH的表達水平。另外，通過測定GFP表達水平來監(jiān)測AAV表達。恒河猴HD表達用恒河猴GAPDH表達歸一化并且和不表達病毒(GFP陰性)的區(qū)域?qū)Ρ取?2左腦半球被切成4塊(從頭側(cè)往尾側(cè)(rostraltocaudal))，第一塊10mm，第二塊和第三塊16mm，第四塊20mm。每塊用OCT包埋，在異戊烷中速凍并保存在-80'C。然后采集10微米切片放在激光顯微切割(LMD)兼容性載玻片上。載玻片上的組織用乙醇固定(30秒，75%乙醇；30秒，95%乙醇；和30秒，100%乙醇)，各步之間用空氣干燥。然后掃描鑒定含目的腦區(qū)(尾狀核和殼核)的載玻片，通過跟蹤標記基因(GFP)的表達獲得病毒傳播數(shù)據(jù)。用LMD從尾狀核和殼核采集GFP陽性區(qū)。采用PicoPureRNA分離i^劑盒(Arcturus公司，山景(MountainView),加拿大)從GFP采集材料中分離RNA。在生成cDNA之前定量RNA。通常LMD采集材料中大約分離出10-80ng總RNA。cDNA采用StratascriptQPCRcDNA合成試劑盒(Stratagene，拉荷亞市，加拿大)制備。HD表達用實時PCR測定并用同一樣品中GAPDH的表達歸一化。為了核實正在被分析的RNA是從病毒轉(zhuǎn)染細胞采集的，還進行了GFP實時PCR以監(jiān)測GFP表達。如圖21所示，當檢測從組織環(huán)切塊獲得的樣品時，在體內(nèi)HD基因在殼核被抑制但尾狀核的沒有。尾狀核沒有觀察到抑制的原因可能是所采集的環(huán)切塊內(nèi)的表達病毒的細胞的百分比太低，不能引起可檢測水平的恒河猴HD抑制。這可以通過采集GFP陽性LMD轉(zhuǎn)導的細胞來說明。當檢測通過LMD獲得的樣品時，體內(nèi)HD基因表達在殼核、尾狀核和放射冠都被抑制(圖22;R1^復制1;112=復制2)?？傊?，這些數(shù)據(jù)顯示根據(jù)本發(fā)明的方法和序列體內(nèi)抑制HD基因表達的可能性和安全性。實施例1:使用本發(fā)明的shNA在恒河猴腦內(nèi)抑制亨廷頓蛋白表達的安全性的臨床前試驗進行了為期12個月的在正常成年恒河猴腦內(nèi)抑制亨廷頓蛋白表達的安全性的臨床前研究。在本研究的前三個月內(nèi)，六只恒河猴(獼猴)被訓練實施一種商業(yè)化的計算機化的行為試驗系列任務(MonkeyCANTAB，Model80650,Lafayette儀器公司，拉法葉，印度)，該任務是以人神經(jīng)生理學試驗為基礎的(CANTAB，CeNeS，劍橋，英國)。這六只猴在系列試驗上的成績和以前公開的恒河猴的成績標準對比以核實該猴子的認知能力在正常范圍。參見，例如Weedetal,BrainResearch:CognitiveBrainResearch,1999，October25;8(3)185-201。其次，這些猴子隨機分到兩個試驗組中的一組第一組的三只猴子，接受顱內(nèi)注射一種含有一個表達盒的腺相關病毒(AAV)載體，該表達盒含有一個驅(qū)動編碼序列SEQIDNO:17shNA短發(fā)夾RNA轉(zhuǎn)錄子表達的RNA聚合酶III啟動子。該同一載體的第二個表達盒編碼綠色熒光蛋白報告基因。第二組的三只猴子，接受顱內(nèi)注射含有同樣表達盒的腺相關病毒(AAV)載體，該表達盒驅(qū)動對照序歹lj(SEQIDNO:18)shNA的表達。同樣，該載體的第二個表達盒編碼綠色熒光蛋白報告基因。該AAV載體給予每只猴子大腦的每個半球的尾狀核和殼核。每次顱內(nèi)注射的給予AAV載體的量、進行這些注射的手術(shù)方法和程序是本領域技術(shù)人員眾所周知的。經(jīng)過一周的術(shù)后恢復時間以后，在剩余12個月的研究期間內(nèi)，使用猴CANTAB測試系列(MonkeyCANTABcomputerizedtestingbattery)對猴子進行定期的重復試驗。每只猴子隨時間變化的認知和行為表現(xiàn)和自身術(shù)前表現(xiàn)比較。在用對照shNA載體處理的猴子和用抗-恒河猴-HDshNA載體處理的猴子身上，都扭有獲得認知或行為的統(tǒng)計學上顯著的成績下降。這表示抑制成年靈長類大腦尾狀核和殼核內(nèi)的亨廷頓蛋白的表達，沒有顯著的認知或行為結(jié)果。由不知道每只猴子試驗分組成員情況的熟練的、合格的獸醫(yī)對每只猴子進行定期神經(jīng)學檢査，猴子沒有顯示神經(jīng)學缺陷。12個月的研究期結(jié)束時，將猴子人道地處死，取出每只猴子的腦由經(jīng)過專門訓練的病理學家檢査異常情況。另外，還要經(jīng)過熒光顯微鏡、免疫組織化學和分子生物化學檢測來研究。通過熒光顯微鏡鑒定出AAV有效遞送shNA的腦區(qū)。這顯示綠色熒光蛋白報告基因在每只猴腦的每個半球的尾狀核和殼核的實質(zhì)區(qū)都有表達。使用抗體和本領域技術(shù)人員眾所周知的方法，免疫組化染色亨廷頓蛋白顯示，接受抗-恒河猴-HDshNA載體的猴子，和接受對照shNA載體的猴子相比，尾狀核和殼核內(nèi)亨廷頓蛋白的水平降低了，表示使用本發(fā)明的shNA抑制了亨廷頓蛋白的表達。最后，對來自每只猴腦尾狀核和殼核的均一化的樣品都采用本領域技術(shù)人員眾所周知的方法，用定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)檢測了恒河猴HDmRNA的水平，用Western雜交檢測了恒河猴亨廷頓蛋白的水平。這些檢測表明，接受抗-恒河猴-HDshNA載體的猴子，和接受對照shNA載體的猴子相比，尾狀核和殼核內(nèi)HDmRNA和亨廷頓蛋白的表達都顯著下降。這些數(shù)據(jù)進一步證實，本發(fā)明的shNA載體在接受抗-恒河猴-HDshNA載體的尾狀核和殼核內(nèi)亨廷頓蛋白的表達得到抑制。因為在恒河猴尾狀核和殼核內(nèi)亨廷頓蛋白的抑制不會導致相應的認知和行為缺陷或者其它可觀察到的神經(jīng)學的異常或腦組織病變，所以確定了在成年靈長類腦的這些區(qū)域抑制亨廷頓蛋白的安全性。實施例2:使用本發(fā)明的shNA治療人類患者的亨廷頓舞蹈癥("HD")一旦在成年靈長類腦內(nèi)尾狀核和殼核抑制亨廷頓蛋白的安全性得以確定，就將臨床前安全性試驗中恒河猴所用的同樣的shNA表達盒，該表達盒體用本
技術(shù)領域：
的技術(shù)人員眾所周知的方法基因設計成AAV載體。該AAV載體含有一個表達盒，該表達盒含有一個RNA聚合酶III啟動子，該啟動子驅(qū)動編碼序列SEQIDNO:17shNA短發(fā)夾RNA轉(zhuǎn)錄子表達的。該AAV載體選擇性地不含有第二個編碼綠色熒光蛋白報告基因的表達盒，因為該表達盒對于治療HD患者不是必需的。特別應該理解，因為由序列SEQIDNO:17編碼的shNA序列含有序列SEQIDNO:4的siNA耙區(qū)，而序列SEQIDNO:4既和相應的獼猴又和人類的HD基因具有100%的同源性，所以含有一個含序列SEQIDNO:17的表達盒的AAV載體能有效抑制人類HD基因和亨廷頓蛋白的表達，又能抑制獼猴HD基因和亨廷頓蛋白的表達。在人類患者的安全性試驗和劑量放大試驗中，給予含序列SEQIDNO:17的AAV載體的安全性得以確定，接著進行了評價本發(fā)明治療HD人類患者的臨床有效性試驗。在這些試驗中，AAV載體可以根據(jù)系統(tǒng)方法或美國專利申請?zhí)?0040162255和20040220132公開的方法給予人類患者。這些試驗確定了使用本發(fā)明的核酸分子、表達盒或載體在罹患HD的患者的尾狀核和殼核抑制亨廷頓蛋白能有效阻礙和部分逆轉(zhuǎn)已經(jīng)出現(xiàn)疾病癥狀的患者的認知和自主運動缺陷。這些結(jié)果和由有條件的轉(zhuǎn)基因小鼠HD模型中獲得的發(fā)現(xiàn)是一致的，在該小鼠24顯型，之后抑制突變HD轉(zhuǎn)基因的表達導致疾病顯型的逆轉(zhuǎn)和小鼠的改善。Yamamotoetal.,Cell,2000,Mar31;101(1):57-66。實施例1:注射序列SEQIDNO:7的shNA局部顯著地降低HDmRNA的量為了證實如上公開的shNA序列在體內(nèi)是有效的,給恒河猴按表3所示注射3xl011含AAV載體的病毒顆粒，該AAV載體包括含序列SEQID.NO:26或SEQ.ID.NO:17序列的shNA或?qū)φ誷hNA(序列SEQ.ID.NO:18)，對照shNA由CMV啟動子調(diào)控的GFP序列上游的人U6啟動子調(diào)控。表3實驗設計<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>亨廷頓蛋白(HD)mRNA采用自組織環(huán)切塊或自組織切片激光微束切割的(LMD)細胞分離的總RNA，用qRT-PCR定量。亨廷頓蛋采用白自組織環(huán)切塊分離的總蛋白，用Western雜交分析定量。注射含有序列SEQIDNO:17的shNA載體引起動物1在GFP的表達的殼核部位與同一半球(右側(cè))非GFP表達殼核部位相比，HDmRNA減少了37n/。(用qRT-PCR測定組織環(huán)切塊)。同一動物的左半球，GFP表達區(qū)域與非GFP表達區(qū)域相比，HDmRNA的量減少了65%70%(用qRT-PCR測定LMD切片)。另外，shNA治療效果是半球特異性的。在動物2觀察到右半球(注射含序列SEQIDNO:17的載體)的GFP表達區(qū)與左半球(注射了含對照shNA的載體，序列SEQIDNO:18)的GFP表達區(qū)相比，HDmRNA顯著下降。因此，這些數(shù)據(jù)顯示含SEQIDNO:17序列的shRNA的病毒構(gòu)造，可以局部地、顯著地減少HDmRNA的量。實施例2:注射序列SEQIDNO:17的shNA不會導致解剖學異常，也不會損害轉(zhuǎn)導細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)動物按照前述實施例的實驗方案注射。用熒光顯微鏡檢測綠色熒光蛋白，蘇木精伊紅(H&E)染色、熒光顯微鏡檢測亨廷頓蛋白，免疫染色法檢測蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)，進行組織學分析。這些研究結(jié)果顯示HD抑制不會引起注射部位任何可檢測的神經(jīng)解剖學異常。病毒轉(zhuǎn)導區(qū)可觀察到外周血管成套的證據(jù)，但是這種成套與HD抑制沒有相關性。另外，鈣聯(lián)結(jié)蛋白和PDI染色沒有顯示轉(zhuǎn)導細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)的任何明顯改變。實施例3:注射序列為SEQIDNO:17的siRNA不會改變自發(fā)活動、趨向改善精細自主活動動物按照實施例1的實驗方案注射。自發(fā)活動和精細活動分別用EthnoVision和mMAP儀測定。EthnoVision是一種商業(yè)化的視覺追蹤系統(tǒng)，可以測定走過的距離和整個身體的運動速度和垂直運動。相關計算機軟件能夠給每個這些參數(shù)定量。mMAP儀(稱猴子運動分析儀)是一種用于客觀測定顯示在待測動物拿取食物的項目時小手肌的精細運動時間。尾狀核和殼核HD的抑制不會引起動物自發(fā)活動的改變。任何動物的精細活動也未收到損害。進一步，病毒注射后，所有動物的精細運動技巧都趨向改善。實施例4:注射序列SEQIDNO:26抑制亨廷頓蛋白mRNA動物3和4接受如本發(fā)明段落0092和表3所述的治療。在動物3，序列SEQIDNO:26給藥能導致亨廷頓蛋白mRNA39n/。的抑審lj(SEM17n/。)。因為缺乏GFP信號，沒有對右半球進行分析。缺乏GFP信號的原因還很難確定，因為不能識別針的軌跡。有可能是終端位于側(cè)腦室的導管和/或白質(zhì)軌跡導致注射物質(zhì)喪失。這可能是因為大腦解剖學上的變異而發(fā)生。在動物4，注射序列SEQIDNO:26導致左半球亨廷頓蛋白mRNA40。/。的抑制(SEM4%)，而在右半球，注射序列SEQIDNO:17導致亨廷頓蛋白mRNA18。/。的抑制。實施例5被注射序列SEQIDNO:26的動物的行為測定了三方面的自發(fā)活動走過距離、運動速度和垂直活動。動物3(和上面討論的動物1和2)在任何這些動物自發(fā)行為方面總體上都沒有顯示任何變化。動物4在術(shù)后第3和4周，運動速度增加，旅行距離延長；動物4在第3周垂直活動也增加了，垂直活動的增加在術(shù)后第4周恢復到正常水平。目前運動速度增加走過距離延長的原因還不得而知。亨廷頓蛋白mRNA的抑制似乎并不是根本原因，因為動物1、2和3的亨廷頓蛋白mRNA都在可測定水平被敲除但是卻沒能表現(xiàn)出運動速度的增加和旅行距離的延長。關于精細自主行為(finemotorperformance)，動物3(和上面討論的動物1和2)治療后自主活動技巧趨向于改善。另一方面，動物4在病毒注射后精細自主行為沒有穩(wěn)定的改變。26實施例6注射序列SEQIDNO:26的動物的組織學數(shù)據(jù)在IHC信號和細胞形態(tài)學可以更好顯現(xiàn)的動物3的左腦半球細胞中，在放射冠觀察到了GFP，在殼核也非常明顯。在左腦半球GFP陽性區(qū)也觀察到了一些外周血管成套。右半球沒有觀察到GFP陽性區(qū)，顯示沒有轉(zhuǎn)導。外周血管成套可能是對綠色熒光蛋白反應的結(jié)果，或者可能是因為病毒制備物不純。無論如何，外周血管成套和亨廷頓蛋白mRNA并不直接相關，因為動物2接受無序?qū)φ招蛄蠸EQ.ID.NO:18的半球也觀察到外周血管成套。在動物4中，GFP出現(xiàn)于左半球的尾狀核、殼核、蒼白球和放射冠。在GFP陽性區(qū)記錄到有外周血管成套和細胞損失。整個放射冠觀察到分布廣泛的炎性反應。右半球也有類似發(fā)現(xiàn)，除了該半球尾狀核沒有GFP和細胞損失。兩個半球殼核和左半球尾狀核的部分DARPP32陽性的細胞顯示GFP陽性信號。這表示病毒構(gòu)造細胞靶向正確。同一區(qū)域觀察到GFP和htt特異性IHC信號很少/沒有共同分布。這顯示病毒能有效抑制亨廷頓蛋白的表達。該聯(lián)結(jié)蛋白和PDI染色顯示左半球尾狀核的GFP陽性區(qū)細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)上沒有明顯變化。上述染色結(jié)果代表著特異性細胞，其中IHC信號和細胞形態(tài)學可以很好顯示。動物4觀察到的炎性反應、細胞損失、運動速度增加和走過距離延長可能都是由于亨廷頓蛋白mRNA的抑制。動物K2和3相似水平的亨廷頓蛋白mRNA抑制沒有激發(fā)任何這種反應。這種改變不象是用序列SEQIDNO:26或SEQIDNO:17治療的直接作用，更象是由于次級因素的作用。這些次級因素可能包括手術(shù)并發(fā)癥、對綠色熒光蛋白的免疫反應或病毒制備物不純。應當理解，本發(fā)明并不限于此處所述的具體實施方式、材料和在本申請的實施例，這些都是可以變化的。例如，本發(fā)明的核酸分子可以制成不同的形式和長度。實際上，本領域的技術(shù)人員應當認識到，本發(fā)明的核酸分子最重要的特征是它們可以進入RISC復合物并且還可以互補性地結(jié)合到目的mRNA序列，誘導mRNA干擾作用，導致這些序列的mRNA穩(wěn)定性和/或翻譯速率降低。此處所用"互補結(jié)合"一詞是指核酸分子與通過傳統(tǒng)的沃森-克里克(Watson-Crick)配對或其他非傳統(tǒng)的方式與mRNA形成一個或多個氫鍵的能力。還應當理解，此處所用術(shù)語只是為了描述具體實施方式，其旨不在限制本發(fā)明的范圍。必須注意，此處和所附權(quán)利要求所用的單數(shù)形式"一"、"一個"和"這個"包括所涉及復數(shù)，除非上下文中另有明確規(guī)定。因此，例如，提到"一個/種序列"、或者"一個/種shNA"是指一個或多個序列或shNA并且包括本領域技術(shù)人員所知曉的其等效物等。除非另有定義，本文中的所有技術(shù)術(shù)語都具有本發(fā)明所屬的
技術(shù)領域：
的普通技術(shù)人員通常理解的含義。本文還描述了具體的方法、裝置和材料，雖然和本文所述的任何相似的或等效的方法或材料都可以用于本發(fā)明的實施和檢測。權(quán)利要求1.一種防治獼猴或人類亨廷頓舞蹈癥(“HD”)細胞毒性作用的方法，包括在細胞中引入一種其量足以抑制HD相關蛋白累積的離體雙鏈核酸，其中該雙鏈核酸能防治HD的細胞毒性作用，其中該雙鏈核酸包括一個第一鏈核酸和一個第二鏈核酸，其中第一鏈含有由選自序列SEQ.ID.NO1和序列SEQ.ID.NO4的序列編碼的至少19個連續(xù)核苷酸，其中第二鏈核酸與第一鏈至少有15個連續(xù)核苷酸互補。2.—種抑制獼猴或人類亨廷頓蛋白表達的方法，包括在細胞中引入一種其量足以抑制HD相關蛋白表達的離體雙鏈核酸，其中該雙鏈核酸能抑制HD相關蛋白的表達，其中該雙鏈核酸包括一個第一鏈核酸和一個第二鏈核酸，其中第一鏈含有由選自序列SEQ.ID.NO:1和序列SEQ.ID.NO:4的序列編碼的至少19個連續(xù)核苷酸，其中第二鏈核酸與第一鏈至少有15個連續(xù)核苷酸互補。3.如權(quán)利要求1或2的方法，其中該離體雙鏈核酸含有序列SEQ.ID.NO:1。4.如權(quán)利要求1或2的方法，其中該離體雙鏈核酸含有序列SEQ.ID.NO:4。5.如權(quán)利要求14任一權(quán)利要求的方法，其中所述的離體雙鏈核酸包括在載體中。6.如權(quán)利要求5的方法，其中所述的載體是病毒載體。7.如權(quán)利要求6的方法，其中該病毒載體是腺相關病毒C'AAV")載體。8.如權(quán)利要求17任一權(quán)利要求的方法，其中所述的獼猴或人類在引入核酸復合物的步驟后至少可以存活四周。9.如權(quán)利要求18任一權(quán)利要求的方法，其中所述的獼猴或人類沒有顯示精細自主活動的損害。10.如權(quán)利要求19任一權(quán)利要求的方法，其中所述的雙鏈核酸被引入到位于選自殼核、尾狀核、放射冠和紋狀核的腦組織的至少一種細胞。11.如權(quán)利要求10的方法，其中所述的雙鏈核酸的表達不會損害該至少一種細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。12.如權(quán)利要求111任一權(quán)利要求的方法，其中所述的雙鏈核酸的表達不會損害該至少鈣聯(lián)結(jié)蛋白的表達或分布。13.如權(quán)利要求112任一權(quán)利要求的方法，其中所述的雙鏈核酸的表達不會損害該至少蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)的表達或分布。14.如權(quán)利要求113任一權(quán)利要求的方法，其中所述的雙鏈核酸的長度為1930個堿基對之間。15.如權(quán)利要求114任一權(quán)利要求的方法，其中所述的核酸的第一鏈和/或第二鏈還包括一個突出區(qū)。16.如權(quán)利要求15的方法，其中所述的突出區(qū)包括3'突出區(qū)、5'突出區(qū)，或既有3'突出區(qū)又有5'突出區(qū)。17.如權(quán)利要求15或16的方法，其中所述的突出區(qū)的長度為110個核苷酸。18.如權(quán)利要求117任一權(quán)利要求的方法，其中所述的雙鏈核酸的第一鏈和第二鏈通過一個核酸環(huán)鏈可操作性地連接，形成一個發(fā)夾結(jié)構(gòu)，該發(fā)夾結(jié)構(gòu)含有一個雙鏈結(jié)構(gòu)和一個環(huán)結(jié)構(gòu)。19.如權(quán)利要求18的方法，其中所述的環(huán)結(jié)構(gòu)含有410個核苷酸。全文摘要本發(fā)明公開了在靈長類包括獼猴和人類中抑制編碼亨廷頓蛋白的HD基因表達的序列、分子和方法。這些序列、分子和方法能幫助HD病因?qū)W的研究，也可以通過減少HDmRNA提供該疾病的治療手段，而不會引起獼猴和人類的死亡、自主運動的損害或細胞的改變。文檔編號A61K48/00GK101557831SQ200780037244公開日2009年10月14日申請日期2007年8月8日優(yōu)先權(quán)日2006年8月9日發(fā)明者威廉姆·F·卡恩米勒,邁克爾·D·凱特申請人:美敦力公司