專利名稱：：通過顱內(nèi)遞送sirna治療亨廷頓氏舞蹈癥的組合物、裝置和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及通過腦內(nèi)注入小干擾RNA或含有編碼小干擾RNA的DNA的載體來治療神經(jīng)退行性障礙的裝置、系統(tǒng)和方法。
背景技術(shù)：
：本發(fā)明提供了將小干擾RNA遞送到腦內(nèi)耙位點以抑制或阻滯神經(jīng)退行性障礙發(fā)生和發(fā)展的新型裝置、系統(tǒng)和方法。在幾種神經(jīng)退行性疾病(諸如帕金森氏病、阿爾茲海默氏病、亨廷頓氏舞蹈癥、1、2和3型脊髓小腦性共濟失調(diào)和齒狀核-紅核-蒼白球-路易氏體萎縮(DRPLA))中，參與疾病整個病程的蛋白已經(jīng)被鑒定。目前，這些神經(jīng)退行性疾病還無法治愈。這些疾病使患者逐漸虛弱，大部分最終致死。這些神經(jīng)退行性疾病(特別是阿爾茲海默氏病和帕金森氏病)的進(jìn)一步問題是其患病率持續(xù)增加，因而造成嚴(yán)重的公共健康問題。最近研究指出a-突觸核蛋白(a-syniiclein)(帕金森氏病)、P-淀粉樣前體蛋白裂解酶1(BACE1(包括其變異體，例如A、B、C和D型變異體))(阿爾茲海默氏病)、亨廷頓蛋白(huntington)(亨廷頓氏舞蹈癥)和1型共濟失調(diào)蛋白(ataxinl)(1型脊髓小腦性共濟失調(diào))分別作為這些疾病的發(fā)病機理中的主要致病因子。在帕金森氏病和阿爾茲海默氏病中的神經(jīng)退行性過程以選擇性神經(jīng)細(xì)胞群的廣泛丟失為特點，伴有突觸損傷和星形膠質(zhì)化。阿爾茲海默氏病的病理學(xué)標(biāo)志包括淀粉樣斑形成、神經(jīng)元纖維纏結(jié)和神經(jīng)氈細(xì)絲形成；帕金森氏病的病理學(xué)標(biāo)志包括腦黑質(zhì)內(nèi)所謂路易(Lewy)體的神經(jīng)元內(nèi)包涵體的形成和多巴胺能神經(jīng)元的喪失。雖然觸發(fā)細(xì)胞功能障礙和死亡的機制并不清楚，但是主流觀點認(rèn)為神經(jīng)退行性變是特異性神經(jīng)元細(xì)胞蛋白諸如a-突觸核蛋白(帕金森氏病)和淀粉樣前體蛋白(APP)(阿爾茲海默氏病——被BACE1加工成P-淀粉樣蛋白(包括其變異體，例如A、B、C和D型突變體))累積的后續(xù)毒性效應(yīng)的結(jié)果。a-突觸核蛋白被牽連到帕金森氏病是因為它在路易體內(nèi)被大量發(fā)現(xiàn)，其在轉(zhuǎn)基因小鼠中的過量表達(dá)導(dǎo)致帕金森氏病樣病變，其分子內(nèi)的突變與家族性帕金森氏病相關(guān)。(x-突觸核蛋白，屬于一個包括p和Y-突觸核蛋白的更大分子家族，是一個具有140個氨基酸的非淀粉樣突觸蛋白，它是在淀粉樣斑中發(fā)現(xiàn)的一個35個氨基酸的非淀粉樣組分蛋白的前體。阿爾茲海默氏病是一種進(jìn)行性大腦退化性疾病，其特點是精神衰退、記憶喪失、精神錯亂和定向障礙。在促成這種病變的細(xì)胞機制中有兩種類型的纖維狀蛋白沉積于大腦由多聚體tau蛋白組成的細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)元纖維纏結(jié)，以及大量的主要含P-淀粉樣蛋白的細(xì)胞外原纖維。P-淀粉樣蛋白，又稱A(3，由淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)在p-和Y-分泌酶裂解位點經(jīng)蛋白水解加工而成，這種加工引起細(xì)胞毒性，并使Ap的兩種主要形式(AP恥和A^2)產(chǎn)生形成淀粉樣蛋白的能力。因此，防止APP被加工成產(chǎn)生斑塊形式的淀粉樣蛋白可以極大地影響該病的進(jìn)展，這使得BACE1(包括其變異體，例如A、B、C和D型變異體))成為抑制或阻滯該病的臨床靶標(biāo)。相似的報道顯示早老素(presenilin)是重新定向異常過程的候選靶標(biāo)。亨廷頓氏舞蹈癥是一種致死性的、遺傳性的神經(jīng)退行性障礙，其特點是非自主性的"顫搐"運動、抑郁和癡呆。病因已經(jīng)確定，是DNA中由過長的C，A,G，C，A，G，......C,A,G系列核苷酸組成的單基因突變。CAG重復(fù)序列位于該基因中的編碼基因產(chǎn)物蛋白的區(qū)域。因此，得到的亨廷頓蛋白也是"倍增的(expended)"，含有由氨基酸谷氨酰胺(由"CAG"編碼)組成的超長區(qū)。就在該突變被精確定位為亨廷頓氏舞蹈癥的病因之后不久，又在其它基因中找到相似的CAG重復(fù)序列倍增并發(fā)現(xiàn)其為多種其它致死性、遺傳性神經(jīng)退行性疾病的病因。目前，這些所謂的"多谷氨酰胺"疾病的名單包括至少ll種，包括1、2禾B3型脊髓小腦性共濟失調(diào)、脊髓性肌肉萎縮癥(SBMA或肯尼迪病)、齒狀核-紅核-蒼白球-路易氏體萎縮(DRPLA)。雖然在每個這些疾病中含有倍增的CAG重復(fù)序列的具體基因不同，但確是因為腦中倍增的多聚谷氨酰胺蛋白的產(chǎn)生引起每種疾病。癥狀通常發(fā)生于中青年時期，之后10到15年就會死亡。目前這些致死性疾病還沒有有效的治療。有相當(dāng)多的證據(jù)顯示關(guān)閉異常蛋白在神經(jīng)元中的產(chǎn)生即可治療多聚谷氨酰胺疾病。已知這些疾病的原因是因突變蛋白而獲得了新的功能，而不是該蛋白原有功能的喪失。攜帶著人倍增基因的1型脊髓小腦性共濟失調(diào)(SCA1)轉(zhuǎn)基因小鼠在青年期發(fā)生嚴(yán)重的共濟失調(diào)(Clark,H.etal.,JournalofNeuroscience17:7385-7395(1997)),但相應(yīng)小鼠基因被敲除的小鼠則沒有罹患共濟失調(diào)或表現(xiàn)出其它異常(Matilla，A.,etal.,JournalofNeuroscience18:5508-^16(1998))。有異常的1型共濟失調(diào)蛋白產(chǎn)生但被基因工程改造不能進(jìn)入細(xì)胞核的SCAl轉(zhuǎn)基因小鼠則不會發(fā)展為共濟失調(diào)(Klement,I.，etal.，Cell95:41-53(1998))。最后，已經(jīng)構(gòu)建亨廷頓氏舞蹈癥轉(zhuǎn)基因小鼠模型，其中突變的人轉(zhuǎn)基因被工程改造成通過給予四環(huán)素，可以被人工"關(guān)閉"(正常情況下，小鼠和人在給予這種抗生素時對這種疾病不會產(chǎn)生任何作用)。這些小鼠產(chǎn)生癥狀之后，通過長期給予四環(huán)素關(guān)閉異常蛋白的產(chǎn)生會引起其行為的改善(Yamamoto,A.，etal.,Cell101:57-66(2000))。這就顯示減少異常亨廷頓蛋白在人類的表達(dá)可能不僅僅能預(yù)防新診斷患者亨廷頓氏舞蹈癥的發(fā)展，而且可能會改善已經(jīng)出現(xiàn)癥狀的患者的生活質(zhì)量。最近多個小組進(jìn)行了siRNA有效性的研究。Caplen,etal.(HumanMolecularGenetics,11(2):175-184(2002))對多種不同的雙鏈RNA對含CAG重復(fù)序列的人類雄性激素受體基因mRNA轉(zhuǎn)錄體細(xì)胞表達(dá)的抑制能力進(jìn)行了評價。他們的工作發(fā)現(xiàn)當(dāng)CAG重復(fù)序列的側(cè)翼序列出現(xiàn)在在雙鏈RNA中時，只有基因特異性抑制作用發(fā)生。他們還表明，構(gòu)建的雙鏈RNA可以拯救誘導(dǎo)的半胱氨酸蛋白酶-3的活性。Xia,Haibin,etal.(NatureBiotechnology,20:1006-1010(2002))采用構(gòu)建的重組腺病毒表達(dá)靶向編碼綠色熒光蛋白mRNA的siRNA，測定了其對表達(dá)融合多聚谷氨酰胺-熒光蛋白的工程神經(jīng)PC12克隆細(xì)胞系的多谷氨酰胺(CAG)表達(dá)抑制作用。設(shè)計和使用與產(chǎn)生特定蛋白的mRNA靶點互補的小干擾RNA是最近分子生物學(xué)家所用的防止特異性mRNA翻譯的工具。分子生物學(xué)家用來干涉翻譯的其他工具包括使用抗治療靶點的核酶裂解mRNA序列來治療阿爾茲海默氏病(見WO01/16312A2)和帕金森氏病(見WO99/50300A1和WOO1/60794A2)。然而，上述專利沒有一篇公開能夠局部治療神經(jīng)退行性疾病的，特異性、局部遞送小干擾RNA載體到腦內(nèi)靶細(xì)胞的方法。上述專利沒有公開遞送裝置的使用或任一將小干擾RNA載體遞送或注入腦部的方法。例如，上述專利沒有公開或提示通過顱內(nèi)遞送裝置將小干擾RNA載體遞送或注入腦部的方法。另外，上述的現(xiàn)有技術(shù)既沒有公開任何注入小干擾RNA載體到腦內(nèi)的技術(shù)，現(xiàn)有技術(shù)也沒有公開小干擾RNA載體在注入腦部后，是否可以進(jìn)入神經(jīng)元并且產(chǎn)生預(yù)想的小干擾RNA，該小干擾RNA是否可以減少至少一種參與神經(jīng)退行性障礙發(fā)病的蛋白的產(chǎn)生?，F(xiàn)有技術(shù)描述了核酶的直接系統(tǒng)性遞送。這種用于治療神經(jīng)退行性障礙的方法看起來既不可行又難如人意。首先，干擾RNA明顯不同于核酶；其次，系統(tǒng)性遞送的小RNA分子不能在體內(nèi)維持到達(dá)預(yù)期靶點的足夠時間，也不太可能通過血腦屏障。另外，現(xiàn)有技術(shù)采用的方法可能是不實際的，因為采用這種方法，為了達(dá)到腦內(nèi)有效量，可能必須給予大量的小干擾RNA。即使血腦屏障可以暫時打開，通過血流遞送的寡核苷酸大多數(shù)還是會在體內(nèi)的其它器官系統(tǒng)特別是肝臟損失掉。美國專利5,735,814和6,042,579公開了藥物注入治療亨廷頓氏舞蹈癥的方法，但是這些專利中特別鑒定的藥物涉及能改變神經(jīng)元興奮性的藥物，而沒有特別鑒定旨在進(jìn)入細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)改變蛋白表達(dá)的藥物。本發(fā)明通過使用病毒載體以編碼小干擾RNA的DNA的形式直接遞送到小干擾RNA到腦部靶細(xì)胞，解決了現(xiàn)有技術(shù)中存在的和系統(tǒng)性遞送核酸相關(guān)的現(xiàn)有問題。直接遞送小干擾RNA載體到腦部患病區(qū)的注入克服了之前的與遞送相關(guān)的障礙。進(jìn)一步，病毒載體的使用使其能夠高效進(jìn)入靶細(xì)胞，并可以高效短期和長期地通過細(xì)胞自身機制直接產(chǎn)生小干擾RNA藥物。最后，本發(fā)明通過定制用于刺激蛋白mRNA編碼序列中的特異性位點的活性小干擾RNA，提供了一種獨特的靶向性和選擇性的方式。發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種遞送小干擾RNA用于神經(jīng)退行性障礙的裝置、系統(tǒng)和方法。所述治療的第一個目的是遞送特異性設(shè)計的小干擾RNA作為治療帕金森氏病的治療藥物。治療帕金森氏病的特異性設(shè)計的小干擾RNA耙向a-突觸核蛋白mRNA以減少神經(jīng)細(xì)胞中(x-突觸核蛋白的產(chǎn)量。在一個相關(guān)的實施方式中本發(fā)明中提供了特異性接入黑質(zhì)遞送抗(x-突觸核蛋白的小干擾RNA的裝置。所述治療的第二個目的是遞送特異性設(shè)計的小干擾RNA作為治療阿爾茲海默氏病的治療藥物。治療阿爾茲海默氏病的特異性設(shè)計的小干擾RNA靶向BACE1(包括其變異體，例如A、B、C和D型變異體)mRNA以減少神經(jīng)細(xì)胞中BACE1(包括其變異體，例如A、B、c和D型變異體)蛋白的產(chǎn)量，從而干擾e淀粉樣蛋白的產(chǎn)生。在一個相關(guān)的實施方式中本發(fā)明中提供了特異性接入梅納特(Meynart)基底核和大腦皮質(zhì)，遞送抗BACE1(包括其變異體，例如A、B、C和D型變異體)的小干擾RNA的裝置。所述治療的第三個目的是遞送特異性設(shè)計的小干擾RNA作為治療亨廷頓氏舞蹈癥的治療藥物。治療亨廷頓氏舞蹈癥的特異性設(shè)計的專用小干擾RNA耙向亨廷頓蛋白mRNA以減少神經(jīng)細(xì)胞中亨廷頓蛋白的產(chǎn)量。在一個相關(guān)的實施方式中本發(fā)明中提供了特異性接入尾狀核和殼核(統(tǒng)稱為基底核)遞送抗亨廷頓蛋白的小干擾RNA的裝置。在本發(fā)明的不同實施方式中，治療亨廷頓氏舞蹈癥的siRNA或編碼這些siRNA的載體包含第一鏈，該鏈含有至少19個連續(xù)核苷酸，核苷酸由選自序列SEQ.ID.NO:24或序列SEQ.ID.NO:25的序列編碼。所述治療的第四個目的是遞送特異性設(shè)計的小干擾RNA作為治療1型脊髓小腦性共濟失調(diào)(SCA1)的治療藥物。治療1型脊髓小腦性共濟失調(diào)的特異性設(shè)計的小干擾RNA耙向1型共濟失調(diào)蛋白mRNA以減少神經(jīng)細(xì)胞中1型共濟失調(diào)蛋白的產(chǎn)量。在一個相關(guān)的實施方式中本發(fā)明中提供了特異性接入齒狀核、栓狀核、蒼白核和小腦頂核(統(tǒng)稱為小腦深部核)遞送抗1型共濟失調(diào)蛋白的小干擾RNA的裝置。所述治療的第五個目的是遞送特異性設(shè)計的小干擾RNA作為治療3型脊髓小腦性共濟失調(diào)(SCA3，也稱馬査多-約瑟夫病(Machado-Joseph病))的治療藥物。治療3型脊髓小腦性共濟失調(diào)的特異性設(shè)計的小干擾RNA耙向3型共濟失調(diào)蛋白mRNA以減少神經(jīng)細(xì)胞中型共濟失調(diào)蛋白的產(chǎn)量。在一個相關(guān)的實施方式中本發(fā)明中提供了特異性接入齒狀核、栓狀核、蒼白核和小腦頂核(統(tǒng)稱為小腦深部核)、丘腦底區(qū)和黑質(zhì)遞送抗3型共濟失調(diào)蛋白的小干擾RNA的裝置。所述治療的第六個目的是遞送特異性特定小干擾RNA作為治療齒狀核-紅核-蒼白球-路易氏體萎縮(DRPLA)的治療藥物。治療齒狀核-紅核-蒼白球-路易氏體萎縮(DRPLA)的特異設(shè)計的小干擾RNA靶向1型萎縮蛋白mRNA以減少神經(jīng)細(xì)胞中1型萎縮蛋白的產(chǎn)量。在一個相關(guān)的實施方式中本發(fā)明中提供了特異性接入齒狀核、栓狀核、蒼白核和小腦頂核(統(tǒng)稱為小腦深部核)、蒼白球和紅核遞送抗1型萎縮蛋白的小干擾RNA的裝置。本發(fā)明提供了一種用于治療神經(jīng)退行性疾病的小干擾RNA載體的遞送系統(tǒng)，它允許將小干擾RNA或含有編碼小干擾RNA的DNA的載體(小干擾RNA載體)靶向遞送到腦內(nèi)靶位點，在較短或較長的時段內(nèi)給患者治療。本發(fā)明一個主要的實施方式中，小干擾RNA載體被注入到腦內(nèi)靶位點，在那里小干擾RNA載體被神經(jīng)元攝取并轉(zhuǎn)運到靶細(xì)胞核內(nèi)。然后小干擾RNA載體被宿主細(xì)胞機制轉(zhuǎn)錄成RNA，產(chǎn)生小干擾RNA，該小干擾RNA能阻止其靶向的神經(jīng)退行性蛋白的產(chǎn)生。本發(fā)明還提供了使用神經(jīng)外科裝置遞送治療性小干擾RNA載體到腦部選擇性區(qū)域的方法。具體而言，本發(fā)明提供了使用手術(shù)植入的導(dǎo)管單次、重復(fù)或長期遞送小干擾RNA載體到腦的方法。引入患病細(xì)胞的小干擾RNA載體具有小干擾RNA被細(xì)胞轉(zhuǎn)錄所需的必要DNA序列，包括啟動子序列、小干擾RNA序列，選擇性包括允許治療性小干擾RNA已知末端產(chǎn)生的側(cè)翼序列，以及選擇性還包括多聚腺苷化信號序列。圖1顯示1型共濟失調(diào)蛋白mRNA的分析圖(采用本領(lǐng)域知曉的定量RT-PCR方法)。該1型共濟失調(diào)蛋白mRNA取自用含抗1型共濟失調(diào)蛋白的核酶(圖1上部泳道)或用含抗1型共濟失調(diào)蛋白的siRNA(圖1下部泳道)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HEK293H細(xì)胞。圖2顯示1型共濟失調(diào)蛋白mRNA的分析圖(采用相同的本領(lǐng)域知曉的定量RT-PCR方法)。該l型共濟失調(diào)蛋白mRNA取自用含抗-l型共濟失調(diào)蛋白的小干擾RNA轉(zhuǎn)染的HEK293H細(xì)胞(下部泳道)，與1型共濟失調(diào)蛋白mRNA獲自用靶向3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)的對照siRNA轉(zhuǎn)染的HEK293H細(xì)胞作對照。圖3顯示腺相關(guān)病毒表達(dá)載體pAAV-siRNA的構(gòu)建。圖4圖示了一種實驗器械(麥德托尼克公司(Medtronic.Inc.)，明尼阿波利斯，明蘇里達(dá)州，型號8506)，它能皮下植入顱骨上，并提供一種可使治療性藥物通過并遞送到腦的通路端口。圖5圖示了一種實驗器械(麥德托尼克公司，明尼阿波利斯，明蘇里達(dá)州，型號8506的原理圖)，它能皮下植入顱骨上，提供一種通路端口，治療性藥物可通過它遞送到腦。圖6示出了文中所述的多種神經(jīng)退行性疾病間的關(guān)系，以及用小干擾RNA載體耙向預(yù)期基因產(chǎn)物的治療位置。最佳實施方式的具體描述本發(fā)明同時解決了現(xiàn)有技術(shù)中的兩個問題(1)如何治療因神經(jīng)元內(nèi)致病性蛋白的產(chǎn)生所致的神經(jīng)退行性疾病的問題；以及(2)遞送治療性小干擾RNA到患病神經(jīng)元的問題。為了更好地理解本發(fā)明，下面列出了術(shù)語以及對這些術(shù)語的理解范圍。術(shù)語"a-突觸核蛋白、BACE1(包括其變異體，例如A、B、C和D型變異體》、亨廷頓蛋白、l型共濟失調(diào)蛋白、3型共濟失調(diào)蛋白和/或l型萎縮蛋白"是指，分別由含有下列基因和/或人類基因組DNA表達(dá)和/或編碼的氨基酸序列的蛋白及其突變蛋白衍生物a-突觸核蛋白(帕金森氏病)，以及P位-APP裂解酶(BACE1(包括其變異體，例如A、B、C和D型變異體))(阿爾茲海默氏病)、亨廷頓蛋白(亨廷頓氏舞蹈癥)，以及l(fā)型共濟失調(diào)蛋白(l型脊髓小腦性共濟失調(diào))，3型共濟失調(diào)蛋白(3型脊髓小腦性共濟失調(diào)或Machado-Joseph病)，和/或齒狀核-紅核-蒼白球-路易氏體萎縮(DRPLA)。此處使用的"細(xì)胞"，用其通常的生物學(xué)含義，并不指完整的多細(xì)胞有機體。該細(xì)胞可存在于有機體，例如人，但是優(yōu)選哺乳動物來源，諸如人、牛、羊、猿、猴、豬、狗、貓等。然而，產(chǎn)生小干擾RNA的一些步驟可能也需要使用原核細(xì)胞(如細(xì)菌細(xì)胞)或者真核細(xì)胞(如哺乳動物細(xì)胞)，因此也包括在術(shù)語"細(xì)胞"的范圍。所用"互補"是指含有一個或多個核酸(DNA或RNA)的分子可以和其它含有一個或多個核酸的分子通過傳統(tǒng)的沃森-克里克(Watson-Crick)配對或其他非傳統(tǒng)的方式形成一個或多個氫鍵。所用a-突觸核蛋白、BACE1(包括其變異體，例如A、B、C和D型變異體))、亨廷頓蛋白、l型共濟失調(diào)蛋白、3型共濟失調(diào)蛋白和/或l型萎縮蛋白的"等效"DNA，包括與編碼a-突觸核蛋白、BACE1(包括其變異體，例如A、B、C和D型變異體))、亨廷頓蛋白、1型共濟失調(diào)蛋白、3型共濟失調(diào)蛋白和/或l型萎縮蛋白的DNA，或者與在包括人類、嚙齒類、靈長類、兔、豬和微生物的多種生物中編碼與a-突觸核蛋白、BACE1(包括其變異體，例如A、B、C和D型變異體))、亨廷頓蛋白、l型共濟失調(diào)蛋白、3型共濟失調(diào)蛋白和/或1型萎縮蛋白具有相似功能的蛋白的DNA具有同源性的(部分或全部)天然產(chǎn)生的DNA分子。等效DNA序列還包括諸如5'非翻譯區(qū)、3，非翻譯區(qū)、內(nèi)含子、內(nèi)含子-外顯子連接區(qū)、小干擾RNA靶點等，任選地，包括并入感染性病毒的DNA，諸如腺相關(guān)病毒(AAV)。術(shù)語"功能等效"是指與參考序列或蛋白功能相似的任一衍生物。特別地，術(shù)語"功能等效"包括有一個或多個核苷酸堿基插入、刪除或替換，而對生物學(xué)功能沒有顯著不利影響的衍生物。所用"基因"是指控制RNA生產(chǎn)的DNA區(qū)域。在產(chǎn)生功能性小干擾RNA這種語境下，這種定義包括必需的DNA序列信息，包括編碼小干擾RNA的DNA序列、非編碼調(diào)控序列和包括在內(nèi)的任何內(nèi)含子。本定義并未排除其它編碼蛋白的基因可以和編碼小干擾RNA的基因聯(lián)合或串聯(lián)而發(fā)揮作用的可能性。術(shù)語"載體"為本
技術(shù)領(lǐng)域：
熟知，定義為質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA、病毒DNA等，它們可以作為DNA運載工具，本發(fā)明的DNA可以插入其中并且可以被轉(zhuǎn)錄為RNA。術(shù)語"多個載體(vectors)"指這些用于遞送目標(biāo)核酸的基于核酸和/或病毒的技術(shù)中的任何一種。存在著多種類型的載體并為本
技術(shù)領(lǐng)域：
所熟知。術(shù)語"表達(dá)"定義為基因被轉(zhuǎn)錄成RNA的過程(轉(zhuǎn)錄)；RNA還可進(jìn)一步加工成成熟的小干擾RNA。術(shù)語"表達(dá)載體"定義為如上所述的載體或運載工具，設(shè)計成使插入序列在轉(zhuǎn)化宿主后能夠表達(dá)?？寺』?插入序列)通常置于調(diào)控因子序列的調(diào)控之下，例如啟動子序列。將克隆基因置于這種調(diào)控序列的調(diào)控之下通常被稱作可操作性地連接到調(diào)控因子或序列。"啟動子"是指能夠直接或間接地結(jié)合到細(xì)胞中的RNA聚合酶并啟動下游(3'方向)編碼序列轉(zhuǎn)錄的DNA調(diào)控區(qū)。為了本發(fā)明的目的，啟動子通過其轉(zhuǎn)錄起始位點結(jié)合在3'末端10并向上游延伸(5'方向)以包括啟動本底水平以上可檢測的轉(zhuǎn)錄所必需的堿基或因子。在啟動子中，可以發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄起始位點(通過S1核酸酶作圖可方便地定義)，以及負(fù)責(zé)結(jié)合RNA聚合酶的蛋白結(jié)合區(qū)(共有序列)。真核細(xì)胞啟動子還常常，但并不總是，含有"TATA"框和"CCAT"框。原核細(xì)胞啟動子含有-10區(qū)和-35區(qū)共有序列用于轉(zhuǎn)錄啟動。所用"同源"是指該兩個或多個核酸分子的核苷酸序列部分或全部相同。所用"高度保守序列區(qū)"是指靶基因中的一個或多個區(qū)域的核苷酸序列從一代到另一代或從一種生物系統(tǒng)到另一種生物系統(tǒng)不會發(fā)生顯著變化。所用術(shù)語"抑制"或"抑制性的"是指和沒有小干擾RNA時所觀察到的相比，靶基因的活性或mRNA或編碼靶基因的等效RNA的水平被降低。優(yōu)選的抑制為比沒有小干擾RNA時降低至少10%、25%、50%，或至少75%、85%，或至少95%。所用"抑制表達(dá)"是指a-突觸核蛋白、BACE1(包括其變異體，例如A、B、C和D型變異體))、亨廷頓蛋白、l型共濟失調(diào)蛋白、3型共濟失調(diào)蛋白和/或l型萎縮蛋白mRNA水平降低，因此相應(yīng)的蛋白水平降低以在某種程度上緩解疾病或病情中的癥狀。所用"RNA"是指核糖核酸，一種由核糖核苷酸通過磷酸-核糖(糖)骨架連接所組成的的分子。所用"核糖核苷酸"是指鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶，或腺嘌呤，或2'位帶羥基(3-D-核-呋喃糖配基。本領(lǐng)域眾所周知，在DNA序列中使用堿基胸腺嘧啶，在RNA中使用尿嘧啶作為遺傳密碼。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知填在核酸序列中如何用尿嘧啶替代胸腺嘧啶將DNA序列轉(zhuǎn)換成RNA序列，反之亦然。所用"患者"是指有機體，它是外植體細(xì)胞的供者或受者或細(xì)胞本身。"患者"還指給予本發(fā)明的核酸分子的有機體。優(yōu)選地，患者是哺乳動物或哺乳動物細(xì)胞，諸如人、牛、羊、猿、猴、豬、狗、貓等，或者用于移植的這些動物的細(xì)胞。更優(yōu)選地，患者是人或者人的細(xì)胞。術(shù)語"突觸核蛋白"是指a-突觸核蛋白(特別是人或小鼠的)或者P-突觸核蛋白(特別是人或小鼠的)。編碼人a-突觸核蛋白的全長核苷酸序列可通過登錄號AF163864(SEQIDNO:7)獲得。人a-突觸核蛋白序列的兩個變異體可通過登錄號NM000345(SEQIDNO:14)和登錄號NM—007308(SEQIDNO:23)獲得。小鼠a-突觸核蛋白可通過登錄號AF163865(SEQIDNO:IO)獲得。術(shù)語"BACEl"是指l型P-淀粉樣蛋白前體蛋白裂解酶(特別是人或小鼠的)。BACE1的幾種變異體已經(jīng)被測序，包括A、B、C或D型變異體。在某些科學(xué)文獻(xiàn)中，BACEl也被稱為ASP2和Memapsin2。編碼人BACE1的全長核苷酸序列及其相關(guān)的變異體序列可通過登錄號No.NMJ38971(SEQIDNO:20)、登錄號NM—138972(SEQIDNO:19)、登錄號NM—138973(SEQIDNO:21)和登錄號NM—012104(SEQIDNO:18)獲得。小鼠同源序列可通過登錄號NM—011792(SEQIDNO:22)獲得。術(shù)語"亨廷頓蛋白"指由亨廷頓氏舞蹈癥基因(IT-15)(特別是人或小鼠的)編碼的蛋白產(chǎn)物。編碼人IT-15的全長核苷酸序列可通過登錄號AH003045(SEQIDNO:9)獲得。小鼠序列可通過登錄號U24233(SEQIDNO:12)獲得。術(shù)語"l型共濟失調(diào)蛋白"指由1型脊髓小腦性共濟失調(diào)基因編碼的蛋白產(chǎn)物(特別是人或小鼠的)。編碼人SCA1的全長核苷酸序列可通過登錄號NM_000332(SEQIDNO:15)獲得。小鼠SCA1可通過登錄號NM—009124(SEQIDNO:13)獲得。術(shù)語"3型共濟失調(diào)蛋白"指由3型脊髓小腦性共濟失調(diào)基因編碼的蛋白產(chǎn)物(特別是人或小鼠的)。編碼人SCA3的全長核苷酸序列可通過登錄號NM—004993(1型剪接變異體)(SEQIDNO:16)和NM—030660(2型剪接變異體)(SEQIDNO:17)獲得。(小鼠同源序列尚不可得)。術(shù)語"l型萎縮蛋白"是指由齒狀核-紅核-蒼白球-路易氏體萎縮(DRPLA)基因編碼的蛋白產(chǎn)物(特別是人或小鼠的)。編碼人DRPLA的全長核苷酸序列可通過登錄號NoXM—032588(SEQIDNO:8)獲得。小鼠序列可通過登錄號No.XM—132846(SEQIDNO:11)獲得。術(shù)語"修飾"包括與參考序列或蛋白基本相似的衍生物。此處所用的"核酸分子"是指含有核苷酸的分子。核酸可以是單鏈的、雙鏈的或多條鏈的，并且可以包括修飾的或非修飾的核苷酸或非核苷酸或不同混合及其組合。根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的一個例子是編碼小干擾RNA的基因，即便它不一定具有其更普遍的編碼蛋白產(chǎn)物的含義。所用"小干擾RNA"是指在底物結(jié)合區(qū)與特異的基因靶標(biāo)具有互補性的核酸分子，它能特異性地引導(dǎo)宿主細(xì)胞的酶裂解耙RNA。亦即，小干擾RNA憑借其序列特異性及其與耙RNA的同源性，能夠引起RNA鏈的裂解，進(jìn)而使靶RNA分子因不能再被轉(zhuǎn)錄而失活。這些互補區(qū)容許小干擾RNA和靶RNA充分雜交因而許可裂解發(fā)生。對于生物學(xué)活性來講百分之百的互補常常是必要的，因此是優(yōu)選的，但是在本發(fā)明中低至^)%的互補性也是可用的。本申請所述的特異性小千擾RNA其旨不在限制，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以清楚，本發(fā)明的小干擾RNA最重要之處在于它具有特異性的底物結(jié)合位點，該位點能與一個或多個耙核酸區(qū)域互補。小干擾RNA是雙鏈RNA制劑，它能與靶RNA(通常是信使RNA)的一個部分互補(即能進(jìn)行堿基配對)。通常，這種互補是100%的，但如果需要，也可以低至諸如91%,92%,93%,94%,95%，96%，97%,98%或99%。例如，21個堿基中的19個堿基可以堿基配對。在某些情況下，需要在多個等位變異體間進(jìn)行選擇，需要與靶基因100%互補以從其它等位序列中識別出耙序列。當(dāng)在等位耙標(biāo)中選擇時，長度的選擇也是一個重要的因素，因為它是涉及互補百分比以及鑒別等位差異能力的另一重要因素。小干擾RNA序列需要具有足夠的長度，以便小干擾RNA能和耙RNA通過堿基配對作用結(jié)合在一起。本發(fā)明的小干擾RNA可以具有不同長度。小干擾RNA的長度優(yōu)選大于或等于10個核苷酸并且具有和靶RNA穩(wěn)定地相互作用的足夠長度；具體地說是1530個核苷酸，更具體說是1530之間的整數(shù)個核苷酸，諸如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30個。所用"足夠長度"是指大于或等于15個核苷酸的寡12核苷酸，它的長度足夠長，在預(yù)期條件下能提供預(yù)期的功能。所用"穩(wěn)定地相互作用"是指小干擾RNA和靶核酸的相互作用(例如通過在耙標(biāo)與互補核苷酸在生理條件下形成氫鍵)。所用"包含"是指包括，但不限于"包含"這個詞之后的任何內(nèi)容。因此，術(shù)語"包含"表示所列出的元素是必需的或強制性的，而其它元素則是可選的，可以存在也可以不存在。所用"由......組成"是指包括且限于短語"由......組成"中的任何內(nèi)容。因此，短語"由......組成"表示所列元素是必需的和強制性的，而不再存在其它元素。所用"基本上由......設(shè)計的組成"是指包括該短語中列出的任何元素，并限于不干擾或有助于在公開內(nèi)容中詳細(xì)說明的所列的活性或作用的其它元素。因此，短語"基本上由......組成"提示所列出的元素是必需的或強制的，但其它元素依賴于他們是否影響所列元素的活性或作用是可選的，可以存在或不存在。本發(fā)明提供了通過顱內(nèi)遞送編碼小干擾RNA的載體來治療多谷氨酰胺疾病(諸如亨廷頓氏舞蹈癥和l型脊髓小腦性共濟失調(diào))、帕金森氏病和阿爾茲海默氏病的手段和工具，該小干擾RNA設(shè)計成能使致病性蛋白或病情惡化蛋白表達(dá)沉默，通過一個或多個植入性頓內(nèi)導(dǎo)管來遞送。具體而言，本發(fā)明是(1)通過顱內(nèi)遞送編碼能使亨廷頓蛋白沉默的小干擾RNA的載體來治療亨廷頓氏舞蹈癥的方法；(2)通過顱內(nèi)遞送編碼能使1型共濟失調(diào)蛋白沉默的小干擾RNA的載體來治療1型脊髓小腦性共濟失調(diào)的方法；(3)通過顱內(nèi)遞送編碼能使a-突觸核蛋白沉默的小干擾RNA的載體來治療帕金森氏病的方法；以及(4)通過顱內(nèi)遞送編碼能使1型P-淀粉樣前體蛋白裂解酶(BACE1)沉默的表達(dá)小干擾RNA的載體來治療阿爾茲海默氏病的方法。如前所述，此處所述的小干擾RNA(或siRNA)是長度為1530個核苷酸的雙鏈RNA片段。它用于觸發(fā)稱為RNA干擾的細(xì)胞反應(yīng)。在RNA干擾中，雙鏈RNA被一種細(xì)胞內(nèi)酶——Dicer酶消化，產(chǎn)生雙螺旋siRNA。該雙螺旋siRNA與另一細(xì)胞內(nèi)酶復(fù)合物結(jié)合，該復(fù)合物因此被激活，導(dǎo)向任何與該siRNA序列同源的(或互補的)mRNA分子。激活的酶復(fù)合物裂解靶mRNA，破壞并防止它被用來指導(dǎo)其相應(yīng)蛋白產(chǎn)物的合成。RNA干擾過程看起來似乎是自我擴增的，其方式尚未完全清楚。最近有證據(jù)顯示，RNA干擾是一種古老的固有的機制，不僅用于對病毒感染的防御(許多病毒都會給細(xì)胞引入外源RNA)，而且也是一種十分基礎(chǔ)水平的基因調(diào)節(jié)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，RNA干擾在植物、昆蟲、低等動物和哺乳動物中都會發(fā)生，并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)RNA干擾比其它基因沉默技術(shù)如反義技術(shù)和核酶技術(shù)都有效得多。作為一種生物技術(shù)，siRNA涉及在細(xì)胞中中引入(或促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生)短的、雙鏈RNA分子，這種RNA分子相似于Dicer酶從入侵的雙鏈RNA病毒加工得到的RNA分子。而人為觸發(fā)RNA干擾的過程，并隨后從那一點繼續(xù)下去。為了將小干擾RNA遞送到患者腦部，優(yōu)選的方法是將編碼該siRNA的DNA而不是該siRNA本身引入腦細(xì)胞。編碼特定的治療性的siRNA的DNA序列在知曉下列情況時可以特定化(a)靶mRNA可獲得的一小部分序列(可以在公共的人類基因組數(shù)據(jù)庫中獲得)；和(b)如何確定DNA的眾所周知的科學(xué)規(guī)則，該DNA在被細(xì)胞轉(zhuǎn)錄時將會產(chǎn)生相應(yīng)的RNA。該DNA序列，一旦確定，就可以基于實驗室供應(yīng)商訂購的合成分子在實驗室中構(gòu)建，并采用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法插入到幾個替代"載體"中的一個中，以遞送DNA至細(xì)胞。一旦遞送到患者腦部的神經(jīng)元中，那些神經(jīng)元自身通過將插入的DNA轉(zhuǎn)錄成RNA將會產(chǎn)生RNA，該RNA成為治療性siRNA。結(jié)果是細(xì)胞自身產(chǎn)生將沉默耙基因的siRNA。結(jié)果是細(xì)胞產(chǎn)生的靶蛋白的量將會減少。小干擾RNA和小干擾RNA載體根據(jù)本發(fā)明，針對患病細(xì)胞產(chǎn)生的小干擾RNA防止神經(jīng)元中疾病相關(guān)蛋白的產(chǎn)生。根據(jù)本發(fā)明，使用特異設(shè)計的載體來遞送小千擾RNA到靶細(xì)胞的。用成功遞送到大腦靶細(xì)胞來治療神經(jīng)退行性疾病來預(yù)測的所設(shè)計小干擾RNA的成功。已經(jīng)表明，小干擾RNA能夠耙向人細(xì)胞中的特異性mRNA分子?？梢詷?gòu)建小干擾RNA載體來轉(zhuǎn)染人細(xì)胞并產(chǎn)生小干擾RNA，它能使靶RNA裂解因而干擾所編碼的蛋白的產(chǎn)生。通過抑制神經(jīng)致病性蛋白本身的產(chǎn)生或者通過抑制參與該神經(jīng)致病性蛋白產(chǎn)生或加工過程的蛋白，本發(fā)明的小干擾RNA載體將會防止致病性蛋白的產(chǎn)生。為了改善患者的生活質(zhì)量，可能需要給患者重復(fù)使用治療性藥物來實現(xiàn)足夠大量的神經(jīng)元的改變。然而，在一個個體神經(jīng)元中，這種改變是長期性的，足以提供治療性益處。諸如阿爾茲海默氏病、帕金森氏病、亨廷頓氏舞蹈癥或I型脊髓小腦性共濟失調(diào)患者的絕境，使得該治療的益處超過治療遞送和用藥的風(fēng)險成為可能。雖然釆用其它治療藥物和給藥途徑來實現(xiàn)神經(jīng)致病性蛋白的減少也有可能，但是開發(fā)直接體內(nèi)轉(zhuǎn)染神經(jīng)元的成功的治療措施卻可提供基于遞送小干擾RNA載體到靶細(xì)胞的最好的方法。遞送外源DNA到腦神經(jīng)元優(yōu)選的載體是腺相關(guān)病毒(AAV)，諸如重組2型血清型腺相關(guān)病毒或重組5型血清型腺相關(guān)病毒。選擇性地，其它病毒載體諸如單純皰疹病毒，也可用于遞送外源DNA至中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元。亦有可能，非病毒載體諸如質(zhì)粒載體也可單獨或與脂質(zhì)體復(fù)合物或聚乙烯胺混合使用，遞送外源DNA到腦部的神經(jīng)元。重要的是，應(yīng)當(dāng)注意此處舉例說明的抗-1型共濟失調(diào)蛋白小干擾RNA和其它用于治療神經(jīng)退行性障礙的小干擾RNA都只是本發(fā)明實施方式的一些例子。在動物上的采用神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域知曉的神經(jīng)外科學(xué)方法的實驗可以鑒定候選小千擾RNA。用這些實證主義方法鑒定的靶裂解部位和小干擾RNA，當(dāng)給予罹患這些神經(jīng)退行性疾病的患者時，將產(chǎn)生最大的治療效果。參照本發(fā)明的核酸分子，小干擾RNA被導(dǎo)向編碼靶蛋白的mRNA的互補序列，這些序列既可在真正的蛋白編碼序列，也可在與5'非翻譯區(qū)或3'非翻譯區(qū)。雜交后，宿主酶可以裂解該mRNA序列。小干擾RNA需要完全或高度互補才能有效?；パa百分比是指核酸分子中可以和第二個核酸分子序列形成氫鍵(如Watson-Crick堿基配對)的連續(xù)的殘基的百分比(諸如10個中有5、6、7、8、9或10個，就是50%、60%、70%、80°/。、90%或100%互補)。"完全互補"指一個核酸序列中的全部連續(xù)殘基都能與第二個核酸分子序列相同數(shù)目的連續(xù)殘基形成氫鍵。然而，應(yīng)當(dāng)注意，siRNA序列中的單個錯配或堿基替代可能會實質(zhì)上降低小干擾RNA的基因沉默活性。靶向a-突觸核蛋白、BACE1(包括其變異體，例如A、B、C和D型變異體)、亨廷頓蛋白、l型共濟失調(diào)蛋白、3型共濟失調(diào)蛋白和/或l型萎縮蛋白中特異性位點的小干擾RNA代表了一種在細(xì)胞或組織中治療帕金森氏病、阿爾茲海默氏病、亨廷頓氏舞蹈癥、1型脊髓小腦性共濟失調(diào)、3型脊髓小腦性共濟失調(diào)和齒狀核-紅核-蒼白球-路易氏體萎縮的新方法。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方式中，小干擾RNA的長度為1530個核苷酸，在具體的實施方式中，核酸分子的長度是15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸。在優(yōu)選的實施方式中，siRNA序列的長度可能在1930個堿基對，更優(yōu)選的是2125個堿基對，更優(yōu)選的是2123個堿基對。在一個優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)一類基于核酸的基因抑制劑的方法，它們對預(yù)期靶標(biāo)表現(xiàn)出高度特異性。例如，小干擾RNA靶標(biāo)優(yōu)選編碼ot-突觸核蛋白、BACE1(包括其變異體，例如A、B、C和D型變異體)、亨廷頓蛋白、l型共濟失調(diào)蛋白、3型共濟失調(diào)蛋白和/或1型萎縮蛋白的靶RNA的高度保守序列區(qū)，以便使用本發(fā)明的一種或多種核酸分子可以提供對一種疾病或病情的特異性治療。另外，通常，小干擾RNA序列可通過識別以一對腺嘌呤堿基(AA)開始的靶序列來選擇(見實施例)?？梢圆捎眠m當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄酶或表達(dá)載體體外或體內(nèi)構(gòu)建SiRNA。SiRNA可以使用DNA寡核苷酸體外構(gòu)建。這些寡核苷酸可以構(gòu)建成含有與沉默子siRNA(SilencersiRNA)(Ambion公司的構(gòu)建試劑盒1620)中包含的T7啟動子引物的5'末端互補的8個堿基序列。每一基因特異性寡核苷酸與所提供的T7啟動子引物退火，用克倫諾片段(Kle加w片段)的填充反應(yīng)產(chǎn)生一全長DNA模板以轉(zhuǎn)錄成RNA。兩個體外轉(zhuǎn)錄的RNA(—個是另一個的反義RNA)通過體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)生成，然后互相雜交形成雙鏈RNA。該雙鏈RNA產(chǎn)物用DNA酶(去除DNA轉(zhuǎn)錄模板)和RNA酶(削平雙鏈RNA末端)處理、柱純化以提供可以被遞送入細(xì)胞并檢測的siRNA。通常使用RNA聚合酶III啟動子驅(qū)動與siRNA結(jié)構(gòu)相似的短發(fā)夾RNA的表達(dá)，來構(gòu)建能在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)siRNA的siRNA載體。編碼該"發(fā)夾"的插入序列被設(shè)計成具有由一小段隔離序列分隔的兩段反向重復(fù)序列。一段反向重復(fù)序列與siRNA靶向的mRNA互補。一串胸腺嘧啶加到3'末端作為polIII轉(zhuǎn)錄終止位點。一段進(jìn)入細(xì)胞，載體組成型表達(dá)發(fā)夾RNA。發(fā)夾RNA被加工成siRNA，該siRNA誘導(dǎo)耙基因表達(dá)的沉默，即所謂的RNA干擾(RNAi)。目前為止，大多數(shù)有記載的siRNA表達(dá)載體中，三個不同的RNA聚合酶III(polIII)啟動子中的一個被用于驅(qū)動小發(fā)夾siRNA(l-5)。這些啟動子包括已經(jīng)明確表征的人類和小鼠的U6啟動子和人HI啟動子。選擇RNA聚合酶III驅(qū)動siRNA表達(dá)是因為它能在哺乳動物中表達(dá)較大數(shù)量的小RNA，并且它會在遇到與36個尿嘧啶串的時候終止轉(zhuǎn)錄。構(gòu)建的核酸分子可以根據(jù)需要被外源性遞送到特異組織或細(xì)胞靶標(biāo)。選擇性地，該核酸分子(如小干擾RNA)可以由遞送至特異細(xì)胞的DNA質(zhì)粒、DNA病毒載體和/或RNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體表達(dá)。被遞送到靶細(xì)胞或組織的小核RNA序列是基于核酸的a-突觸核蛋白、BACE1(包括其變異體，例如A、B、C和D型變異體)、亨廷頓蛋白、l型共濟失調(diào)蛋白、3型共濟失調(diào)蛋白和/或l型萎縮蛋白的表達(dá)抑制劑(例如翻譯抑制劑)，用于在細(xì)胞或組織中防治包括帕金森氏病、阿爾茲海默氏病、亨廷頓氏舞蹈癥、l型脊髓小腦性共濟失調(diào)、3型脊髓小腦性共濟失調(diào)和齒狀核-紅核-蒼白球-路易氏體萎縮在內(nèi)的神經(jīng)退行性疾病，和其它任何與細(xì)胞或組織內(nèi)a-突觸核蛋白、BACE1(包括其變異體，例如A、B、C和D型變異體)、亨廷頓蛋白、l型共濟失調(diào)蛋白、3型共濟失調(diào)蛋白和/或l型萎縮蛋白水平有關(guān)的疾病或病情。本發(fā)明的基于核酸的抑制劑可直接加入，或與陽離子脂質(zhì)體復(fù)合，用脂質(zhì)體包裝，用病毒載體包裝，或以其他手段遞送至靶細(xì)胞或組織。該核酸或核酸復(fù)合物(和生物大分子結(jié)合或者不和生物大分子結(jié)合)，可通過注射、輸液泵或支架局部給予離體相關(guān)組織或體內(nèi)。在優(yōu)選的實施方式中，該核酸抑制劑含有某些序列，這些序列具有足夠長度和/或與用SEQIDNOS:7，8,9,10，11，12,13,14,15，16,17,18,19,20，21，22或23標(biāo)示的互補底物序列穩(wěn)定地相互作用。這些小干擾RNA的例子也在如與1型萎縮蛋白有關(guān)的SEQIDSNOS:1和2、3和4，和5和6等序列中顯示。另一方面，本發(fā)明提供了含有本發(fā)明的一個或多個核酸分子和/或表達(dá)載體的哺乳動物細(xì)胞。該一個或多個核酸分子可以獨立地被導(dǎo)向相同或不同的位置。在本發(fā)明的另一方面，與靶RNA分子相互作用并抑制a-突觸核蛋白、BACE1(包括其變異體，例如A、B、C和D型變異體)、亨廷頓蛋白、l型共濟失調(diào)蛋白、3型共濟失調(diào)蛋白和/或1型萎縮蛋白活性的小干擾RNA分子，是由插入到DNA或RNA載體的轉(zhuǎn)錄單元表達(dá)的。該重組載體優(yōu)選為DNA質(zhì)粒或病毒載體。表達(dá)小干擾RNA的病毒載體，可以基于，但不限于腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺病毒載體序列構(gòu)建。優(yōu)選地，表達(dá)小干擾RNA的重組載體被按上述方式遞送并在耙細(xì)胞中維持。選擇性地，病毒載體可用于提供小干擾RNA的瞬時表達(dá)。根據(jù)需要這些載體可以重復(fù)給藥。一旦表達(dá)，該小干擾RNA結(jié)合到耙RNA并通過宿主機制抑制其表達(dá)進(jìn)而抑制其功能。小干擾RNA表達(dá)載體，或小干擾RNA是通過使用顱內(nèi)通路裝置遞送的。本發(fā)明的核酸分子，可單獨使用或與其它藥物協(xié)同使用或聯(lián)合使用來治療上述疾病或病情。例如，為了治療與a-突觸核蛋白(帕金森氏病)、l型P-淀粉樣前體蛋白裂解酶(阿爾茲海默氏病)、亨廷頓蛋白(亨廷頓氏舞蹈癥)和l型共濟失調(diào)蛋白(l型脊髓小腦性共濟失調(diào))相關(guān)的疾病或病情，可單獨使用或聯(lián)合使用一種或幾種適合于該治療的藥物來治療患者或處理其它適合的細(xì)胞，這對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員是顯而易見的。在進(jìn)一步的實施方式中，所述的小干擾RNA可以與其它已知的治療措施合并使用來治療上述的病情或疾病。在另一個優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明提供了基于核酸的抑制劑(例如小干擾RNA)及其用于下調(diào)或抑制編碼參與帕金森氏病、阿爾茲海默氏病、亨廷頓氏舞蹈癥、1型脊髓小腦性共濟失調(diào)、3型脊髓小腦性共濟失調(diào)和齒狀核-紅核-蒼白球-路易氏體萎縮進(jìn)展或維持的蛋白的RNA(例如，a-突觸核蛋白、BACE1(包括其變異體，例如A、B、C和D型變異體)、亨廷頓蛋白、l型共濟失調(diào)蛋白、3型共濟失調(diào)蛋白和/或l型萎縮蛋白)表達(dá)的方法。本發(fā)明還提供了可以在細(xì)胞內(nèi)由已知的真核細(xì)胞啟動子(例如IzantandWeintraub，1985,Science,229,345;McGarryandLindquist,1986,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA83,399，Scanlonetal.,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88,10591-5;Kashani-Sabetetal.，1992,AntisenseRes.Dev.,2，3-15;Dropulicetal.,1992,JVirol"66，1432-41;Weerasingheetal.，1991，JVirol"65,5531-4;Ojwangetal,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，10802-6;Chenetal.,1992,NucleicAcidsRes.，20,4581-9;Sarveretal.，1990Science,247,1222-1225;Thompsonetal.,1995，NucleicAcidsRes.,23，2259;Goodetal.,1997,GeneTherapy,4,45;所有這些文獻(xiàn)在此以全文以引文形式并入本文)驅(qū)動表達(dá)的核酸分子。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠認(rèn)識到，任何核酸分子都可以從適合的DNA/RNA載體在真核細(xì)胞中表達(dá)。這些核酸分子的活性可以因為被核酶從初級轉(zhuǎn)錄物釋放而增強(Draperetal.,PCTWO93/23569,andSullivanetal.，PCTWO94/02595;Ohkawaetal.,1992,NucleicAcidsSymp.Ser.，27，15-6;Tairaetal.,畫，NucleicAcidsRes"19,5125-30;Venturaetal.,1993，NucleicAcidsRes"21,3249-55;Chowriraetal.,1994，JBiol.Chem.，269，25856;所有這些文獻(xiàn)在此以全文以引文形式并入本文)。本發(fā)明另一方面，本發(fā)明的RNA分子優(yōu)選從插入DNA或RNA載體的轉(zhuǎn)錄單位表達(dá)(見，例如Coutureetal.，1996,TIG.，12,510)。該重組載體優(yōu)選DNA質(zhì)?；虿《据d體。表達(dá)小干擾RNA的病毒載體，可以基于，但不限于腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒或甲病毒載體構(gòu)建。'優(yōu)選地，能表達(dá)核酸分子的重組載體如上述被遞送并維持在靶細(xì)胞中。選擇性地，可以用病毒載體來提供核酸分子的瞬時表達(dá)。這樣的載體根據(jù)需要可重復(fù)給藥。一旦表達(dá)，核酸分子就會結(jié)合到靶mRNA。遞送表達(dá)核酸分子的載體可以通過使用所述的顱內(nèi)通路裝置單次、多次或長期遞送。一方面，本發(fā)明描述了一種表達(dá)載體，它含有編碼至少本發(fā)明的核酸分子的至少一個功能片段的核酸序列。編碼本發(fā)明的核酸分子的核酸序列以一種允許該核酸分子表達(dá)的方式可操縱性地被連接。另一方面，本發(fā)明描述了一種表達(dá)載體，它含有a)轉(zhuǎn)錄起始區(qū)(例如真核poll、II或III起始區(qū))；b)編碼至少一個本發(fā)明的核酸制劑的核酸序列；和c)轉(zhuǎn)錄終止區(qū)(例如真核poll、II或III終止區(qū))；其中所述的序列以一種允許所述的核酸分子表達(dá)和/或遞送的方式可操作性地連接到所述的起始區(qū)和終止區(qū)。正如本領(lǐng)域所知曉和理解的，核酸分子序列的轉(zhuǎn)錄是由真核細(xì)胞RNA聚合酶I(polI)、真核RNA聚合酶II(polll)或真核RNA聚合酶III(polIII)啟動子驅(qū)動的。所有這些文獻(xiàn)在此并入本文作為參考。一些研究人員表明RNA分子可以由這些能在哺乳動物細(xì)胞中發(fā)揮功能的啟動子來表達(dá)(例如Kashani-Sabetetal.，1992，AntisenseRes.Dev.,2,3-15;Ojwangetal.,1992,Proc.NatLlAcadSci.USA，89,10802-6;Chenetal.，1992，NucleicAcidsRes.，20,4581-9;Yuetal.,1993,Proc.Natl.AcadSci.USA,90,6340-4;L'Huillieretal.，1992，EMBOJ，11,4411-8;Lisziewiczetal.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，90，8000-4;Thompsonetal.，1995，NucleicAcidsRes"23，2259;Sullenger&Cech,1993，Science,262,1566)。更具體地說，諸如由編碼U6小核RNA(snRNA)、轉(zhuǎn)移核糖核酸(tRNA)和腺病毒VARNA驅(qū)動的轉(zhuǎn)錄單位都可用于在細(xì)胞中產(chǎn)生高濃度的目的RNA分子諸如小干擾RNA(Thompsonetal.,supra;CoutureandStinchcomb，1996，supra;Noonbergetal.,1994，NucleicAcidRes.,22,2830;Noonbergetal.，USPat.No.5,624,803;Goodetal.,1997,GeneTher.，4,45;Beigelmanetal.,國際PCT公開號WO96118736;所有這些文獻(xiàn)在此以引文形式并入本文)。上述小干擾RNA轉(zhuǎn)錄單位可以被合并到多種載體引入哺乳動物細(xì)胞，包括但不限于質(zhì)粒DNA載體、病毒DNA載體(如腺病毒或腺相關(guān)病毒載體)或病毒RNA載體(如逆轉(zhuǎn)錄病毒或甲病毒載體)(見CoutureandStinchcomb，1996，supra的綜述)。重要的是，應(yīng)注意到基于利用小干擾RNA靶向1型共濟失調(diào)蛋白的mRNA以使之減少的，針對l型脊髓小腦性共濟失調(diào)癥的治療只是本發(fā)明的一個實施方式。其他的實施方式包括利用抗亨廷頓蛋白的小干擾RNA在人腦部紋狀體給藥，以治療亨廷頓氏舞蹈癥，以及利用抗a-突觸核蛋白的小干擾RNA在人腦部黑質(zhì)給藥，以治療帕金森氏癥。應(yīng)當(dāng)注意，構(gòu)建本發(fā)明中作為治療藥物的小干擾RNA的示例性的方法(即從DNA模板體外轉(zhuǎn)錄并組裝成雙鏈RNA，或?qū)⒕幋a發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA的DNA克隆到腺相關(guān)病毒表達(dá)載體中)只是兩種產(chǎn)生治療性小干擾RNA的可能的手段。也可以使用其它更大規(guī)模的、更為有效的方法生產(chǎn)用于人類患者治療的臨床級別和臨床數(shù)量的小干擾RNA,而不會改變本發(fā)明的實質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員很熟悉在眾所周知的和現(xiàn)有的文獻(xiàn)中討論的原理和方法，如Remington'sPharmaceuticalScience(17thEd.,MackPublishingCo.,Easton，Pa.，1985)禾口GoodmanandGilman'sThePharmaceuticalBasisofTherapeutics(8thEd.,PergamonPress,Elmsford,N.Y.，1990),二者在此均以引.文形式并入本文。在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方式中，根據(jù)適合遞送給人類或哺乳動物的藥物組合物的標(biāo)準(zhǔn)方法制成了含有本發(fā)明的siRNA的藥物或其前體或衍生物的組合物。通常，用于靜脈給藥的組合物是無菌等滲水性緩沖液中的溶液。如有必要，該組合物還可以包括增溶劑和局麻藥來緩解注射部位的疼痛。通常，這些成分可單獨或混合在單位劑型中提供，例如，密封容器如安瓿或sachette容器中的凍干粉或無水濃縮物，標(biāo)明活性成分含量。當(dāng)組合物用于輸液給藥時，它可以用含有藥用級的無菌水或鹽的輸液瓶配藥。當(dāng)組合物用于注射給藥時，可提供一安瓿無菌注射用水或鹽水以便其成分在給藥前混合。在靜脈給藥以外的情況下，該組合物可以含有少量的濕潤劑或乳化劑或pH緩沖劑。該組合物可以是液體溶液、懸濁液、乳液、凝膠、聚合物或緩釋制劑。該組合物可以和本領(lǐng)域知曉的傳統(tǒng)的粘合劑和載體一起制成制劑。制劑可以包括標(biāo)準(zhǔn)載體諸如藥用級的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖類化合物的鈉鹽、纖維素、碳酸鎂等在藥物生產(chǎn)中功能明確的惰性載體。已知多種遞送系統(tǒng)可用于本發(fā)明的治療劑的給藥，包括用脂質(zhì)體包囊、微粒、微囊、納米顆粒和納米膠囊等。在另一個優(yōu)選的實施方式中，含小干擾RNA或其前體或衍生物的治療劑可以制成中性或鹽的形式。藥學(xué)可接受的鹽包括與游離氨基基團形成的鹽，諸如從鹽酸、磷酸、醋酸、18草酸、酒石酸等衍生的鹽，以及與游離羧基基團形成鹽諸如衍生于鈉、鉀、銨、鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因或類似物的鹽。本發(fā)明的治療量是指根據(jù)疾病和病情的性質(zhì)，對一種特定失調(diào)或病情是有效的量，這可以用在藥物給藥方面已經(jīng)明確的標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)確定。所用制劑的精確的劑量也有賴于給藥途徑、疾病或病情的嚴(yán)重程度，應(yīng)當(dāng)根據(jù)操作者的判斷以及患者的需求確定。顱內(nèi)給藥劑量的適當(dāng)范圍通常大約為每毫升1031015感染單位的病毒載體，單次注射13000毫升。每毫升中載體感染單位的加入量通常含有大約104、105、106、107、108、109、101Q、1011、1012、1013、1014感染單位病毒載體，在大約10、50、100、200、500、1000或2000毫升中遞送。有效劑量可以由體外或體內(nèi)試驗系統(tǒng)用量效關(guān)系曲線推定。用本發(fā)明的小千擾RNA載體治療神經(jīng)退行性疾病，可以給特定患者植入具有通路端口的多個導(dǎo)管來完成全程治療。在一個優(yōu)選的實施方式中，每個大腦或小腦半球有一個或幾個端口和導(dǎo)管系統(tǒng)。一旦神經(jīng)外科醫(yī)生完成植入，患者的神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)生就可以進(jìn)行常規(guī)治療，該治療由在幾周到幾個月的時間段重復(fù)靜脈推注小干擾RNA表達(dá)載體，以及隨著時間監(jiān)測治療效果組成。在整個療程中，該裝置可保持植入幾個月或幾年。在確認(rèn)治療有效后，通路端口可選擇性地拔除，導(dǎo)管可以封閉并放棄或者拔除。裝置的材料應(yīng)不會干擾磁共振成像，并且，當(dāng)然，小干擾RNA制劑必須與通路端口和導(dǎo)管的材料以及任何表面涂層相兼容。除非特別限定，本文中的科學(xué)術(shù)語和技術(shù)術(shù)語及命名法具有與本發(fā)明所涉及領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常的理解相同的含義。通常，細(xì)胞培養(yǎng)、感染、分子生物學(xué)方法的流程等是本領(lǐng)域常用的方法。這些標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可見于參考手冊諸如Sambrooketal.(1989,MolecularCloning-ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor.Laboratories)禾口Ausubeletal.(1994，CurrentProtocolsinMolecularBiology,Wiley,N.Y.)。構(gòu)建siRNA表達(dá)質(zhì)粒和/或病毒載體所用的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)按照已知技術(shù)實施，見例如美國專利號4,683,195;4,683,202;4,800,159和4,965,188(所有這三篇美國專利公開專利文獻(xiàn)以引文形式并入本文)。通常，PCR涉及在雜交條件下，用待測特定序列每一條鏈的一條寡核苷酸引物處理核酸樣品(如在熱穩(wěn)定DNA聚合酶存在時)。每一引物合成的延伸產(chǎn)物與兩條核酸鏈中的每一條互補，該引物和具有特定序列的每條鏈充分互補、雜交。從每條引物合成的延伸產(chǎn)物還可以作為模板，用相同的引物進(jìn)一步合成延伸產(chǎn)物。延伸產(chǎn)物的合成經(jīng)足夠的循環(huán)數(shù)之后，分析樣品以測定待測序列是否存在?？梢栽陔娪竞?，用溴化乙錠染色使DNA可見，以檢測擴增序列，或按照現(xiàn)有技術(shù)使用可檢測標(biāo)簽來等方法檢測。PCR技術(shù)的綜述見PCRProtocols,AGuidetoMethodsandAmplifications,Michaeletal.Eds，Acad.Press,1990。裝置本發(fā)明還提供了使用前述的小干擾^NA，遞送小干擾RNA到腦部靶位的裝置、系統(tǒng)和方法。可預(yù)見的遞送途徑是通過使用植入的、內(nèi)在的腦實質(zhì)內(nèi)導(dǎo)管，它能提供途徑直接注射含AAV或其它載體的小體積液體到局部腦組織的途徑。這些導(dǎo)管的近端可以連接到一個植入的、外科方法固定在患者腦內(nèi)的顱內(nèi)通路端口，或者連接到位于患者軀干的植入性的藥物泵。本發(fā)明范圍的遞送裝置的例子包括8506型實驗器械(麥德托尼克公司，明尼阿波利斯，明蘇里達(dá)州)，它能皮下植入在顱骨上，提供一個通路端口，治療藥物可以通過它被遞送給腦。遞送通過一個通過立體定向植入的聚氨酯導(dǎo)管來實現(xiàn)。圖4和圖5示意性地描述了8506型實驗器械。能在8506型實驗器械通路端口工作的兩種型號的導(dǎo)管包括8770型腦室導(dǎo)管(麥德托尼克公司)，用于遞送到腦室，公開于美國專利6,093,180，在此以引文形式并入本文；以及IPA1導(dǎo)管(麥德托尼克公司)，用于遞送到腦組織本身(腦實質(zhì)內(nèi)遞送)，公開于美國專利09/540,444和09/625,751，在此以引文形式并入本文。后者導(dǎo)管在遠(yuǎn)端具有多個出口以便沿導(dǎo)管方向的多個位置遞送治療藥物。在接入和放置過程中，優(yōu)選放置某些器件來定位導(dǎo)管遠(yuǎn)端。優(yōu)選在遠(yuǎn)端使用接入和放置過程中能被檢測到的標(biāo)記物。如果接入和定位使用某種形式的x射線放射完成的，則標(biāo)記物優(yōu)選為射線不能透過的。射線不能透過的標(biāo)記物至少是遠(yuǎn)端尖部的一部分x射線不能透過，使尖端在接入和放置過程中通過熒光鏡或通過x線能被觀察到。在一個有優(yōu)勢的實施方式中，該射線成像標(biāo)記物包括鉭份，它分散在由生物相容性粘合劑(諸如如上討論的)組成的基質(zhì)中。其他可能適合作為射線成像標(biāo)記物的材料諸如鋇或鉑材料。通常，射線成像標(biāo)記物需要預(yù)先澆鑄在導(dǎo)管遠(yuǎn)端尖部。選擇性地，放射成像標(biāo)記物可以選擇那些具有足夠放射濃度以便在成像過程中可視，而在導(dǎo)管尖端鑄造時以粉狀形式分散在導(dǎo)管遠(yuǎn)端尖部的材料?？蛇x擇地，標(biāo)記物還可以由與核磁共振成像(MRI)相兼容的材料組成以便遠(yuǎn)端尖部在MRI掃描時可被檢測到。這種標(biāo)記物優(yōu)選的材料是鉑，而鋇、鉭以及相似的材料也可用。不管是否使用放射成像或MRI，提供這種成像標(biāo)記物的目的是使術(shù)者能精確地檢測到尖端的確切位置，有助于放置以及以后驗證導(dǎo)管遠(yuǎn)端的完整性和位置。除了上述裝置，根據(jù)本發(fā)明的小干擾RNA載體的遞送也可以用包括但不限于美國專利5,735,814、5,814,014和6,042,579的多種裝置完成。所有這些在此以引文形式并入本文。采用本發(fā)明，本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員可以認(rèn)識到這些以及其它的裝置和系統(tǒng)都可以適合遞送本發(fā)明的小干擾RNA載體來治療神經(jīng)退行性疾病。在一個優(yōu)選的實施方式中，該方法還包括在腦外植入泵的步驟，該泵與導(dǎo)管的近端相耦聯(lián)，操縱泵即可通過導(dǎo)管的排出部位遞送預(yù)定劑量的至少一種小干擾RNA或小干擾RNA載體。進(jìn)一步的實施方式還包括周期性地為腦外泵更新至少一種小干擾RNA或RNA載體的供給的進(jìn)一步步驟。腦內(nèi)預(yù)定位置可以通過多種方法定位，例如，對于某些應(yīng)用，靶區(qū)可以通過立體排列方式或大體解剖圖譜來定位。在其它實施方式中，當(dāng)靶區(qū)的精確定位非常關(guān)鍵時，例如，當(dāng)至少部分可逆性基因治療系統(tǒng)被遞送到患者腦內(nèi)時，可以采用其它定位方法。這些定位方法包括，但不限于，正電子發(fā)射體層顯像和單光子發(fā)射計算機斷層顯像(分別是PET和SPECT)、藥理學(xué)磁共振成像(phMRI)、功能性MRI(fMRI)和對照增強計算機化成像(CT)掃描。20在另外一個實施方式中，基于計算機輔助圖譜的功能神經(jīng)手術(shù)方法學(xué)可用來準(zhǔn)確和精確地注射本發(fā)明的至少部分可逆性基因治療系統(tǒng)。這些方法學(xué)允許對腦結(jié)構(gòu)的三維顯示和實時操縱。因此，在三維正交定向多腦圖譜相互預(yù)登記的神經(jīng)外方案是可能的，可提高神經(jīng)毒素的注射或植入靶位界限的精確度，通過減少手術(shù)泳道的數(shù)目減少手術(shù)過程的時間，有助于設(shè)計更為復(fù)雜的軌道。見如NowinskiW.L.etal.,Computer-AidedStereotacticFunctionalNeurosurgeryEnhancedbytheUseoftheMultipleBrainAtlasDatabase,IEEETransMedImaging19(1);62-69:2000.在另外一個實施方式中，定位方法還容許術(shù)中驗證導(dǎo)管遠(yuǎn)端的放置。例如，導(dǎo)管遠(yuǎn)端的放置的驗證可以通過術(shù)中使用過MRI實施，MRI可使用術(shù)中MR成像導(dǎo)向系統(tǒng)通諸如PoleStariMRINavigationSuite或與之相當(dāng)?shù)南到y(tǒng)。在另外一個例子中，在接入和放置過程中定位遠(yuǎn)端的方法是使用暫時性地附著到導(dǎo)管近端部分或外科醫(yī)生正在使用的將導(dǎo)管插入到患者腦內(nèi)的手術(shù)儀器上的紅外光反射小球。手術(shù)室中的紅外照相機安放在手術(shù)臺附近，發(fā)射和追蹤從這些小球反射的紅外信號。檢測到的反射使得軟件和計算機系統(tǒng)儲如StealthStation"能夠計算和顯示導(dǎo)管遠(yuǎn)端的位置，在術(shù)中實時地疊加到之前捕獲的、該具體患者的MRI成像。(這是可能的，因為該導(dǎo)管的遠(yuǎn)端和該導(dǎo)管近端為已知的線性距離，而紅外光反射球就是暫時附著在近端的)。在另外一個實施例中，在接入和放置過程中定位遠(yuǎn)端的方法是使用暫時性地附著到導(dǎo)管近端部分或外科醫(yī)生正在使用的將導(dǎo)管插入到患者腦內(nèi)的手術(shù)儀器上的紅外發(fā)射發(fā)光二極管(LED)。手術(shù)室中的紅外照相機安放在手術(shù)臺附近，發(fā)射和追蹤從這些LED發(fā)射的的紅外信號。檢測到的反射使得軟件和計算機系統(tǒng)(諸如StealthStatioi^)能夠計算和顯示導(dǎo)管遠(yuǎn)端的位置，在術(shù)中實時地疊加到之前捕獲的、該具體患者的MRI成像。(這是可能的，因為該導(dǎo)管的遠(yuǎn)端和該導(dǎo)管近端為已知的線性距離，而LED就是暫時附著在近端的)。不管是使用被動反射的紅外光還是使用主動發(fā)射的紅外光來計算導(dǎo)管的位置或術(shù)者所用的辨導(dǎo)管插入患者腦內(nèi)的手術(shù)儀器的位置，使用紅外三角法的目的是使術(shù)者精確攤測定尖端的確切位置，幫助放置和在術(shù)中驗證導(dǎo)管遠(yuǎn)端的完整性和位置。因此，本發(fā)明包括使用可植入性泵和導(dǎo)管遞送小干擾RNA載體，如美國專利5,735,814和6,042,579所揭示的，并且還使用傳感器作為注入系統(tǒng)的一部分來調(diào)節(jié)遞送到腦的小干擾RNA載體的量，如美國專利5,814,014所揭示。根據(jù)本發(fā)明的方法，還可使用例如美國專利申請?zhí)?9/872,698(2001年1月1日提交)和申請?zhí)?9/864,646(2001年5月23日提交)中所公開的其他裝置和系統(tǒng)，在此以引文形式并入本文。綜上，本發(fā)明提供了遞送小干擾RNA載體到人中樞神經(jīng)系統(tǒng)的方法，因此可通過減少神經(jīng)元內(nèi)致病蛋白的產(chǎn)生來治療神經(jīng)退行性疾病。本發(fā)明旨在治療神經(jīng)退行性障礙和/或疾病，包括帕金森氏病、阿爾茲海默氏病、亨廷頓氏舞蹈癥、l型、2型和3型脊髓小腦性共濟失調(diào)，和/或任何由致病性蛋白產(chǎn)生而引起或加重的神經(jīng)退行性疾病，或由任何其它突變蛋白獲得新的致病性功能而引起的神經(jīng)退行性疾病。21實施例實施例l靶向人1型共濟失調(diào)蛋白mRNA的小干擾RNA的構(gòu)建作為本發(fā)明實施方式的一個實施例，我們制成了一種靶向人1型共濟失調(diào)蛋白mRNA的小干擾RNA。該小干擾RNA可減少細(xì)胞培養(yǎng)物中人細(xì)胞中人1型共濟失調(diào)蛋白mRNA的量。作為1型脊髓小腦性共濟失調(diào)癥(SCA1)的治療手段，使用植入的通路端口和導(dǎo)管，同樣的小干擾RNA或類似的小干擾RNA將被遞送到患者腦部的小腦細(xì)胞。結(jié)果是這些細(xì)胞中的1型共濟失調(diào)蛋白量的減少，因此減緩或阻滯了患者SCA1病的進(jìn)展?？谷?型共濟失調(diào)蛋白的小干擾RNA基于人1型共濟失調(diào)蛋白核酸序列構(gòu)建。人1型共濟失調(diào)蛋白核酸序列從NCBI提供的公開的核酸數(shù)據(jù)庫檢索，NCBI檢索登錄號為NM—000332(SEQIDNO:15)。人1型共濟失調(diào)蛋白mRNA序列的一部分被鑒定為小千擾RNA裂解的潛在位點，并通過MFOLD分析預(yù)測為單鏈的。在登錄號NM—000332(SEQIDNO:15)中，構(gòu)建了三對抗1型共濟失調(diào)蛋白的siRNA靶點1.靶向1型共濟失調(diào)蛋白mRNA序列945965位的抗1型共濟失調(diào)蛋白siRNA:SEQIDNO:1:5'-AACCAAGAGCGGAGCAACGAA-3'SEQIDNO:2:3'國GGTTCTCGCCTCGTTGCTTAA-5'2.靶向1型共濟失調(diào)蛋白mRNA序列16711691位的抗1型共濟失調(diào)蛋白siRNA:SEQIDNO:3:5'-AACCAGTACGTCCACATTTCC-3'SEQIDNO:4:3'-GGTCATGCAGGTGTAAAGGAA-5'3.靶向1型共濟失調(diào)蛋白mRNA序列27502770位的抗1型共濟失調(diào)蛋白siRNA:SEQIDNO:5:5'-AAGCAACGACCi;GAAGATCGA-3'SEQIDNO:6:3'-CGTTGCTGGACTTCTAGCTAA-5'設(shè)計了一系列的6個脫氧寡核苷酸片段，從MWGBiotech公司定制并購買，寡核苷酸合成定制服務(wù)提供的6個片段組成了三個靶位點。另外，這些寡核苷酸構(gòu)建時還包括和T7啟動子引物(包括在siRNA構(gòu)建試劑盒中，Ambion公司。貨號1620)5'末端互補的8個堿基序列。每個特異性寡核苷酸都與所提供的T7啟動子引物退火，用Klenow片段補平，產(chǎn)生用以轉(zhuǎn)錄成RNA的全長DNA模板。通過體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)生成了兩種體外轉(zhuǎn)錄RNA(其一是另外一個的反義RNA)，然后彼此雜交產(chǎn)生雙鏈RNA。該雙鏈RNA產(chǎn)物用DNA酶(以去除DNA轉(zhuǎn)錄模板)和RNA酶(以削平雙鏈RNA末端).處理、柱純化以提供該三種siRNA，這三種siRNA被遞送入細(xì)胞并在其中檢測。實施例2耙向人1型共濟失調(diào)蛋白mRNA的小干擾RNA的遞送所構(gòu)建的如實施例1所述的siRNA分子1-3轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞。收獲轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生的RNA，分析以測定人l型共濟失調(diào)蛋白mRNA的量。圖1顯示定量逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)分析HEK293H細(xì)胞培養(yǎng)物中每微克總RNA中1型共濟失調(diào)蛋白信使RNA(mRNA)的量的結(jié)果。分析了四個細(xì)胞群。第一個細(xì)胞群是被抗GAPDH(—種與1型共濟失調(diào)蛋白mRNA表達(dá)沒有已知的相關(guān)性的"管家基因")的siRNA瞬時轉(zhuǎn)染的293H細(xì)胞(抗GAPDHsiRNA作為標(biāo)準(zhǔn)對照，siRNA制備和檢測商業(yè)試劑盒，Ambion,Inc.提供)。第二個細(xì)胞群是被抗1型共濟失調(diào)蛋白mRNA(抗1型共濟失調(diào)蛋白mRNA序列1671位)的siRNA瞬時轉(zhuǎn)染的293H細(xì)胞。第三個細(xì)胞群是被含有抗1型共濟失調(diào)蛋白mRNA的核酶(該核酶在1型共濟失調(diào)蛋白mRNA序列的第1364位裂解l型共濟失調(diào)蛋白mRNA)的質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染的293H細(xì)胞。第四個細(xì)胞群是被含有抗1型共濟失調(diào)蛋白mRNA第0945位的siRNA瞬時轉(zhuǎn)染的293H細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48小時后，同時收獲所有細(xì)胞群得到總細(xì)胞RNA。在照片中的凝膠上，RT-PCR反應(yīng)擴增的DNA產(chǎn)物被凝膠電泳按分子大小分離，可以看出是不同濃度的條帶。所述的每個細(xì)胞群都采用一系列平行反應(yīng)分析，顯示為每個凝膠上部或下部的一組泳道。每一組泳道包括每個泳道的兩條帶。上面一條帶是加入到反應(yīng)中的已知量的DNA的DNA擴增產(chǎn)物，它和由細(xì)胞mRNA逆轉(zhuǎn)錄而來的內(nèi)源性cDNA競爭。如果在某一泳道的條帶的具有相同的濃度，則可以推斷原始細(xì)胞樣本中的細(xì)胞mRNA的量與加入到反應(yīng)管中的已知量的DNA的量相同。泳道從左到右，加入的DNA標(biāo)準(zhǔn)品的量是減少的，顯示是皮克級的量。該分析可以通過觀察該組泳道來解釋，該組泳道中，條帶的濃度從DNA標(biāo)準(zhǔn)品最亮到位于其下的細(xì)胞產(chǎn)物最亮"跨越"，表示此時DNA標(biāo)準(zhǔn)品的量比細(xì)胞mRNA低了。如圖1所示的凝膠，上面一組泳道來源于用抗1型共濟失調(diào)蛋白mRNA的核酶轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。將來自細(xì)胞樣本的條帶和來自DNA標(biāo)準(zhǔn)品的條帶相比較，表明這些細(xì)胞中1型共濟失調(diào)蛋白mRNA的量為0.505皮克到0.303皮克之間/微克總細(xì)胞RNA。下面一組泳道來源于用抗l型共濟失調(diào)蛋白第0945位的siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。對這些泳道的分析表明，這些細(xì)胞中1型共濟失調(diào)蛋白mRNA的量為0.303皮克到0.202皮克之間/微克總細(xì)胞RNA。如圖2所示的凝膠，上面一組泳道來源于用對照用抗GAPDH的siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。對這些泳道的分析表明，這些細(xì)胞中1型共濟失調(diào)蛋白mRNA的量為0.711皮克到0.400皮克之間/微克總細(xì)胞RNA。最后，下面一組泳道來源于用另一抗1型共濟失調(diào)蛋白第1671位的siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。這些泳道表明1型共濟失調(diào)蛋白mRNA的量為0.404皮克到0.303皮克之間/微克總細(xì)胞RNA?？傊?，具體分析結(jié)果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>表2抗1型共濟失調(diào)蛋白的siRNA對細(xì)胞培養(yǎng)物中1型共濟失調(diào)蛋白mRNA表達(dá)的影響這些數(shù)據(jù)顯示抗1型共濟失調(diào)蛋白的siRNAAT1671和AT0945，在轉(zhuǎn)染后48小時，對于減少細(xì)胞中的1型共濟失調(diào)蛋白mRNA的量都是有效的，并且siRNA對于減少1型共濟失調(diào)蛋白mRNA比抗-1型共濟失調(diào)蛋白的核酶更加有效。應(yīng)當(dāng)注意，用于本發(fā)明的治療的小干擾RNA的示例性的構(gòu)建方法(即通過體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的寡核苷酸組裝和雜交)只是制備該治療性小干擾RNA的可能的手段之一。亦可使用其它生產(chǎn)用于人類患者治療的臨床級別的和臨床數(shù)量的更大規(guī)模、更為有效的方法而不會改變本發(fā)明的主旨或偏離由所附的權(quán)利要求定義的本發(fā)明的精神和范圍。實施例3使用小干擾RNA等位基因特異性減少1型共濟失調(diào)蛋白的表達(dá)在雜合體患者中，如果單核苷酸多態(tài)性(SNP)在突變體與正常長度的等位基因中有所不同，那么適合的siRNA則可以選擇性地僅僅降低突變的等位基因的表達(dá)。我們己經(jīng)采用自SCAl起始密碼下游的第+927位(見登錄號NT—007592)SNP等位基因特異性RT-PCR檢測了293、DAOY、SK-N-SH和HeLa細(xì)胞。HeLa細(xì)胞表達(dá)927C而不是927T等位基因，而293細(xì)胞則表達(dá)927T而不是927C等位基因，DAOY和SK-N-SH細(xì)胞則表達(dá)兩種等位基因變異體。我們以該位點為中心，已經(jīng)生成了等位基因特異性siRNA。用這些siRNA對內(nèi)源性SCA1mRNA變異體等位基因特異性抑制的檢測結(jié)果將被給出。實施例4小干擾RNA病毒載體的構(gòu)建構(gòu)建了選擇性報告質(zhì)粒pAAV-U6-Tracer來克隆siRNA(見圖3)。構(gòu)建的質(zhì)粒pAAV-U6-Tracer含有腺相關(guān)病毒的反向末端重復(fù)序列(ITR)、U6RNA聚合酶III啟動子側(cè)翼區(qū)(來自pSilencer，Ambion)、EF1啟動子、綠色熒光蛋白、Zeocin1抗性基因和SV40polyA(來自pTracer，Irwitrogen)。克隆的基因片段如圖3所示。表達(dá)siRNA的寡核苷酸被克隆到緊接U6RNA聚合酶III啟動子下游3'端的多克隆區(qū)域。HEK293細(xì)胞用pAAV-siRNA、pHeiper和pAAV-RC共轉(zhuǎn)染，得到病毒生產(chǎn)細(xì)胞，其中pAAV-RC和pHelper質(zhì)粒是這三個質(zhì)粒AAV生產(chǎn)系統(tǒng)的一部分(Avigen公司)。在培養(yǎng)基中生長的293生產(chǎn)細(xì)胞用于分離重組病毒，該病毒用來轉(zhuǎn)染二級細(xì)胞HeLa細(xì)胞、DAOY細(xì)胞和SK-N-SH細(xì)胞。實施例5注射序列為SEQIDNO:24的siRNA局部顯著地降低HDmRNA的量為了證實如上公開的siRNA序列在體內(nèi)是有效的，給恒河猴注射3X1011含AAV載體的病毒顆粒，該AAV載體包含序列如表3所示的SEQID.NO:24或SEQ.ID.NO:25序列的siRNA或?qū)φ誷iRNA，對照siRNA由CMV啟動子調(diào)控的GFP序列上游的U6啟動子調(diào)控。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>表3抗HDmRNA的siRNA序列<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>表4試驗設(shè)計亨廷頓蛋白(HD)mRNA和蛋白自組織環(huán)切塊或自組織切片激光微束切割的(LMD)細(xì)胞分離，分別用qRT-PCR或蛋白質(zhì)印跡法(Westernblot)定量。注射含有序列SEQIDNO:24的siRNA載體引起動物1在表達(dá)GFP的表達(dá)在殼核部位與同一半球(右側(cè))非GFP表達(dá)殼核部f立相比，HDmRNA減少了37。/。(用qRT-PCR測定組織環(huán)切塊)。同一動物的左半球，GFP表達(dá)區(qū)域與非GFP表達(dá)區(qū)域相比，HDmRNA的量減少了65%70%用(qRT-PCR測定LMD切片)。另外，siRNA治療效果是半球特異性的。在動物2中觀察到右半球(注射含序列SEQIDNO:24的載體)的GFP表達(dá)區(qū)與左半球(注射了含對照siRNA的載體)的GFP表達(dá)區(qū)相比，HDmRNA顯著下降。因此，這些數(shù)據(jù)顯示含SEQIDNO:24序列的siRNA的病毒構(gòu)建體，可以局部地、顯著地減少HDmRNA的量。實施例6注射序列為SEQIDNO:24的siRNA不會導(dǎo)致大的解剖學(xué)異常，也不會損害轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)動物按照前述實施例的方案注射。用熒光顯微鏡檢測綠色熒光蛋白，蘇木精伊紅(H&E)染色、熒光顯微鏡檢測亨廷頓蛋白免疫染色，免疫染色法檢測鈣聯(lián)蛋白，免疫染色法檢測蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)，進(jìn)行組織病理學(xué)分析。這些研究結(jié)果顯示HD抑制不會引起注射部位任何可檢測的神經(jīng)解剖學(xué)異常。病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)可觀察到外周血管成套的證據(jù)，但是這種成套與HD抑制沒有相關(guān)性。另外，鈣聯(lián)蛋白和PDI染色沒有顯示轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的任何明顯改變。實施例7注射序列為SEQIDNO:24的siRNA不會改變自發(fā)活動并趨向改善精細(xì)自主活動(finelocomotoractivity)動物按照實施例5的方案注射。自發(fā)活動和精細(xì)運動行為(finemotoractivity)分別用EthoVision和mMAP儀測定。EthoVision是一種商業(yè)化的視覺追蹤系統(tǒng)(EthoVisionPro,version2.2,NoldusInformationTechnologies,Asheville,NC),可以測定觀察時段內(nèi)動物運動的距離(cm)和整個身體的運動速度(cm/sec)。mMAP儀(稱自動猴運動分析儀mMAP)是一種用于客觀測定恒河猴在從容器室內(nèi)的平板上拿取食物時小手肌的精細(xì)運動時間。尾狀核和殼核HD的抑制不會引起動物自發(fā)活動的改變。任何動物的精細(xì)自主活動也未受到損害。另外，病毒注射后，所有動物的精細(xì)運動技巧都趨向改善。雖然本發(fā)明參考特別實施方式進(jìn)行了描述，可以理解，這些實施方式都只是對本發(fā)明的原則和應(yīng)用的舉例說明。因此應(yīng)當(dāng)理解，可以對這里舉例說明的實施方式進(jìn)行大量的改變和設(shè)計其它排列，均不會偏離由權(quán)利要求定義的本發(fā)明的精神和范圍。說明書中引用的所有文獻(xiàn)，包括專利文獻(xiàn)和非專利文獻(xiàn)，都代表著本發(fā)明相關(guān)的
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員的技術(shù)水平。所有這些文獻(xiàn)在此全文以引文形式并入本文，其程度相當(dāng)于每一篇文獻(xiàn)都具體地、個別地指出作為文獻(xiàn)并入本文。權(quán)利要求1.一種用于治療亨廷頓氏舞蹈癥的醫(yī)學(xué)系統(tǒng)，包括a)顱內(nèi)通路裝置；b)定位腦部預(yù)定位置的定位器件，所述的預(yù)定位置含有至少一個細(xì)胞表達(dá)亨廷頓蛋白；c)可遞送數(shù)量的小干擾RNA，所述小干擾RNA包括第一鏈，該鏈含有至少19個連續(xù)核苷酸，核苷酸由選自序列SEQ.ID.NO24或序列SEQ.ID.NO25的基團或編碼所述小干擾RNA的載體編碼；d)遞送器件，用于通過所述顱內(nèi)通路裝置來遞送所述小干擾RNA到所述腦部位置。2.如權(quán)利要求1所述的醫(yī)學(xué)系統(tǒng)，其中所述的顱內(nèi)通路裝置是顱內(nèi)通路端口。3.如權(quán)利要求1或2所述的醫(yī)學(xué)系統(tǒng)，其中所述的腦內(nèi)預(yù)定位置是尾狀核、殼核、放射冠或紋狀體。4.如權(quán)利要求13的任一權(quán)利要求所述的醫(yī)學(xué)系統(tǒng)，其中所述的遞送器件是從外部注射器到顱內(nèi)通路端口的注射器件。5.如權(quán)利要求14的任一權(quán)利要求所述的醫(yī)學(xué)系統(tǒng)，其中所述的遞送器件是輸液泵。6.如權(quán)利要求5所述的醫(yī)學(xué)系統(tǒng)，其中所述的輸液泵是機電泵。7.如權(quán)利要求5所述的醫(yī)學(xué)系統(tǒng)，其中所述的輸液泵是滲透泵。8.如權(quán)利要求17的任一權(quán)利要求所述的醫(yī)學(xué)系統(tǒng)，其中所述的載體是病毒載體。9.如權(quán)利要求8所述的醫(yī)學(xué)系統(tǒng)，其中所述的病毒載體是腺相關(guān)病毒載體。10.如權(quán)利要求8所述的醫(yī)學(xué)系統(tǒng)，其中所述的病毒載體還編碼一條第二鏈，其中第二鏈與第一鏈至少15個連續(xù)的核苷酸互補。11.如權(quán)利要求110的任一權(quán)利要求所述的醫(yī)學(xué)系統(tǒng)，其中小干擾RNA還包括一條第二鏈，其中第二鏈與第一鏈至少15個連續(xù)的核苷酸互補。12.如權(quán)利要求111的任一權(quán)利要求所述的醫(yī)學(xué)系統(tǒng)，其中定位器件是患者特異性的和用于術(shù)中的。13.如權(quán)利要求112的任一權(quán)利要求所述的醫(yī)學(xué)系統(tǒng)，其中的顱內(nèi)通路裝置包插一個導(dǎo)管，其中的導(dǎo)管包括標(biāo)記物。14.一種治療亨廷頓氏舞蹈癥患者的方法,包括a)定位腦內(nèi)預(yù)定位置，所述的預(yù)定位置含有至少一個亨廷頓蛋白表達(dá)細(xì)胞；b)安放顱內(nèi)通路遞送裝置，以提供到達(dá)腦內(nèi)預(yù)定位置的通路；c)注入一種小干擾RNA，所述小干擾RNA包括第一鏈，該鏈含有至少19個連續(xù)核苷酸，核苷酸由選自序列SEQ.ID.NO:24或序列SEQ.ID.NO:25的序列編碼，或由編碼所述小干擾RNA的載體編碼；其中亨廷頓氏舞蹈癥的至少一個屬性被降低或其進(jìn)展被延緩或阻滯。15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中的顱內(nèi)通路裝置是顱內(nèi)通路端口。16.如權(quán)利要求14或15所述的方法，其中的腦內(nèi)預(yù)定位置是尾狀核、殼核、放射冠或紋狀體。17.如權(quán)利要求1416的任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述的遞送器件是從外部注射器到顱內(nèi)通路端口的注射器件。18.如權(quán)利要求1417的任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述的遞送器件是輸液泵。19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述的輸液泵是機電泵。20.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述的輸液泵是滲透泵。21.如權(quán)利要求1420的任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述的載體是病毒載體。22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述的病毒載體是腺相關(guān)病毒載體。23.如權(quán)利要求21或22所述的方法，其中的病毒載體還編碼一條第二鏈，其中第二鏈與第一鏈至少15個連續(xù)的核苷酸互補。24.如權(quán)利要求1423的任一權(quán)利要求所述的方法，其中小干擾RNA還包括一條第二鏈，其中第二鏈與第一鏈至少15個連續(xù)的核苷酸互補。25.如權(quán)利要求1424的任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述的小干擾RNA至少在四周內(nèi)不會引起患者的死亡。26.如權(quán)利要求1425的任一權(quán)利要求所述的方法，其中注入的小干擾RNA不會損害患者的精細(xì)自主活動。27.如權(quán)利要求1426的任一權(quán)利要求所述的方法，其中的小干擾RNA在至少一個亨廷頓蛋白表達(dá)細(xì)胞中表達(dá)。28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中小干擾RNA在至少一個亨廷頓蛋白表達(dá)細(xì)胞中的表達(dá)不會損害該至少一個細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。29.如權(quán)利要求27或28所述的方法，其中小干擾RNA在至少一個亨廷頓蛋白表達(dá)細(xì)胞中的表達(dá)不會損害鈣聯(lián)接蛋白的表達(dá)或分布。30.如權(quán)利要求2729的任一權(quán)利要求所述的方法，其中小干擾RNA在至少一個亨廷頓蛋白表達(dá)細(xì)胞中的表達(dá)不會摜害PDI的表達(dá)或分布。31.如權(quán)利要求1430的任一權(quán)利要求所述的方法，其中安放顱內(nèi)通路遞送裝置的步驟是在亨廷頓氏舞蹈癥診斷后實施的。32.如權(quán)利要求1430的任一權(quán)利要求所述的方法，其中安放顱內(nèi)通路遞送裝置的步驟是在亨廷頓氏舞蹈癥診斷后，并且亨廷頓氏舞蹈癥癥狀出現(xiàn)以前實施的。33.如權(quán)利要求1430的任一權(quán)利要求所述的方法，其中安放顱內(nèi)通路遞送裝置的步驟是在亨廷頓氏舞蹈癥癥狀出現(xiàn)以后實施的。34.如權(quán)利要求1433的任一權(quán)利要求所述的方法，其中安放顱內(nèi)通路遞送裝置的步驟是術(shù)中驗證的。35.如權(quán)利要求1434的任一權(quán)利要求所述的方法，其中的顱內(nèi)通路遞送裝置包括標(biāo)記物。36.如權(quán)利要求1435的任一權(quán)利要求所述的方法，其中腦內(nèi)預(yù)定位置是以患者特異的方式定位的。全文摘要本發(fā)明提供了治療神經(jīng)退行性障礙的裝置、小干擾RNA和方法，該方法包括手術(shù)植入導(dǎo)管以使該導(dǎo)管的排放部位與腦內(nèi)預(yù)定的注入部位相鄰，并且通過該導(dǎo)管的排放部位排放預(yù)定劑量的能夠抑制至少一種神經(jīng)退行性蛋白產(chǎn)生的至少一種物質(zhì)。本發(fā)明還提供了體內(nèi)治療亨廷頓氏舞蹈癥而不會損傷患者細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、自發(fā)運動活動和自主運動活動的有益的小干擾RNA載體、系統(tǒng)和方法。文檔編號A61M37/00GK101522202SQ200780037105公開日2009年9月2日申請日期2007年8月8日優(yōu)先權(quán)日2006年8月8日發(fā)明者威廉姆·F·卡恩米勒申請人:美敦力公司