專利名稱：：用于調(diào)控細(xì)胞存活的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及信息的實(shí)際應(yīng)用，所述的信息是關(guān)于血小板調(diào)節(jié)領(lǐng)域中的細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)。具體而言，本發(fā)明涉及Bcl-2家族的成員、它們的調(diào)節(jié)劑、以及更寬泛而言的能夠有效調(diào)控細(xì)胞凋亡的藥理學(xué)制劑。本發(fā)明提供了新的靶標(biāo)、方法和制劑以用于調(diào)控與血小板或其前體有關(guān)的相互作用。具體而言，本發(fā)明思考了在治療或預(yù)防與遺傳性或獲得性血小板增多或血小板減少(例如但不限于血管病或出血疾病)有關(guān)的狀況時使用的方法和制劑。本發(fā)明進(jìn)一步涉及制備和儲存血液和血液衍生物的方法和制劑、以及調(diào)控尤其是血小板更新率、止血、凝塊形成、組織重塑和痊愈的方法。
背景技術(shù)：
：在本敘述內(nèi)容的結(jié)尾處收集了在本說明書中作者所引用的出版物的目錄詳情。的信息)或者引用任何已知的事物，不能并且不應(yīng)該成為承認(rèn)或者以任何方式提示，這些現(xiàn)有的出版物(或者由該出版物所得到的信息)或者已知的事物形成了本說明書所涉及的致力領(lǐng)域中的一部分公知常識。血小板是在血液中循環(huán)的巨核細(xì)胞的無核小碎片，并且主要參與諸如血液凝結(jié)和傷口痊愈之類的功能。血小板由巨核細(xì)胞產(chǎn)生，其中所述的巨核細(xì)胞為在骨髓和脾中發(fā)育形成的大型多倍體細(xì)胞。巨核細(xì)胞脫落下血小板，從而進(jìn)入到血流中，血小板循環(huán)大約10天(人)(Leeksma"a/.，Nature,〃J:552-553，1955)，然后被主要存在于肝和脾中的網(wǎng)內(nèi)皮系統(tǒng)破壞。與所有譜系的血細(xì)胞類似，數(shù)量呈穩(wěn)定狀態(tài)的成熟血小板是血小板生成和破壞之間達(dá)到平衡的結(jié)果。在正常個體中，對這些細(xì)胞的增殖、分化、存活和清除的精確控制確保了動態(tài)平衡的保持，并減小了出血(由血小板數(shù)量減少造成)或血栓癥(由血小板過量生成造成)的可能性。如果這種精確的平衡被擾亂，血小板減少或血小板數(shù)量低會隨之發(fā)生。由于血小板減少會導(dǎo)致潛在的致命性出血事件，所以在臨床上，特別是在血液病和腫瘤實(shí)踐中，血小板減少是常見問題。血小板減少可以先天發(fā)生，并伴有多種已經(jīng)定義的遺傳性紊亂(Drachman，Blood，390-398,2004)，但是在臨床上所見的大部分的血小板減少是由其他原因所導(dǎo)致的結(jié)果。對于進(jìn)行癌癥化療的患者而言，血小板減少是主要的問題。與細(xì)胞毒性藥物有關(guān)的血小板減少的急性事件除了將患者置于緊急的危險(xiǎn)之中外，其還可以迫使修改劑量或治療撤除，因此會減弱治療效力。此外，在骨髓增生異常綜合癥(MDS)、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)和慢性肝病中還經(jīng)常遭遇血小板減少，并且血小板減少與病毒感染(特別是AIDS)有關(guān)(Kuter，Blood，歲3457-3469，2002)。在這些更慢性疾病中，血小板減少可能是由于缺陷性血小板的產(chǎn)生或升高的血小板破壞所導(dǎo)致，而這通常是自體免疫應(yīng)答的結(jié)果。針對血小板數(shù)量低的治療方法包括血小板輸注和潛在地施用血小板生成素。血小板介導(dǎo)的血栓癥是導(dǎo)致血管疾病(例如心血管疾病、腦血管疾病、和外周血管疾病)的主要機(jī)制?？刂蒲“宓乃交蚧钚允强寡òY治療的必要部分。諸如阿司匹林、非甾體抗炎劑、P-內(nèi)酰胺抗生素、奎納定、釣通道阻斷劑、噻氯匹定、氯吡格雷和阿昔單抗之類的抗血小板劑被用于治療心肌梗塞和缺血性卒中、或者它們隨后的并發(fā)癥，但是需要更有效且更安全的藥物。在患有諸如骨髓增生疾病、慢性肺部阻塞性疾病和原發(fā)性血小板增多之類狀況的受試對象中，觀察到趨血栓阻塞性狀態(tài)。在過去20年，已經(jīng)相當(dāng)詳細(xì)地對細(xì)胞凋亡的分子調(diào)節(jié)進(jìn)行了表征(Marsdene"人，A畫.Rev.Immunol.,W:71-105，2003)。細(xì)胞凋亡是由天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白酶(半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶)家族執(zhí)行的。在健康細(xì)胞中，許多半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶以非活性形式存在，并響應(yīng)于誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的兩個主要信號傳導(dǎo)途徑而活化。其中第一個途徑是由發(fā)育指令、細(xì)胞因子撤除和其他應(yīng)激刺激誘導(dǎo)的，并且由Bcl-2蛋白質(zhì)家族調(diào)節(jié)，其中所述的Bcl-2蛋白質(zhì)家族包括促細(xì)胞凋亡成員(例如Bax、Hrk、Bim)和促存活成員(例如Bcl-2、Bcl-xJ。第二個細(xì)胞凋亡途徑涉及與死亡受體(例如Fas)結(jié)合的配體，從而使得死亡誘導(dǎo)性信號傳導(dǎo)復(fù)合體形成。Bcl-2蛋白質(zhì)家族在調(diào)節(jié)發(fā)育程序性及應(yīng)激誘導(dǎo)性細(xì)胞死亡中起到中心作用(Adams,GenesDev.,J7:2481-2495，2003;Daniala7.，Cell,L6:205-219，2004)。所述家族中與Bcl-2最密切相關(guān)的并且包括Bc卜Xl(Boiseeta/.，Cell,74:597-608，1993)、Bc卜w、Mcl-l和Al在內(nèi)的一個亞類促進(jìn)了特定細(xì)胞的存活。該亞類蛋白質(zhì)保持細(xì)胞存活，直至其活性通過與遠(yuǎn)系相關(guān)的促細(xì)胞凋亡唯BH3域蛋白質(zhì)(例如Bim、Bad或Bid)的直接結(jié)合而被中和為止(Huangefa/，Cell,旭839-842，2000)。雖然可能的是，諸如Bc卜XL之類的促存活蛋白質(zhì)控制了第二類促細(xì)胞調(diào)亡家族成員(即，多結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)Bax和Bak)的作用，但是這些蛋白質(zhì)的精確的生物化學(xué)作用是有爭議的(Adams,2003Daniale"厶，2004(卿ra);WillisandAdams,Curr.Opin.Cell.Biol.，77:617-625,2005)。所述蛋白質(zhì)在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡中可能通過以下過程來起到實(shí)質(zhì)作用(ChengWa人，Mol.Cell.,《705-711，2001;Lindstena厶，Mol.Cell.,沃1389—1399，2000;Rathmel1a7.，NatureImmunology,932-939，2002;Zonga/.，GenesDev.,1481—1486，2001)，所述的過程為破壞諸如線粒體外膜之類的細(xì)胞內(nèi)膜，由此促進(jìn)諸如細(xì)胞色素C(其通常被隔離在細(xì)胞器中)之類的促細(xì)胞凋亡形成因子釋放到細(xì)胞質(zhì)中，從而促進(jìn)了半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的活性(Greene纟a厶，Science,JOi":626-629，2004;Greenefa/.，Science,^7:1309-1311，1998;Yang"a/.，Science,iVJ:1129—1132，1997)。我們對血小板數(shù)量的分子控制的理解是不完全的，并且遺傳性血小板減少的許多情況尚不能解釋(Drachman，2004(s叩ra))。已經(jīng)假定，對循環(huán)血小板數(shù)量的主要生理學(xué)控制為通過網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)進(jìn)行的血小板的產(chǎn)生和血小板的破壞。在這種設(shè)想下，循環(huán)系統(tǒng)中的血小板存活已經(jīng)被認(rèn)為是代謝能力(即，血小板對其前體巨核細(xì)胞的需要)的函數(shù)，并且在血小板的水平和活性的調(diào)控中，細(xì)胞死亡機(jī)制在傳統(tǒng)上被認(rèn)為起到較少的作用或者不起作用。發(fā)明概述在本說明書的全文中，除非總有說明，應(yīng)將術(shù)語"包括/包含"理解為是指涵蓋了給定元素或整體、或者多個元素或整體的組，但不排除任何其他元素或整體、或者多個元素或整體的組。核苷酸和氨基酸序列通過序列標(biāo)識符序號(SEQIDN0:)表示。SEQIDNO:后的數(shù)字對應(yīng)于序列標(biāo)識符〈400M(SEQIDNO:1)、<400>2(SEQIDN0:2)，等。序列標(biāo)識符的概況由表1所提供。序列表在權(quán)利要求書后提供?；蚝推渌虿牧?例如mRNA、構(gòu)建體等)由斜體字表示，而它們的蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物由非斜體字形式表示。因此，Bc卜&為5c7-z的表達(dá)產(chǎn)物。術(shù)語"Bc卜x,或"Sc7-f、"Bak"或、"Bax"或"&y，用于涵蓋任何生物種類中的所有功能相似的同源物。對導(dǎo)致小鼠血小板減少的突變進(jìn)行基因篩選使得對作為血小板存活的重要調(diào)節(jié)劑的促存活Bcl-xl進(jìn)行鑒定。當(dāng)Bc1-Xl在基因或者化學(xué)上功能不足時，循環(huán)中的血小板的水平就會下降，這是由于它們的壽命減短所導(dǎo)致。具有Sc7-i的突變等位基因的小鼠品系是血小板減少的，并且與假說(即，Bcl-x^為控制血小板存活的主要存活因子)一致，具有特異靶向的"c7-z基因的小鼠也受到類似的影響。因此，控制血小板存活在控制循環(huán)中的血小板的數(shù)量方面(其與調(diào)節(jié)巨核細(xì)胞分化和血小板產(chǎn)生不同)具有重要的作用。如本文所公開的那樣，Bel-xj呆持了血小板的存活，并且如果Bel-x^的活性不足，血小板的壽命期以及由此導(dǎo)致的循環(huán)中的血小板的總數(shù)量都會減少。由Bel-^控制的下游促細(xì)胞凋亡細(xì)胞死亡介質(zhì)的缺失會逆轉(zhuǎn)由于Bc卜&的損失所誘導(dǎo)的血小板減少。具體而言，除去Bak會逆轉(zhuǎn)由于損失Bel-xt而導(dǎo)致的血小板數(shù)量的損失，由此表明，促存活Bcl-xt和促細(xì)胞凋亡Bak之間的平衡是體內(nèi)血小板存活的主要決定因素。Bak+血小板在體內(nèi)具有增快的半衰期，即，它們會更快地從循環(huán)系統(tǒng)中清除。具體而言，Bak的損失將血小板的t增大約40%,即由47小時達(dá)到67小時(參見圖6C)。除去與Bak相關(guān)的分子后，Bax還具有增長血小板壽命期的作用，但是只能達(dá)到較小的程度。因此，本發(fā)明提供了調(diào)控血小板數(shù)量和/或存活的方法，該方法包括施用有效量的調(diào)控細(xì)胞凋亡的制劑。在一些實(shí)施方案中，所述的方法為體外方法。在其他實(shí)施方案中，所述的方法為體內(nèi)方法或離體方法。包括細(xì)胞因子和藥理學(xué)制劑在內(nèi)的大量制劑(例如反義分子、小肽、非肽類抑制劑或結(jié)合分子)是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的，在除了血小板以外的多種細(xì)胞類型中，這些制劑激動或拮抗了影響細(xì)胞凋亡途徑中的所述的分子。在另一種形式中，本發(fā)明提供了細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)劑在治療或預(yù)防與血小板低于正常水平或高于正常水平相關(guān)的狀況中的用途。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了所述的治療劑在制備用于治療或預(yù)防血小板減少或血小板增多的藥劑中的用途。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在用于治療可表征為血小板非正常水平或高于正常水平的狀況中的制劑。在一些實(shí)施方案中，所述的制劑(分子、化合物等)調(diào)控了血小板的功能或活性，例如血小板的凝集能力、分泌致密顆粒儲存物的能力、表達(dá)表面標(biāo)記物的能力以及粘附血漿分子(例如纖維蛋白原或vonWillebrand因子)的能力。因此，例如，本發(fā)明提供了在治療高凝狀態(tài)中使用的促進(jìn)細(xì)胞凋亡的制劑。在另一實(shí)例中，本發(fā)明提供了在治療血小板減少中使用的對細(xì)胞凋亡進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)的制劑。因此，例如，施用半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的抑制劑。在另一實(shí)例中，考慮了促進(jìn)血小板或其前體(巨核細(xì)胞)中Bcl-i的水平或活性的制劑。根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施方案，細(xì)胞凋亡調(diào)控劑有效地靶向或調(diào)控了Bcl-2多肽家族中促存活和/或促細(xì)胞凋亡成員的活性。在一些實(shí)施方案中，所述的制劑調(diào)控了Bel-2細(xì)胞凋亡途徑，特別是Be1-xjBak和/或Bcl-xjBax介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑。在示例性的實(shí)施方案中，所述的制劑有效地調(diào)控了Bel-Xt和/或Bak和/或Bax的活性。具體而言，通過增加相對于促細(xì)胞凋亡分子的促存活分子活性來增強(qiáng)血小板的數(shù)量或存活。例如，如實(shí)施例5所示，在哺乳動物受試對象中，促細(xì)胞凋亡Bak的損失改善了血小板減少的情況。類似地，BH3域模擬型ABT-737會產(chǎn)生Bak介導(dǎo)的和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶依賴的殺死血小板的情況，而這種情況可以在Bak不存在或半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制劑存在的條件下來預(yù)防(參見實(shí)施例7)。Bax的拮抗劑還可以延長生存能力。這在(例如)實(shí)施例7中示出，其中對促細(xì)胞調(diào)亡制劑在缺乏Bak和/或Bax的小鼠中的作用進(jìn)行測試。在Bak不存在的條件下，一個^s;r等位基因的損失使得血小板難以完全受到ABT-737的控制?；蚝推渌虿牧?例如inRNA、構(gòu)建體等)由斜體字表示，而它們的蛋白質(zhì)產(chǎn)物由非斜體字形式表示。因此，Bak多肽為Aair基因的產(chǎn)物。在任何動物中，優(yōu)選在哺乳動物種類中，斜體字或非斜體字形式用于涵蓋同源物和功能變體。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及Bcl-2家族成員的人同源物。在一些實(shí)施方案中，題述方法可用于(例如)治療與血小板減少有關(guān)的狀況、以及用于增強(qiáng)血小板在血液衍生產(chǎn)物中的生存能力。關(guān)于血小板減少，在一些實(shí)施方案中，其為遺傳性血小板減少。在其他實(shí)施方案中，血小板減少為獲得性的。因此，考慮了多種方法來用于增強(qiáng)或保持血小板的生存能力或壽命期這些方法包括施用有效量的對細(xì)胞凋亡進(jìn)行負(fù)調(diào)控的制劑。在示意性的實(shí)施方案中，所述的抗細(xì)胞凋亡制劑為在本文所公開的細(xì)胞篩選物中鑒定得到的制劑。在示意性的實(shí)施方案中，所述的制劑選自在圖10中列出的皮質(zhì)甾類分子中的一種，或者包括圖io列出的大體結(jié)構(gòu)。如本文所述，所述的制劑強(qiáng)烈地抑制了殺哺乳動物細(xì)胞(其暴露于細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)量的Bc1-Xl拮抗刑)的情況。在一些其他實(shí)施方案中，所述的制劑增大了Bel-x"Bak在細(xì)胞中的比例。在其他實(shí)施方案中，所述的制劑為Bc卜&介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑的激動劑或Bcl-xt的激動劑。在特殊的實(shí)施方案中，所述的制劑為Bak和/或Bax的拮抗劑，或者為Bak和/或Bax活性的下游效應(yīng)器的拮抗劑。在其他實(shí)施方案中，所述的制劑抑制了細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)制劑的吸收或細(xì)胞活性。在一些實(shí)施方案中，所述的制劑(激動劑或拮抗劑)為小分子、抑制性RM、抗體、適體、肽、折疊體、擬肽物質(zhì)(包括環(huán)狀擬肽物質(zhì))、或者限制性肽。根據(jù)本發(fā)明，被鑒定為抗細(xì)胞凋亡的分子(即，在本文所述的細(xì)胞篩選物中，增強(qiáng)哺乳動物細(xì)胞的存活、生存能力、半衰期或壽命期的那些制劑)可用于增強(qiáng)哺乳動物細(xì)胞(包括但不限于血小板)的存活、生存能力、半衰期或壽命期。上述方法包括離體施用，例如將所述的制劑給予包含血小板的血液產(chǎn)物，例如全血或血小板制備物。上述方法還包括體內(nèi)施用。就施用而言，在一些實(shí)施方案中，將所述的制劑施用給遭受正在發(fā)展中的血小板減少或處于正在發(fā)展中的血小板減少的危險(xiǎn)中的受試對象。在示意性的實(shí)例中，所述的受試對象為接受任何形式的化療(例如細(xì)胞毒性藥物，包括抗體或抗原結(jié)合分子)的對象。血小板生存能力或存活的一個量度為循環(huán)系統(tǒng)中血小板的數(shù)量或半衰期，另一個量度為受試對象的年齡概況，即，平均年齡。血小板在體外或體內(nèi)的生存能力的其他指標(biāo)在實(shí)施例12中有所描述。在所述方法的一些實(shí)施方案中，血小板的半衰期增長。在其他實(shí)施方案中，血小板經(jīng)離體儲存。在示意性的實(shí)施方案中，所述的半衰期增長約40%。由此，本說明書描述了治療或預(yù)防受試對象中血小板減少的方法，該方法包括鑒定出遭受血小板減少或處于血小板減少危險(xiǎn)中的受試對象；以及向經(jīng)鑒定的受試對象施用對血小板的細(xì)胞凋亡進(jìn)行負(fù)調(diào)控的制劑。如上文所述，在一些實(shí)施方案中所述的制劑增大了Bcl-xL:Bak在血小板中的比例。在一些實(shí)施方案中，所述的制劑為Bcl-xt介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑的激動劑或者為Bcl-XL的激動劑。由于Bak和Bax在血小板中要比Bel-x更穩(wěn)定，所以特定的實(shí)施方案中考慮了施用Bak和/或Bax的拮抗劑。在一些實(shí)施方案中，所述的制劑為Bcl-xt的結(jié)合Bak的部分或其變體或其模擬物，或者為Bc卜Xl的結(jié)合Bax的部分或其變體或其模擬物，或者為Bcl-^的結(jié)合Bak和Bax的部分或其變體或其模擬物。在其他實(shí)施方案中，所述的制劑為基因沉默制劑。備選地，所述的制劑為Bak和/或Bax活性的下游效應(yīng)器的拮抗劑，或者為抑制血小板中細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)制劑的吸收或細(xì)胞內(nèi)活性的制劑。在一些實(shí)施方案中，所述的制劑為細(xì)胞凋亡形成因子的抑制劑。就一些實(shí)施方案而言，所述的制劑(激動劑或拮抗劑)為小分子、抑制性RNA、抗體、適體、肽、擬肽物質(zhì)、或者限制性肽。在另一方面中，通過降低促存活分子(較好地為促細(xì)胞凋亡分子)的活性，血小板的數(shù)量和/或存活降低。在示例性的實(shí)施方案中，Bc1-Xl被Bc1-2同源結(jié)構(gòu)域模擬制劑(例如BH3同源結(jié)構(gòu)域模擬制劑)抑制或者拮抗，并且血小板的數(shù)量和/或存活下降。在另一實(shí)施方案中，增強(qiáng)或激動Bak活性，會直接或間接地導(dǎo)致血小板細(xì)胞凋亡增多。對血小板數(shù)量進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)可用于(例如)治療或預(yù)防與血栓癥有關(guān)的狀況。因此，在所述方面的寬泛的實(shí)施方案中，考慮了減少血小板的存活、壽命期、半衰期或生存能力的方法，所述方法包括施用有效量的增強(qiáng)細(xì)胞凋亡的制劑。在一些實(shí)施方案中，所述的制劑為Bcl-x^介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑的拮抗劑，包括Bcl-XL多肽活性的拮抗劑。在其他實(shí)施方案中，所述的制劑為Bak多肽活性的激動劑，或者為Bax多肽活性的激動劑，或者為Bak和Bax多肽活性的激動劑。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的制劑在Bak和/或Bax與半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活性之間的Bcl-XL途徑中發(fā)揮作用，在這種情況下，所述的制劑為Bak和/或Bax活性的下游效應(yīng)器的激動劑。在其他實(shí)施方案中，所述的制劑為IAP(細(xì)胞凋亡抑制劑)拮抗劑。在其他實(shí)施方案中，所述的拮抗劑為BH3結(jié)構(gòu)域模擬制劑或基因沉默制劑，或者小分子。在其他實(shí)施方案中，所述的制劑(激動劑或拮抗劑)為小分子、抑制性RNA、抗體、適體、肽、擬肽物質(zhì)、或者限制性肽。用于減少血小板存活、壽命期、半衰期或生存能力的方法包括體內(nèi)或離體施用所述的制劑。在一些實(shí)施方案中，就體內(nèi)或離體施用而言，將所述的制劑施用給在施用前經(jīng)血小板增多的受試對象。在另一方面中，由于較成熟的血小板比較幼嫩的血小板更易受到Bcl-x^拮抗劑的攻擊，所以在供給血液或血小板之前，將Bcl-Xl拮抗劑施用給血液或血小板供者，以便減小被供給血液或血小板中血小板的平均年齡。對于體內(nèi)應(yīng)用而言，將上述制劑施用有需要的受試對象以治療或預(yù)防血小板增多。因此，考慮了一種治療或預(yù)防受試對象中血小板增多的方法，該方法包括鑒定出遭受血小板增多或處于血小板增多的危險(xiǎn)中的受試對象；以及向經(jīng)鑒定的受試對象施用促進(jìn)血小板細(xì)胞凋亡的制劑。在一些實(shí)施方案中，所述的制劑為Bcl-xt介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑的拮抗劑，例如Bc卜xt的拮抗劑。在另一實(shí)施方案中，所述的制劑為Bak和/或Bax的激動劑，或者為Bak和/或Bax活性的下游效應(yīng)器的激動劑。在一些實(shí)施方案中，所述的Bcl-x^介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑的拮抗劑為BH3結(jié)構(gòu)域模擬物。在另一實(shí)施方案中，所述的制劑為小分子、抑制性RNA、抗體、適體、肽、擬肽物質(zhì)、折疊體、或者限制性肽。根據(jù)血小板受到細(xì)胞凋亡調(diào)控劑的攻擊性被增強(qiáng)的情況，可以以這樣的量或者在這樣的時間內(nèi)施用題述的制劑，其中所述的量或時間會影響血小板但不會影響其他哺乳動物的細(xì)胞，因此有效地區(qū)分開靶細(xì)胞。因此，在一個實(shí)施方案中，以可以有效地謙導(dǎo)無核血小板發(fā)生細(xì)胞凋亡、但基本上不會資導(dǎo)有核細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡的量和/或時間施用所述的制劑。在另一實(shí)施方案中，所述的制劑調(diào)控以細(xì)胞程序性死亡終結(jié)的所述途徑中的其他成分的活性。例如，對半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活性進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)或者增強(qiáng)IAP活性的制劑可用于促進(jìn)血小板的生存能力。合適的制劑是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的，或者可以通過現(xiàn)有的篩選方法或其經(jīng)修飾方法來鑒定。在另一實(shí)施方案中，下游效應(yīng)器包括細(xì)胞色素C、Apaf-1和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶。雖然使用Bel-x^、Bak或Bax對本發(fā)明進(jìn)行了舉例說明，但是本發(fā)明沒有被如此限定，并且可以擴(kuò)展到所有的功能性同源物、功能性同功型或功能性變體，包括Bc卜Xl、Bak或Bax的片段。在一些實(shí)施方案中，Bcl-2多肽家族中的促存活和/或促細(xì)胞凋亡成員受到調(diào)節(jié)。促細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)劑包括Bak，Bok(Mtd)，Bax，Bad,Bid,Bik(Blk)，Hrk(DP5)，BNIP3，Bim，Puma，Noxa，Mule(Lasu/ARF-BPI)和Bmf。促存活成員包括Bcl-2，Mcl-l，Bc卜w，Bc卜Xl，Bcl-B和Al(人類中為Bfl-1)。在其他實(shí)施方案中，靶向一種或多種Bel-2的家族成員。在一些實(shí)施方案中，多種制劑調(diào)控了兩種或多種Bcl-2的家族成員。在其他實(shí)施方案中，共施用一種或多種不同的制劑以增強(qiáng)效力。優(yōu)選的制劑降低了細(xì)胞凋亡并拮抗了Bax和/或Bak或者細(xì)胞凋亡途徑中Bax和/或Bak下游的分子。所提及的共施用包括兩種或多種制劑的同時、依次和/或間隔施用。在相關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明考慮了多種組合物的用途，其中所述的組合物包括Bc1-Xl或Bak和/或Bax多肽、或者其類似物、或者Bc卜x^或Bak和/或Bax多肽的變體或調(diào)控Bc卜Xl和/或Bak和/或Bax的水平或活性來在受試對象中或在體外對血小板的水平進(jìn)行正調(diào)節(jié)或負(fù)調(diào)節(jié)的制劑。在一個具體的實(shí)施方案中，調(diào)控Bcl-Xl或Bak和/或Bax的水平或活性的制劑包括核酸分子，通過該核酸分子可產(chǎn)生Bc卜Xl或Bak或Bax多肽或肽。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在治療和/或預(yù)防與血小板減少或血小板增多有關(guān)的狀況中使用的調(diào)控細(xì)胞凋亡的制劑。傳統(tǒng)上，所述的制劑為組合物，其包含所述的制劑、以及一種或多種可藥用的載體、稀釋劑和/或賦形劑。所述的制劑還可以與另外的細(xì)胞凋亡調(diào)控劑(例如半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制劑、或血小板水平或活性的調(diào)控劑，例如阿司匹林)聯(lián)合使用。因此，本發(fā)明提供了組合物、或者雙組分或多組分藥物組合物，其中在一種實(shí)施方案中，所述的雙組分藥物或多組分藥物包含至少一種血小板細(xì)胞凋亡調(diào)控劑和一種血小板功能抑制劑。在另一實(shí)施方案中，施用血小板保護(hù)性抗細(xì)胞凋亡制劑作為在(例如)癌癥治療方案中使用的細(xì)胞凋亡刺激劑的助劑。在另一方面中，本發(fā)明提供了對用于在體外或體內(nèi)調(diào)控血小板水平或壽命期的制劑進(jìn)行篩選或測試的方法。在一些實(shí)施方案中，對多種制劑增長或降低血小板存活、壽命期、生存能力或半衰期的能力進(jìn)行測試。在一些實(shí)施方案中，對多種制劑調(diào)控本文所鑒定的Bcl-2家族靶標(biāo)、或者在導(dǎo)致細(xì)胞凋亡途徑中的Bcl-2家族成員下游的分子的活性的能力進(jìn)行測試。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，選擇這樣的制劑，該制劑通過降低Bak和/或Bax的水平或活性、或者在Bax或Bak介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑下游的分子的水平或活性來對細(xì)胞凋亡進(jìn)行負(fù)調(diào)控。本發(fā)明還提供了經(jīng)修飾的非人類的動物和經(jīng)分離的細(xì)胞，這些動物或細(xì)胞在一種或多種Bcl-2家族基因中包含造成部分損失的功能突變。本發(fā)明提供了進(jìn)一步產(chǎn)生小鼠品系的方法，該方法包括將本文所述的Bc卜XL突變體小鼠與不同品系的小鼠雜交，從而產(chǎn)生進(jìn)一步突變體以用于測試。本發(fā)明還提供了篩選或測試受試對象中Bcl-2家族基因(例如^A和^7基因)或它們的基因或蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)分子(其為受試對象中血小板減少或血小板增多的特定的基因基礎(chǔ)的指示)的突變情況的方法。其他方法涉及測定受試對象中促存活分子與促細(xì)胞凋亡分子的比例?？梢允褂媚苡绊懕景l(fā)明所鑒定的靼標(biāo)的任何制劑來調(diào)控血小板的存活、生存能力或半衰期。本發(fā)明的方法包括篩選調(diào)控了血小板存活、壽命期或生存能力的制劑的方法，該方法包括(u使所述的制劑與包含靶標(biāo)的系統(tǒng)接觸，其中所述的耙標(biāo)選自Bc卜Xl和/或Bak或Bax多肽，以及5c/-;r，"ai:或5n基因序列；以及(U)測定所述制劑與所述靶標(biāo)之間的復(fù)合體的存在情況，所述靶標(biāo)的活性的變化情況，或者所述靶標(biāo)的活性的指示劑活性水平的變化情況。在一些實(shí)施方案中，所述的方法包括篩選能夠增強(qiáng)血小板和/或其他哺乳動物細(xì)胞的存活、壽命期或生成能力的分子。在示意性的實(shí)施方案中，所述的方法包括(i)使所述的分子與細(xì)胞結(jié)合；(ii)將所述的細(xì)胞與能夠拮抗所述細(xì)胞中的促存活Bcl-2家族分子、并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的一種或多種制劑接觸；(iii)相對于對照品，測定在所述分子存在下細(xì)胞存活(生存能力、壽命期、半衰期)的變化情況；以及(iv)選擇能夠增強(qiáng)細(xì)胞存活(生存能力、半衰期)的分子。在一些實(shí)施方案中，所述的方法進(jìn)一步包括將得自(iv)中的所選的分子與血小板結(jié)合，從而相對于對照品，測定在所述分子存在下血小板細(xì)胞存活(生存能力、半衰期)的變化情況。為了有利于篩選，在一些實(shí)施方案中，例如通過降低一種或多種促存活Bel-2家族成員的水平或活性來對所述的細(xì)胞進(jìn)行修飾，從而增強(qiáng)其對細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑的敏感性。在其他實(shí)施方案中，通過基因打斷來對所述的細(xì)胞進(jìn)行修飾，從而使其缺少一種或多種促存活Bcl-2的家族成員。在示意性的實(shí)施方案中，所述的細(xì)胞為得自多細(xì)胞有機(jī)體的Mcl-l缺陷型細(xì)胞，而所述的制劑為Bc卜xt拮抗劑。在其他實(shí)施方案中，所述的方法包括鑒定出在所述細(xì)胞中Bel-2的家族蛋白的調(diào)控情況。本發(fā)明的制劑和組合物包括(例如)小的或大的、有機(jī)或無機(jī)化學(xué)分子，肽，多肽，經(jīng)修飾的肽(例如限制性肽)，折疊體，擬肽物質(zhì)，環(huán)狀擬肽物質(zhì)，蛋白質(zhì)，脂質(zhì)，碳水化合物或核酸分子(包括反義分子或其他基因沉默分子)。小分子通常具有小于500道爾頓的分子量。大分子通常包括分子量大于500道爾頓的整個多肽或其他化合物。制劑可以包括本文所定義的天然形成的分子或其變體(包括類似物)，或者非天然形成的分子。其他組合物包括細(xì)胞、組織或器官組合物。具體而言，本說明書思考了經(jīng)修飾的血小板群體，以用于向有需要的受試對象進(jìn)行施用，其中所述的血小板包括離體儲存的、以及與細(xì)胞凋亡拮抗劑接觸以增大血小板半衰期的血小板群體。在一些實(shí)施方案中，所述的制劑包括Bcl-xt激動劑或Bak拮抗劑。本說明書進(jìn)一步思考了在治療或預(yù)防血小板減少中使用的細(xì)胞凋亡抑制劑。所述的制劑被考慮單獨(dú)使用或者與其他治療方法聯(lián)合使用。一種其他的治療方法為癌癥的治療方法。在具體的實(shí)施方案中，在治療或預(yù)防血小板減少中，細(xì)胞凋亡抑制劑增大了血小板中Bel-xL:Bak的比例。在其他實(shí)施方案中，所述的細(xì)胞凋亡抑制劑用于增長儲存的血小板的半衰期。備選地，細(xì)胞凋亡促進(jìn)劑被用于減小被儲存血小板的平均年齡，其中在供給血液前，使用細(xì)胞凋亡促進(jìn)劑處理血液或血小板供者，或者被用于治療或預(yù)防血小板增多。本發(fā)明進(jìn)一步思考了制劑盒，該制劑盒包含用于治療或預(yù)防血小板減少或者用于增長被儲存血小板的生存能力或半衰期的細(xì)胞凋亡抑制劑。本說明書進(jìn)一步考慮了用于治療或預(yù)防血小板減少的組合物，該組合物包含能夠抑制或延遲或負(fù)調(diào)控血小板細(xì)胞凋亡的有效量的制劑。在一些實(shí)施方案中，所述的制劑增大了血小板中Bel-x^:Bak的比例。在其他實(shí)施方案中，考慮了用于增長被儲存血小板的半衰期的組合物，該組合物包含能夠抑制被儲存血小板的細(xì)胞凋亡的、有效量的制劑。在其他實(shí)施方案中，考慮了用于治療或抑制血小板增多的組合物，該組合物包含能夠促進(jìn)血小板的細(xì)胞凋亡的有效量的制劑。上述概述不是并且也不應(yīng)該以任何方式視為是對本發(fā)明所有實(shí)施方案的窮舉性的敘述。有些附圖包含彩色的代表物或?qū)嶓w。彩色版的附圖可以通過請求得自專利權(quán)人或者得自合適的專利局。如果得自專利局可以征收一定的費(fèi)用。圖l提供了示出&/-^中經(jīng)分離和分子鑒定的突變情況的數(shù)據(jù)圖。(A)為得自ENU-誘變的BALB/c雄鼠的810G:后代在7周齡時外周血中的血小板計(jì)數(shù)。每個圓圏代表一只單獨(dú)的小鼠。圖中示出了尸/"0和？/"f譜系的首建鼠。證實(shí)了三種其他血小板減少0°/〃7，戶"/《和戶"i7)的遺傳性；這些譜系均處于基因圖譜序列中的不同階段。尸/〃7被定位在染色體11中，并鑒定出在編碼Gplba的基因中發(fā)生了突變。戶/"《繪制于染色體16上的間隔中，而尸"i7則被指定在圖譜區(qū)域中。沒有鑒定出引起血小板增多的遺傳性突變。(B,C)為分別繪制的^c/-/，(B)和Ac/-(C)的單倍型。示出了所用的標(biāo)記物以及它們在2006年4月UCSC小鼠基因組中的位置。所定義的重組事件以灰色陰影顯示；通過遺傳性測試證實(shí)的那些以粗體顯示。在JCCA19和D2Mit500之間的16.3Mb的間隔被定義為^c/-/":在JCCA9和D2MU139之間5c/-/""的候選間隔被優(yōu)化為1.9Mb。(D，E)為示出在萬c/-/〃"(D)或(E)突變雜合的動物中核苷酸變化的DNA序列電泳圖語。進(jìn)一步測序確定，在親代BALB/c品系或C57BL/6定位品系中均不存在/VHf和/VW。中的突變。酪氨酸15和異亮氨酸182(在尸/^^和？〃"語系中取代的殘基)分別被保留在小鼠和人Bcl-XL之間。圖2提供了示出類似于5"-/""和^/-/冊突變體小鼠的、缺少一個Bcl-x等位基因的小鼠為血小板減少情況的數(shù)據(jù)的圖形。(A)為在野生型C57BL/6，"c/-;r+/—，&7-2+/—，"c/i—/_或J/c7-r"雄鼠中血小板計(jì)數(shù)的自動分析。缺失一個Sc7-;r等位基因使得血小板的數(shù)量明顯減少。使用雙側(cè)非對稱t-檢驗(yàn)比較測試結(jié)果。*p<0.05。(B)為減少的5c/-/，血小板的壽命期。在使用生物素N-羥基琥珀酰亞胺注射后的0，4，8，12，24，28，48，72和96h，由5c/-/'"。小鼠取得外周血液樣品。野生型(&/-//+)血小板表現(xiàn)出t^為57h，這與已經(jīng)公開的觀察結(jié)果一致(BergerefW.,Blood4446-4452，1998),而在雜合子中，^/-/諸突變使得tw呈劑量依賴的方式降低至24h，在&/-/"純合子小鼠中，tw2以劑量依賴的方式降低至10h。(C)Sc7-;r突變縮短了血小板的壽命期。在所顯示的基因型小鼠中，血小板的半衰期如(B)中測定。與野生型(*/-//+)同窩出生對照小鼠血小板的半衰期相比，與&/-/""突變類似，或^/-1缺失(化/-^勺還會降低也會降低血小板的半衰期。卞關(guān)于小鼠遺傳背景的詳細(xì)信息將在試驗(yàn)過程中提供。(D)在^r/-,中具有突變的小鼠中血小板半衰期縮短為固有缺陷。將得自所示基因型小鼠的生物素化血小板采用一定方式轉(zhuǎn)移到指定基因型的未經(jīng)處理的受者中，并且它們由循環(huán)系統(tǒng)中的清除率可如(B)中測定。(E)Bcl-xt的損失增大了血小板的更新率，從而成比例地形成幼嫩的血小板群體。網(wǎng)狀血小板的百分率可通過^f吏用噢唑橙染色來測定(KienastWa/.，Blood，":116-121，1990);每個符號都代表單個的小鼠。(F)血小板的產(chǎn)生不會由于"c/-;r的突變而削弱。網(wǎng)狀血小板的絕對數(shù)量可通過使用噻唑橙染色并在穩(wěn)定狀態(tài)下測量血小板數(shù)量來測定。(B)、(C)和(D)中的數(shù)據(jù)表示在各時間點(diǎn)下5-8只小鼠的平均值土SD。圖3提供了示出&/-/脂和^/-//"《的突變使得8(;1-&蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的數(shù)據(jù)圖。(A)為在Bc1-Xl上/，和突變的位置。兩種突變(藍(lán)色所示)被定位在小鼠Bcl-xJ淺灰色)與BimBH3肽(紅色)(1PQ1)形成的復(fù)合體中的3維結(jié)構(gòu)上(Liuefa/.，I讓unity,M341-352，2003.)。Y15(尸"2訪部分暴露于溶劑中，而I182(戶7"。被完全隱藏，它們都不會參與形成Bc1-Xl的BH3結(jié)合槽。使用PyM0L制作所述的結(jié)構(gòu)圖(DeLano,W.L.2002ThePyM0LMolecularGraphicsSystem;http:〃雨.pymol.org)。(B)由z的尸/"〃和等位基因編碼的突變體蛋白質(zhì)還能結(jié)合Bax和Bak。FLAG標(biāo)記的野生型Bcl-xL、或者/V"0(Y15C)和/V〃f(1182N)突變體在293T細(xì)胞中與HA標(biāo)記的Bax(上方)或Bak(下方)共表達(dá)，并且使用小鼠單克隆抗FLAG(FL;M2克隆)、-HA(HA.11克隆)、或者不相關(guān)的對照抗體(-GluGlu)來對包含TritonX-100的裂解物進(jìn)行免疫沉淀。使用針對FLAG(9H1)或HA(3F10)的大鼠單克隆抗體探測斑點(diǎn)。(C)尸/"0和尸/H6突變使Bc1-Xl不穗定。圖3C上Bcl-xt戶/〃f蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)表達(dá)減少。使用由所示基因型的原代MEF制備的等價(jià)裂解物對Bc1-XlMcl-l,Bak或Actin(裝載對照)進(jìn)行免疫印跡處理。圖3C下針對所示的蛋白質(zhì)，探測由野生型或5c/-/'","。原代MEF制備的等價(jià)裂解物，其中所述的原代MEF在廣譜半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制劑qVD.OPh(50nM)存在下在暴露于50pg/mL環(huán)己酰亞胺(蛋白質(zhì)合成抑制劑)后經(jīng)歷0-24h。所示的數(shù)據(jù)代表了所分析的各種基因型的至少2個細(xì)胞系。(D)5c7-y或"c/-//mMEF易受蛋白質(zhì)合成抑制作用的影響。在50lig/mL的環(huán)己酰亞胺中暴露0-30h后，得自野生型、Z"w或"W〃""小鼠的代表性的原代MEF的生存能力(通過PI排除法來測定)。數(shù)據(jù)代表了代表性細(xì)胞系的平均值士SD。卞-<1%生存能力。圖4提供了示出引發(fā)急性血小板減少的BH3模擬物ABT-737的數(shù)據(jù)圖。(A)以腹膜內(nèi)注射的方式向野生型C57BL/6小鼠注入單劑量的ABT-737(75mg/kg;紅色箭頭所示)。使動物流血2-24h，然后測定血小板數(shù)量。所有經(jīng)過注射的小鼠都表現(xiàn)出血小板數(shù)量明顯減少，并且在注射后的大約4h時達(dá)到最低點(diǎn)(<30%正常值)；每個符號都代表小鼠。(B)在使用單劑量的ABT-737后血小板的恢復(fù)。在使用單劑量的ABT-737(紅色箭頭所示)之后的2-96h測定血小板的數(shù)量(藍(lán)色的符號表示；左側(cè)軸)。注意，到第3天完全恢復(fù)，到第4天回彈至血小板增多。橙色符號代表了血清TPO的水平(右側(cè)軸)。(C)為由ABT-737引發(fā)的周期性急性血小板減少。在每隔一周施用單劑量的ABT-737(紅色箭頭所示)之前以及之后的8h測定血小板的數(shù)量。每次，所述藥物都使血小板數(shù)量可比較地減少。在恢復(fù)過程中，基線數(shù)量向上浮動。(D)ABT-737選擇性地對老化的血小板產(chǎn)生作用。在使用單劑量的ABT-737之后，經(jīng)噻唑橙染色的血小板的代表性流式細(xì)胞概況(紅色箭頭所示)表明經(jīng)ABT-737處理后幼嫩(網(wǎng)狀)血小板的比率(藍(lán)色表示的％)增大。(E)同步血小板。單劑量抗血小板血清(APS;藍(lán)色箭頭所示)的處理激起了急性重度血小板減少(血小板數(shù)量紅色符號；左側(cè)軸)。在恢復(fù)過程中，新合成的幼嫩血小板是較大的，這可由增大的平均血小板體積(藍(lán)色符號；右側(cè)軸)表明。(F)幼嫩的血小板對ABT-737具有抗性。使用APS對野生型C57BL/6小鼠進(jìn)行處理，然后在第2天或第7天向這些小鼠注射ABT-737(紅色箭頭所示)。測定血小板的絕對數(shù)量以及網(wǎng)狀血小板的°/。。圖4F上示出了在注射ABT-737之前或之后在經(jīng)過噻唑橙染色后的代表性流式細(xì)胞概況。圖4F下示出了在注射ABT-737前或注射ABT-737后的2h時血小板的數(shù)量。(B)、(C)、(E)和(F)中的數(shù)據(jù)表示了在各時間點(diǎn)時3-6只小鼠的平均值土SD。圖5提供了示出引發(fā)急性血小板細(xì)胞凋亡的BH3模擬物ABT-737的數(shù)據(jù)圖。(A)為血小板中Bel-2家族蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。針對Bcl-XL，Mcl-l，Bc卜2，Bak，Bax或Actin(負(fù)載對照)，探測由50網(wǎng)或5pg血漿制備的裂解物，其中所述的血漿富集有小鼠血小板或MEF。(B)Bc1-Xl的基因消除使ABT-737誘導(dǎo)的血小板減少惡化。使用單劑量的ABT-737處理野生型C57BL/6,Sc7-Z或^;/-//-小鼠(75mg/kg;紅色箭頭所示)，此后在2-24h時測定血小板的數(shù)量。(C)ABT-737激發(fā)了血小板中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的活性。對細(xì)胞裂解物中的全長且完整的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(p32;圖5C上)、裂解法的p17片段(圖5C中)或凝溶膠蛋白(圖5C下)進(jìn)行免疫印跡處理，其中所述的細(xì)胞裂解物由新分離的或新培養(yǎng)的血小板制備而來，這些血小板未經(jīng)過處理，或者是在廣譜半胱氨酸天冬氨酸抑制劑qVD.OPh(50一(單獨(dú)的qVD.OPh)或依托泊苷(IO^M)存在或不存在下在ABT-737中暴露過。ABT-737會誘導(dǎo)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3完全活化以及凝溶膠蛋白裂解(其可部分地被qVD.OPh阻斷)。(D)ABT-737激發(fā)了Bak介導(dǎo)的、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶依賴的培養(yǎng)物中血小板損失。在未進(jìn)行處理，或者是在qVD.OPh(50^M)(單獨(dú)的qVD.OPh)或依托泊苷(IOpM)存在或不存在下暴露于ABT-737(1juM)之后，對野生型C57BL/6或A3irv—血小板進(jìn)行計(jì)數(shù)。數(shù)據(jù)代表了使用由各種基因型的6只小鼠匯集得到的血小板在4個獨(dú)立的試驗(yàn)中歸一化的血小板數(shù)量(未經(jīng)處理的-100%)的平均值±SD。(E)人類血小板表現(xiàn)出容易以半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶依賴的方式受到ABT-737(1nM，作用1或2h)的影響。(F)Bak的缺乏保護(hù)血小板免受ABT-737的影響。使用單劑量的ABT-737(75mg/kg;紅色箭頭所示)對野生型C57BL/6,^2i「—z-勘yz—小鼠進(jìn)行處理，此后在0-24h時測定血小板的數(shù)量。在早期時間點(diǎn)(至多4h)時，5si:—z小鼠未受ABT-737的影響，而iai^a/〃小鼠則完全受到保護(hù)。在(B)和(F)中的數(shù)據(jù)代表了在各時間點(diǎn)時至少6只小鼠的平均±SD。圖6提供了示出血小板中Bak為促存活Bcl-XL的主要靶標(biāo)的數(shù)據(jù)圖。(A)編碼Bak的基因的缺失導(dǎo)致血小板減少。野生型C57BL/6，勘Z—，5"—/_或iai—^a^-小鼠中血小板數(shù)量的自動分析表明萬ai:的損失使血小板的數(shù)量明顯增多；^z的作用不大。(B)為/_血小板中正常血小板的亞顯微結(jié)構(gòu)。得自野生型(圖6B上)或^3擴(kuò)—(圖6B下)小鼠的代表性血小板的透射電子顯微圖像。(C)&irv—血小板具有增長的壽命期。所示基因型小鼠中的血小板的半衰期如上文所述的方法測定(數(shù)據(jù)未示出)。數(shù)據(jù)代表了得自8只小鼠的平均值±SD。(D)^i:的基因消除阻止了由Bcl-x^的功能損失性突變而引起的血小板減少。對具有所示基因型的小鼠的血小板數(shù)量進(jìn)行比較。一個^i:等位基因的缺失阻止了^/-;r+小鼠的血小板減少，而兩個等位基因的損失產(chǎn)生了無法與由單獨(dú)的^i缺失而產(chǎn)生的血小板減少區(qū)別的血小板減少。因此，5ai:在遺傳上位于"c7-t的下游。(E)在混合的遺傳背景下，雜合的5c7V或^/-/〃"突變體小鼠中的血小板減少可通過^ai:的損失來阻止，并通過Ac7-義的組成性缺乏而惡化。*p<0.05;采用雙側(cè)非對t-檢驗(yàn)來進(jìn)行(A，D，E)中的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。圖7提供了在Bcl-XL戶"i^和Bc卜XL戶7〃f中Bcl-xt失去穩(wěn)定性的數(shù)據(jù)圖。(A)使用抗FLAG抗體(M2)對穩(wěn)定表達(dá)經(jīng)FLAG標(biāo)記的野生型Bcl-x^(藍(lán)色柱狀圖)、尸"W(綠色柱狀圖)或尸/H6(紅色柱狀圖)突變體的5c/-MEF多克隆庫進(jìn)行染色，并使用FITC綴合的抗小鼠二級抗體檢測免疫熒光。通過黑色柱狀圖顯示(用載體感染的MEF的)對照著色情況。(B)使用50jng/mL的環(huán)己酰亞胺將(A)中所述的細(xì)胞庫處理0-24h，并通過PI排除法測定它們的生存能力。數(shù)據(jù)示出了由代表性試驗(yàn)得到的平均值。(C)為在使用0-100^iM的依托泊苷處理后的24h時(A)中所述的細(xì)胞庫的生存能力。注意由野生型Bcl-XL提供的保護(hù)比由Bcl-x,"?；駼c卜x，"所提供的保護(hù)更強(qiáng)。數(shù)據(jù)示出了得自代表性試驗(yàn)的平均值土SD。(D)為通過Mcl-l和Bcl-Xt調(diào)節(jié)Bak的模型(Willisa/.，2005(wprs))。然而Bim可以與Mcl-1和Bel-Xl結(jié)合并中和Mc卜l和Bc1-Xl，從而引起B(yǎng)ak介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，另一種唯BH3蛋白質(zhì)Noxa只能夠結(jié)合Mcl-l。因此，除非Bc卜xt也是無活性的，否則Noxa不能有效地殺滅。(E)Bcl-x，"具有弱的促存活活性。在使用表達(dá)Bims或Noxa的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染后的24h，通過PI排除法測定穩(wěn)定表達(dá)野生型或突變體Bc1-Xl(如A中所述)的萬c/1—AMEF的生存能力(Chene"/.，Mol.Cell.,77:393-403，2005)。Bims能夠計(jì)數(shù)野生型或突變體Bcl-xL(灰色柱)的過表達(dá)。Noxa通過使Mc卜l(唯一剩下的控制Bak的促存活蛋白)失活來殺滅載體對照AMEF。當(dāng)引入野生型Bcl-xL(或者Bcl-x〃^突變體)時，由于過表達(dá)的Bel-&(其由Noxa所備用(參見圖7D))能夠保持使Bak受控，所以Noxa不再能殺滅。與此截然不同的是，Bcl-x，"在很大程度上是無活性的。數(shù)據(jù)示出了得自代表性試驗(yàn)的平均值±SD。圖8為示出得自Bc卜x突變體小鼠的細(xì)胞系對細(xì)胞凋亡的敏感性的數(shù)據(jù)圖形。(A)得自野生型、/，〃，或/""〃""小鼠的原代MEF對使用廣譜激酶抑制劑星孢菌素(1Q|nM)進(jìn)行的處理同等敏感。通過PI吸收測定生存能力；數(shù)據(jù)表示代表性細(xì)胞系的平均值士SD。卞-<1%生存能力。(B)在環(huán)己酰亞胺(IOOng/mL)存在下將得自所示基因型小鼠的細(xì)胞因子依賴性骨髓(FDM)細(xì)胞(Ekertetal.，J.Cell.Biol.，165:835-842,2Q04)培養(yǎng)l-48h，并通過PI排除法及使用AnnexinV-FITC染色來測定它們的生存能力。數(shù)據(jù)代表了在至少3個獨(dú)立的試驗(yàn)中測試得到的3個獨(dú)立衍生的細(xì)胞系的平均值±SD。圖9為示出ABT-737不影響血小板凝集的數(shù)據(jù)圖形。對使用1]LiMABT-737預(yù)溫育lh(綠色的線)或未經(jīng)溫育(紅色的線)的人血小板富集的血漿(250x107L血小板)進(jìn)行血小板凝集，然后使用(A)膠原(4]ug/ml)或(B)ADP(10^iM)進(jìn)行刺激。注意，ABT-737不誘導(dǎo)血小板凝集，或者影響與激動劑的作用。BH3模擬化合物不會改變對也經(jīng)過測試的其他激動劑(即為腎上腺素、花生四烯酸或利托菌素)的應(yīng)答(數(shù)據(jù)未示出)。圖10為針對能夠增強(qiáng)細(xì)胞生存能力、存活或壽命期的制劑，在目標(biāo)細(xì)胞篩選中所鑒定的制劑的結(jié)構(gòu)圖。表格說明表1提供了對本說明書中所提及的SEQIDNO的說明。表2提供了氨基酸的亞類。表3提供了示例性的氨基酸取代。表4提供了本發(fā)明所考慮的非天然氨基酸的列表。表5示出了ABT-737對體外造血祖細(xì)胞形成的影響。將得自C57BL/6小鼠骨髓的細(xì)胞(25，000)用含有G-CSF、IL-3和EPO的軟瓊脂培養(yǎng)7d，然后進(jìn)行染色和計(jì)數(shù)。在第1、3和5天加入鹽水或ABT-737。在所用的最高濃度下，對巨核細(xì)胞的集落形成影響較小，而其他集落的形成也未受影響。G:粒細(xì)胞集落；GM:粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落；M:巨噬細(xì)胞集落；E。嗜酸性粒細(xì)胞集落；Meg:巨核細(xì)胞集落。總集落數(shù)為兩個培養(yǎng)物的平均值；巨核細(xì)胞集落的數(shù)量代表了4種獨(dú)立培養(yǎng)物的平均值士SD。表6提供了帶有Bc卜x突變體等位基因的小鼠的血液分析結(jié)果。發(fā)明詳述本發(fā)明部分依據(jù)這樣的另人驚奇且意想不到的發(fā)現(xiàn)，即，可以使用能夠調(diào)控內(nèi)在細(xì)胞凋亡程序的生理學(xué)或藥理學(xué)制劑來對血小板的存活進(jìn)行體外和體內(nèi)調(diào)節(jié)。因此，本發(fā)明提供調(diào)控血小板的數(shù)量和/或存活的方法。該方法包括施用有效量的能夠調(diào)控細(xì)胞凋亡的制劑。該制劑直接或通過抑制或增強(qiáng)本身可直接促進(jìn)或減少細(xì)胞凋亡的分子來促進(jìn)或減少細(xì)胞、組織或受試對象中的細(xì)胞凋亡。通過靼向細(xì)胞凋亡的保守性介質(zhì)，可以延長或減短血小板的存活。除非已經(jīng)作出了清楚的陳述，否則本說明書中所述的各種實(shí)施方案有待于經(jīng)過必要的修正之后再應(yīng)用于每一個其他的實(shí)施方案中。如技術(shù)人員所理解的那樣，可以根據(jù)本發(fā)明定靶細(xì)胞凋亡程序中的多種調(diào)節(jié)劑或效應(yīng)器(包括細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑、抑制劑，在一些實(shí)施方案中，效應(yīng)器例如為效應(yīng)器分子的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族)。Bcl-2的分子家族及其在細(xì)胞凋亡中的作用已經(jīng)成為大量研究的主題。大量的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)劑已經(jīng)被鑒定(例如參見Baell的綜述，Biochem.Pharmacol.,"(5-6):85卜863，2002;Fesik，Nat.Rev.Cancer,1):876—885，2005;Schimmer，CellDeathDiffer.,"(2):179-188，2006)。例如，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的制劑包括BH3模擬制劑，例如肽(例:i口參見Cosulicha人，CurrentBiology,7:913—920，1997;Diaz"a/.，J.Biol.Chem.，272:11350—11355，1997;HoiingerWa厶，J.Biol.Chem.,"4:13298-13304，1999;0ttiliee"人，JournalofBiologicalChemistry,272:30866-30872，1997;Schimmera人，CellDeathDiffer.,《725-733，2001;Shangary，Biochemistry,9485-9495，2002;Wanga/.，CancerResearch,6ft1498—1502，2000b);限制性肽(例如參見Walenskya/.,Science,1466-1470,2004&WO2004/058804，在此以引用方式全文并入本文)；折疊體(例如參見Sadowsky，J.Am.Chem.Soc.，"7(34):11966-11968，2005);以及小型有機(jī)化合物，例如抗霉素A(例如Tzunge"/.，Nat.Cell.Biol.,J:183-191，2001)，BH3I(例如Degtereva7.,Nat.Cell.Biol.，J:173—182，2001)，四癌菌素A(例如Nakashimae"厶，CancerResearch,6ft1229—1235，2000)，多酚(包括棉子酚)(例如Kitadaa/.，J.Med.Chem.，4259-4264，2003),阿樸棉子酚(例如Becattini，2004),HA14-1(例如WangWa/.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,夕7:7124-7129，2000a),化合物6(例如Enyedye"/.,J.Med.Chem.，":4313-4324，2001)，ABT-737(例如01tersdorf"a/.,Nature,4^5:677—681，2005),三聯(lián)苯系化合物(例如Yin,LAm.Chem.Soc.,"7(15):5463-5468，2005),如在WO2006/002474中公開的作為a-螺旋狀模擬物的苯酰脲化合物(所述文獻(xiàn)在此以引用方式全文并入本文)，以及如(例如)在2006年4月6日提交的USSN60/789982中公開的苯并噻唑《汙生物(所述文獻(xiàn)在此以引用方式全文并入本文)。在另一方法中，靶向通過抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活性來抑制細(xì)胞凋亡的細(xì)胞凋亡抑制劑(IAP)分子。IAP拮抗劑(也稱為SMAC/Diablo激動劑)在(例如)Oost，J.Med.Chem.，47(18):4417—4426，2004;Wang，J.Biol.Chem"iW46):48168-48176，2004;Vucic，Biochem.J.，，(Pt1):11—20，2005;以及Franklin,Biochemistry,"(27):8223-8231，2003中有所描述。在詳細(xì)描述本發(fā)明之前，應(yīng)該理解，除非另作說明，否則題述發(fā)明不限于成分的具體配方、歸選方法、劑量方案等，因?yàn)檫@些都是可以變化的。還應(yīng)該理解本文所采用的術(shù)語僅是為了達(dá)到描述具體實(shí)施方案的目的，而無意于進(jìn)行限定。如本文說明書中所用，除非文中內(nèi)容清楚地做出了相反的說明，否則單數(shù)形式的"一"、"該"和"所述的"包括復(fù)數(shù)方面。因此，例如，參見"Bcl-2家族成員"，其包括一個Bcl-2家族成員、以及兩個或多個Bcl-2家族成員；等等。術(shù)語"化合物"、"分子"、"活性制劑"、"藥理學(xué)制劑"或"生理學(xué)制劑"、"藥劑"、"制劑"和"藥物"都用于指可誘導(dǎo)期望的藥理學(xué)和/或生理學(xué)效應(yīng)的化學(xué)化合物。所述的術(shù)語還涵蓋了本文明確提及的那些活性制劑的可藥用的及藥理學(xué)活性成分，其包括(但不限于)鹽、酯、酰胺、藥物前體、活性代謝物、類似物等。當(dāng)使用術(shù)語"化合物"、"活性制劑，，、"藥理學(xué)活性制劑，，、"藥劑"、"活性物質(zhì)"和"藥物"時，應(yīng)該理解它們包括所述的活性制劑本身以及可藥用的藥理學(xué)活性的鹽、酯、酰胺、藥物前體、對映體、代謝物、類似物等。術(shù)語"制劑"不應(yīng)該僅被解釋成無機(jī)化學(xué)化合物，而應(yīng)該被擴(kuò)展至肽、多肽和蛋白質(zhì)、以及遺傳分子(例如RNA、DNA和其化學(xué)類似物)。術(shù)語"調(diào)控劑"為可調(diào)控細(xì)胞凋亡的制劑、分子、藥理學(xué)活性制劑、藥劑、活性物質(zhì)和藥物的實(shí)例。"有效量"是指至少部分達(dá)到所需應(yīng)答而需要的量。對于人類受試對象而言，有效量在大約0.lng/kg體重/劑量至lg/kg體重/劑量的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，所述的范圍為大約lja至lg、大約lmg至lg、lmg至500mg、lmg至250mg、lmg至50mg或者1y至lmg/kg體重/劑量。將劑量方案調(diào)整為適于事態(tài)的緊急情況，并且可以將劑量方案調(diào)整為產(chǎn)生最佳的治療劑量。例如，可以每日、每周、每月或其他合適的時間間隔提供多個劑量。參見"調(diào)控"、"經(jīng)調(diào)控的，，或"調(diào)控劑"等，其包括負(fù)調(diào)控、抑制、拮抗、降低或減少，以及正調(diào)控、增大、增強(qiáng)、激動、延長、刺激或提高，以及具有這些作用的制劑。這些術(shù)語在本文中使用具體是指"細(xì)胞凋亡"、存活、壽命期、半衰期、生存能力和細(xì)胞功能、或者活性。可以使用多種細(xì)胞測試方法來對細(xì)胞的這些屬性中的一種或多種屬性進(jìn)行評估或定量。例如，血小板的多種不同功能的測試在諸如實(shí)施例10之類的實(shí)施例中有所描述。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了調(diào)控受試對象中血小板或其前體的教量和/或存活的方法，該方法包括向受試對象施用有效量的制劑，其中所述的制劑能夠調(diào)控Be卜Xl和/或Bak和/或Bax多肽或其功能變體的活性，或者能夠調(diào)控Bcl"^和Bak和/或Bax多肽之間的相互作用。在另一實(shí)施方案中，所述的制劑調(diào)控了Bax和/或Bak多肽的活性。能夠受益于本發(fā)明的方法或組合物的任何受試對象或動物也被包含在內(nèi)。術(shù)語"受試對象"包括(但不限于)人和非人的靈長類動物、動物、牲畜動物、伴侶動物、實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)動物、被捕獲的野生動物、爬行動物和兩棲動物、魚、鳥等。本發(fā)明最優(yōu)選的受試對象為人類受試對象。不管是人還是非人的生物體，受試對象可以指患者、個體、對象、動物、宿主或受者。Bel-XL和Bak和/或Bax多肽及其功能變體之間的"相互作用，，包括(但不限于)Bc卜&和Bak和/或Bax或其功能變體或其同源物之間的結(jié)合、以及通過一種或多種中間物Bcl-2家族成員的相互作用。Bcl-XL和Bak和/或Bax之間的結(jié)合是通過(例如)BH3結(jié)構(gòu)域進(jìn)行的，因此，模擬了Bak和/或Bax的BH3結(jié)合活性的制劑還調(diào)控了Bel-Xl和Bak和/或Bax之間的相互作用。在一些實(shí)施方案中，拮抗Bcl-xi的制劑會有效地激動Bak和/或Bax的活性，并且拮抗Bak和/或Bax的制劑會有效地激動Bc卜x。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了增加受試對象中血小板或其前體的數(shù)量和/或存活的方法，該方法包括施用有效量的制劑，其中所述的制劑能夠增大Bc1-Xl的水平或活性，或者能夠降低Bak和/或Bax(血小板中)的水平或活性，或者能夠降低半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的水平或活性。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了降低血小板或其前體的數(shù)量和/或存活的方法，該方法包括向受試對象施用有效量的制劑，其中所述的制劑能夠減少Bcl-^的水平或活性，或者能夠增加血小板中Bak和/或Bax的水平或活性，或者能夠增加半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的水平或活性。在另一方面中，本發(fā)明提供了增強(qiáng)血小板體外存活的方法，該方法包括將血小板在體外與能夠?qū)?xì)胞凋亡進(jìn)行負(fù)調(diào)控的制劑接觸。在一個實(shí)施方案中，所述的制劑調(diào)控了Bcl-x^或Bak和/或Bax的活性。在另一實(shí)施方案中，所述的制劑抑制了半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的活性，或者促進(jìn)了諸如IAP多肽之類的細(xì)胞凋亡蛋白質(zhì)的內(nèi)生抑制劑的活性。調(diào)控革巴標(biāo)(例如包括肽、多肽、核酸或細(xì)胞)的"活性"包括指分子/細(xì)胞的水平或數(shù)量、或者靶標(biāo)的濃度、或者靶標(biāo)或細(xì)胞的功能活性。優(yōu)選的靶標(biāo)屬于Bcl-2家族的多肽，或者其編碼基因序列，或者下游細(xì)胞凋亡效應(yīng)器分子。其中，特別考慮Bcl-^、Bax和Bak以及BchL/Bak/Bax途徑。多肽的活性可以通過增大編碼DNA或RNA的轉(zhuǎn)錄或翻譯的水平來增強(qiáng)。多肽的活性還可以通過降低轉(zhuǎn)錄或翻譯的水平(例如通過抑制啟動子或增強(qiáng)子的活性，或者通過采用反義/siRNA策略，目前這些都是本領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù))來降低。因此，在一些實(shí)施方案中，血小板中促存活或促細(xì)胞凋亡多肽的水平可以通過施用制劑(例如編碼功能型多肽的基因構(gòu)建體)來調(diào)控，其中通過所述的制劑可以產(chǎn)生所述的多肽或其調(diào)節(jié)劑。在另一實(shí)施方案中，基因/靶向構(gòu)建體編碼了靶多肽的表達(dá)調(diào)節(jié)劑，例如反義分子、啟動子或增強(qiáng)子。本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員能理解多種策略可用于將基因構(gòu)建體或多肽/肽構(gòu)建體傳遞至細(xì)胞內(nèi)，以用于調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的多肽活性或者部分核酸的活性。術(shù)語"基因材料"、"基因構(gòu)建體"、"基因型式"、"核酸"、"核苷酸"和"多核苷酸"包括RNA、cDNA、基因組DNA、合成形式和混合的聚合物、正義和反義鏈，并且可以為化學(xué)或生物化學(xué)修飾的或者可以包含非天然或衍生的核苷酸堿基，這些都可以容易地被本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解。這些修飾包括(例如)標(biāo)記物；曱基化；使用類似物(例如嗎啉環(huán))取代一個或多個天然形成的核普酸；核苷酸間修飾，例如不帶電的連接體(例如膦酸曱酯、磷酸三酯、磷酸酰胺、氨基甲酸酯等)、帶電的連接體(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、懸垂的部分(例如多肽)、嵌入劑(例如吖啶、補(bǔ)骨脂素等)、螯合劑、烷化劑和經(jīng)修飾的連接體(例如OC-異頭核酸等)。此外，還包括這樣的合成分子，該分子模擬了多核苷酸通過氫鍵和其他化學(xué)相互作用而與指定序列結(jié)合的能力。此類分子是本領(lǐng)域已知的，并包括(例如)其中在分子主鏈中肽連接體取代了磷酸酯連接體的那些。本發(fā)明進(jìn)一步考慮了包含重組構(gòu)建體的重組核酸，其包含5c/-;r或A"或5ai基因或它們中任一者的功能變體的全部或部分。所述的重組構(gòu)建體能夠在宿主細(xì)胞中自發(fā)復(fù)制。備選地，所述的重組構(gòu)建體能夠整合到宿主細(xì)胞的染色體DNA中。這種重組多核苷酸包含基因組、cDNA、半合成或合成來源的多核苷酸，根據(jù)多核苷酸的來源或操作，所述多核苷酸(i)會不與天然相關(guān)的全部或部分的多核苷酸相關(guān)；(n)會與除了天然連接的多核苷酸以外的多核苷酸相連；或者(iii)不會天然形成。在根據(jù)本發(fā)明的核酸包括RM的情況下，對所示的序列應(yīng)該被解釋為是指其中U取代了T的RM等價(jià)物。這種構(gòu)建體可用于增高Bcl-^或Bak的水平，或者通過(例如)反義手段或RNAi介導(dǎo)的基因沉默方法對Bc1-Xl或Bak和/或Bax的水平進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)。如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所公知的那樣，所述的構(gòu)建體還可用于形成動物模型以及具有經(jīng)修飾的Bc卜Xl或Bak和/或Bax等位基因的細(xì)胞。至本敘述內(nèi)容的結(jié)尾，簡要地描述了所述的動物和細(xì)力包、以及包含這種動物和細(xì)月包的組合物。如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知道的那樣，反義多核苷酸序列是阻止和減少細(xì)胞凋亡的內(nèi)生或生理學(xué)調(diào)節(jié)劑表達(dá)的有用制劑。備選地，如Summerton等人(AntisenseandNucleicacidDrugDevelopment,7:187-195，1997)所述，可以使用嗎啉。反義分子可以干擾核酸分子的任何功能。被干擾的DNA的功能可以包括復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。復(fù)制和轉(zhuǎn)錄可以得自(例如)內(nèi)生細(xì)胞模板、載體、質(zhì)粒構(gòu)建體等。待干擾的RNA的功能可以包括多種功能，例如RNA至蛋白質(zhì)翻譯位點(diǎn)的易位；RNA至細(xì)胞內(nèi)位點(diǎn)的易位，其中所述的位點(diǎn)遠(yuǎn)離于RNA合成的位點(diǎn)；由RNA的蛋白質(zhì)翻譯；形成一種或多種RNA種類的RNA的剪接；以及與RNA有關(guān)的催化活性或復(fù)合體形成(該過程可由RNA進(jìn)行或者可通過RM來促進(jìn))。這種對耙核酸功能進(jìn)行干擾的一個優(yōu)選的結(jié)果是調(diào)控細(xì)胞凋亡促存活或促細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)劑(例如Bc1-Xl和/或Bak)的表達(dá)。雖然優(yōu)選形式的反義化合物為單鏈反義寡核苷酸，但是在多種物種中，引入雙鏈結(jié)構(gòu)(例如雙鏈RNA(dsRNA)分子)已經(jīng)顯示出誘導(dǎo)了基因或其相關(guān)基因產(chǎn)物的功能發(fā)生有利且由特異性反義鏈介導(dǎo)的降低。在題述發(fā)明的內(nèi)容中，術(shù)語"寡聚化合物"是指包含多個單體單元的聚合物或寡聚物。本發(fā)明中術(shù)語"寡核苷酸"是指核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核苷酸(DNA)、或其模擬物、嵌合體、類似物和同源物的寡聚體或聚合物。該術(shù)語包括由天然形成的核堿基、糖和共價(jià)核苷(主鏈)間鍵構(gòu)成的寡核苷酸、以及具有功能相似的非天然形成部分的寡核苷酸。這種經(jīng)修飾或取代的寡核苷酸通常由于其具有期望的性質(zhì)(例如增強(qiáng)的細(xì)胞吸收、對耙核酸增強(qiáng)的親和性以及在核酸酶存在下增強(qiáng)的穩(wěn)定性)而比天然形式的寡核苷酸優(yōu)選。通常，與^/-jr或勘i:和/或mRNA的開放閱讀框內(nèi)的核苷酸雜交的核酸酶抗性硫代磷酸酯會誘導(dǎo)RMseH介導(dǎo)的降解。根據(jù)本發(fā)明上述方面的基因制劑或組合物優(yōu)選地包含約8至約80個核堿基(即，約8至約80個連接的核苷)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將理解核堿基的長度為<image>imageseeoriginaldocumentpage36</image>本發(fā)明具體的化合物。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的制劑包括Bel-Xl或Bak或Bax或其功能片段或其功能變體，或者基因形式的"c/-t或^i:或""基因或其功能部分或其功能變體，或者它們的互補(bǔ)形式。本發(fā)明提供了包含"c/-i或^i或Aj，或者Bc1-Xl或Bak或Bax(即，基因或蛋白質(zhì)形式的分子)或其功能變體的組合物，該組合物在用于調(diào)控與血小板和/或血小板的存活有關(guān)的相互作用中實(shí)質(zhì)性增強(qiáng)或降低了Bc1-Xl或Bak和/或Bax的活性。這些組合物可以被i殳計(jì)成體外或體內(nèi)施用。本發(fā)明的調(diào)控劑可以為化學(xué)制劑，例如合成或重組的分子、多肽、肽、經(jīng)修飾的肽或蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖蛋白或其他天然或非天然形成的分子、其變體、衍生物或類似物。備選地，可以使用諸如DNA(gDNA,cDNA)，RNA(正義RM，反義RNA，mRNA，tRNA，rRNA，小干擾RM(SiRNA)，短發(fā)夾RNA(shRNA)，微小RNA(miRNA)，小核仁RNA(SnoRNA)，小核(SnRNA)核酶，適體，DNA酶或其他核糖核酸酶類型的復(fù)合體之類的基因制劑。根據(jù)本發(fā)明上述方面的制劑可以直接與Bel-x"》c7-x，Bak，Ai，Bax或Ai相互作用。因此，可以方《更地^f吏用(例如)抗體或肽、寡糖、折疊體、擬肽物質(zhì)或類似物，并且可以方便使用的其他此類的生物分子。備選地，可以采用基因機(jī)制間接調(diào)控Bel-x""c/-i,Bak，Ai:，Bax或^^的活性。此外，多種策略和反應(yīng)劑都^皮充分地記載，并且包括了用于轉(zhuǎn)錄前或轉(zhuǎn)錄后沉默的機(jī)制。本發(fā)明特別考慮了反義分子的表達(dá)或共抑制、或者RNAi或siRNA或shRNA或DNA本發(fā)明還考慮了適體。在多種應(yīng)用中，RNA和DNA適體可以代替單克隆抗體(Jayasena，Clin.Chem.，W(9):1628-1650，1999;Morrisa人，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA，夕i"(6):2902-2907，1998)。適體為核酸分子，其具有通過除了傳統(tǒng)的Watson-Crick堿性。適體在(例如)美國專利No.5，475，096;5，270，163;5，589，332;5，589，332;和5，741，679中有所描述。已經(jīng)通過SELEX研發(fā)出的識別其非核酸靶標(biāo)的DNA和RM適體的數(shù)量逐漸增多，并且已經(jīng)表征(Golde"/.,A麵.Rev.Biochem.，"763-797.1995;Bachere"人，DrugDiscoveryToday,J(6):265-273，1998)。在一些實(shí)施方案中，如上文所述，調(diào)控Ac/i或&1或化i基因、或者Bel-x或Bak或Bax多肽的水平或活性的制劑可以4汙生自Bcl-x，5c7-i，Bak或5ai:，Bax或5"或者為它們的變體。備選地，它們可以在體外或體內(nèi)篩選中被識別。天然產(chǎn)物、結(jié)合性合成的有機(jī)或無機(jī)化合物、肽/多肽/蛋白質(zhì)、核酸分子和文庫、或噬菌體、劑。天然產(chǎn)物包括得自珊瑚、土壤、植物、海洋或南極環(huán)境中的那些?？梢蕴禺愋缘厍蚧蚝Y選Bel-2家族成員的多個結(jié)構(gòu)域，例如Bcl-2同源結(jié)構(gòu)域，促細(xì)胞凋亡或促存活Bcl-2家族多肽的BH1，BH2，BH3或BH4結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中靶向，Bcl-2蛋白質(zhì)的BH3結(jié)合域或者Bak或Bax蛋白質(zhì)的Bc卜2結(jié)合域。在其他實(shí)施方案中，可以乾向BH1或BH1結(jié)構(gòu)域。備選地，可以草S向目標(biāo)蛋白質(zhì)的獨(dú)特區(qū)域，從而提供更高的選擇性。因此，在一些實(shí)施方案中，考慮了使血小板中Bc1-Xl的失活的Bak或Bax的變體。在一些實(shí)施方案中，將待測試的制劑與包含Bc1-&，Bak或Bax多肽或肽、或者萬c/-;r，^ir或^x基因序列的系統(tǒng)接觸。然后，測試以下方面制劑與靶標(biāo)之間的復(fù)合體的存在情況；靶標(biāo)活性的變化情況；或者靶標(biāo)活性指示劑的活性水平的變化情況。竟?fàn)幮缘慕Y(jié)合測試以及其他高通量的篩選方法在本領(lǐng)域中是公知的，并且在(例如)國際公開No.W084/03564和W097/02048中有所描述；Bcl-xL結(jié)合分子在(例如)W02002/072761中有所描述。在一些實(shí)施方案中，Bel-Xl可用作Bak和/或Bax的竟?fàn)幮越Y(jié)合劑。在其他實(shí)施方案中，Bak和/或Bax可用作Bel-Xl的竟?fàn)幮越Y(jié)合刑。在另一實(shí)施方案中，細(xì)胞測試被用于鑒定保持血小板生存能力的化合物。這些方法包括在待測試化合物存在下，溫育對細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)制劑敏感的細(xì)胞；然后將所述細(xì)胞與細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)制劑接觸；并測定未發(fā)生細(xì)胞凋亡的活細(xì)胞的存在情況。在一些實(shí)施方案中，所述的細(xì)胞對一種或多種Bcl-2家族成員(例如包括Bcl-2，Bc1-Xl，Bcl-w,Mcl-1和Al)的拮抗劑(例如BH3結(jié)構(gòu)域模擬制劑)是敏感的。在其他實(shí)施方案中，所述的細(xì)胞對Bc卜Xl或Mcl-1的拮抗劑是敏感的。在另一實(shí)施方案中，所述Bcl-XL的拮抗劑為ABT-737。在一些實(shí)施方案中，所述的細(xì)胞為血小板或成纖維細(xì)胞(例如小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF))。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的細(xì)胞為這樣的細(xì)胞，其中Mcl-l或Bcl"^的水平或活性部分地或完全地受到負(fù)調(diào)節(jié)，這是由本領(lǐng)域已知的方法形成的。在一些實(shí)施方案中，采用化學(xué)、基因或基因沉默(RNAi)的方法對Mcl-1或Bcl-XL的水平進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)。例如，可使用CDK抑制劑(例如R-細(xì)胞周期蛋白依賴激酶))或蛋白質(zhì)合成抑制劑(例如環(huán)己酰亞胺)可以降低Mcl-l的水平?；虿呗园ㄍㄟ^缺失全部或部分的基因、或者通過將外源DNA插入到基因中、或者通過使用外源啟動子來表達(dá)轉(zhuǎn)基因，從而形成功能等位基因的損失。還可以使用條件突變體技術(shù)。基因沉默提供了用于抑制基因功能的方便的程序。Mcl-l反義寡核苷酸在(例如)國際公開No.W02006/099667中有所描述，該文獻(xiàn)全文并入本文。使用ABT-737或等效的BH3結(jié)構(gòu)域模擬制劑可以方便地減少Bc1-xl的水平或活性。因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了鑒定可以保持血小板生存能力的化合物的方法，該方法包括在待測試化合物存在下，溫育對Bcl-Xt或Mcl-l的拮抗劑敏感的細(xì)胞；將所述的細(xì)胞與Bcl-xt或Mcl-l的拮抗劑接觸；以及測定活性細(xì)胞的存在情況，該存在情況表明所述的化合物能夠阻斷由Bel-xt或Mcl-1的拮抗劑誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡并保持細(xì)胞的生存能力。在另一實(shí)施方案中，所述Bcl-x^的拮抗劑為ABT-737或者其類似物。在一些實(shí)施方案中，對Bel-&的拮抗劑敏感的細(xì)胞為Mcl-l缺陷型細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，對Mcl-1的拮抗劑敏感的細(xì)胞為Bel-Xl缺陷型細(xì)胞。然后，對經(jīng)過初步篩選所鑒定的化合物進(jìn)行測試，從而測定它們對靶標(biāo)的作用。例如，在Mcl-1棵細(xì)胞且Bax棵細(xì)胞以及Mcl-1棵細(xì)胞且Bak棵細(xì)胞中測試化合物，從而證明所述的化合物通過Bax或Bak或者其他的下游乾標(biāo)起作用。如果需要的話，接著按照所述的方式對其他的下游靶標(biāo)進(jìn)行測試。在一個實(shí)施方案中，考慮了篩選可以增強(qiáng)血小板和/或其他哺乳動物細(xì)胞的存活、壽命期或生存能力的分子的方法，該方法包括(i)將所述的分子與細(xì)胞結(jié)合；(n)將所述的細(xì)胞與一種或多種能夠拮抗細(xì)胞中促存活Bcl-2家族分子并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的制劑接觸；(iii)相對于對照，測定在所述分子存在下細(xì)胞的存活(生存能力、壽命期、半衰期)的變化情況；以及(iv)選擇能夠增強(qiáng)細(xì)胞存活(生存能力、半衰期)的分子。在一些實(shí)施方案中，所述的方法包括將得自(iv)中的所選分子與血小板結(jié)合，從而相對于對照，測定在所述分子存在下血小板的細(xì)胞存活(生存能力、半衰期)的變化情況。在其他實(shí)施方案中，所述的方法包括將得自(iv)的所選分子與靶類型的細(xì)胞結(jié)合，從而相對于對照，測定在所述分子存在下細(xì)胞的細(xì)胞存活(生存能力、半衰期)的變化情況。在另一實(shí)施方案中，考慮了用于篩選能夠調(diào)控細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的分子的方法，該方法包括(a)將所述的分子與所述的細(xì)胞結(jié)合；以及(b)鑒定所述細(xì)胞的Bcl-2家族蛋白質(zhì)的調(diào)控情況，其中Bcl-2家族蛋白質(zhì)的調(diào)控表明所述的分子調(diào)控了所述細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。在另一實(shí)施方案中，考慮了篩選能夠調(diào)控鈿胞的Bcl-2家族蛋白質(zhì)的分子的方法，該方法包括(a)將所述的分子與所述的細(xì)胞結(jié)合；以及(b)鑒定所述細(xì)胞的細(xì)胞凋亡是否被調(diào)控，其中細(xì)胞凋亡的調(diào)控表明所述的分子調(diào)控了Bel-2家族蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法在步驟a)和b)之間進(jìn)一步包括對所述的細(xì)胞進(jìn)行處理以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的步驟。所述的細(xì)胞可以用能夠降低Bcl-2蛋白質(zhì)家族的促存活成員(例如Bel-Xl和/或Mcl-l)的水平和/或活性的制劑進(jìn)行處理。在一些實(shí)施方案中，所-2蛋白質(zhì)家族的促細(xì)胞凋亡成員(例如Bak和/或Bax)的水平和/或活性的制劑進(jìn)行處理。在一些其他的實(shí)施方案中，在步驟a)的細(xì)胞中，降低了至少一種Bcl-2家族促存活成員的水平和/或活性。在步驟a)的細(xì)胞中，可以降低Bcl-2家族(選自Bc1-Xl，Bcl-2，Bc卜w，Mcl-l，Al和Bcl-B)1至6個成員之間的水平和/或活性。可以降低Bc1-Xl和/或Mcl-l的水平和/或活性。在一些實(shí)施方案中，在步驟a)的細(xì)胞中，降低了至少一個Bcl-2蛋白質(zhì)家族促細(xì)胞凋亡成員的水平和/或活性，例如，可以降低Bak和/或Bax的水平和/或活性。在示意性的實(shí)施方案中，降低了Mcl-l和Bak的水平和/或活性。在其他實(shí)施方案中，降低了Mcl-1和Bax的水平和/或活性。在一些實(shí)施方案中，所述的方法在體外進(jìn)行。在其他實(shí)施方案中，所述的方法在體內(nèi)進(jìn)行。高通量的篩選方案被廣泛使用，例如在Geysen中所述的那些(國際公開No.W084/03564)。簡而言之，在固體基底(例如塑料針或一些其他的表面)上合成大量的(例如)小肽測試化合物。通過多種方法檢測結(jié)合的多肽。與在珠子上合成肽(其形成了肽文庫，其中每個珠子都為單個的文庫成員)有關(guān)的類似方法在美國專利No.4,631,211中有所描述，并且相關(guān)的方法在國際公開No.W092/00091中有所描述?；谥樽拥姆椒ǖ拿黠@改進(jìn)涉及使用獨(dú)特的鑒定標(biāo)記(例如寡核苷酸或電泳標(biāo)記)來標(biāo)記每個珠子，從而有利于各文庫成員的氨基酸序列的鑒定。這些經(jīng)改進(jìn)的基于珠子的方法在國際公開No.W093/06121中有所描述。另一種化學(xué)合成篩選方法涉及在表面上合成肽(或者擬肽物質(zhì))的陣列，其中在所述的陣列中，各種獨(dú)特的肽序列均位于分開的并且是預(yù)定的位置處。各文庫成員的特性通過其在陣列中的空間位置來鑒定。在其中預(yù)定分子與反應(yīng)性文庫成員之間發(fā)生結(jié)合相互作用的情況下，測定處于所述情況下的陣列中的位置，由此，基于空間位置測定反應(yīng)性文庫成員的序列。這些方法在美國專利No.5,143,854;國際公開No.WO90/15070和WO92/10092;以及Fodoreta人，Science,767，1991中有所描述。能夠使核酸與其表達(dá)的多肽相連的顯示系統(tǒng)是特別有用的。用于分離大型文庫的所需成員的選擇方案在本領(lǐng)域中是已知的，其可以由噬菌體表達(dá)技術(shù)來代表。其中多種肽序列表達(dá)于纖維狀噬菌體的表面上的此類系統(tǒng)可用于創(chuàng)建抗體片段(以及編碼該抗體片段的核苷酸序列)的文庫，從而用于體外選擇和擴(kuò)增與靶抗原結(jié)合的特異性抗體片段。將編碼Vh和、區(qū)域的核苷酸序列與編碼前導(dǎo)信號(其指導(dǎo)所述的核苷酸序列進(jìn)入到Aco//的外周原生質(zhì)空間中)的基因片段相連，并且所得的抗體片段(其通常與噬菌體外殼蛋白質(zhì)(例如pin或pvni)融合)被表達(dá)于噬菌體的表面上。備選地，抗體片段表達(dá)于x噬菌體衣殼(噬菌體)的外表上。基于噬菌體的表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)在于，可以通過使包含細(xì)菌細(xì)胞中的所選文庫成員的噬菌體進(jìn)行生長來簡便地?cái)U(kuò)增所選的文庫成員。此外，由于編碼所述多肽文庫成員的核苷酸序列被包含在噬菌體或噬菌體載體中，所以測序、表達(dá)和隨后的基因操作均相對簡單。相應(yīng)的技術(shù)被用于小型有機(jī)分子的結(jié)合性文庫中。已經(jīng)測定出Bcl-xt，Bak和Bax的三維結(jié)構(gòu)，這有助于^:計(jì)調(diào)控細(xì)胞凋亡的結(jié)合制劑。對Bcl-x^和/或Bak和/或Bax或這些分子中每一個的變體、衍生物或類似物的一個或多個結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行三維重視，以根據(jù)形狀、反應(yīng)性、電荷電位等鑒定順利相互作用或結(jié)合的相互作用分子。在優(yōu)選的方面中，技術(shù)人員可以篩選化合物的三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫，從而鑒定出具有與一個或多個結(jié)合位點(diǎn)相擬合的官能團(tuán)的那些化合物。可以圍繞這些結(jié)構(gòu)來形成結(jié)核性化學(xué)文庫，從而鑒定出對Bc1-Xl，Bak和/或Bax結(jié)合位點(diǎn)具有高的結(jié)合親和性的化合物。然后，在擬合操作中，使用(例如)Docking軟件程序?qū)⑼ㄟ^篩選化合物的數(shù)據(jù)庫或文庫而鑒定得到的制劑與Bc卜Xl，Bak和/或Bax結(jié)合位點(diǎn)的三維重視圖擬合。"在生物信息學(xué)中"，可以在潛在的調(diào)控劑的實(shí)際合成和測試之前，針對其結(jié)合Bcl-x^Bak或Bax活性位點(diǎn)的能力，對該調(diào)控劑進(jìn)行評價(jià)?？梢酝ㄟ^(例如)形狀的互補(bǔ)程度(通過對相互作用的能量進(jìn)行估計(jì))來評估與多個位點(diǎn)結(jié)合的所述實(shí)體的擬合性質(zhì)(Menge"/.，J.Corap.Chem.，"505-524，1992)。與細(xì)胞凋亡途徑的成分(包括Bc1-Xl和/或Bak和/或Bax)相關(guān)聯(lián)的化學(xué)實(shí)體的設(shè)計(jì)通常涉及考慮兩個因素。以考慮Bel-Xl和Bak作為實(shí)例，所述的化合物必需能夠在物理和結(jié)構(gòu)上與Bel-a或Bak相關(guān)聯(lián)。在Bel-x^或Bak與其相互作用的伴侶的結(jié)合中起重要作用的非共價(jià)分子相互作用包括氫鍵、范德華和疏水相互作用。第二，所述的化合物必需能夠呈現(xiàn)允許其與Bcl-^或Bak結(jié)合的構(gòu)象。雖然，所述化合物的某些部分沒有直接參與到與Bcl-x^或Bak的這種結(jié)合中，但是這些部分仍可以影響所述分子的整體構(gòu)象。所述的構(gòu)象要求包括整體三維結(jié)構(gòu)、以及化學(xué)實(shí)體或化合物相對于所有活性位點(diǎn)或部分活性位點(diǎn)的取向，或者包含多個化學(xué)實(shí)體(其直接與Bcl-x^或Bak相互作用)的化合物的官能團(tuán)之間的間隔。如上所述，一旦以最佳方式選擇或設(shè)計(jì)出結(jié)合化合物，接著就可以在其一部分原子或側(cè)基中進(jìn)行取代從而改善或修飾其結(jié)合性質(zhì)。通常，初始取代是保守性的，即，替換基團(tuán)具有與原始基團(tuán)大約相同的尺寸、形狀、疏水性和電荷。當(dāng)然應(yīng)該理解的是，應(yīng)該避免本領(lǐng)域已知的會改變構(gòu)象的成分。通過一系列步驟，可以以計(jì)算方式評價(jià)和設(shè)計(jì)推定的結(jié)合制劑，其中在所述的步驟中，針對化學(xué)實(shí)體或片段與一個或多個結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的能力來對其進(jìn)行篩選和選擇。然后，將所選的片段或化學(xué)實(shí)體以多種取向定位，或者"空間對接，，到目標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)中?？梢允褂弥T如QUANTA和SYBYL之類的軟件、然后通過利用了標(biāo)準(zhǔn)的分子力學(xué)場(例如CHARMM或AMBER)的能量最小化和分子動力學(xué)來完成空間對接。專業(yè)計(jì)算機(jī)程序可用于選擇所關(guān)注的片段或化學(xué)實(shí)體。這些程序包括(例如)GRID(牛津大學(xué)，Oxford,UK),5MCSS(分子模擬機(jī)構(gòu)，USA),AUT0D0CK(斯克里普斯研究所，USA),DOCK(加州大學(xué)，USA),XSITE(倫敦大學(xué)學(xué)院，UK)和CATALYST(Accelrys)。幫助技術(shù)人員關(guān)聯(lián)化學(xué)實(shí)體或片段的有用的程序包括CAVEAT(加州大學(xué)，USA)，3D數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)和H00K(分子模擬機(jī)構(gòu)，USA)。新的配體設(shè)計(jì)方法包括在LUDI(分子模擬機(jī)構(gòu)，USA),LEGEND(分子模擬機(jī)構(gòu)，USA),LeapFrog(Tripos公司)SPROUT(利茲大學(xué)，UK)等中所描述的那些?；诮Y(jié)構(gòu)的配體設(shè)計(jì)在本領(lǐng)域中是公知的，并且有多種策略可以利用，這些策略可以建立在結(jié)構(gòu)信息上從而測定可以有效調(diào)控細(xì)胞凋亡途徑中多種成分(包括Bcl-x"Bak或Bax)活性的配體。分子建模技術(shù)包括在Cohene"7.，J.Med.Chem.，組-<W，1990，和Naviaa/.,CurrentOpinionsinStructuralBiology,2:202-2101992中所描述的那些?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)的同源建模技術(shù)以便測定未知的三維結(jié)構(gòu)或分子復(fù)合體。同源建模涉及使用一種或多種相關(guān)蛋白質(zhì)分子、其分子復(fù)合體或部分的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)來構(gòu)建未知結(jié)構(gòu)的模型?？梢酝ㄟ^針對已知分子中同源結(jié)構(gòu)元件的三維結(jié)構(gòu)對其三維結(jié)構(gòu)有待解析的蛋白質(zhì)的共同部分或同源部分進(jìn)行擬合，來進(jìn)行同源建模?？梢岳冒被嵝蛄械奶匦?、同源二級結(jié)構(gòu)元件和/或同源三級折疊來確定同源性。同源建?？梢园ㄊ褂闷湎嚓P(guān)結(jié)構(gòu)有待解析的那些結(jié)構(gòu)中的氨基酸殘基(或其他成分)進(jìn)行替換來重建部分或全體三維結(jié)構(gòu)。利用這些三維結(jié)構(gòu)，研究者鑒定出推定的結(jié)合位點(diǎn)，隨后鑒定或設(shè)計(jì)出與所述的結(jié)合位點(diǎn)相互作用的制劑。然后，針對對目標(biāo)分子的調(diào)控效果來篩選這些制劑。在一些實(shí)施方案中，對結(jié)合制劑進(jìn)行設(shè)計(jì)，使其結(jié)合的變形能不大于約10kcal/mole，更優(yōu)選的是不大于7kcal/mole?？梢岳糜?jì)算機(jī)軟件來評價(jià)化合物的變形能和靜電相互作用。所述的軟件例如有Gaussian98，AMBER，QUANTA,CHAR醒，INSIGHTII，DISCOVER,AMSOL和De脂?？梢允褂帽绢I(lǐng)域的技術(shù)人員已知的高通量技術(shù)來形成和篩選小型有機(jī)分子庫。例如，參見美國專利No.5，763，263和美國申請No.20060167237。結(jié)合性合成提供了有用的方法，其中合成了非常多的相關(guān)化合物，這些化合物在母結(jié)構(gòu)的共同結(jié)構(gòu)或亞結(jié)構(gòu)中具有不同的取代。此類化合物通常為非寡聚體，并且在它們的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)和功能中是相似的，而在(例如)鏈長、環(huán)的大小或取代的數(shù)量或模式方面是不同的。如上文所述，還可以構(gòu)建虛擬庫，并且在本領(lǐng)域已知的生物信息學(xué)(例如參見美國申請No.20060040322)或者體外或體內(nèi)測試中對多種化合物進(jìn)行測試。在另一個方面中，所述的制劑可衍生自核酸分子。關(guān)于萬c/-x，^i或^i基因的核苷酸序列，術(shù)語功能形式或變體、功能等價(jià)衍生物或同源物包括這樣的分子，該分子在定義溫度下或在一定范圍的條件下，在中度或高度嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下，在全部或部分的基因分子上，與"c/i，Air或化i基因或其互補(bǔ)形式選擇性雜交，或者該分子與定義了Sc7-i，&1或^3z基因的核苷酸序列具有大約60%至90%或98%的序列一致性。示意性的"c7i或5si:核苷酸序列包括具有SEQIDNO:1或5或它們的互補(bǔ)物或校正形式(小鼠或人5c/-amRNA)所列的、以及SEQIDNO:3或7(小鼠或人&1mRNA)或它們的互補(bǔ)物或才交正形式所列的核苷酸序列的那些。示意性的^z核苷酸序列包括具有SEQIDNO:9或它們的互補(bǔ)物或校正形式所列的核苷酸序列的那些。但是，為了避免被質(zhì)疑，應(yīng)該注意術(shù)語'？c/-i基因"或""ai:基因"或"&,基因"清楚地涵蓋了包含調(diào)節(jié)區(qū)域在內(nèi)的所有形式的基因，其中所述的調(diào)節(jié)區(qū)域例如有表達(dá)編碼序列所需的那些區(qū)域、以及包含探針和引物在內(nèi)的基因組形式或特異性的片段、以及包含所述片段或其部分的構(gòu)建體、以及cDNA或RNA以及它們的一部分。術(shù)語"功能形式"或"變體"、"功能等價(jià)衍生物"或"同源物"包括具有這樣的氨基酸序列的多肽，其中所述的氨基酸序列與SEQIDNO:2，4，6,8或10所示的Bc1-Xl或Bak或Bax多肽具有大約60%的序列一致性。示例性的Bcl-x或Bak氨基酸序列包括具有SEQIDNO:2(小鼠Bcl-xJ，SEQIDNO:4(小鼠Bak)，SEQIDNO:6(人Bcl-xJ或SEQIDNO:8(人Bak)所列序列的那些。示例性的Bax氨基酸列于SEQIDNO:10(人Bax)中。本文所述的"中度嚴(yán)謹(jǐn)，，包括并涵蓋了至少約16v/v。/。至至少約30v/vy。的曱酰胺和至少約Q.5M至至少約G.9M的鹽用于雜交，以及至少約0.5M至至少約0.9M的鹽用于洗滌條件，或者高度嚴(yán)謹(jǐn)，其中所述的高度嚴(yán)謹(jǐn)包括并涵蓋了至少約31v/v。/。至至少約50v/v%的曱酰胺和至少約0.01M至至少約0.15M的鹽用于雜交，以及至少約0.OIM至至少約0.15M的鹽用于洗滌條件。通常，洗滌是在Tm-69.3+0.41(G+C"/。下進(jìn)4亍的(Marmur"".,J.Mol.Biol.，109，1962)。但是，錯配堿基對的數(shù)量每升高1%，雙鏈體DNA的L就會降低1°C(Bonnerefa/.,Eur.J.Biochem.，^!'83，1974)。在上述雜交條件下，甲酰胺是可任選的。因此，特別優(yōu)選的嚴(yán)謹(jǐn)水平定義如下低度嚴(yán)謹(jǐn)為6xSSC緩沖劑，0.1%w/vSDS,25-42°C;中度嚴(yán)謹(jǐn)為2xSSC緩沖劑，0.1%w/vSDS,在20'C至65。C的范圍內(nèi)；高度嚴(yán)謹(jǐn)為0.1xSSC緩沖劑，0.1%w/vSDS，至少65。C的溫度。在一些實(shí)施方案中，編碼Bcl-xt或Bak多肽的核酸分子包含SEQIDNO:1，3，5，7或9所列的核苷酸序列，或者為在中度或高度嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交條件下與其雜交或其互補(bǔ)形式的核苷酸序列。優(yōu)選的是，所述的雜交區(qū)域?yàn)殚L度約12至約80或更多的核堿基。更優(yōu)選的是，在特定核苷酸序列和參照序列之間的百分一致性為約60%、或65%、或約70%、或約80%、或約85%,更優(yōu)選的是為約90%的相似性，或者大于約95%、96%、97%、98%、99%或更高的相似性。在60%至100%之間的百分一致性被涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。"參照序列"為長度為至少12、但往往為15至18并且通常為至少25或更多(例如30個)的單體單元(包括核苷酸和氨基酸殘基)。由于兩種多核苷酸均可以包含(1)在兩種多核普酸之間相似的序列(即，僅是完整多核苷酸序列的一部分)；以及(2)在兩種多核苷酸之間是不同的序列，所以通常通過在"對比窗口"上比較兩種多核普酸的序列來進(jìn)行兩種(或多種)多核苷酸之間的序列比對，從而鑒定和對比出序列相似的局部區(qū)域。"對比窗口"是指用于與參照序列進(jìn)行比較的通常為12個連續(xù)殘基的概念性節(jié)段。與參照序列(其不包含添加或缺失)相比，所述的對比窗口可以包含約20%或更少的添加或缺失(即，間隙)，從而使兩種序列達(dá)到最佳的比對。可以通過計(jì)算機(jī)化地運(yùn)行算法(GAP，BESTFIT，F(xiàn)ASTA,以及在theWisconsinGeneticsSoftwarePackageRelease7.0中的TFASTA，GeneticsComputerGroup,575ScienceDriveMadison,WI，USA)或者通過檢查以及采用所選多種方法中的任意一種方法而形成的最佳比對(即，在對比窗口上所得的同源性百分比達(dá)到最高)來進(jìn)行用于比地對比窗口的序列的最佳序列比對。還可以參照在(例如)Altschul"a人，Nucl.AcidsRes.",3389,1997中所公開的BLAST系列的程序。序列分析的詳細(xì)討論可以在Unit19.3ofAusubela/.,C"ive/7f/Vc^oco/s//#o/ecu/arA/o/c^jJohnWiley&SonsInc，1994-1998，Chapter15)中找到。例如，核苷酸序列之間的序列一致性百分率可通過以下過程計(jì)算得到，所述的過程為在對比窗口上比較兩個最佳排列的序列，測定其中在兩種序列中都具有的一致的核酸堿基(例如A，T，C，G，I)的位置的數(shù)量從而得到匹配位置的數(shù)量，用匹配位置的數(shù)量除以對比窗口(即，窗口大小)的位置總數(shù)，以及將所得的結(jié)果乘以100從而得到序列一致性的百分率。就本發(fā)明的目的而言，"序列一致性"應(yīng)該被理解為"匹配百分率，，，其是使用了所述軟件所附參考手冊中使用的標(biāo)準(zhǔn)缺省的DNASIS計(jì)算機(jī)程序(Version2.5，用于windows操作系統(tǒng)；得自HitachiSoftwareengineering公司，SouthSanFrancisco,California,USA)而計(jì)算得到的。類似的注釋適用于氨基酸序列的序列相似性。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明考慮了全長Bel-Xl或Bak或Bax、或者這些多肽的生物活性部分的用途。生物活性Bc卜Xl或Bak或Bax部分包含一個或多個結(jié)合結(jié)構(gòu)域。全長多肽的生物活性部分可以為長度為(例如)4，5，6，7,8，9，10，11,12,13，14，15,16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，30，40，50，60，70，80，90，100，120，150，300或更多的氨基酸殘基的多肽。本發(fā)明的Bel-Xl或Bak或Bax多肽包括包括所有生物活性或功能天然形成形式的Bcl-^或Bak或Bax、及其生物活性部分和這些蛋白質(zhì)的變體或衍生物。例如，Bcl-x^或其功能變體(包括激動劑或拮抗劑)可以作為傳遞構(gòu)建體(其被設(shè)計(jì)可以進(jìn)行合適的細(xì)胞內(nèi)靶向)的一部分以蛋白質(zhì)的形式被傳遞至血小板。本發(fā)明還考了了所述的相互作用的分子的變體形式。"變體"多肽包括由天然蛋白質(zhì)通過以下過程而衍生得到的蛋白質(zhì)，所述的過程為在天然蛋白質(zhì)的N末端和/或C末端缺失(也稱為截短)或添加一個或多個氨基酸；在天然蛋白質(zhì)的一個或多個位點(diǎn)處缺失或添加一個或多個氨基酸；或者在天然蛋白質(zhì)中在一個或多個位點(diǎn)處取代一個或多個氨基酸。本發(fā)明所涵蓋的變體蛋白質(zhì)為有生物活性的，即，它們?nèi)跃哂刑烊坏鞍踪|(zhì)的至少一種生物活性。此類變體可以由(例如)基因多態(tài)性或通過人為處理得到。天然Bc卜x，Bak或Bax多肽的生物活性變體與天然蛋白質(zhì)的氨基酸序列具有至少40%,50%,60%，70%，通常至少為75%，80%，85%,優(yōu)選為約90%至95%或更高，并且更優(yōu)選為約98%或更高的序列相似性，這可由本文其他處所述的序列比對程序使用缺省參數(shù)來測定得到。Be1-xL或Bak多肽的生物活性變體通?？梢耘c所述的多肽具有多至100、50或20個不同的氨基酸殘基，或者合適的具有少至1-15個不同的氨基酸殘基，少至1-10個(例如6-10)不同的氨基酸殘基，少至5個、少至4、3、2或甚至1個不同的氨基酸殘基?？梢酝ㄟ^多種方式(包括氨基酸取代、缺失、截短和插入)來改變Bcl-xt，Bak或Bax多肽/肽。用于這種處理的方法是本領(lǐng)域公知的。例如，可以通過向編碼DM中引入突變來制備Bcl-x或Bak或Bax多肽的氨基酸序列變體。用于形成突變和改變核苷酸序列的方法是本領(lǐng)域乂^知的。例如參見Kunkel(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,《么488—492，1985)，Kunkela厶，(MethodsinEnzymol.，"4:367-382，1987)，美國專利No.4,873,192，Watson".("MolecularBiologyoftheGene",第四版，Benjamin/Cummings,MenloPark,Calif.，1987)，并且這些文獻(xiàn)在本文中都有引用。關(guān)于合適的氨基酸取代(其不會影響所關(guān)注蛋白質(zhì)的生物活性)的指導(dǎo)方法可以在Dayhoff等人的模型中找到(Natl.Bio齢d.Res.Found,5:345-358,1978)。用于篩選結(jié)合性文庫(通過點(diǎn)突變或截短得到)的基因產(chǎn)物的方法、以及針對基因產(chǎn)物(其具有所選的性質(zhì))篩選cDM文庫的方法是本領(lǐng)域已知的。此類方法適用于快速篩選通過多肽的組合突變形成而得到的基因文庫?？梢詫⑦f歸整體突變(Recursiveensemblemutagenesis)(REM)法(一種增大文庫中功能突變體頻率的技術(shù))與所述的篩選測試結(jié)合使用來鑒定有用的多肽變體(Arkin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,約7811-7815，1992;Delgravea/"ProteinEngineering,6327-331，1993)。如下文更加詳細(xì)討論的那樣，保守性取代(例如一個氨基酸與另一個具有相似性質(zhì)的氨基酸互換)是理想的。與參照氨基酸序列相比，變體Bc卜Xl，Bak或Bax多肽可以在沿著其序列的多個位置處包含保守性的氨基酸取代。"保守性的氨基酸取代"是指這樣的取代，其中所述的氨基酸殘基被具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基替換。本領(lǐng)域中，已經(jīng)定義了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族，這些氨基酸殘基家族通常可以分為如下亞類酸性在生理學(xué)pH下，由于損失了H離子而使得殘基具有負(fù)電荷，并且該殘基被水性溶液所吸引，從而使得在肽處于生理學(xué)pH的水性介質(zhì)中時，所述的殘基會在包含該殘基的肽構(gòu)象中尋求表面位置。具有酸性側(cè)鏈的氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸。堿性由于在生理學(xué)pH下或者在其一個或兩個pH單元(例如組氛酸)中殘基與H離子結(jié)合而使得該殘基具有正電荷，并且該殘基被水性溶液所吸引，從而使得在肽處于生理學(xué)pH的水性介質(zhì)中時，所述的殘基會在包含該殘基的肽構(gòu)象中尋求表面位置。具有堿性側(cè)鏈的氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。帶電荷的在生理學(xué)pH下，殘基帶有電荷，因此該殘基包括具有酸性側(cè)鏈或堿性側(cè)鏈的氨基酸(即，谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、賴氨酸和組氨酸)。疏水性在生理學(xué)pH下，殘基不帶電荷，并且該殘基被水溶液所排斥，從而使得當(dāng)肽處于水性介質(zhì)中時，所述的殘基會在包含該殘基的肽構(gòu)象中尋求內(nèi)部位置。具有疏水性側(cè)鏈的氨基酸包括酪氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。如本文所示，Bcl-Xt的BH4結(jié)構(gòu)域中酪氨酸的取代或者Bcl-xt多肽的BH2結(jié)構(gòu)域中異亮氨酸的損失會深刻改變該多肽的體內(nèi)活化能力。中性/極性在生理學(xué)pH下，殘基不帶電荷，但是該殘基不被水溶液完全排斥，這樣當(dāng)肽處于水性介質(zhì)中時，所述的殘基會在包含該殘基的肽構(gòu)象中尋求內(nèi)部位置。具有中性/及性側(cè)鏈的氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、組氨酸、絲氨酸和蘇氨酸。本說明書還將某些氨基酸表征為"小型"的，這是由于這種氨基酸的側(cè)鏈不是足夠大，從而使得其即使不具有極性基團(tuán)，也能夠賦予疏水性。脯氨酸是個例外，"小型"氨基酸是指當(dāng)至少一個極極性基團(tuán)沒有位于側(cè)鏈上時具有三個碳或更少的那些。具有小型側(cè)鏈的氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸。由于基因編碼的二級氨基酸脯氨酸對肽鏈的二級構(gòu)象的已知的影響，所以該脯氨酸是一種特殊的情況。脯氨酸的結(jié)構(gòu)與所有其他天然形成的氨基酸不同，這是因?yàn)槠鋫?cè)鏈與a氨基以及ct碳的氮鍵合。但是，多種氨基酸的相似的矩陣(例如在如Dayhoffefs人，1978和byGonnet"".，Science,篇(5062):1443-1445，1992中公開的PAM120矩陣和PAM250矩陣)在與甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸具有相同的基團(tuán)中包含了脯氨酸。因此，就本發(fā)明的目的而言，脯氨酸被歸類為"小型"氨基酸。氨基酸殘基還可以針對殘基的側(cè)鏈取代基而進(jìn)一步分為以下亞類環(huán)狀或非環(huán)狀、以及芳香族或非芳香族這些自我說明的類別，并且可以分為小型或大型的亞類。如果殘基共包含4個碳原子或更少(羧基碳也包含在內(nèi))，則認(rèn)為該殘基為小型殘基，前體條件是存在其他極性取代基；如果不存在其他極性取代基，則碳原子總數(shù)為3個或更少的殘基被認(rèn)為是小型殘基。當(dāng)然，小型殘基通常為非芳香族的。根據(jù)氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)性質(zhì)，該氨基酸殘基可能分為兩個或多個類別。針對天然形成的蛋白質(zhì)氨基酸，根據(jù)所述方案的亞類示于表2中。保守性的氨基酸取代還包括基于側(cè)鏈的分組。例如，一組具有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸為甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；一組具有脂肪族幾基側(cè)鏈的氨基酸為絲氨酸和蘇氨酸；一組具有含酰氨基側(cè)鏈的氨基酸為天冬酰胺和谷氨酰胺；一組具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸為苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；一組具有堿性側(cè)鏈的氨基酸為賴氨酸、精氨酸和組氨酸；以及一組具有含硫側(cè)鏈的氨基酸為半胱氨酸和蛋氨酸。例如，合理地認(rèn)為使用異亮氨酸或纈氨酸取代亮氨酸、使用谷氨酸取代天冬氨酸、使用絲氨酸取代蘇氨酸、;斤得變體多肽的性質(zhì)產(chǎn)i較大影響:i否氨基酸變化會產(chǎn)生有功能的Bel-Xl或Bak多肽可以容易地通過檢測其活性來確定?？梢匀菀坠烙?jì)的活性是技術(shù)人員已知的，并且包括用于測定結(jié)合情況或者二聚或寡聚化情況(通過(例如)Biacore、動力學(xué)、親和性和下拉分析檢測)的測試。保守性的取代示于示例性取代標(biāo)題下的表3中。更優(yōu)選的取代示于優(yōu)選取代的標(biāo)題下。落入本發(fā)明范圍內(nèi)的氨基酸取代通常通過以下過程完成，所述過程為選擇在保持(a)取代區(qū)域中肽主鏈的結(jié)構(gòu)、(b)在靶位點(diǎn)處分子的帶電性或疏水性、或者(c)側(cè)鏈的體積的作用上沒有顯著差異的取代。在引入取代之后，針對生物活性篩選變體。備選地，可以根據(jù)側(cè)鏈的特性，將用于進(jìn)行保守性取代的相似氨基酸歸入三個類別中。第一組包括谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、賴氨酸、組氨酸，它們都具有帶電的側(cè)鏈；第二組包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺；第三組包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸，如Zubay，G.，Biochemistry,thirdedition,Wm.C.BrownPublishers(1993)中所述。因此，Bc卜i或Bak多肽中所預(yù)計(jì)的非必需氨基酸殘基通常被得自相同側(cè)鏈家族中的另一種氨基酸殘基替換。備選地，可以通過(例如)飽和突變形成沿著多核苷酸編碼序列的全部或部分隨機(jī)引入突變，并可以針對親代多肽的活性篩選所得的突變體，從而鑒定出保持所述活性的突變體。在編碼序列中突變形成后，可以以重組方式表達(dá)所編碼的肽，并且可以測定所述肽的活性。因此，本發(fā)明還考慮了天然形成的Bcl-xL,Bak或Bax等肽序列或者它們生物活性片段的變體，其中所述的變體通過一個或多個氨基酸殘基的添加、缺失或取代而與天然形成的序列不同。通常，變體顯示出與(例如)在SEQIDNO:2，4，6,8或10的任意一項(xiàng)中所列的參照Bcl-Xt或Bak多肽序列具有至少約50，55，60，65，70，7580，85，90，91，92，93,94，95，96，97，98，99%的一致性。此外，本發(fā)明考慮了這樣的序列，該序列通過l，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18,19,20，30，40，50或更多氨基酸的添加、缺失或取代而與天然或親代序列不同，但是該序列保留了參照Bcl-xt或Bak多肽的某些性質(zhì)。本發(fā)明的變體Bc1-Xl,Bak，Bax多肽還包括這樣的多肽，該多肽由在本文所述的嚴(yán)謹(jǐn)條件下(特別是在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下)與A^i:或""多肽序列雜交的多核苷酸或其非編碼鏈編碼。在一些實(shí)施方案中，變體多肽與Bcl-x"Bak或Bax多肽序列具有至少1個但少于50，40，30,20，15，10，8，6，5，4，3或2個不同的氨基酸殘基。在另一實(shí)施方案中，變體多肽與SEQIDNO:2，4，6，8或10的任意一項(xiàng)中所示的相應(yīng)序列具有至少1%但少于20°/。，15°/，10%或5%不同的殘基。如果這種比較需要進(jìn)行比對，則應(yīng)該將多個序列排列成具有最大的相似性。(認(rèn)為得自缺失或插入、或者錯配的"環(huán)凸"序列是不同的。)在一個實(shí)施方案中，所述的不同為在非必需殘基或保守性取代處的差異或變化。對得自多種哺乳動物物種的Bc1-Xl，Bak或Bax蛋白質(zhì)進(jìn)行的序列比對用于證明保守的殘基。"非必須"氨基酸殘基為這樣的殘基，該殘基是由實(shí)施方案的多肽的野生型序列改變得到，但沒有破壞或?qū)嵸|(zhì)上改變該多肽的一種或多種活性。合適的是，所述的改變沒有實(shí)質(zhì)性地改變所述活性中的任何一種活性，例如，所述的活性為野生型的至少20%，40%,60%70%或80%。"必需"氨基酸殘基為這樣的殘基，當(dāng)該殘基由本發(fā)明多肽制劑的野生型序列改變得到時，存在這樣的結(jié)果，親代分子的活性被破壞，其活性不到野生型活性的20%。在其他實(shí)施方案中，變體多肽包括這樣的氨基酸序列，該氨基酸序列與由(例如)SEQIDNO:2，4，6，8或10所列多肽的相應(yīng)序列具有至少約50%，55%,60%，65%,70%,75%，80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%95%，96%,97%，98%或更高的相似性，并且變體多肽具有Bc卜Xl，Bak或Bax多肽的至少一種活性?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適的過程制備多肽制劑。例如，所述的多肽可以通過包括以下步驟的過程制備，所述的步驟為(a)制備包含核苷酸序列的嵌合構(gòu)建體，其中所述的核苷酸編碼了Bcl-xl，Bak或Bax多肽或其功能變體中的至少一部分，并且可操作地與一個或多個調(diào)節(jié)元件連接；(b)將所述的嵌合構(gòu)建體引入宿主細(xì)胞；(c)培養(yǎng)所述的宿主細(xì)胞使其表達(dá)Bcl-XL，Bak或Bax多肽或它們的變體；以及(d)由所述的宿主細(xì)胞中分離出Bc1-Xl，Bak或Bax多肽或這些多肽中的任意一種多肽的變體。在示意性的實(shí)施例中，所述的核苷酸序列編碼了SEQIDNO:2，4，6，8或10中所列序列或它們的變體的至少一部分。可以使用在(例如)Sambrook,e"7.，(1989，supra),特別是第16和17部分；Ausubele"入，(1994supra)，特別是第10章和16章；以及Coligan，CURRENTPROTOCOLSINPROTEINSCIENCE(JohnWiley&Sons,Inc.1995-1997),特別是第1、5和6章中所述的標(biāo)準(zhǔn)方案方便地制備重組多肽。備選地，多肽制劑可以通過化學(xué)合成方法合成，所述的化學(xué)合成方法例如為采用在(例如)AthertonandShephard(sw;ra)的第9章以及在Robergeefa/,,(Science,^f義202，1995)中所述的溶液合成方法或固相合成方法。構(gòu)象限制性肽的合成在(例如)國際公開No,WO2004106366中有所描述。術(shù)語"衍生物，，和"變體"可以互換使用，并且不論涉及基因分子還是蛋白質(zhì)分子，所述的那些術(shù)語都包括突變體、片段、類似物以及雜交體、嵌合體或融合分子和糖基化變體作為合適的部分。特別有用的變體保留了親代分子的功能活性，并且具有位于Bcl-札Bak或Bax氨基酸序列中的一個或多個氨基酸取代、缺失和/或添加。優(yōu)選的是，所述的變體具有功能活性，或者備選地，所述的變體調(diào)控了Bc卜Xl，Bak或Bax的功能活性。如本文所述，^c/-i，"ai:或^;r基因的局部、部分或片段^皮定義為具有至少約10個核苷酸、優(yōu)選的為約13個核苷酸或者更優(yōu)選的為至少約20個核苷酸的最小尺寸，并且可以具有至少為約35個核苷酸的最小尺寸。所述的定義包括10至35個、以及大于35個核苷酸范圍內(nèi)的所有尺寸。因此，所述的定義包括這樣的核酸，該核酸分子具有12，15，20，25，40，60，1QQ，200，500個核苷酸，并且具有500至由SEQIDNO:1，3，5，7或9或其補(bǔ)體形式所示數(shù)量之間的任何數(shù)量的核苷酸。對于Bcl-XL，Bak或Bax多肽的局部、部分文獻(xiàn)。取代的變體通常在所述蛋白質(zhì)內(nèi)的一個或多個位點(diǎn)處包含一個氨基酸與另一個氨基酸的互換，并且可以被設(shè)計(jì)成對抗蛋白水解的裂解來調(diào)控所述多肽的一種或多種性質(zhì)(例如穩(wěn)定性)，而不會使其他功能或性質(zhì)造成損失。可以基于所涉及殘基在極性、帶電性、溶解性、疏水性、親水性和/或良性性質(zhì)方面的相似性來進(jìn)行氨基酸取代。優(yōu)選的取代為這樣的取代，該取代是保守性的，即，一個氨基酸被相似形狀和電荷的另一種氨基酸替換。保守性的取代是本領(lǐng)域公知的，并且通常包括在以下范圍內(nèi)的取代甘氨酸、丙氨酸；纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；絲氨酸、蘇氨酸；賴氨酸、精氨酸；以及酪氨酸、苯丙氨酸。在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中，可以在多種結(jié)構(gòu)的相互結(jié)合能力沒有發(fā)生明顯損失的情況下用其他氨基酸取代某些氨基酸，其中所述的多種結(jié)構(gòu)例如有抗體的抗原結(jié)合區(qū)域、底物分子上的結(jié)合位點(diǎn)或者在與所述多肽發(fā)生相互作用的蛋白質(zhì)上的結(jié)合位點(diǎn)。正是由于蛋白質(zhì)的相互作用能力和性質(zhì)定義了蛋白質(zhì)的生物功能活性，所以可以在蛋白質(zhì)序列及其相應(yīng)的DNA編碼序列中進(jìn)行某些氨基酸的取代，并仍獲得具有相似性質(zhì)的蛋白質(zhì)。在進(jìn)行這些變化的過程中，可以考慮氨基酸的親水性指數(shù)。在賦予蛋白質(zhì)以相互作用的生物學(xué)功能過程中，疏水氨基酸指數(shù)的重要性通常被本領(lǐng)域所理解(KyteWa7.,J.Mol.Biol.,JJ7.'105-132，1982)。備選地，可以根據(jù)親水性有效地進(jìn)行相似氨基酸的取代。在賦予蛋白質(zhì)以相互作用的生物學(xué)功能過程中，親水性的重要性通常被本領(lǐng)域所理解(美國專利No.4,554,101)。疏水指數(shù)或親水性在設(shè)計(jì)多肽中的用途在美國專利No.5，691，198中有進(jìn)一步的討論。已經(jīng)鑒定出多種Bcl-2蛋白質(zhì)的3-D結(jié)構(gòu)。術(shù)語"同源物"在本文中廣泛地指功能或結(jié)構(gòu)相關(guān)的分子，包括得自其他物種的那些。例如，已經(jīng)描述了起拮抗劑Bel-2作用的Bcl-2多肽的病毒同源物(White,CellDeathandDifferentiation,":1371-1377，2006)。本文中所參考的"模擬物"包括碳水化合物、核酸或肽模擬物，并且該術(shù)語意指這樣的物質(zhì)，該物質(zhì)具有允許該物質(zhì)作為功能類似物來發(fā)揮作用的構(gòu)象特征。肽模擬物可以為模擬了蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)元件的含肽分子(JohnsonWW.,〃戶ep〃f/e7w/77#/邁6〃"〃^/ofec/w3o/c^7a/2d戶/ar鵬c/,尸ezzwfoa/.,edsChapmanandHall,NewYork,1993)。肽模擬物可以通過針對模擬了Bcl-2多肽功能活性的肽分子來篩選隨機(jī)的肽文庫(例如噬菌體表達(dá)或結(jié)合性文庫)而鑒定得到。備選地，可以使用模擬物設(shè)計(jì)、模擬物合成和模擬物測試。通過蛋白質(zhì)對碳水化合物和脂質(zhì)的識別在許多生物系統(tǒng)中是重要的事件，并且基于碳水化合物和/或脂質(zhì)模擬物(其可以破壞特異性的識別過程)的化學(xué)療法的發(fā)展成為快速出現(xiàn)的領(lǐng)域。核酸模擬物包括(例如)含有N3'--P5'氨基磷酸酯核苷酸間鍵(其替代了天然形成的RNA03'—P5'磷酸二酯基團(tuán))的RNA類似物。酶模擬物包括催化抗體或它們的編碼序列(其還可以為人源化的)?？梢酝ㄟ^鑒定出乾分子的所述殘基(其對于功能而言是重要的)將肽或非肽模擬物作為Bcl-x^Bak或Bax的功能類似物來形成。建模技術(shù)可用于設(shè)計(jì)能夠與靶分子相互作用并且能夠改善藥理學(xué)性質(zhì)的分子。合理性藥物設(shè)計(jì)允許形成所關(guān)注生物活性多肽的結(jié)構(gòu)類似物或者形成小分子的結(jié)構(gòu)類似物，使它們(例如激動劑、拮抗劑、抑制劑或增強(qiáng)劑)與所述的結(jié)構(gòu)類似物相互作用從而塑造出這樣的藥物，該藥物(例如)為所述多肽的更有活性或更穩(wěn)定的形式，或者(例如)能夠在體內(nèi)增強(qiáng)或干擾多肽的功能。例如參見Hodgson(Bio/Technology，義.19-21,1991)。在一種方法中，人們首先要通過NMR光i脊法、x-射線結(jié)晶法、計(jì)算機(jī)建?；蛘咦钔ǔ５氖峭ㄟ^多種方法的組合來測定所關(guān)注蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。關(guān)于多肽結(jié)構(gòu)的有用信息還可以通過基于同源蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行建模來獲得。此外，可以通過丙氨酸掃描法來分析推定的肽或多肽制劑(Wells,MethodsEnzymol.，M么'2699-2705，1991)。在這種技術(shù)中，氨基酸殘基被Ala替代，并測定對所述肽的活性所產(chǎn)生的影響。以這種方式分析所述肽的每一個氨基酸殘基，從而測定所述肽的重要區(qū)域?？紤]該模擬物針對唯BH3蛋白質(zhì)模擬物結(jié)合Bc1-Xl的疏水槽并由此防止Bc1-Xl抑制Bak功能的能力。例如，如在W02006/002474中所公開的那樣，苯甲酰脲衍生物提供了用于與Bc卜2多肽進(jìn)行相互作用的ct螺旋擬肽物質(zhì)的構(gòu)架。在另一實(shí)例中，三聯(lián)苯衍生物提供了BakBH3結(jié)構(gòu)域的oc螺;旋擬肽物質(zhì)，如YinWaA，2005(swpra)所述。此外，還可以分離出通過功能測試方法選擇的靶標(biāo)特異性抗體，然后解析其晶體結(jié)構(gòu)。原則上，這種方法形成了藥物核心，隨后基于所述藥物核心進(jìn)行藥物設(shè)計(jì)?？梢酝ㄟ^針對功能型藥理學(xué)活性抗體來形成抗獨(dú)特型抗體(抗-ids)從而完全繞過蛋白質(zhì)晶體學(xué)。作為鏡像的鏡像，希望抗-ids的結(jié)合位點(diǎn)為原始受體的類似物。然后，可以使用抗-ids來由化學(xué)或生物學(xué)方法形成的多種肽庫的庫中鑒定并分離多種肽。然后，將所選的肽作為藥物核心。簡而言之，可以設(shè)計(jì)或篩選出這樣的模擬物，該模擬物具有增強(qiáng)的活性或穩(wěn)定性，或者可以以更容易和/或更經(jīng)濟(jì)的方法得到。在一些實(shí)施方案中，多種類似物具有增強(qiáng)的穩(wěn)定性和活性，或者具有減小的不利的藥理學(xué)性質(zhì)。還可以對類似物進(jìn)行設(shè)計(jì)，使得它們具有增強(qiáng)的穿越生物膜或僅與特異性底物相互作用的能力。因此，類似物可以保留一些親代分子的功能特征，但是可以具有改進(jìn)的特異性或者能夠?qū)嵤┯糜诒景l(fā)明(即，用于向受試對象進(jìn)行施用)的新的功能。在另一方面中，考慮了激動劑或拮抗劑的類似物。本文所考慮的肽或多肽制劑的類似物包括(但不限于)側(cè)鏈的修飾，在肽、多肽或蛋白質(zhì)合成過程中非天然氨基酸和/或它們的衍生物的摻入，交聯(lián)劑的使用，以及對蛋白質(zhì)分子或它們的類似物施加構(gòu)象限制的其他方法。本發(fā)明所考慮的側(cè)鏈修飾的實(shí)例包括通過以下方法的氨基的修飾，所述的方法例如有還原性烷基化，通過與乙醛反應(yīng)，然后用NaB仏還原；使用甲基乙亞氨酸酯進(jìn)行胺化；使用乙酸酐進(jìn)行乙酰化；使用氰酸酯對氨基進(jìn)行曱氨?；?；使用2，4，6-三硝基苯硫酸(TNBS)對氨基進(jìn)行三硝基苯化；使用琥珀酸酐和四氫鄰苯二曱酸肝對氨基進(jìn)行?；?；以及使用吡噴醛-5-磷酸對賴氨酸進(jìn)行吡嘖化、然后用NaB出還原。精氨酸殘基的胍基可以通過使用諸如2，3-丁二酮、苯曱酰曱醛和乙二醛之類的制劑形成雜環(huán)濃縮產(chǎn)物來進(jìn)行修飾。羧基可以通過形成O-?；愲暹M(jìn)行碳二亞胺活化來進(jìn)行修飾，隨后衍生形成(例如)相應(yīng)的氨基化合物。巰基可以通過以下方法進(jìn)行修飾，所述的方法例如有使用珙乙酸或碘代乙酰胺進(jìn)行羧曱基化；將過甲酸氧化成磺基丙氨酸；使用其他硫醇化合物形成混合的二硫化物；與馬來酰亞胺、馬來酸酐或其他取代的馬來酰亞胺反應(yīng)；使用4-對氯汞基苯曱酸鹽、4-氯汞基苯基硫酸、氯化苯汞、2-氯汞-4-硝基酚和其他汞化物形成汞衍生物；在堿性pH下使用氰酸鹽進(jìn)行曱氨?；Ｉ彼釟埢梢酝ㄟ^以下方法進(jìn)行^修飾，所述的方法例如有使用N-溴代琥珀酰亞胺進(jìn)行氧化或者使用2-羥基-5-硝基芐基溴化物或硫苯基卣化物對p引味環(huán)進(jìn)行烷基化。另一方面，酪氨酸殘基可以通過使用四硝基曱烷進(jìn)行硝化從而形成3-三硝基酪氨酸衍生物來改變。組氨酸殘基的咪唑環(huán)的修飾可以通過使用碘乙酸衍生物進(jìn)行烷基化或者使用焦碳酸二乙酯進(jìn)行N-乙氧羰化來完成。不限于)使用正亮氨酸、4-氨基丁酸、4-氨基-3-羥基-5-苯基戊酸、6-氨基己酸、叔丁基甘氨酸、正纈氨酸、苯基甘氨酸、烏氨酸、肌氨酸、4-氨基-3-羥基-6-曱基庚酸、2-噻吩基丙氨酸和/或氨基酸的D異構(gòu)體。本文所考慮的非天然氨基酸的列表示于表4中。交聯(lián)劑可以用于(例如)穩(wěn)定3D構(gòu)象，可以使用同源雙功能交聯(lián)劑，例如具有(CH2)J'司隔基團(tuán)的雙功能酰亞胺酯，其中n-l至n=6;戊二醛；N-羥基琥珀酰亞胺酯；以及異源雙功能制劑，該異源雙功能制劑通常包含諸如N-羥基琥珀酰亞胺之類的氨基反應(yīng)性部分以及諸如馬來酰亞胺或二硫代部分(SH)、或者碳二亞胺(C00H)之類的另一種特異性反應(yīng)性部分。此外，肽可以通過(例如)摻入Ca和N。-甲基氨基酸以及在氨基酸的C。和Ce原子之間引入雙鍵來進(jìn)行象造限制。考慮能夠調(diào)控細(xì)胞凋亡的經(jīng)構(gòu)象限制的肽，例如在WO2006/00034中所述的唯BH-3蛋白質(zhì)才莫擬物。因此，與Bcl-2蛋白質(zhì)的疏水袋結(jié)合的分子的螺旋構(gòu)象可以通過在序列中兩個氨基酸殘基之間共價(jià)鍵合的連接體來穩(wěn)定。用于本發(fā)明的制劑(例如肽或者小型有機(jī)或無機(jī)分子、碳水化合物、脂質(zhì)或核酸分子)可以容易地與靶向化合物綴合，從而允許直接將制劑傳遞至血小板或血小板前體。合適的靶向制劑是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的，并且包括抗體或其抗原結(jié)合片段?？贵w及其形成以及治療是本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的。用于形成抗體的示例性方案在Coliganefa/"CurrentProtocolsinImmunology"(JohnWiley&Sons,1991)和Ausubel"a/"CurrentProtocolsinMolecularBiology"(1994-1998)中提供?？贵w可以為多克隆或單克隆抗體、片段，包括免疫球蛋白分子的Fv，F(xiàn)ab，F(xiàn)ab'和F(ab02部分?？梢苑奖愕厥褂煤铣傻腇v片段，包括根據(jù)(例如)美國專利No.5,091,513中所述而制備的合成的單鏈Fv片段。其他結(jié)合分子包括一個可變區(qū)結(jié)構(gòu)域(稱為dAb)，或者包含單鏈的微抗體(其包含在美國專利No.5，837，821中所公開的完整抗體的必需元件)。在其他實(shí)施方案中，抗原結(jié)合分子包含針對一個或多個抗原的多結(jié)合位點(diǎn)(例如多scFv)。在其他實(shí)施方案中，抗原結(jié)合分子為由非免疫球蛋白衍生的蛋白質(zhì)框架，其具有針對特定抗原(例如血小板表面蛋白質(zhì)部分)所選的互補(bǔ)決定區(qū)。在另一實(shí)施方案中，考慮了根據(jù)權(quán)利要求1至13的任意一項(xiàng)中所述的用于增強(qiáng)或保持血小板生存能力或壽命期的方法，該方法包括施用一種制劑、或包含式1所示制劑的組合物、或包含選自圖10所示制劑(a)至(d)中的一種制劑的組合物。因此，考慮將細(xì)胞凋亡抑制劑或細(xì)胞凋亡延遲制劑、或者包含這些制劑的組合物用于治療或預(yù)防血小板減少，其中所述的制劑包含式1所列的結(jié)構(gòu)。在另一實(shí)施方案中，考慮將細(xì)胞凋亡抑制劑或細(xì)胞凋亡延遲制劑、或者包含這些制劑的組合物用于增強(qiáng)儲存的血小板的生存能力或存活，其中所述的制劑包含式1所列的結(jié)構(gòu)。在另一實(shí)施方案中，題述制劑被用于保護(hù)用于移植的組織或器官的生存能力。通過本發(fā)明的方法鑒定的分子可以調(diào)控細(xì)胞凋亡。如本文所用，術(shù)語"調(diào)控"是指改變或調(diào)整。因此，細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡的速率可以被改變或調(diào)整。細(xì)胞凋亡的速率可以增大或降低。即，可以使細(xì)胞的壽命更長或更短。備選地或此外，Bcl^蛋白質(zhì)家族成員的水平和/或活性可以被調(diào)控，并且可以被增大或降低。即，可以使Bcl-2家族成員的水平和/或活性更大或更低。所述的分子可以直接或間接調(diào)控細(xì)胞凋亡和/或Bc卜2家族成員的水平和/或活性。例如，所述的分子可以與Bcl-2蛋白質(zhì)家族成員結(jié)合。備選地，所述的蛋白質(zhì)可以與另一種分子結(jié)合，其中所述的另一種分子反過來與Bcl-2蛋白質(zhì)家族成員結(jié)合。例如，所述的分子可以間接調(diào)控細(xì)胞凋亡和/或Bcl-2蛋白質(zhì)家族成員的水平和/或活性。小分子ABT-737為拮抗促存活Bel-Xl的BH3模擬藥物。其選擇性地靶向Bcl-2，Bc卜Xl和Bcl-w，但不會靶向其他促存活蛋白質(zhì)Mcl-l或Al。備選地，所述的分子可以通過與Bel-2蛋白質(zhì)家族下游的另一種分子(例如半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶)結(jié)合來調(diào)控細(xì)胞凋亡。所述的分子可以為Bcl-2蛋白質(zhì)家族成員的激動劑或拮抗劑。如本文所用，術(shù)語"激動劑"是指提高不同分子的活性的分子。術(shù)語"拮抗劑"是指與另一種分子的作用相對抗的分子。因此，所述的分子可以對細(xì)胞凋亡和/或Bcl-2蛋白質(zhì)家族成員的水平和/或活性進(jìn)行正調(diào)節(jié)或負(fù)調(diào)節(jié)。力(特別是哺乳動物細(xì)胞的生存能力，例如在治療或預(yù)防多種疾病)中具有一定的用途。在示意性的實(shí)例中，特別考慮了以下疾病細(xì)胞凋亡介導(dǎo)的疾病、細(xì)胞減少、炎性疾病、自體免疫疾病、破壞性骨病、增殖疾病、傳染性疾病、變性疾病、與細(xì)胞死亡有關(guān)的疾病、酒精過量攝取疾病、病毒介導(dǎo)的疾病、葡萄膜炎、炎性腹膜炎、骨關(guān)節(jié)炎、胰腺炎、哮喘、成人呼吸窘迫綜合征、血管球性腎炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、全身性紅斑狼瘡、硬皮病、慢性甲狀腺炎、Grave疾病、自體免疫胃炎、糖尿病、自體免疫性溶血性貧血、自體免疫性嗜中性白血球減少癥、血小板減少、慢性活性肝炎、重癥肌無力、炎性腸疾病、Crohn疾病、4艮屑病、特應(yīng)性皮炎、瘢痕、移植物抗宿主疾病、器官移植性排斥反應(yīng)、骨質(zhì)疏松癥、白血病和相關(guān)疾病、骨髓增生異常綜合癥、多發(fā)性骨髓瘤相關(guān)性骨疾病、急性髓細(xì)胞白血病、慢性髓細(xì)胞白血病、轉(zhuǎn)移性黑素瘤、Kaposi肉瘤、多發(fā)性骨髓瘤、失血性休克、膿血病、感染性休克、燒傷、志賀氏菌病、Alzheimer疾病、Parkinson疾病、Huntington疾病、朊毒病、腦缺血、癲癇癥、心肌疾病、缺血病、急性和'隄性心臟病、心肌梗塞、充血性心力衰竭、動脈硬化癥、冠狀動脈旁路移植、脊髓性肌萎縮、肌萎縮側(cè)索硬化癥、多發(fā)性硬化癥、HIV相關(guān)腦炎、老化、脫發(fā)、由于中風(fēng)而引起的神經(jīng)損壞、潰瘍性結(jié)腸炎、外創(chuàng)性腦損傷、脊髓損傷、曱型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、庚型肝炎、其他形式的病毒肝炎、藥物(例如樸熱息痛)誘導(dǎo)的肝病、黃熱病、登革熱、日本腦炎、肝病、酒精肝、腎病、多嚢腎病、幽門螺桿菌相關(guān)的胃和十二指腸潰瘍疾病、HIV感染、肺結(jié)核、腦膜炎，以及治療與冠狀動脈旁路移植有關(guān)的并發(fā)癥。更具體而言，通過本發(fā)明的方法鑒定的分子可用于保持器官的生存能力，所述的器官例如(但不限于)腎、心臟和心臟瓣膜、肺、肝臟、皮膚、角膜、血管和其他脈管、骨、腱和其他骨骼肌肉組織、胰腺、腸等。在一些實(shí)施方案中，如此鑒定的分子可用于延長患者或庫存血液中血小板的存活、以及治療或預(yù)防心肌梗塞、再灌注損傷、栓塞性中風(fēng)，從而使神經(jīng)組織的損失最小、預(yù)防在高劑量化療和全身放療之后的腸毒性(粘膜炎)、肝炎和其他形式的肝功能衰竭、以及導(dǎo)致組織損傷(例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、貧血癥、嗜中性白血球減少癥、由于精子生存能力降低而導(dǎo)致的不育、以及由于黑素細(xì)胞損傷而導(dǎo)致的早年白發(fā)(用于頭發(fā)色素細(xì)胞))的炎性疾病。在一些實(shí)施方案中，所述的細(xì)胞為除了血小板細(xì)胞以外的其他細(xì)胞。用于鑒定對Bcl-2蛋白質(zhì)家族成員的水平和/或活性、和/或細(xì)胞凋亡的調(diào)控情況的細(xì)胞，以及待處理或其壽命期有待保持或增長的細(xì)胞可以為包含一種或多種Bel-2蛋白質(zhì)家族成員的任何細(xì)胞(即，多細(xì)胞有機(jī)體中的任何細(xì)胞)。由于Bcl-2蛋白質(zhì)家族成員或其同源物可以在諸如線蟲、小鼠和人之類的有機(jī)體中找到，所以所述的細(xì)胞可以得自任何多細(xì)胞有機(jī)體。因此，所述的細(xì)胞可以得自人或者對于人而言具有經(jīng)濟(jì)重要性和/或社會重要性的哺乳動物，例如除了人以外的食肉動物(例如貓和狗)、豬類(家豬、公豬和野豬)、反芻動物(例如牛、公牛、綿羊、長頸鹿、鹿、山羊、野牛和駱駝)、馬、鳥(包括瀕危的被保持在動物園中的那些種類的鳥)和家禽，并且更具體的馴養(yǎng)家禽例如有雞類，如火雞、小雞、鴨、鵝、珍珠雞等，這是由于它們對于人而言也具有經(jīng)濟(jì)重要性。所述的術(shù)語沒有注明具體的年齡。因此，得自成人和新生有機(jī)體的細(xì)胞應(yīng)被包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。待治療的細(xì)胞可以為具有核的任何細(xì)胞，包括(但不限于)成纖維細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞、肝細(xì)胞、成肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、角化細(xì)胞、間皮細(xì)胞和肌肉細(xì)胞。備選地，所述的細(xì)胞可以為無核的，即，不具有核，因此其不具有DNA。無核細(xì)胞的實(shí)例包括血紅細(xì)胞(紅血球)和血小板(凝血細(xì)胞)。在一些實(shí)施方案中，所述的細(xì)胞缺乏Bcl-2蛋白質(zhì)家族的一種或多種促存活成員。在其他實(shí)施方案中，所述的細(xì)胞缺乏Bcl-2蛋白質(zhì)家族的一種或多種促細(xì)胞凋亡成員。在一些實(shí)施方案中，所述的細(xì)胞為Mcl-1缺陷性細(xì)胞。缺乏所述蛋白質(zhì)的細(xì)胞可以通過本領(lǐng)域已知的方法形成。例如，已知為"基因打斷，，的技術(shù)通過使用突變體等位基因替換所述的基因來選擇性地使其他正常細(xì)胞中的基因失活。已經(jīng)研發(fā)出用于完成諸如酵母和小鼠之類有機(jī)體細(xì)胞的基因打斷(也稱為基因敲除或基因沉默)的有效方法。這些方法依賴于同源重組，其中相似性序列的區(qū)域與DNA節(jié)段互換。"同源重組"是指在同源核苷酸序列位點(diǎn)處兩種核酸分子之間的核酸區(qū)域的互換。插入到細(xì)胞中的外源DNA可以打斷任何基因，這些基因通過互換節(jié)段而至少部分是同源的。如果特定基因的核苷酸序列是已知的，則可以對該基因進(jìn)行打靶。在一些實(shí)施方案中，外源DNA可以定位于靶向構(gòu)建體中。靶向構(gòu)建體為人工構(gòu)建的可以被轉(zhuǎn)移到所選細(xì)胞中的基因材料的節(jié)段。所述的耙向構(gòu)建體可以整合到宿主細(xì)胞基因組中能夠增強(qiáng)或抑制(部分或完全)特定基因表達(dá)的位置處。所述的靶向構(gòu)建體可以使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)的方法制得。例:i口,》口在SambrookandRussell，#o7eci//ar670/7//2fJL36arator/船/7wa7，3rdEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,2001;Ausubel(ed)，(7"rreii1rofoco/s//#o7ec"7ar^.。7^7，5thEdition,JohnWiley&Sons,Inc，NY，2002)中所述的那些。靶向構(gòu)建體的發(fā)展有助于其引入到本發(fā)明方法中使用的細(xì)胞中。用于將靶向構(gòu)建體引入(體內(nèi)或體外)到宿主細(xì)胞中的多種技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并且包括(但不限于)微注射、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移、以及電穿孔。為了調(diào)控細(xì)胞凋亡和/或Bcl-2蛋白質(zhì)家族成員的水平和/或活性，將所述的分子在體外或體內(nèi)與細(xì)胞結(jié)合。將所述的分子與所述的細(xì)胞結(jié)合可以通過本領(lǐng)域已知的方法來實(shí)現(xiàn)。在一些實(shí)施方案中，已經(jīng)從有機(jī)體中分離出所述的細(xì)胞，并將所述的分子與所述的細(xì)胞在體外進(jìn)行結(jié)合。在其他實(shí)施方案中，未從有機(jī)體中分離出所述的細(xì)胞，并將所述的分子與所述的細(xì)胞在體內(nèi)進(jìn)行結(jié)合。所述的分子可以直接與所述的細(xì)胞結(jié)合，即，直接施加到細(xì)胞上。備選地，所述的分子可以間接地與所述的細(xì)胞結(jié)合，即，將所述的分子注入到有機(jī)體的血流中，然后這些血流會將所述的分子帶入所述的細(xì)胞中?？梢圆捎眉?xì)胞測試來鑒定出能夠調(diào)控細(xì)胞凋亡和/或Bel-2蛋白質(zhì)家族成員的水平和/或活性的分子。這種方法包括在測試分子存在下，溫育對細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)分子敏感的細(xì)胞；以及測定未發(fā)生細(xì)胞凋亡的活細(xì)胞的存在情況。如果所述的分子調(diào)控了Bcl-2蛋白質(zhì)家族成員的水平和/或活性，則可以通過測定所述的細(xì)胞是否發(fā)生細(xì)胞凋亡來鑒定該分子。備選地，如果所述的分子調(diào)控了細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，則可以通過測定Bel-2蛋白質(zhì)家族成員的水平和/或活性來鑒定該分子。已經(jīng)發(fā)明了許多不同的方法來檢測細(xì)胞凋亡，所述的方法例如有活體細(xì)胞染料(曙紅、臺盼藍(lán)、阿爾瑪藍(lán))的吸收情況、TUNEL(TdT介導(dǎo)的dUTP切口末端標(biāo)記)分析、ISEL(原位末端標(biāo)記)、以及用于檢測細(xì)胞群或單個細(xì)胞中DNA片段的DNA梯帶分析、測定質(zhì)膜變化情況的Annexin-V染色、細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白質(zhì)(例如半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶)的檢測(包括半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的活性或活化作用)、Bel-2家族蛋白質(zhì)、p53、Fas和FADD。這些都是技術(shù)人員所知的技術(shù)。類似地，用于檢測Bcl-2蛋白質(zhì)家族成員的水平和/或活性的許多方法是技術(shù)人員已知的。例如，可以通過(例如)層析技術(shù)由細(xì)胞中純化出蛋白質(zhì)，并將該蛋白質(zhì)與由尚未經(jīng)歷本發(fā)明方法的細(xì)胞中純化得到的蛋白質(zhì)相比較?？梢詫⒈景l(fā)明的小型或大型化學(xué)制品、多肽、核酸、抗體、肽、化學(xué)類似物或模擬物配制到根據(jù)常規(guī)的藥物配混技術(shù)制備得到的藥物組合物中。例如參見Remington'sPharmaceuticalSciences,18thEd.(1990，MackPublishing,Company,Easton，PA，U.S.A.)。所述的組合物可以包含活性制劑或者該活性制劑的可藥用的鹽。這些組合物除了包含一種活性物質(zhì)以外，還包含可藥用的賦形劑、栽體、緩沖劑、穩(wěn)定劑或本領(lǐng)域已知的其他材料。這些材料應(yīng)該是無毒的，并且不應(yīng)該干擾所述活性組分的效力。才艮據(jù)施用(例如靜脈內(nèi)、口服、鞘內(nèi)、神經(jīng)外膜或胃腸外)所需的制備物的形式，所述的栽體可以采取多種形式。對于口服施用而言，可以將所述的化合物配制到固體或液體制備物中，例如膠嚢、丸劑、片劑、錠劑、粉末、懸浮液或乳液。在制備口服劑型的所述組合物的過程中，可以使用任何可用的藥物介質(zhì)，例如，在口服液體制備物(例如懸浮劑、酏劑和溶液)的情況下為水、乙二醇、油、酒精、調(diào)味劑、防腐劑、著色劑、懸浮劑等；或者在口服固體制備物(例如粉末、膠嚢和片劑)的情況下為諸如淀粉、糖、稀釋劑、顆粒劑、潤滑劑、粘結(jié)劑、分解劑之類的載體。由于片劑和膠嚢在施用時具有方便性，所以片劑和膠嚢代表了最有利的口服劑量單元的形式，在這種情況下顯然可以使用固體藥物載體。如果需要的話，可以通過標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)對片劑進(jìn)行糖包衣或腸包衣?？梢詫⒒钚灾苿┠曳馄饋?，從而使其穩(wěn)定地通過胃腸道，同時4吏其通過血腦屏障。例如參見國際專利公開No.W096/11698。對于胃腸外施用而言，可以將所述的化合物溶解于藥物載體中，并以溶液或懸浮液的形式施用。示例性的合適的栽體為水、鹽、右旋糖溶液、果糖溶液、乙醇、或者動物油、植物油或合成來源的油。所述的載體還可以包含其他組分，例如防腐劑、懸浮劑、增溶劑、緩沖劑等。所述的活性制劑優(yōu)選的是以治療有效量進(jìn)行施用。施用的實(shí)際量以及施用的速率和時間過程取決于待治療疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度。治療處方(例如所決定的劑量、時間選擇等)是在普通從業(yè)者或?qū)I(yè)人員的責(zé)任范圍內(nèi)，并且通常要考慮待治療的疾病、個體患者的狀況、遞送的位置、施用的方法以及從業(yè)者已知的其他因素。技術(shù)和方案的實(shí)例可以在Remington'sPharmaceuticalSciences,備選地，靶向療法可以用于通過使用諸如抗體或細(xì)胞特異性配體、遞送載體或模型位點(diǎn)之類的靶向系統(tǒng)來將活性制劑以更加特異性的方式遞送至產(chǎn)生或蓄積血小板的組織，例如骨髓、肺、脾、血管系統(tǒng)。鑒于多種原因，靶向是合乎需要的，所述的原因例如為如果所述的制劑具有不可接受的毒性，或者如果在其他情況下需要非常高的劑量，或者在其他情況下所述的制劑不能進(jìn)入靶細(xì)胞中，則可以避免靼向才幾體的其他區(qū)域。不釆用直接施用所述的那些制劑，則所述的制劑可以在靶細(xì)胞中形成，例如在病毒載體(例如上文所述的那些)或者在基于細(xì)胞的遞送系統(tǒng)(例如在美國專利No.5，550，050以及國際專利公開No.WO92/19195，WO94/25503，WO95/01203,WO95/05452，WO96/02286，WO96/02646，WO96/40871,WO96/40959和WO97/12635中所述的那些)中形成。所述的栽體可以被靶向至目標(biāo)細(xì)胞中，或者表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)被限定在特定的細(xì)胞、發(fā)育階段或細(xì)胞周期階段中。將基于細(xì)胞的遞送系統(tǒng)設(shè)計(jì)成植入到患者體內(nèi)的所需靶位置處，并且所述的基于細(xì)胞的遞送系統(tǒng)包含用于靶制劑的編碼序列。備選地，所述的制劑可以以前體形式施用，該前體形式通過由待治療細(xì)胞產(chǎn)生的活化制劑或者通過被靶向到待治療細(xì)胞中的活化制劑而轉(zhuǎn)換成活性形式。例如參見歐洲專利申請No.0425731A和國際專利公開No.WO90/07936。根據(jù)本發(fā)明的所述方面，可以使用包含5c/-1，勘i:或&,多核苷酸的基因組合物處理表現(xiàn)出經(jīng)修飾的5c/-i，^i:或"^基因序列的受體對象的細(xì)胞。向具有突變體或改變形式的基因的細(xì)胞提供野生型或經(jīng)增強(qiáng)的Bel-xL，Bak或Bax功能，在這種情況下，會彌補(bǔ)所述的缺陷?？梢詫⑤d體中的野生型等位基因引入到細(xì)胞中，使得所述的基因保持在染色體外。備選地，可以使用人工染色體。通常，所述的載體可以與宿主基因組結(jié)合，并在其中表達(dá)。根據(jù)通常接受的方法(例如由Friedman(In:7力ei"ap/尸orCe"e〃c"/sea5"e，T.Friedman,Ed.，OxfordUniversityPress,pp.105-121,1991)或Culver(Ce/7er力erap/..爿尸r/邁er尸orP力y"'ci'a/2S，2ndEd.,MaryAnnLiebert，1996)所述)進(jìn)行基因治療。合適的載體是已知的，例如在美國專利No.5,252,479、國際專利公開No.W093/07282和美國專利No.5,691,198中公開的那些。本領(lǐng)域已知的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)可用于實(shí)施本發(fā)明的基因治療方法。這些方法包括病毒和非病毒轉(zhuǎn)移方法。非病毒基因轉(zhuǎn)移方法是本領(lǐng)域已知的，例如化學(xué)技術(shù)(包括磷酸鈣共沉淀)、機(jī)械技術(shù)(例如微注射)、通過脂質(zhì)體而進(jìn)行的膜融合介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移、DNA的直接攝取、受體介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移以及核轉(zhuǎn)染。病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移可以與采用脂質(zhì)體進(jìn)行遞送的體內(nèi)直接基因轉(zhuǎn)移相結(jié)合。在基因治療方法中的表達(dá)載體是指包括這樣的構(gòu)建體，該構(gòu)建體含有足以表達(dá)多核苷酸的序列，而所述的多核苷酸已經(jīng)在所述的栽體中被克隆。在病毒表達(dá)載體中，所述的構(gòu)建體包含足以支持包裝該構(gòu)建體的病毒序列。如果所述的多核苷酸編碼了(例如)Bcl-xu則表達(dá)將會產(chǎn)生Bcl-x"如果所述的多核苷酸編碼了正義或反義多核苷酸或核酶或DNA酶，則表達(dá)將會產(chǎn)生正義或反應(yīng)多核苷酸或核酶或DNA酶。至此，就這一點(diǎn)而言，表達(dá)并非必須使蛋白質(zhì)產(chǎn)物被合成。除了被克隆到表達(dá)栽體中的多核苷酸以外，所述的載體還包含在真核細(xì)胞中有功能的啟動子。所克隆的多核苷酸處于該啟動子的控制之下。通常，合適的真核啟動子是確定的?？梢酝ㄟ^使DM通過聚賴氨酸與蛋白質(zhì)配體綴合來實(shí)現(xiàn)受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。根據(jù)相應(yīng)配體受體在靶類型的細(xì)胞/組織的細(xì)胞表面上的存在情況來選擇配體。肝細(xì)胞表面上的受體可以有利地被靶向。如果需要的話，可以將這些配體-DNA綴合物直接注射到血液中，并定向于耙組織，在此形成受體結(jié)合以及DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體的內(nèi)化。為了克服DNA在細(xì)胞內(nèi)被破壞的問題，可以包含與腺病毒共感染，從而石皮壞內(nèi)涵體的功能。在本發(fā)明的其他相關(guān)方面中，已經(jīng)確定，Bcl-x"Bak或Bax的水平或活性的改變對血小板的存活具有深刻的影響。因此，目前可以通過針對Bc1-Xl和/或Bak和/或Bax的水平或活性的變化情況、或者萬c/-i和/或^i:和/或A2J基因的特異性突變或畸變情況(例如曱基化事件)，來監(jiān)測受試對象，從而對與低于正?；蚋哂谡５难“鍞?shù)量有關(guān)的狀況的易感性進(jìn)行診斷。術(shù)語"基因"以其最廣泛的含義使用，并且包括與基因的外顯子相對應(yīng)的cDNA。本文所指的"基因"還被用來包括以下方面(i)由轉(zhuǎn)錄和/或翻譯調(diào)節(jié)序列和/或編碼區(qū)和/或非翻譯序列(即，內(nèi)含子、5，-和3，-非翻譯序列)構(gòu)成的傳統(tǒng)基因組基因；或者(n)與基因的編碼區(qū)(即，外顯子)和5，-和3，-非翻譯序列相對應(yīng)的mRNA或c親。失去Bcl-x^，Bak或Bax功能。在一些實(shí)施方案中，基因中的修飾會影響轉(zhuǎn)錄、翻譯或翻譯后加工，并因此會影響B(tài)cl-x"Bak或Bax的水平或活性。在一些實(shí)施方案中，Ac/-z中的突變位于BH4和/或BH1，BH2或BH3編碼結(jié)構(gòu)域中；^i:或Asi中的突變位于BH1，BH2或BH3結(jié)構(gòu)域中。有多種突變檢測篩選方法是可利用的，這些方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的。可以使用允許在測試核酸序列與對照核酸序列之間進(jìn)行精確對比的任何方法。掃描方法包括測序、變性梯度凝膠電泳(DGGE)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP和rSSCP，REF-SSCP)、化學(xué)裂解方法(例如CCM、ECM、DHPLC和MALDI-TOFMS)、以及DNA芯片技術(shù)。用于篩選預(yù)定突變的特異性方法包括等位基因特異性寡核苷酸法(ASO)、等位基因特異性擴(kuò)增法、竟?fàn)幮怨押塑账嵋锓?、寡核苷酸連接測試、堿基特異性引物延伸、斑點(diǎn)印跡測試以及RFLP-PCR。這些方法和其他方法的優(yōu)勢以及弱點(diǎn)在Sambrook，C力a;7"rU，M/eci//ar"0/2//^，2001中有所綜述。此外，甲基化鑒定測定法是本領(lǐng)域已知的，該方法用于檢測5-甲基胞嘧夂是最有利的，如在Rein""，NucleicAcidsResearch,26(10):2255—2264，1998中所綜述的那樣。此外，胞嘧啶甲基化的檢測在國際公開No.WO00/70090和WO03/000926中有所描述。本發(fā)明提供了診斷受試對象中與血小板減少或血小板增多有關(guān)的狀況的方法，并且本發(fā)明進(jìn)一步提供了測定受試對象發(fā)展出這些狀況的易感性的、基于基因或蛋白質(zhì)的方法。本發(fā)明的診斷和預(yù)后方法檢測和估計(jì)了在野生型^7-1和/或Asir和/或A3i基因或座位中的畸變情況，從而確定是否產(chǎn)生了經(jīng)修飾的多肽，或者多肽是否是過度產(chǎn)生的或是產(chǎn)生不足的。在基因或座位中的術(shù)語"畸變"涵蓋了所有形式的突變，包括在編碼區(qū)和非編碼區(qū)的缺失、插入、點(diǎn)突變和取代。所述的畸變還包括基因甲基化模式的變化。點(diǎn)突變可以形成終止密碼子、移碼突變或氨基酸取代。體細(xì)胞突變是指僅在某些組織(例如在腫瘤組織中)中發(fā)生但不會在種系中遺傳的那些突變。種系突變可以在任何機(jī)體組織中發(fā)現(xiàn)并且是遺傳性的?？梢葬槍θfc/-x和/或勘i:和/或^x基因中的突變情況測試人或其他哺乳動物的任何組織，來查明易染與血小板減少或血小板增多有關(guān)的狀況的體質(zhì)?？梢酝ㄟ^測試得自受試對象機(jī)體的任何組織的DNA來測定突變情況。此外，可以通過針對5c7-z和/或Asi:和/或Ax基因的突變情況測試胎兒細(xì)胞、胎盤細(xì)胞或羊水，從而完成出生前的診斷?？梢酝ㄟ^多種手段檢測野生型等位基因的變化情況(例如通過點(diǎn)突變、缺失或曱基化)。用于檢測5c/i和/或勘l和/或勘^基因中畸變情況的有用的診斷技術(shù)包括(但不限于)熒光原位雜交(FISH)、PFGE分析、DM印跡分析、斑點(diǎn)印跡分析和PCR-SSCP。此外，DNA微芯片技術(shù)是有用的。直接DNA測序(人工測序或自動化熒光測序)可以檢測序列的變化情況。另一種方法為單鏈構(gòu)象多態(tài)性測試方法(SSCP)(Oritae"厶，Proc.Nat.Acad.Sci.USA,2776-2770，1989)。這種方法可以最優(yōu)化地檢測出大部分的DM序列變化。在研究的基礎(chǔ)上，SSCP方法的這種可以發(fā)生的、增大的通量使得其成為有吸引力的且可行的備選方法來指導(dǎo)用于突變檢測的測序。然后，對在SSCP凝膠上流動性發(fā)生變化的片段進(jìn)行測序，從而確定DNA序列變化的確切性質(zhì)。其他基于兩條互補(bǔ)DNA鏈之間錯配的檢測情況的方法包括夾板變性凝膠電泳(CDGE)(Sheffield<3人，Am.J.Hum.Genet.，'699-706，1991)、異源雙鏈體分析(HA)(Whiteefa/.，Genomics,7么'301-306，1992)以及化學(xué)錯配裂解法(CMC)(GrompeWa人，Pro"Natl.Acad.Sci.USA，仏.5855-5892，1989)?？梢詸z測出調(diào)節(jié)區(qū)域中的突變情況或者可能包含大的缺失、重復(fù)或插入的其他方法包括蛋白質(zhì)截?cái)鄿y試法或不對稱測試法。檢測DNA序列變化情況的方法的綜述可以在Grompe(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,《《.5855-5892，1993)中找到。其他用于證實(shí)野生型或突變體5c7-i和/或^i:和/或^si等位基因的測試方法有變性梯度凝膠電泳(DGGE)(Wartelle〃人，Nucl.AcidsRes.，7&'2699-2705，1990;Sheffield3人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，《《'232-236，1989);核糖核酸酶保護(hù)測試(Finkelsteine"人，Genomics,7..167-172,1990;Kinszlere"厶，Science,1366-1370,1991);變性HPLC;等位基因特異性寡核苷酸法(ASO雜交)(Conner"a/.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,^.'278-282，1983);識別核苷酸錯配的蛋白質(zhì)(例如Acoh'突變S蛋白質(zhì))的使用(Modrich，Ann.Rev.Genet"229—253，1991);以及等位基因特異性PCR(RuanoWa/.,Nucl.Acids.Res.",8392，1989)。對于等位基因特異性PCR而言，使用了與具體序列的3，末端雜交的引物。如果不存在特定的突變，則觀察不到擴(kuò)增產(chǎn)物。此外，還可以使用擴(kuò)增受阻突變體系(ARMS),如在歐洲專利公開No.0332435和Newtowna/.(Nucl.Acids.Res.77..2503—2516，1989)中公開的那些。此外，還可以使用等位基因特異性探針篩選通過使用PCR或其他擴(kuò)增反應(yīng)擴(kuò)增得到的5c/i和/或"ai:和/或化i基因的核酸序列。這些探針為核酸寡聚體，每一個寡聚體都包含具有已知突變的基因序列的區(qū)域。通過使用等位基因特異性探針池，可以篩選PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，從而鑒定出Ac/-x和/或^ir和/或A^基因中之前鑒定的突變的存在情況?？梢栽?例如)尼龍過濾器上進(jìn)行等位基因特異性探針與所擴(kuò)增的Ac/i和/或Air和/或"az序列的雜交。在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下與特定探針發(fā)生的雜交表明，在所述組織中，與等位基因特異性探針相同的突變的存在。此外，微芯片技術(shù)可用于本發(fā)明。在這些技術(shù)中，在位于硅芯片或其他固體支承體(例如聚合物薄膜或栽玻片)上的陣列中，建立數(shù)千種不同的寡核普酸或cDNA探針。使用報(bào)告分子(例如焚光標(biāo)記)對待分析的核酸進(jìn)行標(biāo)記，然后使該核酸與芯片上的探針雜交。還可以使用這些核酸微芯片來研究核酸-蛋白質(zhì)的相互作用情況。使用這些技術(shù)，人們可以測定所分析的核酸序列中突變的存在情況，或者人們可以測定所關(guān)注的一種或多種基因(例如編碼生物化學(xué)途徑中的產(chǎn)物的基因)的表達(dá)水平。所述的技術(shù)在多種出版物(包括Haciae"/.(NatureGenetics,K:441-447，1996)和Shoemakerefs/.(NatureGenetics,",450-456，1996))中有所描述。此外，還可以4十對野生型Bcl-x，Bak或Bax蛋白質(zhì)的變化進(jìn)行篩選來鑒定野生型"c/i和/或&1和/或"a義基因的變化情況。例如，可以使用與Bcl-x,Bak或Bax發(fā)生免疫反應(yīng)的單克隆抗體來由受試對象中篩選樣品。水平、大小上的變化或者關(guān)聯(lián)抗原的缺乏表明了突變情況。此外，還可以使用對突變體等位基因產(chǎn)物具有特異性的抗體來檢測突變體基因產(chǎn)物?？梢栽诒绢I(lǐng)域已知的任何方便的形式下進(jìn)行所述的免疫學(xué)檢測。這些檢測包括蛋白質(zhì)印跡、免疫組織化學(xué)測試、以及ELISA和RAPID測試。在免疫測試中使用單克隆抗體是特別優(yōu)選的，這是由于具有大量且均質(zhì)產(chǎn)生這種抗體的能力。用于產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系制備物可以通過將永生細(xì)胞系與淋巴細(xì)胞(其被免疫制備物(即，包括Bc卜Xl，Bak或Bax多肽)所敏化)融合而得到，或者可以通過本領(lǐng)域的技術(shù)人員所公知的技術(shù)來得到。(例如參見Doui1lardWa厶，BasicFactsaboutHybridomas，in(7o邵e/2fl7M/o尸/邁/z7w70/057Vol.II，ed.bySchwartz,1981;Kohlera/.，Nature,^^..495—499，1975;Kohlera/.，EuropeanJournalofImmunology,<5>511-519，1976)。在另一方面中，本發(fā)明提供了特別用于發(fā)展或測試本文所述的制劑的、經(jīng)修飾的動物或細(xì)胞。經(jīng)基因修飾的動物(例如本文所述的PLT20或PLT16突變體)及其細(xì)胞提供了敏化系統(tǒng)，以便研究在缺失Be1-2/Bak/Bax途徑的情況下，一系列細(xì)胞凋亡修飾劑的作用。細(xì)胞或構(gòu)建體可以冷凍儲存，并且可以與使用說明書一起售出。在一些實(shí)施方案中，所述的經(jīng)修飾的動物為經(jīng)基因修飾的，包括在促存活或促細(xì)胞凋亡基因、或者Ac/-^化l或^i基因中的突變，例如功能部分損失的突變。術(shù)語"經(jīng)基因修飾的"是指基因組的水平發(fā)生變化，在本文中是指這樣的細(xì)胞或動物，該細(xì)胞或動物在其基因組內(nèi)含有一個或多個已經(jīng)改變的特定基因。備選的情況可以為單個堿基的變化，例如點(diǎn)突變，或者可以包括通過多種技術(shù)(例如采用了同源重組的那些)而得到的基因的整個部分的缺失?；蛐揎棸ㄕ{(diào)節(jié)區(qū)域的改變、其他多個拷貝的內(nèi)源或外源基因的插入、使用外源基因或基因區(qū)域的插入或取代、等等。因此，改變包括由多個核酸形成的單一的插入、缺失、取代或它們的組合，從而導(dǎo)致基因的功能受到部分損失?？梢允褂镁哂幸粋€或多個經(jīng)修飾的等位基因的細(xì)胞和動物作為模型系統(tǒng)，來研究基因產(chǎn)物的作用和/或在這些功能受到損傷時來測試具有治療制劑潛力的物質(zhì)。可以在整個動物的突變形成后，或者在種系細(xì)胞或受精印經(jīng)過處理后來選擇用于測試治療制劑的動物。在測試物質(zhì)被施加到細(xì)胞中后，測定細(xì)胞的表現(xiàn)型?？梢詫?xì)胞的任何特征進(jìn)行評估。因此，經(jīng)基因修飾的動物或細(xì)胞包括得自轉(zhuǎn)基因動物，"基因敲入"或"基因敲除"的動物，條件變體或其他突變體或容易受到共抑制、基因沉默或RNAi的引入的影響的細(xì)胞或動物。方便地，最初使用靶向基因構(gòu)建體來在細(xì)胞或有機(jī)體中產(chǎn)生經(jīng)修飾的基因序列。靶向構(gòu)建體通常但不會專門地通過同源重組來修飾靶序列。備選地，可以使用人工染色體來引入經(jīng)修飾的基因序列。使用本領(lǐng)域公知的方法來產(chǎn)生打靶構(gòu)建體或其他構(gòu)建體，并將這些構(gòu)建體引入到目標(biāo)細(xì)胞中，其中所述的方法在分子生物學(xué)試驗(yàn)指南(例i口Sambrook，#o/eci/7arC/o/^'/^v^Za6oratoiy#a/7i/<2/，3rdEdition,CSHLP，CSH，NY,2001;Ausubel(Ed)Cwrre/2t戶ro&co"/刀#。/ecw/ar腸/ow，5thEdition,JohnWiley&Sons,Inc，NY，2002)中有所描述。使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)來形成經(jīng)基因修飾的有機(jī)體，其中所述的4支術(shù)在(例j口)Hogana入,^a/7/;u/a"'/7gf力eMoi/se^z/6r/o.'JL26ar"or/他/7wa/，ColdSpringHarbourLaboratoryPress,CSHNY,1986;Mansour"a/.，Nature,，348-352，1988;Pickert，7>a/75^e/7/cj/72'邁a/7bc/加/owJZa6or"or/〃s7^ooir，AcademicPress,SanDiego，CA，1994中有所描述。本發(fā)明提供了產(chǎn)生經(jīng)基因修飾小鼠突變體的方法，該方法包括使用所述的技術(shù)修飾本文所述的小鼠突變體。通過以下非限定實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明。實(shí)施例1哞的iTf^致j&V、炎減^'在野生型小鼠中，進(jìn)行全基因組突變篩選(KileWa人，Nat.Rev.Genet.，6557-567，2005)，以鑒定出導(dǎo)致血小板減少的突變。使用化學(xué)誘變劑N-乙基-N-亞硝基脲(ENU)處理雄性BALB/c小鼠，并使該小鼠與未經(jīng)處理的BALB/c雌鼠交配。在7周齡時，將第一代(GJ后代小鼠放血，并在第9周時，將表現(xiàn)出循環(huán)血小板數(shù)量低于900xlOVjLiL(正常范圍的下限)的小鼠再次放血。多只G:小鼠表現(xiàn)出持續(xù)的血小板減少(參見圖1A),通過使這些小鼠與野生型BALB/c小鼠交配來測試各種情況下這些小鼠的遺傳可能性。在7周齡時，將得自上述交配小鼠的G2后代放血，并且證實(shí)5代譜系都存在血小板數(shù)量低的動物分離出了導(dǎo)致血小板減少(~600x10ViaL)的可遺傳的顯性突變(參見表6)。通過標(biāo)準(zhǔn)的定位克隆方法，將這些突變中的兩個突變(表示為戶/W。和/V〃"定位于2號染色體的遠(yuǎn)端。精細(xì)定位分別將(參見圖1B)和/V〃f(參見圖1C)的候選區(qū)域精確于16.3和1.9Mb的重疊區(qū)間。對候選基因的外顯子和拼接連接區(qū)域進(jìn)行直接測序，并在得自尸"M(參見圖1D)和戶/〃6(參見圖1EH普系的受影響動物中鑒定出^/-i基因中的突變。在？〃M的情況下，預(yù)示出A-至-G的轉(zhuǎn)變，從而導(dǎo)致在Bel-Xl的第15個殘基處半胱氨酸取代了酪氨酸(其為Ac7-;r座位編碼的主要蛋白質(zhì))。在尸/"6的情況下，預(yù)示了T-至-A轉(zhuǎn)換的突變，從而導(dǎo)致在殘基182位處天冬酰胺取代了異亮氨酸。實(shí)施例2^/-/'"。和^/-/""小處類似，萬c/-力^潛^V、篇A乂益小我減，種Bcl-xL(Boise"a/.，1993)為Bc卜2蛋白質(zhì)家族(其調(diào)節(jié)了發(fā)展中的程序性以及應(yīng)激誘導(dǎo)性的細(xì)胞死亡，包括Bcl-2，Bc卜w，Mc卜l和Al)的促存活成員(Adams，2003(卿ra);Daniale/1a入，2004(s叩ra))。由具有"c/-x的戶〃i^和尸/〃6等位基因的小鼠所表現(xiàn)出的血小板減少表明，Bc1-Xl有助于保持血小板的數(shù)量。為了證實(shí)Bel-Xl的作用，消除5c/i基因的其他缺陷(例如異常剪接、顯性活化)并排除導(dǎo)致血小板減少的連接的ENU誘導(dǎo)的突變，對經(jīng)過特異性改造而缺乏Bc1-Xl的動物進(jìn)行檢測(Motoyamaeta/，Science,繞1506-1510，1995)。^;/-/—小鼠發(fā)育正常,并以所期望的孟德爾頻率出生(Motoyamaefa/，1995(sw/7/a))。與和/〃""小鼠類似，動物與野生型動物(~1，100xlOVpL)相比，表現(xiàn)出血小板數(shù)量明顯降低(860xlOViaL)，從而證明"c/-;r的單倍劑量不足會導(dǎo)致血小板減少(參見圖2A)。與&/-/""http://;""動物(只觀察到有較少的這種動物出生)和"c/-yz—小鼠(其在懷孕中期死亡(Motoyama""，1995)不同，&/-//",'"小鼠以所期望的孟德爾頻率出生，并存活至至少6個月齡，由此表明Ac7-z的這種等位基因?yàn)橄滦У任换?hypomorphic)，而不是功能的完全損失。除了脾臟紅血球生成溫和升高以外(數(shù)據(jù)未示出)，萬c/-/，w^小鼠在造血區(qū)間內(nèi)未顯示出任何其他的顯著異常(參見表6)，并且與具有"c7-z的其他等位基因的動物(Kasai"".，DevBiol雄202-216，2003)截然不同的是，雄鼠是可生育的，從而表明精子的形成沒有被明顯的損害。值得注意的是，純合子小鼠中的血小板數(shù)量被進(jìn)一步減少至野生型同窩出生小鼠血小板數(shù)量的大約25%(參見表6),由此表明，就血小板數(shù)量而言，Bcl-XL增加的減少形成了表現(xiàn)型梯度。血小板減少并非為類Bc卜2促存活蛋白質(zhì)失活的一般結(jié)果與化/-i突變體小鼠不同，在"c/-/A，^7-#/_和#^-廣—動物中血小板的數(shù)量是正常的(參見圖2A)。實(shí)施例3在萬c/ij^f伴V、厲哞^V、我清餘^遽羋增義在5c/i突變體小鼠的骨髓和脾中充沛的巨核細(xì)胞生成駁斥了血小板生成缺陷為血小板減少的主要原因的說法。在小鼠和5c/-/〃w"e同窩出生小鼠中，巨核細(xì)胞祖細(xì)胞的數(shù)量是正常的(數(shù)據(jù)未示出)。在andSc/-y〃""小鼠中，成熟的巨核細(xì)胞少量增多，而在S"-f^純合子小鼠中，成熟的巨核細(xì)胞微量增多(數(shù)據(jù)未示出)。在所有^/i突變體小鼠中，它們在形態(tài)學(xué)上是正常的，并且表現(xiàn)出與野生型配對鼠相似的倍性概況(數(shù)據(jù)未示出)。此外，得自突變體小鼠的巨核細(xì)胞祖細(xì)胞在體外并非傾向于自發(fā)的細(xì)胞凋亡，并且與野生型配對鼠相同，在體內(nèi)，它們都會由應(yīng)激誘導(dǎo)的血小板減少中頑強(qiáng)地恢復(fù)過來(數(shù)據(jù)未示出)。這些數(shù)據(jù)表明，"c7-i的突變不會明顯地?fù)p害血小板的生成。檢測脾臟隔離的增加是否會造成血小板數(shù)量的減少。然而，由純合子^卜/"^，小鼠中移出脾臟僅會部分地校正血小板減少(由367±41至516±63x10ViliL,與野生型同窩出生小鼠中的1，279±200至1，650±136x107pL相對比)，表明異常的脾臟功能不能從根本上造成血小板數(shù)量低。然后，檢測Bcl-i在其作為促存活調(diào)節(jié)劑的能力中是否會直接影響血小板的命運(yùn)。已經(jīng)詳盡論述，Bcl-xt功能發(fā)生降低的血小板可能會在成熟前死亡，然后與野生型血小板相比，這些血小板會以盡快的速率由血液中除去。通過跟蹤體內(nèi)生物素標(biāo)記的血小板的命運(yùn)(Aultet".,Exp.Hematol.，":996-1001，1992),確定5c/-/膀的突變會以劑量依賴的方式減少血小板的半衰期(參見圖2B)。肋/t的一個突變體等位基因會使正常血小板的半衰期(t1/2)降低約50%(~57h至24h)，，而兩個等位基因的突變會引起t^進(jìn)一步降低至小于12h(參見圖2B)。類似地，得自萬c/-/〃，和Z小鼠的血小板還表現(xiàn)出血小板的壽命期縮短(參見圖2C)。為了證明在由循環(huán)半衰期所反應(yīng)的血小板固有性質(zhì)中發(fā)生的那些變化，進(jìn)行了交互性過繼轉(zhuǎn)移。在SO州"。和/'","。血小板轉(zhuǎn)移到野生型受者中后，與野生型血小板相比，這些血小板的清除速率更快(參見圖2D),并且這些血小板與在未經(jīng)處理的小鼠中所見到血小板半衰期是不可區(qū)分的。與此相反，轉(zhuǎn)移到"c/-x+/+，"c7-//w"tf或AW","。小鼠中的野生型血小板的清除是相同的，而與受者的表現(xiàn)型無關(guān)(參見圖2D)。通過使用噻唑橙(其為一種充滿RNA的"網(wǎng)狀"幼嫩血小板的標(biāo)記物)進(jìn)行染色來檢測循環(huán)血小板的年齡概況(Aultefa7.，1992Kienast"".，1990(卿ra))。&/-義中戶/"〃和？/〃f的突變使得陽性細(xì)胞的比率以劑量依賴的方式增加(參見圖2B),從而表明具有這些突變的小鼠中血小板群是相對幼嫩的。這與它們縮短的整體壽命期一致。在"c/-/州"?；騘/-/"靡"。小鼠中，網(wǎng)狀血小板的絕對數(shù)量與野生型小鼠中的網(wǎng)狀血小板的絕對數(shù)量相當(dāng)(參見圖2F),再次支持了*/-^的突變不會顯著損壞血小板生成的結(jié)論(參見表6，數(shù)據(jù)未示出)。實(shí)施例4/，和Ac/-/，^f炎與^7-y,-小鼠相反的是，純合子/諸詢。小鼠中，不發(fā)生嚴(yán)重的早期發(fā)育缺陷的情況證明，在大多數(shù)類型的細(xì)胞中必需具有足量的Bc卜xt以保持存夠的存活。戶〃"和戶""突變都不會直接影響B(tài)el-Xl的BH3結(jié)合槽(參見圖3A)(對于功能而言，該結(jié)合槽為重要的區(qū)域)(Adams，2003(sw;7rs);Liu"a/.，2003(sw/7ra);Sattlere"入，Science,"J:983-986，1997)。與所述的情況相一致，在很大程度上，突變體Bcl-^蛋白質(zhì)與細(xì)胞凋亡的必要下游介質(zhì)(Bax或Bak)的結(jié)合能力(Chenge"人，2001(卿ra)jUndstenWa/.，2000(w/7ra))表現(xiàn)為并未受到影響(參見圖3B)。當(dāng)突變體Bcl-^蛋白質(zhì)在細(xì)胞系(包括永生Ac/-Z—小鼠胚胎成纖維細(xì)胞)中過表達(dá)時，該蛋白質(zhì)不具有組成型的細(xì)胞毒性，相反，與野生型Bc1-Xl相比，該蛋白質(zhì)是不穩(wěn)定的(數(shù)據(jù)為示出)。同樣地，測定到，在得自小鼠的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)中，內(nèi)源性全長Bel-XL的穩(wěn)定性(正常"~18h)會適度地降低(U~12h)(參見圖3C)。甚至在^^-,，〃"細(xì)胞中的內(nèi)源性Bcl-^的基礎(chǔ)水平也發(fā)生降低，這與這種待降解的Bel-^突變體形式的傾向性一致(參見圖3C，7A)。有趣地是，由于Bc1-Xl和Mc1-1(其為促細(xì)胞凋亡Bak的兩種限制物(Willisefa人，2005(i^;ra)))在經(jīng)過環(huán)己酰亞胺處理后均發(fā)生降解(參見圖3C),所以當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的合成受到抑制時，Bcl-^的不穩(wěn)定會特異性地敏化MEF發(fā)生細(xì)胞凋亡(參見圖3D,7B，8B)。與此相反，在經(jīng)過上述處理后甚至24h仍保持有Bak。由于對于Bak介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡而言，需使所述的兩種促存活蛋白質(zhì)(Bc1-Xl和Mcl-l)失活(WillisWa人，2005),所以穩(wěn)定性更強(qiáng)的野生型Bcl-xL可以在經(jīng)過環(huán)己酰亞胺處理之后(參見圖3D,7B)、甚至在Mcl-l被降解時(參見圖3C)，仍能夠延長存活。與此相反，所述突變對其他破壞信號(其不會直接影響蛋白質(zhì)的合成，利用使用使用廣譜激酶抑制劑星孢菌素進(jìn)行處理)的敏感性方面，突變不會產(chǎn)生影響(參見圖8A)。因此，/簡和Ac/-/""為編碼不穩(wěn)定蛋白質(zhì)的"c/-;r的下效等位基因。當(dāng)新蛋白質(zhì)的合成受到限制時，這些突變的影響是最明顯的，這潛在地說明了為什么它們產(chǎn)生了這種突出的血小板表現(xiàn)型，即，具有有限的合成新蛋白質(zhì)的能力的細(xì)胞類型(Booyse"a7.Biochim.Biophys.Acta.，"7:660-663，19681Denis"".，Cell,7":379-391，2005;Kieffere/a/.，Eur.J.Biochem.，嵌189-195，1987;Weyriche"/.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,5556-5561，1998)。實(shí)施例5模擬^合參,放,慈V、炎減>'如果在體內(nèi)需要Bcl-^來維持血小板的存活，則推斷在野生型小鼠中對Bcl-^的活性進(jìn)行藥理學(xué)拮抗將會引發(fā)血小板死亡，并導(dǎo)致血小板減少。小分子ABT-737為拮抗促存活Bc1-Xl的BH3模擬藥物(01tersdorfe"/.,2005)。其選擇性地靶向Bcl-2，Bcl-xL和Bcl-w,但不會耙向其他促存活蛋白質(zhì)Mc卜l或Al(Oltersdorfefa人，2005(sw/ra);vanDelftWa/.，CancerCell,Jft389-399，2006)。到目前為止，據(jù)報(bào)道該小分子在小鼠中是良好耐受的，并證明了對抗某些腫瘤細(xì)胞系(特別是得自小細(xì)胞肺癌或淋巴瘤的那些)的單制劑的效力(Oltersdorf"".,2005(卿ra))。在向野生型C57BL/6小鼠注入單劑量ABT-737(但不具有媒介物對照)的兩個小時內(nèi)，血小板的數(shù)量降至不到正常水平的30%,并且在4小時時達(dá)到最低點(diǎn)(參見圖4A，數(shù)據(jù)未示出)。血小板減少呈現(xiàn)出劑量依賴性(數(shù)據(jù)未示出)，并且血小板的數(shù)量在處理后的第3天逐漸恢復(fù)達(dá)到正常的水平(參見圖4B)。即使每天注射ABT-737，仍能夠觀察到這種發(fā)現(xiàn)(與血小板生成素(TP0)的持續(xù)產(chǎn)生有關(guān))(參見圖4B)。當(dāng)使ABT-737持續(xù)14天時，直到治療停止，血小板的水平保持在正常水平的~60-70%(數(shù)據(jù)未示出)。與此相反，當(dāng)每周給予ABT-737時，急性血小板減少繼而以循環(huán)方式發(fā)生(參見圖4C)，并且血小板的數(shù)量在干涉時期恢復(fù)。有趣地是，當(dāng)通過噻唑橙染色檢測在給予ABT-737之后循環(huán)血小板的年齡概況時，注意到網(wǎng)狀血小板的比率短暫增多(參見圖4D)。這表明，老年血小板可能更容易受到藥物的影響。為了研究這種可能性，使用抗血小板的血清(APS)處理小鼠，從而以人工方式使血小板的生成同步。在24小時時，在給予APS之后血小板的數(shù)量快速降低至幾乎不可檢測的水平，然后經(jīng)過7天的過程恢復(fù)(參見圖4E)。在這種恢復(fù)過程中，噻唑橙的概況急劇變化，主要在給予APS之后的第2天形成了新的網(wǎng)狀血小板的大量同源群(參見圖4F)。隨著群的老化，網(wǎng)狀血小板群在給予APS之后的第7天降低至幾乎正常的水平。新合成的幼嫩血小板(在給予APS之后的第2天)高度抵抗ABT-737的作用(參見圖4F)。與此形成尖銳對比的是，老化的血小板(在給予APS之后的第7天)在體內(nèi)更易受到ABT-737的影響，從而證明所述的藥物主要對老的血小板起作用。藥物是導(dǎo)致血小板減少的公知的原因。除了由細(xì)胞毒性制劑所導(dǎo)致的骨髓抑制以外，血小板減少通常是免疫介導(dǎo)的。通常，在這種情況下，在最初暴露于藥物之后的7-10天發(fā)生血小板減少，并且通過連續(xù)的處理而不可避免地惡化(Georgeefa/.，Ann.Intern.Med.，W義886-890，1998)。與此相反，ABT-737的作用極快速(參見圖4A)，并且盡管治療仍在進(jìn)行，在治療小鼠中血小板的數(shù)量也會部分恢復(fù)(數(shù)據(jù)未示出)，從而表明用于維持血小板水平的新型變阻器已經(jīng)確立。已經(jīng)觀察到，在處理小鼠中，TPO的水平和巨核細(xì)胞的生成是正常的，或者可能甚至升高(數(shù)據(jù)未示出)。此外，當(dāng)在體外在祖細(xì)胞培養(yǎng)物中對ABT-737進(jìn)行測試時，發(fā)現(xiàn)對所形成的多種巨核細(xì)胞集落沒有影響(數(shù)據(jù)未示出)。因此，與在藥物損傷血小板形成或者引發(fā)免疫介導(dǎo)的破壞時所觀察到的良好表征的效果截然不同的是，本文所述的結(jié)果指向ABT-737(作為促細(xì)胞凋亡分子的實(shí)例)對血小板的直接細(xì)胞毒性作用。實(shí)施例6w謬#芋應(yīng)扇凝天冬我^蛋冷^j&v、炎亡如所預(yù)期的那樣，Bel-i(而非Bel-2)的無效等位基因的雜合性惡化了ABT-737誘導(dǎo)的血小板減少(參見圖5B)。在所培養(yǎng)的血小板中，暴露于ABT-737會引發(fā)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3的裂解和完全活化、以及凝溶膠蛋白的裂解(一種已知的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的底物)(參見圖5C)。此外，用廣譜抑制劑qVD.OPh(Casertae"/.，Apoptosis，《345-352，2003)抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(其為細(xì)胞凋亡的下游效應(yīng)器(Thornberryefa人，Science,房:1312-1316，1998))會部分地改善ABT-737對培養(yǎng)物中的小鼠血小板(參見圖5D)和人血小板(參見圖5E)的細(xì)胞毒性作用。當(dāng)然，離體暴露于ABT-737不會引發(fā)血小板的活化，或者不利地影響血小板響應(yīng)于ADP或膠原蛋白而凝集的能力(參見圖9)。實(shí)施例7^^關(guān)攻吝7由JA7W摩,致V、我減乂，為了研究對Bel-&的拮抗是怎樣通過半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶來引發(fā)對血小板的破壞的，考慮了該蛋白酶活性的潛在的分子靶標(biāo)。最可能的候選物為多結(jié)構(gòu)域促細(xì)胞凋亡家族的成員Bax和Bak，這是因?yàn)橐呀?jīng)顯示出這些成員為在半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶下游起作用的細(xì)胞凋亡性細(xì)月包死亡的必要介質(zhì)(ChengWa/.，2001(swpra);Lindstene"/.，2000(卿rs);Rathmelle"人，2002(,ra);Zongeta/.,2001U叩ra))。此外，Bcl-Xt具有通過直接結(jié)合所述的細(xì)胞死亡介質(zhì)而保持Bak處于控制之中的能力(參見圖3B;參見上文討論)(Willises/.,2005(s叩ra))，由此阻制了其下游作用。因此，檢查了ABT-737在缺乏上述蛋白中的任一種蛋白或這兩種蛋白都缺乏的小鼠中的作用。Bak的缺乏明顯減弱了ABT-737對培養(yǎng)中血小板生存能力的作用(參見圖5D),并且顯著緩沖了ABT-737的體內(nèi)細(xì)胞凋亡作用(參見圖5F)。雖然單獨(dú)的Bax的損失具有較少的影響(數(shù)據(jù)未示出)，但是Bak的完全缺乏與另外的一個勘義等位基因的損失會使得血小板完全難以受到ABT-737的控制(參見圖5F)。這些數(shù)據(jù)表明，ABT-737作為Bcl-XL拮抗劑的實(shí)例通過中和Bcl-x^的促存活作用而積極誘導(dǎo)了對血小板的取殺過程，由此得到了關(guān)鍵的促細(xì)胞凋亡介質(zhì)Bak的未受限制的作用，以及程度較輕的Bax的未受限制的作用。實(shí)施例8^^V、炎哞，傻細(xì)應(yīng)源亡""^傻存活"c7-A的f要乾標(biāo)由于下游效應(yīng)器Bak和Bax的缺失保護(hù)了血小板對抗ABT-737誘導(dǎo)的滅殺作用，所以對這些分子在正常血小板動態(tài)平衡中的作用進(jìn)行檢測。在穩(wěn)定狀態(tài)下，Bax缺陷型小鼠中的血小板數(shù)量與野生型小鼠中血小板的數(shù)量是不可區(qū)分的(參見圖6A)。與此相反，小鼠表現(xiàn)為血小板的數(shù)量明顯增多(參見圖6A)。Ai:-z-血小板在形態(tài)學(xué)上是正常的(參見圖6B),并且小鼠不具有可能會造成血小板增多的缺陷(例如脾功能減退)。因此重要的是發(fā)現(xiàn)了在這些動物中，血小板的半衰期(通過體內(nèi)標(biāo)記檢測法測定)增大了近50%(參見圖6C,數(shù)據(jù)未示出)。在帶有突變的5c/-i，Ai:和/或&i等位基因的組合的小鼠中，檢測血小板計(jì)數(shù)和半衰期。引人注意的是，一個Ai:等位基因的損失援救了小鼠中的血小板減少(參見圖6D)。即使在Ac7-/〃小鼠中具有減少的Bc卜x^兩個&i:等位基因的缺乏也會延長血小板的半衰期(參見圖6C)并導(dǎo)致與在Bak缺陷型動物中所見的情況相似的血小板增多(c.f.參見圖6D和6A)。此外，在雜合的&/-/，或&/-//〃《小鼠中所見的血小板減少通過組成型缺乏其他5c/-i等位基因而惡化，并通過損失一個^3i:等位基因而逆轉(zhuǎn)(參見圖6E)。因此，^i:在生物化學(xué)上(Willise"厶，2005(參見圖3，5)和遺傳上(參見圖6)位于5c7-z的下游。實(shí)施例9##保持細(xì)應(yīng)^存雜力的合參迷/f細(xì)^謬逸血小板是不易受到離體操作的影響的。因此，為了鑒定出可促進(jìn)細(xì)胞存活(包括增長的壽命期/生存能力)的化合物(制劑)，使用了對細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)制劑敏感的細(xì)胞。例如，使用其中Bel-xt為Bak的關(guān)鍵控制物的細(xì)胞來篩選能夠抑制細(xì)胞死亡的小分子或其他化合物(制劑)，即使是在Bel-x^失活時也如此。此類化合物可用于保持細(xì)胞的生存能力。在一個實(shí)施例中，將小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)改造成缺乏Mc1-1，該Mcl-l是Bak的另一種控制物(Willise"入，2005(^/p/\s))。除非Mcl-l也是失活的，使用(例如)ABT-737使Bc1-Xl失活并不能使細(xì)胞死亡(vanDelftefa/.，2006"w/ra))。在組成型缺乏Mcl-1的情況下，MEF對(例如)ABT-H7是高度敏感的。在多種情況下，對Bak的唯一制動器是Bc卜x"其可以通過作為Bel-Xl的有效抑制刑的化合物ABT-737來廢止。因此，針對能夠阻斷由ABT-737誘導(dǎo)的對Mcl-l缺陷型MEF的滅殺作用的化合物來篩選化合物文庫。此類化合物可以直接阻斷ABT-737或者細(xì)胞死亡介質(zhì)Bak和/或Bax的作用。在一個非限定性實(shí)例中，將Mcl-1無效MEF植入到底面平坦的96孔板中。在12-24h之后，加入最終濃度為0.1，l和10—的文庫化合物，并溫育2h，然后加入ABT-737(100nM)或載體媒介物。24h后使用阿爾瑪藍(lán)染色對細(xì)胞的生存能力進(jìn)行評分，并在4h后讀取。將文庫化合物或ABT-737不存在情況下的細(xì)胞生存能力作為陽性對照。將在文庫化合物和ABT-737不存在下缺乏生存能力的細(xì)胞作為陰性對照。在不具有ABT的情況下，惰性化合物顯示出使細(xì)胞的生存能力正常。在文庫化合物存在、但ABT-737不存在下，細(xì)胞毒性化合物顯示出使細(xì)胞生存能力降低。陽性細(xì)胞數(shù)顯示，在ABT-737和文庫化合物存在下，細(xì)胞的生存能力增強(qiáng)，而陰性化合物顯示，在文庫化合物和ABT-737存在下，細(xì)胞的生存能力降低。對多個獨(dú)立的細(xì)胞系和培養(yǎng)中的血小板測試陽性細(xì)胞數(shù)。在一些實(shí)施方案中，所述的化合物可以通過阻斷ABT-737的細(xì)胞吸收或者抑制ABT-737在細(xì)胞中的作用來發(fā)揮作用。在其他實(shí)施方案中，所述的化合物通過直接抑制Bak和/或Bax，或者間接抑制Bak或Bax或其下游細(xì)胞凋亡效應(yīng)器分子來發(fā)揮作用。此外，還對經(jīng)修飾的小鼠(具有經(jīng)修飾的Bcl-2家族基因)實(shí)施所述的方法，從而使篩選更敏感，并檢測出各種陽性制劑的分子靶標(biāo)。實(shí)施例10補(bǔ)蘢的試驗(yàn)過程以每周給予一次的方式，向雄性BALB/c小鼠腹膜內(nèi)注射3個100mg/kg劑量的ENU(亞硝基-N-乙基脲，SigmaN3385lgisopac)。在8周中，使經(jīng)處理的小鼠恢復(fù)生育能力，然后使其與未經(jīng)處理的BALB/c雌鼠交配，從而生出第一代(G:)后代。在G!小鼠7周齡后，由該小鼠的眼球后靜脈叢收集血液，并轉(zhuǎn)移至裝有EDTA鉀(Sarstedt)的管中，然后使用Advia120自動化血液(Haemtological)分析器(Bayer)來檢測外周血液中血小板的數(shù)量。通過使受影響的動物與野生型C57BL/6小鼠異型雜交來對戶/WO和戶/W6突變進(jìn)行定位。針對血小板的數(shù)量篩選由這些交配小鼠產(chǎn)生的Fi后代，然后將受影響的F:小鼠與野生型C57BL/6小鼠異型雜交，從而產(chǎn)生R子代。在各種情況下，從40只F2動物中收集基因組DM,并使用具有80種簡單序列長度多態(tài)性(SSLP)標(biāo)記物的板進(jìn)行全基因組掃描。通過使用MIT和內(nèi)部CA重復(fù)標(biāo)記物以增大的密度來分析其他的減數(shù)分裂產(chǎn)物，從而精確化候選時間間隔。裙靡0由尾部活組織提取出基因組DNA,然后對該DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。為了除去引物以及未整合的核苷酸，使用ExoSAP-IT(USB)，根據(jù)制造商提供的說明書處理經(jīng)PCR后得到的反應(yīng)物，然后將該反應(yīng)物通過Sephadex柱過濾。然后,使用BigDyeTerminatorv3.0(AppliedBiosystems)對擴(kuò)增子直接進(jìn)行測序。A濕為、浙通過使用人工或自動化(Advia120)的計(jì)數(shù)技術(shù)，測定紅細(xì)胞比容、血小板和白細(xì)胞的數(shù)量以及差異。在大多數(shù)的試驗(yàn)中，除了圖1A和6E所示的數(shù)據(jù)以外，所述的數(shù)據(jù)均由雄鼠收集得到。使用由100ng/mL鼠千細(xì)胞因子、10ng/mL鼠IL-3和4單位/mL人EPO構(gòu)成的混合物刺激處于lmL0.3%的瓊脂(含于補(bǔ)充有新生小牛血清(20%)的DMEM中)中的2.5xl(T個成人骨髓細(xì)胞或5x104個脾細(xì)胞的克隆培養(yǎng)物，并在37匸下，在完全潮濕的氣氛(空氣中含有10%的C02)中溫育7天。將瓊脂培養(yǎng)物固定，并依次用乙酰膽堿酯酶、羅克沙爾堅(jiān)牢藍(lán)和蘇木精染色；在x100400的放大倍數(shù)下測定各集落中的細(xì)胞組合物。通過人工計(jì)數(shù)方法計(jì)數(shù)得自胸骨和脾切片(經(jīng)蘇木精/曙紅染色后)中的巨核細(xì)胞的數(shù)量。在最少10個高倍視野(x200)中進(jìn)行評分。羞小我^#餘#浙使用600pg溶于緩沖劑(含有140mMNaCl和10%DMS0)中的N-羥基琥珀酰亞胺生物素(NHS-生物素)(Sigma)對小鼠進(jìn)行靜脈內(nèi)注射。在各時間點(diǎn)處，分離出全部的鼠尾血液，并將該血液與BSGC緩沖劑(116mMNaCl，13.6raM檸檬酸三鈉，8.6mMNa2HP04，1.6raMKH2P04，0.9raMEDTA，11.1mM葡萄糖)混合。將1j^L當(dāng)量的血液在平衡鹽溶液(BSS:149mMNaCl，3.7mMKCl，2.5mMCaCl2，1.2mMMgS04:7.4raMHEPES，1.2mMKH2P04，0.8mMK2HP04，3%小牛血清)中洗滌，在1,210g下沉淀10分鐘，并使用與FITC綴合的大鼠抗CD41(BD)和與藻紅蛋白綴合的鏈霉親核素(BD)在冰上染色lh。將50，000個與別藻藍(lán)蛋白綴合的珠子(流式細(xì)胞學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品)加入到每個樣品中，從而有助于對血小板的絕對數(shù)量進(jìn)行定量。將樣品再次于BSS中洗滌，并在LSR流式細(xì)胞儀(BD)上進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)數(shù)。通過大小和CD41的染色情況將血小板與其他細(xì)胞區(qū)分開；經(jīng)生物素標(biāo)記的血小板為藻紅蛋白陽性的。摩,y^小農(nóng)脊移j法使用600mg溶于緩沖劑(含有140raMNaCl和10%DMSO)中的N-羥基琥珀酰亞胺生物素(NHS-生物素)(Sigma)對小鼠進(jìn)行靜脈內(nèi)注射。在注射生物素后30分鐘，使用肝素化的注射器收集小鼠心臟血液，并將2mL的血液與5mL的BSGC緩沖劑混合。將所得的血液在600g下離心3分鐘，并在各時間點(diǎn)時移出5mL富集血小板的血漿。在1210g下沉淀匯集的富含血小板的血漿10分鐘，并再次懸浮于154mMNaCl中，然后靜脈注射到受者小鼠中。在注射后的各時間點(diǎn)處，從受者小鼠中分離出血液，并按照上文所述進(jìn)行分析。河炎j&V、炎^^記使用蓉唑橙對網(wǎng)狀血小板進(jìn)行染色。反應(yīng)物包含1|LlL血液、50inL噻唑橙(O.1pg/mL，溶于PBS中)、0.25^L與藻紅蛋白綴合的CD41抗體(BD)和9PBS。將反應(yīng)物在室溫及黑暗條件下溫育15分鐘，然后通過加入lmL的PBS1。/。PFA進(jìn)行固定。基于大小和CD41的表達(dá)情況可以將血小板與其他細(xì)胞區(qū)別開。將200pL兔抗小鼠血小板的血清(APS;IntercellLot號6309)以l:60的稀釋度腹膜內(nèi)注射到各只小鼠中。動參試驗(yàn)所有的動物試驗(yàn)都遵守墨爾本健康研究理事會動物倫理委員會(MelbourneHealthResearchDirectorateAnimalEthicsCommittee)的規(guī)章標(biāo)準(zhǔn)，并由該委員會所認(rèn)可。缺乏Bc卜Xl(MotoyamaWs/，1995(si/;ra))，Bc卜2(Veisefa/.,Cell,75:229-240，1993)，Bcl—w(Print"a7.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA，夕J:12424—12431，1998)，Bax(Knudson"a/.，Science,，96-99，1995)和Bak(Lindstene"/.，2000(swprs))的小鼠如上文所述。它們最初是在混合的C57BL/6x129Sv背景(使用129SvES細(xì)胞用于基因乾向)下產(chǎn)生的。在本研究中，這些品系的小鼠在使用前都經(jīng)過與C57BL/6小鼠回交至少10代。在近交C57BL/6背景下形成缺乏Mc卜l的小鼠，并且該小鼠在其他處具有詳細(xì)的描述(PNK,AStrasserandPBouillet，manuscriptinpreparation)。簡而言之,由C57BL/6(克隆75A5)BACDNA制備lc7-J靼向構(gòu)建體，并且4.6kb#c7-J編碼區(qū)域的側(cè)翼為通過電穿孔進(jìn)入到C57BL/6ES細(xì)胞中的loxP位點(diǎn)，并將其注射到129胚泡中。在種系傳遞建立之后，將毛色嵌黑的子代與表達(dá)Cre重組酶的C57BL/6轉(zhuǎn)基因小鼠交配，從而得到y(tǒng)f/c卜廣-小鼠；成功的切除通過PCR表現(xiàn)型來證明。在近交BALB/c背景下，誘導(dǎo)Plt20和Plt16突變，并與C57BL/6回交。在本研究中使用的所有"c7-/諸和"c/-/""小鼠都是在混合的背景下的，其與C57BL/6小鼠經(jīng)過至少2代、但不多于6代的回交。盡管在親代C57BL/6和BALB/c品系之間沒有觀察到血小板數(shù)量具有顯著差異(這與之前的報(bào)道一致(Kileets/.，Mamm.Genome,/《81-85，2003;Petersefa/.，Physiol.Genomics.,":185-193,2002))，仍將同窩出生的小鼠用作合適的對照。j&V、炎炎桌產(chǎn)豸定將全血收集到檸檬酸鈉(3.2%)中，并通過在室溫下在800rpm下離心12分鐘得到富含血小板的血漿。然后，通過在室溫下將剩余的血液在3，000rpm下離心15分鐘，從而得到血小板貧瘠的血漿。使用血小板貧瘠的血漿將血小板的數(shù)量調(diào)節(jié)至250xIOVL。將經(jīng)過稀釋的血小板富集的血漿放置于被加溫至37。C并經(jīng)攪拌的凝集計(jì)比色杯中，同時在4個通道的血小板凝集計(jì)中測定穿過血漿的光透射情況。在得到基線測定值之后，加入ADP或膠原蛋白(均得自EdwardKeller)以誘導(dǎo)凝集。i小我減,^為N^f使用非肝素化的毛細(xì)管由眼球后竇收集血液，并將其轉(zhuǎn)移至Eppendorf管中，然后在室溫下溫育2h。將所得物在5，500rpm下離心20分鐘之后，將所得的上清液在相同的條件下再次離心，然后收集血清。4吏用QuantikineMouseTPOImmunoassay制劑盒(R&DSystems),根據(jù)制造商的說明書，通過酶聯(lián)免疫吸附測試法(ELISA)測定血小板生成素的水平。^裙細(xì)^^流式'細(xì)^僅分^f將得自大腿骨的骨髓沖洗到2mL的CATCH培養(yǎng)基(溶于不含有鈣和鎂的HBSS中的0.38%檸檬酸鈉，1mM腺苷，2mM茶堿，3pg/mL前列腺素L)中，并使用移液管進(jìn)行輕輕的分散。將細(xì)胞懸浮液過濾通過100的細(xì)胞過濾網(wǎng)，從而除去細(xì)胞團(tuán)和碎片，然后在RT下在400g下離心4分鐘。在將所得物再次懸浮與lmL的CATCH(使用含有5%FBS的PBS以1:1進(jìn)行稀釋)中之后，通過將細(xì)胞與對抗CD16和CD32的抗體預(yù)溫育來阻斷抗體的非特異性結(jié)合。將細(xì)胞用與FITC綴合的抗CD41抗體在水上標(biāo)記30分鐘，然后用4mL的CATCH(使用含有5%FBS的PBS以1:1進(jìn)行稀釋)洗滌。將所得物在RT、400g下離心4分鐘之后，將所得的細(xì)胞再次懸浮于lmL的低滲碘化丙啶(50ng/mL，溶于O.1%檸檬酸鈉中)中，然后在冰上溫育15分鐘。然后加入核糖核酸酶，直至其最終濃度為50pg/mL，在RT下溫育30分鐘之后，將細(xì)l包過濾通過100iam的細(xì)胞過濾網(wǎng)，并進(jìn)行分析。^f貞微裙法將富含血小板的血漿在溶于0.1M二曱胂酸鹽緩沖劑(含有2mMCaCl)中的10體積2.5%戊二醛和2.0%曱醛中稀釋，并將得自股骨的骨髓沖洗到上述溶液中。在固定1.5h之后，將樣品用0.1M的二曱胂酸鹽緩沖劑洗滌兩次，然后在1%四氧化鋨/0.1M二曱胂酸鹽緩沖劑中后固定lh。將樣品用緩沖劑洗滌，然后通過一系列濃度等級的乙醇脫水，在用環(huán)氧丙烷進(jìn)行中間脫水，接著4吏用GlauertEMBED樹脂混合物進(jìn)行逐漸的樹脂過濾從而進(jìn)入到環(huán)氧丙烷中，然后再使用純樹脂進(jìn)行過濾。之后，將樣品放置于具有純樹脂的BEEM膠嚢中，并在60'C下治療2天。切下500pm厚的切片，并使用曱苯胺藍(lán)復(fù)染色。隨后，切下60nm薄的切片，并使用1%的水性乙酸鈾酰和Reynold檸檬酸鉛水溶液染色。使用透射電子顯微鏡觀察網(wǎng)格。使用Gatan2kx2kCCD照相機(jī)獲取數(shù)字圖像?；蜻@#建沐如上所述，將用于FLAG標(biāo)記的野生型或突變體小鼠Bcl-Xh以及HA標(biāo)記的人Bax或Bak的哺乳動物表達(dá)載體亞克隆到pEFPGKpuro或pEFPGKhygro中(Chenet".，2005;Huang""，EMBO.J.，764628-4638，1997;O'Connora/.，EMBO.J.，77:384-395，1998)。通過亞克隆到pMIG載體中制得用于人Bims和人Noxa的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)構(gòu)建體(Chena/.，2005(^//ra))，以及通過亞克隆到pMIH載體中制得用于野生型或突變體小鼠Bel-^的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)構(gòu)建體(MSCV-IRES-潮霉素)(vanDelftWa/.，2006"w/7ra))。通過測序證實(shí)了所有的構(gòu)建體，并且寡核苷酸和構(gòu)建體的詳細(xì)情況可得自作者。遂織培#、勿應(yīng)ys亡謬,、逆橫,秀病毒惑染以及細(xì)應(yīng)源亡趁^將細(xì)胞系(HEK293T:永生的人胚胎腎細(xì)胞系，PhoenixEcotropic包裝細(xì)胞，以及小鼠胚胎成纖維細(xì)胞"MEF")培養(yǎng)與補(bǔ)充有10%胎牛血清的Dulbecco，sModifiedEagles(DME)培養(yǎng)基中，在某些情況下，所述的培養(yǎng)基補(bǔ)充有250L-天冬酰胺和502-巰基乙醇。按照之前所述的方法，由E13-14.5胚胎得到所有的MEF(ChenWa/.，20050"prs);WillisWa/.，2005(s"jwa))。按照之前所述，在高水平的IL-3存在下，通過將E14.5胎兒肝臟單細(xì)胞懸浮液與表達(dá)HoxB8逆轉(zhuǎn)錄病毒的成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)而得到IL-3依賴性(因子依賴性骨髓-FDM)細(xì)胞系(Ekerte,a人，2004(wpw))。通過使用pMIH逆轉(zhuǎn)錄病毒對所述的細(xì)胞進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒感染而形成表達(dá)Bcl-x^或其突變體的細(xì)胞(ChenWa人，2005(w/ra))。按照之前所述，使逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體瞬時轉(zhuǎn)染到PhoenixEcotropic包裝細(xì)胞中，并使用病毒上清液感染細(xì)胞(Chenefa人，2005(swpra))。通過加入lmg/mL的潮霉素來選擇進(jìn)行表達(dá)的細(xì)胞匯聚物。使用ABT-737(至多5—，AbbottLaboratories(Oltersdorf"a/.，2005(M/ra))、依托泊戒(至多100joM,Pharmacia)或星孢菌素(IOhM，Sigma)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡；此外，在某些試驗(yàn)中還加入50qVD.OPh(EnzymeSystems)。通過流式細(xì)胞M義(用于排除了多典化丙突:的細(xì)胞)或者通過使用血球計(jì)數(shù)器進(jìn)行人工計(jì)數(shù)來測定細(xì)胞的生存能力。^€瘦沉/定、龍嫂伊遊和名嫂染g在包含1%TritonX-100(TX-100)的裂解緩沖劑(20mMTris-pH7.4，135mMNaCl，1.5mMMgCl2，1raMEGTA，10%甘油)中制備細(xì)胞裂解物，其中所述的裂解緩沖劑補(bǔ)充有蛋白酶抑制劑(RocheandSigma)。按照之前所述，^f吏用對抗FLAG(M2:Sigma)或HA(HA.11:CRP)的小鼠單克隆抗體進(jìn)行免疫沉淀(Chen"a/.，2005"叩ra);Huang"a/，1997(卿ra);O'Connor"a人，1998);使用小鼠抗-Glu-Glu(MMS-115R:CRP)進(jìn)行對照免疫沉淀。通過SDS:PAGE(Novexgels:Invitrogen)分辨蛋白質(zhì)，并將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，然后使用大鼠單克隆抗HA(3F10:Roche)和抗FLAG(9H1，(Wilson-Annana/.，J.Cell.Biol.,7^:877-888，2003)的抗體通過免疫印跡進(jìn)行檢測。用于免疫印跡的其他抗體為小鼠單克隆抗Bel-xL(2H12;BD)、抗Bcl-2(克隆7;BD)、抗人Bc卜2(Bcl-2-100)、抗肌動蛋白(AC40;Sigma)、抗Bax(2D2和5B7:Sigma)、抗Mcl-l(克隆22:BD);大鼠單克隆抗Mcl-l(14C11;DHuang，未公開)、兔多克隆抗Bak(B5897:Sigraa)、抗Mcl-l(Rockland)、抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(585;giftofY.Lazebnik)、抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3的裂解的p17片段(AB3623;Chemicon)、抗凝溶膠蛋白(DKwiatkowski贈送)(Kothakota"a/.，Science,"《294-298，1997);倉鼠單克隆抗小鼠Bcl-2(3F11;BD)。二級抗體包括與HRP綴合的抗大鼠或抗倉鼠的IgG(SouthernBiotech)、抗小鼠或抗兔的IgG(Chemicon)、以及抗小鼠IgGFcY鏈的特異性抗體(JacksonImmunoResearch)。-使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL;GEHealthcare)檢測所述的蛋白質(zhì)。此外，通過使用小鼠單克隆抗FLAGM2抗體進(jìn)行免疫染色、然后與FITC綴合的山羊抗小鼠IgG(lOng/mL;SouthernBiotech)溫育，來檢測經(jīng)FLAG標(biāo)記的Bel-i的表達(dá)情況；使用FACScan(BD)分析所述的樣品。以每日單劑量的給予方式，向小鼠腹膜內(nèi)注射75mg/kg的ABT-737。將ABT-737(1g/mL，溶于DMS0)原溶液在由30%丙二醇，5%Tween80以及65%D5W(5%右旋糖水溶液)形成的混合物(pH4-5)中稀釋；DMS0的最終濃度小于1%。庠伴j&V、炎^/試使用肝素化的注射器由所示的小鼠中收集血液，并以l:5在具有l(wèi)mg/mL的前列腺素12的葡萄糖檸檬酸緩沖鹽(bufferedsalineglucosecitrate)中稀釋。在具有知情同意書的情況下獲得人全血(獲得倫理文員會(theInstitutionalReviewBoard)的認(rèn)可)。獲得富含血小板的血漿，并在室溫下與藥物或?qū)φ瘴餃赜?h。使用血球計(jì)數(shù)器以人手方式對血小板進(jìn)行三次計(jì)數(shù)。實(shí)施例11本文所示的這些結(jié)果確定，Bcl-x^為血小板存活的主要的內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)劑。與此相反，其他類Bel-2的促存活蛋白質(zhì)沒有起到重要的作用。Bcl-&在體內(nèi)或體外的基因或藥理學(xué)拮抗作用使得血小板的存活和壽命期對劑量的依賴性減少，但是在Bcl-2，Bcl-w或Mcl-1中發(fā)生突變則不會如此。此外，由于BH3模擬化合物ABT-737沒有靶向這些促存活Bel-2家族成員，所以沒有考慮促存活Mcl-1或Al在體內(nèi)的作用(Oltersdorfa厶，2005(swpra);vanDelfta/.，2006)。Bel-Xl在保持血小板存活中的獨(dú)特作用與其在血小板形成中所提出的相關(guān)作用不同。Bel-2在造血區(qū)間的過表達(dá)導(dǎo)致血小板減少(0gilvya/.，1999(Si/pra))，而編碼促細(xì)胞凋亡唯BH3蛋白質(zhì)Bim的基因發(fā)生缺失也會發(fā)生血小板減少(Bouilleta/.，1999(w/ra))。此外，Bc1-Xl或Bc卜2在巨核細(xì)胞中的過表達(dá)損害前血小板的形成(DeBottone"入，Blood纖1310-1317，2002;KaluzhnyWa/.，2002(wpra))?？紤]到活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶是血小板脫落所必需的這些證據(jù)，上述數(shù)據(jù)表明了在大量的"副細(xì)胞凋亡，，(Thielee"厶，Acta.Haematologica.,夕7:137-143，1997)的細(xì)胞質(zhì)再造(其中巨核細(xì)胞開始產(chǎn)生血小板，所述的細(xì)胞質(zhì)再造如同在垂死細(xì)胞中，見察到的細(xì)胞質(zhì)起泡的過程)中的細(xì)胞凋亡的機(jī)制。雖然對血小板生物形成有確切貢獻(xiàn)的多種細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)劑仍有待確定，但是本文可以得出這樣的結(jié)論，Bcl-x^并非絕對為巨核細(xì)胞增殖和分化所必需的。此外，也研究了細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)劑在血小板脫落過程中的作用。在非限定性實(shí)施方案中，本文提出，血小板繼承而來的Bc1-Xl的量確定了其壽命期。由于經(jīng)過一段時間后Bel-Xl被降解，所以會達(dá)到閾值，此時促細(xì)胞凋亡Bak被釋放，并且血小板細(xì)胞凋亡凈皮誘導(dǎo)。以基因或藥理學(xué)方式抑制Bel-^會加速"分子時鐘"，由此帶領(lǐng)至進(jìn)入點(diǎn)，從而進(jìn)入細(xì)胞死亡以及隨后進(jìn)行的循環(huán)系統(tǒng)中血小板的清除。所述的模型由本文所述的觀察結(jié)果所支持，其中所述的觀察結(jié)果為Bcl-xt和Bak具有不同的半衰期在新蛋白質(zhì)合成缺乏的條件下，BclU匕Bak更快降解。考慮到它們有限的合成能力，因此期望所有其他的方面是同等的，即，在老化的血小板中，相對于Bak,Bel-^不會遭遇無情的減少。事實(shí)上，之前的報(bào)道表明，在儲存于37。C下的血小板中，Bak的水平是穩(wěn)定的(Browneta人，J.Biol.Chem.，2":5987-5996，2000)，Bel-xL的水平隨時間流逝降低(Bertinoa人，Transfusion(Paris),857-866，2003)。必然的結(jié)果為，與較幼嫩的對應(yīng)血小板相比，含有較少Bel-x^的較老的循環(huán)血小板更容易受到ABT-737作用的影響，并且我們的試驗(yàn)(使用抗血小板血清，然后進(jìn)行ABT-737處理)清楚地表明了所述的情況。這可能解釋了，在每天使用ABT-737進(jìn)行處理的小鼠中，血小板的數(shù)量幾乎恢復(fù)到正常值，而每周接受所述藥物的小鼠則表現(xiàn)為急性發(fā)作血小板減少，并在兩次注射之間分散有血小板完全恢復(fù)的情況。在持續(xù)抑制Bc1-Xl的情況下，血小板的年齡概況大概發(fā)生了變化，這樣循環(huán)群中主要包括更難以受到ABT-737控制的幼嫩細(xì)胞。在每周注射后，隨著藥物的清除血小板的年齡概況反而恢復(fù)到正常，因此循環(huán)中的血小板群對ABT-737是正常敏感的(normosensitive)。拮抗血小板中的Bcl-xt的制劑會導(dǎo)致血小板減少，這成為臨床上抑制Bel-Xt的替代生物標(biāo)記物。因此，本研究證明，用于細(xì)胞程序性死亡(細(xì)胞凋亡)的內(nèi)在機(jī)制調(diào)節(jié)了無核血小板的壽命期。血小板的存活以及由此得到的壽命期取決于抑制促細(xì)胞凋亡蛋白質(zhì)Bak和/或Bax的促存活Bcl-x"之前已經(jīng)才艮道，無核細(xì)胞質(zhì)能夠發(fā)生細(xì)胞凋亡(Jacobsonefs人，EMBO.J.，":1899-1910，1994)。據(jù)我們所了解，血小板為不僅能夠進(jìn)行細(xì)胞程序性死亡、而且其壽命期可以通過促存活和促細(xì)胞凋亡因子之間的相互作用來控制的非操作性無核細(xì)胞的第一實(shí)例。所述的研究表明，在控制血小板存活的重要基因中發(fā)生的突變說明了遺傳性或獲得性血小板減少和血小板增多的某些情況。通過抑制細(xì)胞凋亡來促進(jìn)血小板存活的策略在患有血小板減少的某些患者中是有利的。與此相反，患有血栓形成狀況或血小板增多的患者將受益于使用促進(jìn)細(xì)胞凋亡的制劑(例如BH3模擬物，如ABT-737)而進(jìn)行的處理，從而促進(jìn)血小板破壞并由此預(yù)防與未受控的凝集有關(guān)的后遺癥。本發(fā)明提供了用于在輸注前處理和儲存血小板的方法。在離體中所觀察到的血小板生存能力的快速降低涉及細(xì)胞凋亡過程-血小板儲存損傷(Lie"入，Transfusion(Paris),^ft1320-1329，2000)。事實(shí)上，雖然在儲存于37。C下的人血小板中Bc1-Xl的水平降低，但是在經(jīng)過在22。C下的常規(guī)血庫儲存過程的血小板中Bc1-Xl的水平似乎沒有降低(BertinoWW.，2003)。根據(jù)我們的發(fā)現(xiàn)，保持Bc1-Xl:Bak和/或Bax的平衡以有利于Bel-x"將為重要的機(jī)制，通過該機(jī)制，血小板的生存能力在于室溫下和低溫下的儲存過程中得以保持。因此，通過使用用于穩(wěn)定Bel-xt或抑制Bak和/或Bax的細(xì)胞凋亡抑制劑可以預(yù)計(jì)在儲存并且甚至可能在輸注后的過程中血小板的生存能力發(fā)生有價(jià)值的改善。例如，可以將通過促進(jìn)Bcl-^的水平和/或活性而抑制細(xì)胞凋亡的制劑，與已經(jīng)收集以用于離體儲存及隨后向有需要的受試對象進(jìn)行施用的血小板相接觸?？梢詫⒂糜诖龠M(jìn)Bcl-Xt而有利于Bak和/或Bax的制劑在由供者收獲血小板的過程中(例如通過將所述的制劑供入到收集容器中)加入到血小板中。備選地，可以在血小板的離體儲存過程中或者在血小板的再輸注給受試對象的過程中加入制劑。類似地，可以將拮抗Bak和/或Bax的水平和/或活性的制劑與將進(jìn)行離體儲存從而在其后向有需要的患者進(jìn)行施用的血小板相接觸?？梢詫⒓?xì)胞凋亡抑制劑與血小板相接觸，從而增強(qiáng)可以向受試對象進(jìn)行施用的儲存的血小板的半衰期、生存能力或存活。例如，所述的制劑可以將儲存的血小板的半衰期或存活增大10%或更大、20%或更大、30°/或更大、40%或更大、以及50%或更大。在另一實(shí)施方案中，所述的制劑可以將促細(xì)胞凋亡制劑的活性抑制20%或更大、30%或更大、40%或更大、50%或更大、60%或更大、70%或更大、80%或更大、或90%或更大。多個研究組已經(jīng)對抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(下游破壞酶)是否可以有效地延遲與儲存有關(guān)的血小板生存能力的降低進(jìn)行了檢測。即使酶活性發(fā)生了減小，但是對血小板的生存能力仍幾乎不產(chǎn)生影響(Bertinoefa/.，2003Brownefa/.，2000Cohene"厶，Th函b.Res.，7":387-393，2004;Lie"/.，2000(w;ra))。這可能反映了一些抑制劑的半衰期短，或者在完全破壞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活性方面發(fā)生失效，這是因?yàn)榈退降幕钚跃妥阋栽斐杉?xì)月包凋亡(Methot,efa/.，J.Exp.Med.，"義199-207，2004)。更可能的是，即使完全抑制了半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的活性，也不能防止由活化的Bak誘導(dǎo)的細(xì)胞器(特別是線粒體)損壞(Greena/.，2004(s";ra))。在該實(shí)施方案的一個方面中，在Bcl-xL:Bak和/或Bax軸的水平下抑制細(xì)月包凋亡級聯(lián)過程被建議用于克服這種重要的限制。實(shí)施例12iV、炎W^存錄力和^然W檢灣血小板功能的檢測在(例如)Goncalvesa/.，J，Biol.Chem.，278(37):34812，2003;Maxwell"a/.，J.Biol.Chem.,279(31):32196，2004;Manginefa7.，J.Biol.Chem.，278(35):328802003;以及Bakimere"/.，J.Clin.Invest.,89(5):1558，1992中有所描述。特別重要的是下文所述的檢測。i)標(biāo)準(zhǔn)的血小板功能檢測a)血V、炎凝桌一這種相對簡單的技術(shù)涉及在血小板活化物質(zhì)存在下攪拌血小板懸浮液，并監(jiān)測能夠精確地監(jiān)測溶液中血小板團(tuán)塊(凝集)的裝置中光透射的變化。該檢測可用于測定主要血小板整合素otmP3(GPIIb-IIIa)的粘附功能的變化。b)^^,殺:##放^趁*一血小板致密顆粒中儲存有多種核苷酸(ADP和ATP)以及血小板的其他小分子活化劑(血清緊張素、腎上腺素和組胺)。這些分子在血栓發(fā)展過程中由血小板釋放出來，并且在保持血小板活化中起到主要作用。檢測"C血清緊張素的釋放為檢測致密顆粒分泌物中的缺陷的簡單且可靠的方法。c)^4'^^^/"炎法一檢測血小板活化的多種標(biāo)記物(例如GPIIb-IIIa的活化、P選擇素的釋放以及的磷脂酰絲氨酸的暴露)的表面表達(dá)在定義血小板活化途徑中的特異性異常中是重要的。這些標(biāo)記物表達(dá)中的缺陷通常分別與血小板凝集、a-顆粒的分泌以及促凝劑功能的異常有關(guān)。d)盞7、喪輪/^#^的檢游一可以對血小板與多種基質(zhì)(包括纖維蛋白原和vonWUlebrand因子)之間的相互粘附作用進(jìn)行分析。結(jié)合諸如全內(nèi)反射熒光法和熒光顯微技術(shù)之類的成像技術(shù)，這些檢測系統(tǒng)可以對細(xì)胞形態(tài)、受體動力學(xué)和近膜處信號事件中的變化進(jìn)行同時分析。這些檢測方法可特別用于定義膜流動性中的變化、現(xiàn)有時空信號傳遞事件以及細(xì)胞骨架的變化。H)基于體外流動的血栓癥模型a)與趟^^j&舍多成f冷^^/^的j^V、我一這些檢測涉及在寬泛的血液流動條件下，分析血小板與經(jīng)純化的vonWillebrand因子、膠原蛋白或纖維蛋白原的粘附情況。所述的簡化流式檢測法幫助定義在血小板粘附應(yīng)答中的特異性異常和所涉及的可能受體。b)在j&發(fā)歩成4面J:j&V、我j&趁的移4—該檢測方法涉及將天然或抗凝全血灌注到經(jīng)膠原蛋白或纖維蛋白原/vWf包被的表面上，以及使用共聚焦顯微鏡檢測血栓生長的3D動力學(xué)。c)就動炎,悉V、威活/A/#況一通過使用鈣指示劑染料，我們可以監(jiān)測到鈣流量(血小板活化的敏感標(biāo)記物)與血小板形態(tài)學(xué)及粘附動力學(xué)同時發(fā)生變化。這是一種用于檢測血小板粘附和活化情況的時空動力學(xué)的強(qiáng)力檢測系統(tǒng)。d)在岸伴i#皇尹/^Wj^V、^j^趁^多成一該檢測方法涉及灌注天然或抗凝全血通過得自嚙齒動物或人組織樣品的經(jīng)分離的血管節(jié)段。通過機(jī)械或光化學(xué)手段，使用FeCl3誘導(dǎo)血管損傷，并使用多種活細(xì)胞成像技術(shù)檢測血小板血栓的形成情況。這是一種可用于檢測在與血小板和白細(xì)胞的血管反應(yīng)性中所發(fā)生的潛在變化的有用技術(shù)，從而形成擴(kuò)大的血栓形成應(yīng)答。iii)體內(nèi)血栓癥的模型a)Fo/"fj&發(fā)癥模型一Folts模型主要在大型動物中使用，并且被認(rèn)為是黃金標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)血栓癥模型之一。該模型適用于研究小鼠頸動脈血栓形成。所述的模型涉及在動脈狹窄區(qū)域造成反復(fù)的擠壓損傷，從而使血小板暴露于內(nèi)皮下血栓形成成分以及高剪切應(yīng)力(其為促進(jìn)血栓生長的兩個重要因素)下。小鼠中閉塞性血栓的發(fā)展通常在血管損傷的2-3分鐘內(nèi)發(fā)生，并且血管的機(jī)械攪動導(dǎo)致血栓的栓塞以及正常血液流動的恢復(fù)。血栓的持續(xù)形成及移動會導(dǎo)致循環(huán)流動減慢(CFR)，其為Folts模型的特有特征。血栓為特征性的血小板富集，而CFR的消除則是血小板功能障礙/抑制的標(biāo)志特征。b)迨席##型一此外，電解血栓癥模型主要用于大型動物中，并在較大的血管中導(dǎo)致發(fā)展成血小板富集的血栓。所述的模型適用于使小鼠的非狹窄形態(tài)的頸動脈產(chǎn)生電解損傷。電解損傷導(dǎo)致整個厚度的血管損傷，從而引發(fā)在小鼠中形成血小板富集的血栓(由組織學(xué)所證實(shí))(其最終閉塞動脈15-20分鐘)。與Folts模型相似，電解模型為評估血小板功能缺陷的優(yōu)異系統(tǒng)。c)^^<^銀^#藝一Folts和電解模型的局限是不能直接顯現(xiàn)血栓生長的動力學(xué)。已經(jīng)使用活體顯微鏡來顯現(xiàn)在激光誘導(dǎo)血管損傷之后在小鼠的腸系膜小動脈中的血栓的發(fā)展。在這種模型中，將腸系膜由腹部取出，并通過脈沖氮染色激光器(440nm;MicropointLaserSystem,PhotonicsInstruments,StCharles,IL)誘導(dǎo)的損傷定位于小動脈的內(nèi)腔表面上。該模型通過調(diào)整激光的強(qiáng)度而得到分級的血管損傷?？梢允褂玫怪肔eicaDMIRB顯微鏡直接觀察血小板的粘附和凝集以及血栓發(fā)展的全部動力學(xué)。本模型在定義血小板粘附功能的缺陷方面是經(jīng)過良好表征的。實(shí)施例13#c7-J無效勿應(yīng)的檢-1.緒論在Mc卜l(+)細(xì)胞中，通過化合物ABT-737誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。所述的細(xì)胞可以通過通用的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制劑Q-VD-OPH的作用而被救助。本檢測方法有助于發(fā)現(xiàn)具有與Q-VD-OPH的作用相當(dāng)?shù)钠渌衔??？偠灾?，使?xì)胞在第l天分裂，從而使其在第2天具有60-80%匯合率。在第2天，以確保至檢測的第4天細(xì)胞不會匯合的密度，將所述的細(xì)胞接種到檢測板中。將檢測板在室溫下溫育20-60分鐘，然后轉(zhuǎn)移到37X:下，使得邊緣效應(yīng)最小化。鑒于同樣的原因，在溫育器中，檢測板不再疊堆于彼此的頂部。在第3天，將所述的細(xì)胞首先用Q-VD或WEHI文庫化合物進(jìn)行處理。將所得的細(xì)胞在文庫化合物存在下溫育2小時，然后使用ABT-737進(jìn)行處理。最后，在第4天，將所得的細(xì)胞在CellTitre-BlueCellViabilityAssay存在下溫育4小時。所得的產(chǎn)物包含刃天青，其由活性細(xì)胞代謝成試卣靈。在4小時后，測定試卣靈的水平。2.反應(yīng)物、消耗品和儀器使Mc卜l(—"小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)在Iwaki75(^2組織培養(yǎng)燒瓶(cat#3U3-075)中生長。使MEF在FMA培養(yǎng)基中生長，其中所述的FMA培養(yǎng)基由以下成分構(gòu)成89%廳Kelso10。/。熱滅活的胎牛血清(FCS)(Hyclonecat#SH30396.03)1%lOmM天冬酰胺(Flukacat#11149).275^1的1:2000稀釋的2-巰基乙醇被加入到最終體積為500ml的FMA(Sigmacat#M7522;在MT-PBS中稀釋)中FMA在4。C下儲存，并在37。C下使用。使用FMA培養(yǎng)基、MT-PBS(Parkvillestores)和胰蛋白酶(Parkvillestores)培養(yǎng)MEF，并收獲該細(xì)胞。所有的反應(yīng)物都是在4'C下儲存，并在37。C下使用的。對于檢測而言，將細(xì)胞接種于僅含有1%FCS的FMA培養(yǎng)基中。其中所述的培養(yǎng)基由以下成分構(gòu)成98%醒Kelso(Parkvillestores).1%熱滅活的胎牛血清(FCS)(Hyclonecat#SH30396.03).1%lOmM天冬酰胺(Flukacat#11149)275|ia的1:2000稀釋的2-巰基乙醇被加入到最終體積為500ml的FMA(Sigmacat#M7522;在MT-PBS中稀釋)中將檢測物接種于具有平坦且清晰的底面的、Corning384孔組織培養(yǎng)級的黑色平板(DKSHAustraliaP/Lcat#3712)中。在Matrical384孔的5(^1V底培養(yǎng)板中制備化合物(cat#MP101-2-PP)。使用得自BeckmanCoulter的密封箔(cat#538619)將所述的化合物板密封過夜儲存。將AnalaR級DMSO用于化合物的制備和滴定(Merckcat#1.02952.2500)。將臺盼藍(lán)溶液(0.4%)(SigmaT8154)用于細(xì)胞計(jì)數(shù)。CellTitre-Blue細(xì)胞生存能力檢測儀得自Promega(cat#G8081)，并在-20。C下儲存、在37X:下使用。將Q-VD-OPH通用半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制劑(MPBiomedicalscat.#OPH109)用作陽性對照。Multidrop384(ThermoLabsystems)用于將細(xì)胞接種于檢測板中，并向細(xì)胞中加入CellTitre-BlueTM生存能力反應(yīng)物。將ZymarkScicloneALH3000系統(tǒng)用于加入對照物和化合物。WallacEnVision板讀取器(PerkinElmer)用于在入^535nm/入^590nm下測定熒光。3.方法3.1第1天一細(xì)胞分裂由細(xì)胞中吸出培養(yǎng)基，然后將所得的細(xì)胞用10ml溫暖的MT-PBS洗滌。將PBS吸出，并將2ml的胰蛋白酶加入到燒瓶中。將該燒瓶放置于37。C下，直到細(xì)胞分離為止。使用FMA培養(yǎng)基(6ml)洗滌燒瓶底部的胰蛋白酶和細(xì)胞。將全部的容量轉(zhuǎn)移至50ml的離心管中，并在250xg下離心3分鐘。吸出上清液，然后將沉淀再次懸浮于4ml10°/。的FCSFMA中。將1毫升的這種細(xì)胞懸浮液加入到裝有"ml10%FCSFMA培養(yǎng)基的干凈的75ci^燒瓶中，由此以1:4進(jìn)行分裂。根據(jù)之后幾天的檢測所需的細(xì)胞的數(shù)量，通過將剩余細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到其他75cii^燒瓶中來重復(fù)上述過程。用條形碼對第2天使用的檢測板進(jìn)行標(biāo)記。3.2第2天一接種檢測板及制備對照板重復(fù)第1天的方案，直至細(xì)胞沉淀的時間點(diǎn)，并吸出上清液。將沉淀再次懸浮于10ml1%的FCSFMA中。在1.5ml的管中，使用800^1水、lOOjnl細(xì)胞懸浮液和IOOjliI臺盼藍(lán)溶液制備1:10的稀釋液。將所得的細(xì)胞渦旋混合，然后使用血球計(jì)數(shù)器進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)算在所需的體積中獲得2xl(T個細(xì)胞mr(在裝有50pl培養(yǎng)基的每個孔中具有1000個細(xì)胞)的密度所需的稀釋液，并在1%的FCSFMA中進(jìn)行稀釋。使用Multidrop系統(tǒng)將細(xì)胞接種于檢測板的所有384個孔中。建立所述的系統(tǒng)，從而將50pl的細(xì)胞懸浮液遞送至每個孔中。使用無菌盒頭(cassettehead)，并在使用前用無菌蒸餾水充分漂洗。將檢測板在室溫下靜置60分鐘，然后在37。C/5。/。C02下放置過夜。其中檢測板并非堆疊放置。在Matrical化合物板中建立Q-VD-OPH和ABT-737板。使用原溶液濃度為12.5mM(其為在25一細(xì)胞中形成的最終濃度)的Q-VD。將10^1的這種原溶液^t置于23和24到的孔I-P中。在所有剩余的孔中，分配有l(wèi)O)nl的DMSO。ABT-737的原溶液濃度為10mM，并以10^M(其為在20nM的細(xì)胞中形成的最終濃度)用于所述的化合物板中。由此，進(jìn)行1:1000的稀釋，然后將10jal的稀釋液分配到除了23A-D,24A-D，23I-L和241-L以外的384孔Matrical板的所有孔中。將DMSO(10pl)分配到所述的16個孔中。然后，將這兩種板用箔密封，并在12。C下儲存過夜。3.3第3天一處理所述的細(xì)胞1.由冰箱中取出文庫板，并在使用前使其在室溫下解凍30-60分鐘(注意加入Q-VD-0PH的過程花費(fèi)了~60分鐘，使得在加入Q-VD-0PH的同時4吏所述的板可以解凍)。Itisimportantthatthe2.建立Zymark系統(tǒng)。開啟HEPA過濾器單元，檢查針工具以確保其是干凈的且無負(fù)載的，然后使用吸墨紙、乙醇和DMSO建立平臺(參見圖表l)。3.將Q-VD-OPH加入到細(xì)胞中。為了進(jìn)行該操作，將Q-VD-OPH板放置在平臺(參見圖表l)上，并使該板的Al角面對其中EnVision計(jì)算機(jī)所坐落的空間角落。將檢測板放置在前方Twister的疊堆l中(參見圖表l)。在Zymark臺式計(jì)算機(jī)上,打開ClaraExecutionManager。通過點(diǎn)擊"Initialize"按鈕，使所有的部件初始化。一旦完成初始化過程，l更由ApplicationChain窗口中移除任何舊應(yīng)用程序，并按照以下所述的次序添加以下的軟件(對于每個應(yīng)用而言，你需要輸入運(yùn)行的號，即，你要處理的檢測板的號)1.ControlAddition2.ControlAdditionRestack3.PintoolUnload一旦所述的過禾呈就緒并確i人，寸更會出現(xiàn)MaterialInitialization屏幕，并確認(rèn)。然后出現(xiàn)一個ZymarkStackStorage系統(tǒng)窗口，并訪問配置菜單。選擇"New",然后選擇"ControlAddition"，并確認(rèn)。再次訪問配置菜單，并對"ControlAdditionRestack"程序重復(fù)所述的過程。一旦完成上述過程，便點(diǎn)擊Clara上的"Run"按鈕，由此開始運(yùn)行。在運(yùn)行結(jié)束時，將檢測板留在堆疊器上，并將Q-VD-OPH板由Zymark平臺上取下。4.然后開始加入文庫化合物。將所述的化合物板放置在后方Twister的疊堆1中，并使Al面對MiniTrak(參見圖表1)。由Clara的ApplicationChain中移除舊的應(yīng)用程序，并按照以下的次序添加新的軟件，并且對于每個應(yīng)用而言，輸入運(yùn)行的號1.PintoolAdditionCorning2.PintoolUnload一旦完成上述過程，4更可以確認(rèn)，然后檢查MaterialInitialization窗口并確認(rèn)。然后出現(xiàn)一個ZymarkStackStorage系統(tǒng)窗口，并訪問配置菜單。選擇"New"，然后選擇"ControlAddition"，并確認(rèn)。一旦完成上述過程，便點(diǎn)擊Clara上的"Run"按鈕，由此開始運(yùn)行。在運(yùn)行結(jié)束時，將檢測板再蓋上，并返回至37°C/5%C02，再持續(xù)剩余的2小時(從向第一個檢測板中加入化合物開始計(jì)時一對于運(yùn)行20個板而言，通常大約30分鐘)。將文庫板再蓋上并返回至冰箱中儲存。7.在2個小時的溫育結(jié)束時，加入ABT-737。將Q-VD板》丈置在所述的平臺上(參見圖表1)，并使該板的Al角面對其中EnVision計(jì)算機(jī)所坐落的空間角落。將檢測板放置在前方Twister的疊堆1中。在Zymark臺式計(jì)算機(jī)上,打開ClaraExecutionManager。通過點(diǎn)擊"Init.ialize"按鈕，使所有的部件初始化。一旦完成初始化過程，便從ApplicationChain窗口中移除任何舊的應(yīng)用程序，并按照以下所述的次序添加以下的軟件(對于每個應(yīng)用而言，你需要輸入運(yùn)行的號，即，你要處理的檢測板的號)1.ControlAddition2.ControlAdditionRestack3.PintoolUnload一旦所述的過程就緒并確i人，^f更會出現(xiàn)MaterialInitialization屏幕，并確認(rèn)。然后出現(xiàn)一個ZymarkStackStorage系統(tǒng)窗口，并訪問配置菜單。選擇"New"，然后選擇"ControlAddition"，并確認(rèn)。再次訪問配置菜單，并對"ControlAdditionRestack"程序重復(fù)所述的過程。一旦完成上述過程，便點(diǎn)擊Clara上的"Run"按鈕，由此開始運(yùn)行。在運(yùn)行結(jié)束時，將檢測板再蓋上，并返回至37t:/5%C02,然后從Zymark平臺上移出ABT-737板。8.關(guān)閉HEPA過濾器，DMSO和乙醇儲存器已空且耗盡，然后按照以下的程序清洗針工具-在VP清洗溶液中浸漬10x;在VP清洗溶液中靜置5分鐘；blot-在MQ水中浸漬10x;blot-在100%乙醇中浸漬10x;blot3.4第4天一生存能力分析將CellTitre-BlueTM加溫至37。C,然后使用Multidrop將lO^il的CellTitre-BlueTM加入到測試板的各孔中。然后使所述的板返回至37°C4小時，然后加載到EnVision板讀取器中。進(jìn)行生存能力測試，然后將所得的數(shù)據(jù)輸入至Abase(IDBS)中以用于分析。實(shí)施例14^愛試對虞#謬逸參^J^定犮^類翁寧使用在實(shí)施例13中列出的方法篩選已知化合物的文庫。初步分析結(jié)果顯示出了多種活性分子，其為皮質(zhì)類甾醇并符合以下結(jié)構(gòu)式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage102</formula>式l——可以是單鍵或雙鍵A=H或F、B=H、CH3、F或OHR=H或C2-C6AcylR,=H，OH或OC2-C6AcylR2=H，Me或R,和R2形成二氧戊烯環(huán)具體而言，這些制劑(參見圖10)能夠顯著地抑制ABT-737對Mcl-1無效MEF細(xì)胞的滅殺作用。因此，這些制劑適用于增強(qiáng)或延長血小板生存能力壽命期或存活的本發(fā)明的方法中。此外，所述的制劑在延長或保持其他細(xì)胞壽命期的治療干預(yù)中具有廣泛的應(yīng)用。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會理解，本文所述的發(fā)明除了本文具體描述的那些以外，容易形成多種變體和修改形式。應(yīng)該理解本發(fā)明包括所有這些變體和修改形式。本發(fā)明還包括在本說明中所提及或敘述的所有步驟、特征、組合物和化合物(單獨(dú)地或結(jié)合地)，以及任何兩個或多個所述步驟或特征的任何和所有的組合。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage103</column></row><table>表2減^凝亞類亞類—酸性堿性帶電荷的小型極性/中性茅^類參詢鋩承々的戎差氨基酸天冬氨酸，谷氨酸非環(huán)狀的精氨酸，賴氨酸；環(huán)狀的組氨酸天冬氨酸，谷氨酸，精氨酸，賴氨酸，組氨酸甘氨酸，絲氨酸，丙氨酸，蘇氨酸，脯氨酸天冬酰胺，組氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸，絲氨酸，蘇氨酸天冬^麼，各減教應(yīng)激瘋凝，鐨減^，#;*^^，^桌^,末丙^凝，惑桌^表3<table>tableseeoriginaldocumentpage103</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage104</column></row><table>表4非常規(guī)氨基酸的代碼非常規(guī)氨基酸代碼非常規(guī)氨基酸代碼a-氨基丁酸AbuL-N-甲基丙氨酸Nmalaa-氨基-a-曱基丁酸MgabuL-N-甲基精氨酸Nmarg氨基環(huán)丙烷羧酸CproL-N-曱基天冬酰胺NmasnL-N-曱基天冬氨酸Nmasp'氨基異丁酸AibL-N-甲基半胱氨酸Nmcys氨基冰片基羧酸NorbL-N-甲基谷氨酰胺NmglnL-N-甲基谷氨酸Nmglu環(huán)己基丙氨酸ChexaL-N曱基組氨酸Nmhis環(huán)戊基丙氨酸CpenL-N-曱基異亮氨酸NmileD-丙氨酸DalL-N-曱基亮氨酸NmleuD-精氨酸DargL-N-甲基賴氨酸NralysD-天冬氨酸DaspL-N-曱基蛋氨酸NmmetD-半胱氨酸DcysL-N-甲基正亮氨酸NmnleD-谷氨酰胺DglnL-N-曱基正纈氨酸NmnvaD-谷氨酸DgluL-N-曱基鳥氨酸NmornD-組氨酸DhisL-N-曱基苯丙氨酸NmpheD-異亮氨酸DileL-N-曱基脯氨酸NmproD-亮氨酸DleuL-N-曱基絲氨酸Mms6rD-賴氨酸DlysL-N-曱基蘇氨酸NmthrD-蛋氨酸DmetL-N-甲基色氨酸NmtrpD-鳥氨酸DornL-N-甲基酪氨酸NmtyrD-苯丙氨酸DpheL-N-甲基纈氨酸NmvalD-脯氨酸DproL-N-曱基乙基甘氨酸NraetgD-絲氨酸DserL-N-甲基叔丁基甘氨酸NmtbuD-蘇氨酸DthrL-正亮氨酸NleD-色氨酸DtrpL-正纈氨酸NvaD-酪氨酸DtyrD-纈氨酸DvalD-a-甲基丙氨酸DmalaD-a-曱基精氨酸DmargD-a-曱基天冬酰胺DmasnD-a-曱基天冬氨酸DmaspD-a-甲基半胱氨酸DmcysD-a-甲基谷氨酰胺DmglnD-a-曱基組氨酸DmhisD-a-曱基異亮氨酸DmileD-a-曱基亮氨酸DmleuD-a-曱基賴氨酸DmlysD-a-甲基蛋氨酸DmmetD-a-曱基鳥氨酸DmornD-a-曱基苯丙氨酸DmpheD-a-曱基脯氨酸DmproD-a-曱基絲氨酸DmssrD-a-甲基蘇氨酸DmthrD-a-曱基色氨酸DmtrpD-a-甲基酪氨酸DmtyD-a-曱基纈氨酸DmvalD-N-曱基丙氨酸DnmalaD-N-甲基精氨酸DnmargD-N-甲基天冬酰胺DnmasnD-N-曱基天冬氨酸DnmaspD-N-曱基半胱氨酸DnmcysD-N-甲基谷氨酰胺DnmglnD-N-甲基谷氨酸DnmgluD-N-曱基組氨酸Dnmhisa-曱基-氨基異丁酸酯Maiba-甲基，-氨基丁酸酯Mgabua-甲基環(huán)己基丙氨酸Mchexaa-曱基環(huán)戊基丙氨酸Mcpena-甲基-a-萘基丙氨酸Manapa-曱基青霉胺MpenN-(4-氨基丁基)甘氨酸NgluN-(2-氨基乙基)甘氨酸NaegN-(3-氨基丙基)甘氨酸NornN-氨基-oc-曱基丁酸Nmaabua-萘基丙氨酸A卿N-千基甘氨酸NpheN-(2-氨基甲?；一?甘氨酸NglnN-(氨基曱酰基甲基)甘氨酸NasnN-(2-羧乙基)甘氨酸NgluN-(羧曱基)甘氨酸NaspN-環(huán)丁基甘氨酸NcbutN-環(huán)庚基甘氨酸NchepN-環(huán)己基甘氨酸NchexN-環(huán)癸基甘氨酸NcdecN-環(huán)十二烷基甘氨酸NcdodN-環(huán)辛基甘氨酸NcoctN-環(huán)丙基甘氨酸NcproN-環(huán)十一烷基甘氨酸NcundN-(2，2-聯(lián)苯乙基)甘氨酸NbhmN-(3,3-聯(lián)苯丙基)甘氨酸NbheN-(3-胍乙基丙基)甘氨酸NargN-(1-羥乙基)甘氨酸NthrN-(幾乙基))甘氨酸NserD-N-曱基異亮氨酸DnmileN-(咪唑基乙基))甘氨酸NhisD-N-曱基亮氨酸DnmleuN-(3-e引哚基乙基)甘氨酸NhtrpD-N-曱基賴氨酸DnmlysN-曱基—Y—氨基丁酸酯NmgabuN-曱基環(huán)己基丙氨酸NmchexaD-N-曱基蛋氨酸DnmmetD-N-曱基鳥氨酸DnmorriN-曱基環(huán)戊基丙氨酸NmcpenN-甲基甘氨酸NalaD-N-曱基苯丙氨酸DnmpheN-曱基氨基異丁酸NmaibD-N-曱基脯氨酸DnmproN-(l-甲基丙基)甘氨酸NileD-N-曱基絲氨酸DnmserN-(2-曱基丙基)甘氨酸NleuD-N-曱基蘇氨酸DnmthrD-N-曱基色氨酸DnmtrpN-(1-曱基乙基)甘氨酸NvalD-N-曱基酪氨酸DnmtyrN-甲基-萘基丙氨酸NmanapD-N-曱基纈氨酸DnmvalN-曱基青霉胺NmpenY-氨基丁酸GabuN-(r羥苯基)甘氨酸NhtyrL-卜丁基甘氨酸TbugN-(硫代甲基)甘氨酸NcysL-乙基甘氨酸Etg青霉胺PenL-高苯丙氨酸HpheL-a-甲基丙氨酸MalaL-a-曱基精氨酸MargL-a-曱基天冬酰胺MasnL-a-曱基天冬氨酸MaspL-a-曱基叔丁基甘氨酸MtbugL-a-曱基半胱氨酸McysL-曱基乙基甘氨酸MetgL-a-甲基谷氨酰胺MglnL-a-甲基谷氨酸酯MgluL-a-甲基組氨酸MhisL-a-曱基高苯丙氨酸MhpheL-a-曱基異亮氨酸MUeN-(2-曱基硫代乙基)甘氨酸NmetL-a-曱基亮氨酸MleuL-a-曱基賴氨酸MlysL-a-甲基蛋氨酸MmetL-a-曱基正亮氨酸MnleL-a-甲基正纈氨酸MnvaL-a-曱基鳥氨酸MornL-a-曱基笨丙氨酸MpheL-a-曱基脯氨酸MproL-a-曱基絲氨酸Ms6rL-a-甲基蘇氨酸MthrL-a-曱基色氨酸MtrpL-a-曱基酪氨酸MtyrL-a-甲基纈氨酸MvalL-N-曱基高苯丙氨酸NmhpheN-(N-(2,2-聯(lián)苯乙基)NnbhmN-(N-(3，3-聯(lián)苯丙基)Nnbhe氨基曱?；鶗趸?甘氨酸氨基曱?；谆?甘氨酸1-羧基-1-(2,2-聯(lián)苯-Nmbc乙基氨基)環(huán)丙烷表5添力口齊'jBlastGGMMMeg鹽1219714122i3ABT-737(1yM)1614614114之6表6<table>tableseeoriginaldocumentpage109</column></row><table>所示的值為平均值±l標(biāo)準(zhǔn)偏差MCV，平均紅細(xì)胞體積；MPV，平均血小板體積所有的小鼠都是近交BALB/c背景的，除了Ac7-Z，w。以外，其為C57BL/6和BALB/c的混合參考文獻(xiàn)Adams,GenesDev.,77:2481-2495，2003.Altschula/.，Nucl.AcidsRes.Z5.'3389,1997.Arkine"/.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,約7811—7815,1992.Aulte"/.，Exp.Hematol.，"996-1001，1992.Ausubela/.，Ci/rre/7f尸rofocoh/'/7#o/ecw/arA2'0/0^7JohnWiley&SonsInc，1994-1998，Chapter15Ausubel(Ed)Ci/7Te/7f尸ro^co/51//7￥o/ecw/arA/o/og/,5thEdition,JohnWiley&Sons,Inc，NY，2002.Bachers/.，DrugDiscoveryToday,J(6):265-273，1998.Baell，Biochem.Pharmacol.,<^(5-6):851-863，2002.Bakimere"/.,J.Clin.Invest.，"(5):1558，1992.Bergera/.，Blood4446-4452，1998.Bertinoe"/.，Transfusion(Paris),":857-866,2003.Blajchman，Transfusion(Paris),":121-125，1997.Boisee"/.，Cell,74:597-608，1993.Bo腸re"/.，Eur.J.Biochem.，"..83，1974.Booysee"入Biochim.Biophys.Acta.，757:660-663，1968.Bouillete"/.，Science,腐1735-1738，1999.Brechere"/"Transfusion(Paris),":974-978，2003.Browna/.，J.Biol.Chem.，275:5987—5996，2000.Carpinelli"a厶，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,頂6553-6558,2004.Casertae"/.，Apoptosis，《345-352，2003.Chens/.，Mol.Cell.,77:393—403，2005.Chenga人，Mol.Cell.,《705-711,2001.Chiu"a/.,Transfusion(Paris)950-954，1994.CohenWa/.，J.Med.Chem.,1990.Cohenefa/.，Thromb.Res.，387-393，2004.Coliganefa/"CurrentProtocolsinImmunology",JohnWiley&Sons,1991.Connere"/.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,M;278-282，1983.Cosulich"a/.，CurrentBiology,7:913-920，1997.Culver,Ce/er力era;77;爿尸Ti邁(？rfor戶//s/c2'a/2s，2ndEd.，MaryAnnLiebert，1996.Danialeta/.,Cell,77(5":205—219，2004.Dayhoffefa/.,Natl.Biomed.Res.Found,5":345—358，1978.DeBottona/.，BloodJOft1310-1317,2002.Degtereva人，Nat.Cell.Biol.，J:173-182，2001.Delgrave"a厶，ProteinEngineering,6:327-331，1993.DenisWaA,Cell,"2:379-391，2005.Diaze"/.,J.Biol.Chem.，"2:11350-11355，1997.Douillarda/.，BasicFactsaboutHybridomas,inCo/z7;7e/7i//i//zo尸/卿"/3o/og/Vol.II，ed.bySchwartz,1981.Drachman,Blood,390-398，2004.Enyedye"/.，J.Med.Chem.，"4313-4324，2001.Ericksona/.，Science,雄.527-533，1990.Ekert，J.Cel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求1所述的方法，其中所述的制劑增大細(xì)胞中Bcl-xL:Bak的比例。3.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的制劑為Bc卜&介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑的激動劑。4.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的制劑為Bcl-x^的激動劑。5.權(quán)利要求1所述的方法，的拮抗劑。6.權(quán)利要求1所述的方法，活性的下游效應(yīng)子的拮抗劑。7.權(quán)利要求1所述的方法，制劑的吸收或細(xì)胞活性。8.權(quán)利要求1所述的方法，9.權(quán)利要求8所述的方法，板的血液產(chǎn)品。其中所述的制劑為Bak和/或Bax其中所述的制劑為Bak和/或Bax其中所述的制劑抑制細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)其中離體施用所述的制劑。其中將所述的制劑施用于含有血小10.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述的血液產(chǎn)品為全血或血、板制備物。11.權(quán)利要求l所述的方法，其中體內(nèi)施用所述的制劑。12.權(quán)利要求1所述的方法，其中將所述的制劑施用給患血小板減少的受試對象，或者處于形成血小板減少的危險(xiǎn)中的受試對象。13.權(quán)利要求12所述的方法，其中所述的受試對象正在接受化療。14.治療或預(yù)防受試對象血小板減少的方法，該方法包括鑒定患血小板減少的受試對象或者處于血小板減少危險(xiǎn)中的受試對象；以及向所鑒定的受試對象施用能夠?qū)ρ“宓募?xì)胞凋亡進(jìn)行負(fù)調(diào)控的制劑。15.權(quán)利要求13所述的方法，其中所述的制劑增大血小板中Bc卜xjBak的比例。16.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述的制劑為Bel-XL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑的激動劑。17.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述的制劑為Bel-xt的激動劑。18.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述的制劑為Bak和/或Bax的拮抗劑。19.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述的制劑為Bcl-XL或其變體或其模擬物的Bak結(jié)合部分，或者Bel-XL或其變體或其模擬物的Bak結(jié)合部分，或者Bcl-xt或其變體或其纟莫擬物的Bak和Bax結(jié)合部20.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述的制劑為基因沉默制劑21.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述的制劑為Bak和/或Bax活性的下游效應(yīng)器的拮抗劑。22.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述的制劑抑制血小板中細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)制劑的吸收或細(xì)胞活性。23.降低血小板存活、壽命期或生存能力的方法，該方法包括施用有效量的增強(qiáng)細(xì)胞凋亡的制劑。24.權(quán)利要求23所述的方法，其中所述的制劑為Bcl-XL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑的拮抗劑。25.權(quán)利要求23所述的方法，其中所述的制劑為Bcl-xt多肽活性的拮抗劑。26.權(quán)利要求23所述的方法，其中所述的制劑為Bak多肽活性的激動劑，或者Bax多肽活性的激動劑，或者Bak和Bax多肽活性的激動劑。27.權(quán)利要求23所述的方法，其中所述的制劑為Bak和/或Bax活性的下游效應(yīng)器的激動劑。28.權(quán)利要求23所述的方法，其中所述的制劑為IAP拮抗劑。29.權(quán)利要求24所述的方法，其中所述的拮抗劑為BH3結(jié)構(gòu)域模擬物或基因沉默制劑。30.權(quán)利要求25所述的方法，其中所述的制劑為小分子、抑制性RNA、抗體、適體、肽、擬肽物質(zhì)、或者限制性肽。31.權(quán)利要求23所述的方法，其中體內(nèi)施用所述的制劑。32.權(quán)利要求23所述的方法，其中離體施用所述的制劑。33.權(quán)利要求31或32所述的方法，其中向在施用前經(jīng)過血小板增多測試的受試對象施用所述制劑。34.權(quán)利要求23所述的方法，該方法包括在損獻(xiàn)血液或血小板之前，使用血小板細(xì)胞凋亡增強(qiáng)制劑來處理血液或血小板捐獻(xiàn)者，以減小所捐獻(xiàn)的血液或血小板中血小板的平均年齡。35.治療或預(yù)防受試對象中血小板增多的方法，該方法包括鑒定患血小板增多的受試對象或者處于血小板增多危險(xiǎn)中的受試對象；以及向所鑒定的受試對象施用能夠促進(jìn)血小板的細(xì)胞凋亡的制劑。36.權(quán)利要求35所述的方法，其中所述的制劑為Bcl-x^介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑的拮抗劑。37.權(quán)利要求35所述的方法，其中所述的制劑為Bc1-Xl的拮抗劑。38.權(quán)利要求35所述的方法，其中所述的制劑為Bak和/或Bax的激動劑。39.權(quán)利要求35所述的方法，其中所述的制劑為Bak和/或Bax活性的下游效應(yīng)器的激動劑。40.權(quán)利要求36所述的方法，其中所述的拮抗劑為BH3結(jié)構(gòu)域模擬物。41.權(quán)利要求35所述的方法，其中所述的制劑為小分子、抑制性RNA、抗體、適體、肽、擬肽物質(zhì)、或者限制性肽。42.權(quán)利要求35所述的方法，其中所述的制劑以能夠有效誘導(dǎo)無核血小板細(xì)胞凋亡、但基本上不誘導(dǎo)有核細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的量和/或時間進(jìn)行施用。43.權(quán)利要求42所述的方法，其中所述的制劑為Bel-xt介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑的拮抗劑。44.用于治療或預(yù)防血小板減少的組合物，該組合物包含有效量的能夠抑制血小板細(xì)胞凋亡的制劑。45.權(quán)利要求44所述的組合物，其中所述的制劑增大血小板中Bcl-xjBak的比例。46.用于增加儲存的血小板的半衰期的組合物，該組合物包含有效量的能夠抑制所述儲存的血小板的細(xì)胞凋亡的制劑。47.用于治療或預(yù)防血小板增多的組合物，該組合物包含有效量的能夠促進(jìn)血小板細(xì)胞凋亡的制劑。48.用于篩選調(diào)控血小板的存活、壽命期或生存能力的制劑的方法，該方法包括(i)使所述的制劑與包含靶標(biāo)的系統(tǒng)接觸，其中所述的靶標(biāo)選自Bc1-Xl和/或Bak或Bax多肽，以及Ac/i、Aair或^21基因序列；以及(n)測定所述制劑與所述靶標(biāo)之間的復(fù)合體的存在情況，所述耙標(biāo)的活性的變化情況，或者所述靶標(biāo)的活性的指示劑活性水平的變化情況。49.用于篩選增強(qiáng)血小板和/或其他哺乳動物細(xì)胞的存活、壽命期或生存能力的分子的方法，該方法包括(i)將所述的分子與細(xì)胞組合；(ii)使所述的細(xì)胞與一種或多種制劑接觸，其中所述的制劑拮抗所述的細(xì)胞中促存活Bel-2家族分子并且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；(iii)相對于對照，測定在所述分子存在下細(xì)胞存活(生存能力、壽命期、半衰期)的變化情況；(iv)選擇增強(qiáng)細(xì)胞存活(生存能力、半衰期)的分子；以及(v)任選將來自(iv)的所選出的分子與血小板組合，以相對于對照，測定在所述分子存在下血小板的細(xì)胞存活(生存能力、半衰期)的變化情況。50.權(quán)利要求49所述的方法，其中對所述的細(xì)胞進(jìn)行修飾從而增強(qiáng)其對細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)制劑的敏感性。51.權(quán)利要求50所述的方法，其中通過降低一種或多種促存活Bcl-2家族成員的水平或活性來對所述的細(xì)胞進(jìn)行修飾。52.權(quán)利要求50所述的方法，其中通過基因破壞來將所述的細(xì)胞修飾成缺少一種或多種促存活Bcl-2家族成員。53.權(quán)利要求49所述的方法，其中所述的細(xì)胞為得自多細(xì)胞有機(jī)體的Mcl-1缺陷型細(xì)胞，而所述的制劑為Bcl-xj吉抗劑。54.權(quán)利要求49所述的方法，其進(jìn)一步包括鑒定Bcl-2家族蛋白質(zhì)在所述的細(xì)胞中的調(diào)控情況。55.—種用于對有需要的受試對象進(jìn)行施用的經(jīng)修飾的血小板群，其中所述的血小板包括離體儲存并與細(xì)胞凋亡拮抗劑接觸以便增加血小板半衰期的血小板群。56.權(quán)利要求55所述的經(jīng)修飾的血小板群，其中所述的制劑包括Bc卜x^的激動劑或Bak的拮抗劑。57.—種用于治療或預(yù)防血小板減少的細(xì)胞凋亡抑制劑。58.權(quán)利要求57所述的細(xì)胞凋亡抑制劑，其與癌癥的治療聯(lián)合使用。59.—種用于治療或預(yù)防血小板減少的細(xì)胞凋亡抑制劑，其增大血小板中Bcl-xL:Bak的比例。60.—種用于增加儲存的血小板的半衰期的細(xì)胞凋亡抑制劑。61.—種用于減小儲存的血小板的平均年齡的細(xì)胞凋亡促進(jìn)劑，其中在給血前，使用所述的細(xì)胞凋亡促進(jìn)劑處理血液或血小板供體。62.用于治療或預(yù)防血小板增多的細(xì)胞凋亡促進(jìn)劑。63.包含用于治療或預(yù)防血小板減少的細(xì)胞凋亡抑制劑的制劑盒。64.包含用于增加儲存的血小板半衰期的細(xì)胞凋亡抑制劑的制劑盒。65.權(quán)利要求l所述的方法，其中所述的制劑為小分子。66.根據(jù)權(quán)利要求1至13的任意一項(xiàng)中所述的增強(qiáng)或保持血小板的生存能力或壽命期的方法，該方法包括施用式1所示的制劑。67.增強(qiáng)或保持血小板的生存能力或壽命期的方法，該方法包括施用一種制劑，該制劑選自圖10所示的制劑(a)至(d)中的一種。68.用于治療或預(yù)防血小板減少的細(xì)胞凋亡抑制劑或細(xì)胞凋亡延遲劑，所述的制劑包含式1所示的結(jié)構(gòu)。69.用于增強(qiáng)儲存的血小板的生存能力或存活的細(xì)胞凋亡抑制劑或細(xì)胞凋亡延遲劑，所述的制劑包含式l所示的結(jié)構(gòu)。全文摘要本說明書公開了多種增強(qiáng)或保持血小板的生存能力或壽命期的方法，該方法包括施用對細(xì)胞凋亡進(jìn)行負(fù)調(diào)控的制劑。本說明書還公開了降低血小板的存活、壽命期或生存能力的方法，該方法包括施用有效量的能夠增強(qiáng)細(xì)胞凋亡的制劑。文檔編號A61P7/00GK101541379SQ200780033800公開日2009年9月23日申請日期2007年8月10日優(yōu)先權(quán)日2006年8月11日發(fā)明者A·W·羅伯特,B·T·奇勒,D·C·S·黃,K·D·瑪森,M·R·卡皮尼利申請人:沃爾特及伊萊薩霍爾醫(yī)學(xué)研究院