專利名稱：一種抗腫瘤人源單鏈抗體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種人源抗體。具體地說是一種具有抗腫瘤活性的特異性識別CDK4 蛋白的人源單鏈抗體的基因獲得及活性表征。
背景技術：
腫瘤是威脅人類生命健康的主要殺手，目前尚缺乏有效治療手段。腫瘤細胞惡性增殖的主要原因之一是細胞周期失控。Evan GI等2001年在 Nature,2001,411 :342-348中提出細胞周期調控機制的核心是周期蛋白依賴性蛋白激酶 (cyclin-dependent kinases, CDKs)時相性激活。CDKs 是一類 kr/Thr 蛋白激酶，其活性 依賴于與周期蛋白(Cyclin)的結合。CDKs的異常活化將導致細胞周期失控，從而誘發(fā)腫 瘤的形成。Malumbers M 等 2005 年在 Trends in Biochemical Sciences, 2005, 30 (11) 630-641中總結提出，目前已發(fā)現(xiàn)11種同源的CDK分子，即CDKl 11。其中Matsushime等 1992年在Cell, 1992，71 (2) :323-334中最早分離得到CDK4基因，CDK4基因定位于染色體 12ql3 14，mRNA序列全長為2. 14kb，其cDNA開放讀碼框架為912bp，編碼303個氨基酸 的蛋白質，分子量約為34kD，與⑶K2非常接近。⑶K4主要存在三個功能區(qū)在9 觀個殘 基之間，是ATP的結合部位和該酶的活性部位；在42 51個殘基之間，是調節(jié)亞基的結合 部位；在177 208個殘基之間，是pl3的結合部位。因為⑶K4分子中缺乏典型的PSTA^ 序列，故CyclinA、Cyclin B和Cyclin E均不能激活CDK4，只有Cyclin D家族成員對CDK4 具有活化功能。Sherr CJ and Roberts M 2004 年在Genes Dev,2004,18 :2699-2711 中指出 CDK4 作為細胞進入增殖周期第一個被激活的周期蛋白依賴性蛋白激酶，通過與CyclinDl結合 形成有活性的CyclinDl/CDK4激酶復合物，促進細胞GO — S期的轉換，是細胞周期進程中 G1/S 期轉換的限速因子。Deshpande A 等 2005 年在 Oncogene，2005，24 :2909-2915 中提 出在許多腫瘤細胞中存在CDK4過度表達和過度活化，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切關系。 Bonin S 等 2006 年在 Virchows Archiv, 2006,448 (5) :539-544 中發(fā)現(xiàn) CDK4 與腫瘤的預后 密切相關。美國Reddy等人2005年在Cancer Res, 2005,65 (22) :10174-10178的研究結果 顯示⑶K4的表達是導致一些乳腺癌發(fā)生的必要因子，并提出抑制⑶K4活性的治療可能是 治療乳腺癌高度特異性的途徑。哈佛醫(yī)學院的Yu等2006年在Cancer Cell, 2006,9 (1) 23-32中對CDK4基因敲除鼠模型的最新研究結果表明，乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展需要CDK4激酶 的持續(xù)活化，因此，Malumbres M 和 Barbacid M 2006 年在 Cancer Cell, 2006,9 (1) :2_4 中 也提出抑制CDK4激酶活性將有利于乳腺癌治療。這些結果都為CDK4作為腫瘤治療的一個 有效靶點提供了實驗依據(jù)。Dai Y禾口 Grant S 2004 年在 Curr Oncol Rep, 2004,6 (2) 123 中提出抑制 CDK4 催 化活性的小分子化合物能夠阻滯腫瘤細胞增殖，誘導細胞凋亡，抑制CDKs活性的研究將為 腫瘤治療藥物的設計提供新思路。桑建利等1999年在科學通報，1999,44(2) :184中利用反 義RNA抑制乳腺癌細胞中CDK4基因的表達，致使細胞的增殖速率和致瘤性明顯降低，抑制腫瘤細胞增殖。Grillo M 等 2006 年在 Breast Cancer Res Treat, 2006,95 (2) :185-194 中 證實通過應用針對⑶K4的siRNA作用于腫瘤細胞時，腫瘤細胞的生長均得到了控制。這些 研究成果表明，抑制CDK4活性均能抑制腫瘤細胞增殖，CDK4是腫瘤治療的一個有效靶點。但上述抑制CDK4活性的抗腫瘤治療研究中存在如下問題和缺點首先，小分子抑 制劑的特異性和腫瘤細胞靶向性問題很難解決，這樣就會產生明顯的毒副作用；其次反義 技術及RNA干擾技術存在相對不穩(wěn)定、作用范圍較窄等問題。因而不能實現(xiàn)CDK4的靶向、 高效滅活。單鏈抗體是用基因工程方法制備的小分子抗體，是由彈性連接肽(一般為12-15 個氨基酸)將抗體的重鏈可變區(qū)(VH)與輕鏈可變區(qū)(VL)連接而成的重組抗體，其分子量 只相當于原天然抗體的六分之一，但單鏈抗體含有全部的抗原結合位點，所以單鏈抗體最 大程度的保留了抗體的抗原結合活性，是具有親本抗體抗原結合活性的最小片段。單鏈抗 體出現(xiàn)以后，人們在研究單鏈抗體的過程中，發(fā)現(xiàn)單鏈抗體具有一些無可比擬的優(yōu)越性，所 以人們就利用現(xiàn)有技術對單鏈抗體進行了改造和修飾，以完善單鏈抗體的功能和發(fā)展新的 用途，其中胞內抗體(intracellular antibody or intrabody)技術是近年來，隨著人們對 抗體工程和細胞內信號傳導的深入研究，派生出一項全新的可阻斷細胞內重要靶蛋白的抗 體技術。胞內抗體技術可以通過添加細胞核定位信號或內質網(wǎng)滯留信號等方法對抗體分子 進行適當修飾，使之定向分布于細胞核、細胞漿或某些細胞器中，從而特異性干擾或阻斷分 布于該部位的某些生物大分子的活性或加工、分泌過程，引起細胞的一系列生物過程發(fā)生 改變，從而達到結合和失活任一胞質結構的作用，實現(xiàn)重要靶分子的表型敲除。它是繼反義 RNA、特異性核酶、顯性負突變、自殺基因等技術之后又一新型基因治療途徑。并且與新發(fā)展 起來的RNAi技術相比，胞內抗體能夠高特異性、高穩(wěn)定性地作用于細胞內的蛋白質，在抗 腫瘤基因治療中具有巨大潛力和應用前景。

發(fā)明內容
鑒于上述抑制⑶K4活性的小分子抑制劑存在的缺乏特異性和腫瘤細胞靶向性造 成的毒副作用及反義技術及RNA干擾技術存在的相對不穩(wěn)定、作用范圍較窄等問題，本發(fā) 明的目的是提供一種低毒、高效、特異、穩(wěn)定的抑制CDK4的活性分子，即抗CDK4人源單鏈抗 體，并實現(xiàn)其在細胞內有效敲除CDK4的表型功能，從而達到抑制腫瘤細胞增殖的目的。為 了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術方案是一種抗腫瘤人源單鏈抗體是特異性抗人CDK4人源單鏈抗體，其核苷酸序列如 Sequence NO. 1 所述。本發(fā)明的一種抗腫瘤人源單鏈抗體還包含核定位信號肽NLS、E_tag標簽肽基因 編碼序列，其核苷酸序列如kquence NO. 2所述。 一種抗腫瘤人源單鏈抗體，在制備具有抗腫瘤作用的藥物中的應用。本發(fā)明所述的抗腫瘤人源單鏈抗體的應用，所述的腫瘤為人乳腺癌和人宮頸癌。以重組人⑶K4蛋白為抗原，通過“吸附-洗脫-擴增”淘選過程從人源噬菌體抗 體庫中篩選獲得特異性抗人⑶K4蛋白的單鏈抗體基因ANK4，進一步通過原核表達、ELISA、 Western blot和免疫沉淀等技術，對ANK4蛋白進行活性表征，即獲得特異性的抗人CDK4人 源性單鏈抗體。由于細胞核是CDK4的主要活化功能區(qū)，為了實現(xiàn)ANK4特異性干擾或阻斷分布于細胞核的CDK4的活性，實現(xiàn)CDK4的表型敲除，從而發(fā)揮ANK4的抗腫瘤作用，進一步 以ANK4為模板，通過聚合酶鏈式反應(PCR)克隆入細胞核定位信號，E-tag檢測信號，添加 相應酶切位點，即獲得抗CDK4人源胞內單鏈抗體基因NANK4，進而將其亞克隆到真核表達 載體pcDNA3. 1中，從而構建了重組細胞核定位型抗CDK4人源胞內單鏈抗體基因的真核表 達載體pNANK4。將構建的真核表達載體PNANK4轉染人類乳腺癌MCF-7細胞株和人類宮頸 癌HeLa細胞株后，對重組細胞核定位型抗⑶K4人源胞內抗體基因的表達情況、定位情況以 及體外生物活性進行了系列研究，結果表明，抗CDK4人源單鏈抗體ANK4添加細胞核定位信 號后獲得的細胞核定位型抗CDK4人源胞內單鏈抗體基因(NANK4)能夠在腫瘤細胞中有效 表達并實現(xiàn)ANK4的目標定位。該基因的穩(wěn)定表達能夠顯著抑制細胞生長和增殖，引起細胞 周期阻滯，并明顯誘導細胞凋亡。本發(fā)明具有如下優(yōu)點本發(fā)明中所獲得的人源抗CDK4單鏈抗體ANK4是一種低毒、 高效、特異的抑制CDK4的活性的分子，由于該抗體為人源性抗體，避免了異源抗體用于人 體的毒副作用，該抗體是小分子的單鏈抗體，具有分子量小、免疫原性低等優(yōu)點，克服了以 往單克隆抗體分子量大、免疫原性高的缺點，另外可以通過引入細胞核定位信號，進一步重 組到真核表達載體中，使該單鏈抗體在細胞內特定部位高效、穩(wěn)定結合、滅活CDK4功能，為 腫瘤治療開辟新途徑。另外，還可以通過使用腫瘤特異性真核表達載體，進行該抗體的腫瘤 靶向治療，實現(xiàn)該治療基因的可控性，這樣不僅能充分發(fā)揮抗體的抑瘤作用，而且具有腫瘤 特異性，確保治療的安全有效。


圖1.噬菌體抗體與⑶K4抗原結合能力測定。圖2. ELISA法檢測可溶性單鏈抗體與⑶K4蛋白的結合活性。圖3. SDS-PAGE分析ANK4的可溶性表達及純化。1.蛋白分子量標準；2為 ANK4/HB2151載體對照菌；3和4分別為ANK4/HB215IIPTG誘導前、后菌體沉淀；5. ANK4/ HB215IIPTG誘導上清；6.樣本5經鎳柱流出液；7. 40mM咪唑洗滌流出液；8. 500mM咪唑洗 脫液。圖 4. Western blot 鑒定 ANK4。1. ANK4/HB2151 未經 IPTG 誘導上清；2. ANK4/ HB2151IPTG誘導上清；3.純化的ANK4蛋白。圖5. Westernblot檢測純化的ANK4與重組人CDK4結合活性。1. pET28a-CDK4/ BL21IPTG誘導前菌體沉淀；2.純化的重組人CDK4蛋白。V5Ab 抗V5抗體。圖6· ANK4的親和力測定。圖7.抗⑶K4多克隆抗體對ANK4的競爭性抑制。A.只加入抗⑶K4多克隆抗體； B.同時加入抗CDK4多克隆抗體和ANK4 ;C.只加入ANK4。*p < 0. 01 vs A or C。圖8. Western blot檢測純化的ANK4與MCF-7細胞內源性表達的⑶K4結合活性。 A.陰性對照組，NC膜不與ANK4蛋白孵育，直接與抗V5抗體作用。B.實驗組，NC膜首先與 ANK4蛋白孵育，然后與抗V5抗體反應。以β-actin作為細胞裂解液Wfestern blot蛋白加 樣的內參對照。V5Ab 抗V5抗體。圖9.免疫共沉淀分析ANK4與細胞內源性表達的⑶K4結合活性。V5Ab 抗V5抗 體；CDK4Ab 抗 CDK4 抗體。
圖10. NANK4的PCR擴增及重組表達載體pNANK4構建。其中A. PCR擴增結果。 1. DL-2000Marker ；2. PCR產物；3.純化的PCR產物；B.重組表達載體pNANK4的鑒定。1. Ikb DNA ladder marker ；2.pcDNA3. 1 ；3.ρ ΝΑΝΚ4 ；4.pcDNA3. 1/Hind III+EcoRI ；5. pNANK4/ Hind III+EcoR I ；6. NANK4/Hind III+EcoR I ；7. DL_2000Marker。圖11. RT-PCR分析NANK4在穩(wěn)定轉染細胞中的表達。圖12.免疫熒光檢測NANK4在穩(wěn)定轉染細胞中的表達及定位。A.MCF-7細胞； B. HeLa細胞。Hoechst 33342與細胞核區(qū)域結合，發(fā)出藍色熒光。抗Ε-Tag抗體和FITC標 記的二抗檢測細胞內表達的NANK4，發(fā)出綠色熒光，Merge是將同一區(qū)域的藍色熒光和綠色 熒光疊加。圖 13. Western-blot 分析 NANK4 在穩(wěn)定轉染細胞中的表達。1. MCF-7 ；2. MCF-7/ pcDNA3. 1 ；3.MCF-7/pNANK4 ；4. HeLa ；5. HeLa/pcDNA3. 1 ；6.HeLa/pNANK4。圖14.免疫共沉淀實驗檢測NANK4與⑶K4在細胞內的結合。1. MCF-7 ；2. MCF-7/ pcDNA3. 1 ；3.MCF-7/pNANK4 ；4. HeLa ；5.HeLa/pcDNA3. 1 ；6. HeLa/pNANK4。圖15A. MTT法測定NANK4對MCF-7細胞的體外增殖活性影響。圖15B. MTT法測定NANK4對HeLa細胞的體外增殖活性影響。圖16.流式細胞儀檢測NANK4對細胞周期影響。1. MCF-7 ；2. MCF-7/ pcDNA3. 1 ；3. MCF-7/pNANK4 ；4. HeLa ；5. HeLa/pcDNA3. 1 ；6.HeLa/pNANK4。*p < 0. 01 vs MCF-7orMCF-7/pcDNA3. Iat the same phase, η = 3 ；**ρ < 0. 01 vs HeLa or HeLa/ pcDNA3. 1 atthe same phase,η = 3。圖17. Armexin-V檢測NANK4對細胞凋亡的影響。其中A為各組代表性圖片；B為統(tǒng) 計學分析結果。1. MCF-7 ；2. MCF-7/pcDNA3. 1 ；3. MCF_7/pNANK4 ；4. HeLa ；5. HeLa/pcDNA3. 1 ； 6. HeLa/pNANK4。*ρ < 0. 01 vs MCF-7 or MCF_7/pcDNA3. 1，η = 3 ;**p < 0. 01 vs HeLa or HeLa/pcDNA3. 1，η = 3。
具體實施例方式實施例1特異性抗人CDK4人源單鏈抗體的制備，為了便于閱讀，本專利“特異性抗 人CDK4人源單鏈抗體”以下簡稱“ANK4”一、實驗材料1.質粒和菌株大腸桿菌(Escherichia coli)DH5 α、HB2151和XLl-Blue購自北京鼎國生物技 術有限責任公司。PUC119質粒購自大連寶生物工程有限公司。輔助噬菌體VCSM13購自 Stratagene 公司。2.分子克隆主要相關試劑細菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨(tryptone)，酵母提取物(yeast extract)，購自Oxid公 司。原核表達并用Ni-NTA Agarose純化的重組人⑶K4蛋白參照曹玉華等2008年在吉林 大學學報(理學版)，2008，46 (5) =992-996中的方法制備；HRP/Anti_M13單克隆抗體購自 Pharmacia公司，抗V5單克隆抗體為Invitrogen公司產品；anti_CDK4antibody購自Santa Cruz Biotechnology公司。鐵蛋白(Fer)和卵清蛋白(OA)、0PD、考馬斯亮藍R-250、G_250、 PMSF、Tris、BSA、抗生素(Amp、Tet)購自 Sigma 公司。His TrapHP Kit、PD-10 脫鹽柱購自Amersham Bioscience。脫脂奶粉購自Bio-Rad公司。硝酸纖維素(NC)膜購自Amersham Bioscience。ECL發(fā)光試劑盒購自iTransgen生物技術公司。蛋白Marker、HRP標記羊抗小 鼠IgG、Eppendorf管、移液器槍尖等塑料耗材購自北京鼎國生物技術有限責任公司。其他 試劑均為分析純的國產生化試劑。質粒提取、純化試劑盒，購自Promega公司。3.相關溶液的配制參照《分子克隆實驗指南》。二、實驗方法 1.抗⑶K4人源單鏈抗體基因ANK4的篩選噬菌體人源單鏈抗體庫的獲得具體參照文獻Sblattero D等Nat Biotechnol, 2000，18 74-80 及 Sblattero D 等 1998 年在 Immunotechnology, 1998，3 :271-278 的方法 進行，通過滴度測定表明，最終獲得庫容為IXlO11的噬菌體人源單鏈抗體庫?？贵w庫的篩選采用固相化抗原免疫吸附篩選法，將人CDK4蛋白用0. 05mol/L碳酸 鹽緩沖液稀釋至ΙΟΟμ g/ml，以Iml包被免疫管(NUNC公司)，參照李春英等在中國皮膚性 病學雜志，2005，19 =388-390中所述方法對抗體庫進行4輪“吸附-洗脫-擴增”篩選。每 一輪篩選均測定次級庫滴度，并計算噬菌體投入/產出比(回收率)，作為特異性噬菌體抗 體富集的指標。從第4輪篩選的菌落培養(yǎng)盤中隨機挑取100個克隆，接種在2 X YT中培養(yǎng)，用輔助 病毒VCSM13超感染誘導培養(yǎng)過夜后，收集上清為噬菌體抗體。以10 μ g/ml的人⑶K4為 抗原包被ELISA板，經1 % BSA封閉后加入待測噬菌體抗體上清，以HRP/Anti-M13單克隆 抗體為二抗，孵育、洗滌后OPD底物顯色；顯色陽性的克隆再以人鐵蛋白(Fer)和卵清蛋白 (OA)與目的抗原⑶K4同時包被ELISA板，鑒定其抗原抗體反應的特異性，所用二抗為HRP/ Anti-M13單克隆抗體，加入OPD顯色后，讀取A49tl值。將A49tl值陽性的特異性結合目的抗原的噬菌體抗體上清感染對數(shù)生長期的 冊2151菌株，371孵育301^11后涂布2\￥11平板(5(^8/1111 Amp)。次日挑取單個菌落于 2XYT培養(yǎng)液中培養(yǎng)過夜后以1 100稀釋轉接，培養(yǎng)到對數(shù)生長期，加入IPTG至終濃度 為lmmol/L，30°C誘導培養(yǎng)過夜，離心收集上清即為可溶性單鏈抗體。以2 μ g/ml人⑶K4包 被ELISA板，封閉后加入待檢測表達上清，37°C孵育lh，洗滌后加入適當稀釋的Anti-V5單 克隆抗體，37°C孵育1小時，洗滌后加入適當稀釋的HRP-羊抗小鼠IgGj^AOPD顯色后， 讀取A49tl值。選擇結合活性最高的克隆的噬菌抗體上清感染對數(shù)生長期的XLl-Blue菌株， 37°C孵育30min后涂布2 X YT平板(20 μ g/ml Amp, 10 μ g/ml Tet)。次日挑取單個菌落于 2 X YT培養(yǎng)液(20 μ g/ml Amp, 10 μ g/ml Tet)中培養(yǎng)過夜后，保存菌種并按Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System試劑盒操作說明提取質粒，由上海生工生物工程 有限公司進行測序。2.抗⑶K4單鏈抗體ANK4的可溶性表達與純化將ANK4克隆接種于400ml含Amp+抗性的2 X YT培養(yǎng)基中，ImM的IPTG誘導過夜 后離心收集上清。上清中加入40% -60%的硫酸銨進行低溫沉淀，12000rpm離心20min收 集沉淀的蛋白，沉淀的蛋白經PH7. 4的0. OlM PBS溶解，透析、除鹽；由于表達的抗⑶K4單 鏈抗體的C末端含有His-Tag，所以沉淀的蛋白經除鹽后可以用His Trap HPKit進行純化。 純化時，His Trap HP Kit柱先用含10mmol/L咪唑的Binding Buffer平衡，將經過過濾的 蛋白溶液上柱，然后依次用Binding Buffer和含有咪唑的洗滌Buffer分別上柱清滌雜蛋白，以500mmol/L咪唑作為洗脫液，收集各個流出組份并進行SDS-PAGE電泳，確定最佳洗滌 濃度。純化的蛋白用Bradford比色法測定蛋白含量。3. Western blot 分析鑒定 ANK4 抗體將純化的蛋白經12%的SDS-PAGE電泳后；半干式轉移槽IOOmA轉移池，將蛋白轉 移到硝酸纖維素(NC)膜上；取出NC膜，PBST洗滌之后放入5%脫脂奶粉-PBST中室溫封 閉Ih ；將NC膜取出放入抗V5單克隆抗體(1 5000稀釋于5%脫脂奶粉-PBST中)中室 溫孵育；取出，PBST振蕩洗滌3次，每次IOmin ；再將NC膜放入HRP標記的羊抗小鼠IgG 中(1 5000稀釋于5%脫脂奶粉-PBST中)室溫孵育Ih ；PBST中洗滌3次，每次IOmin ； ECL發(fā)光試劑盒檢測目的條帶的出現(xiàn)。三、結果與分析1.抗⑶K4人源噬菌體抗體的篩選經過4輪篩選，噬菌體抗體回收率得到約70倍富集，從最后1輪挑取的100個克隆 制備噬菌體抗體，用ELISA方法進行初篩，結果發(fā)現(xiàn)有15個可與人CDK4抗原結合的克隆， 再用鐵蛋白O^er)和卵清蛋白(OA)作為對照抗原進行噬菌體ELISA鑒定，僅9個克隆的噬 菌體抗體能與人CDK4特異性結合，與無關抗原不具備結合特性(附圖1)。2.可溶性單鏈抗體的表達及結合活性為了檢測獲得的噬菌體抗體與人CDK4的結合活性，將9個陽性克隆的噬菌體抗體 上清感染無琥珀抑制的菌株HB2151，IPTG誘導可溶性單鏈抗體表達，以人⑶K4包被ELISA 板，以可溶性表達上清、Anti-V5單克隆抗體和HRP-羊抗小鼠IgG為抗體，進行ELISA檢測， 結果顯示只有4個克隆具有特異性結合活性(附圖2)。經測序和后續(xù)分析結果顯示，結合 活性最高的7號克隆的基因全長744bp (序列見kquence No. 1)，編碼248個氨基酸。該抗 體的輕鏈為λ鏈，能夠與CDK4特異性結合，因此我們將其確定為抗CDK4人源單鏈抗體，命 名為ΑΝΚ4，并進行了 一系列研究。3.抗⑶Κ4人源單鏈抗體ΑΝΚ4的可溶性表達、純化及鑒定將ΑΝΚ4/ΗΒ2151的IPTG誘導上清進行硫酸銨沉淀，沉淀經過溶解和透析后進行親 和純化。由于細菌蛋白可能含多聚組氨酸，且存在非特異性結合，為了得到純度較高的蛋 白，曾進行過多次純化條件摸索。當以含IOmM咪唑的結合緩沖液、含40mM咪唑的洗滌緩沖 液、含500mM咪唑的洗脫緩沖液純化效果較好。結果如附圖3所示，經SDS-PAGE分析，500mM 咪唑洗脫下來的溶液在約30kD處出現(xiàn)一條明顯的蛋白條帶。經過BandScan掃描分析，蛋 白純度約為96%。將純化的抗⑶K4單鏈抗體經過SDS-PAGE電泳后，以抗V5Tag單克隆抗 體為一抗對其進行Astern blot分析。結果如附圖4所示，IPTG誘導的ANK4/HB2151上 清和純化后的抗CDK4單鏈抗體樣品泳道在30kDa處有特異性目的條帶出現(xiàn)，而在未經誘導 的ANK4/HB2151上清中未檢測到目的條帶。這些結果表明已成功實現(xiàn)了抗⑶K4單鏈抗體 的可溶性表達和純化。純化得到的ANK4蛋白保存于_80°C，用于活性表征。實施例2抗⑶K4人源單鏈抗體ANK4的活性表征一、實驗材料pEI^8a-CDK4/BL21 (DE3)菌株參照曹玉華等2008年在吉林大學學報(理學版)， 2008,46(5) :992-996中的方法制備。人乳腺癌MCF-7細胞株為吉林大學免疫教研室提供。 細胞培養(yǎng)用DMEM、小牛血清購自Gibco公司。DTT、胰蛋白酶、Protein G on Sepharose 4Bfast flow購自Sigma公司，抗β -actin鼠單克隆抗體購自Sigma公司，兔抗⑶K4多克隆 抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司，HRP標記的羊抗兔IgG購自北京鼎國生物技術 有限責任公司。細胞培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶、細胞刮購自Costar公司。其余試劑及材料參照實施 例1。 二、實驗方法 1. Western blot分析純化的抗⑶K4單鏈抗體ANK4與重組人⑶K4的結合活性重組人⑶K4蛋白經12%的SDS-PAGE電泳后；半干式轉移槽IOOmA轉移2h，將蛋 白轉移到硝酸纖維素(NC)膜上；取出NC膜，PBST洗滌之后放入5%脫脂奶粉-PBST中室溫 封閉Ih ；將NC膜取出放入ANK4 (20 μ g/ml稀釋于5%脫脂奶粉-PBST中)中室溫孵育池； 再以抗V5抗體(1 5000稀釋于5%脫脂奶粉-PBST中)為一抗，HRP標記的羊抗小鼠IgG 為二抗，ECL發(fā)光試劑盒檢測目的條帶的出現(xiàn)。2.抗CDK4單鏈抗體ANK4親和力的測定首先用經過2η梯度稀釋的⑶K4蛋白100 μ 1于4°C包被聚苯乙烯板過夜；次日 棄上清，用0. 05% BSA-PBST 200 μ 1封閉Ih ；再加入經過2η梯度稀釋的抗⑶Κ4單鏈抗體 100 μ 1室溫孵育2h;棄上清，加入抗V5鼠單克隆抗體(以0.05% BSA-PBST按1 5000稀 釋)孵育2h ；棄上清，再加入50 μ 1 HRP-羊抗小鼠IgG (以0. 05% BSA-PBST按1 5000 稀釋)；以OPD為底物避光顯色，讀取0D490的值。然后按照公式(n[Abl]-[Ab])/(n-l)計 算抗CDK4單鏈抗體的親和常數(shù)，η為抗CDK4單鏈抗體的稀釋倍數(shù)，Ab和Abl分別表示當抗 原濃度為Ag和Agl時，l/2Max0D490對應的抗CDK4單鏈抗體濃度。3. ELISA法檢測抗⑶K4多克隆抗體與抗⑶K4單鏈抗體ANK4的競爭性結合以10 μ g/ml的重組人CDK4蛋白包被ELISA板并4 °C過夜；次日以0. 05 % BSA-PBST封閉2h ；然后每孔加入50 μ 1純化的抗⑶Κ4單鏈抗體ΑΝΚ4 (10 μ g/ml)，加入等 體積的兔抗⑶K4多克隆抗體作為競爭性抑制劑(以0. 05% BSA-PBST按1 2000稀釋) 共同孵育(所得A490的值即抑制后A值)，以不加競爭性抑制劑作為陽性對照(所得A490 的值即抑制前A值)，以不加抗CDK4單鏈抗體而只加兔抗CDK4多克隆抗體為陰性對照，孵 育2h后加入50μ1抗V5鼠單克隆抗體(以0. 5000稀釋)孵育2h， 再加入50 μ 1 HRP-羊抗小鼠IgG (以0. 05 % BSA-PBST按1 5000稀釋)，以OPD為底物 避光顯色，讀取A49tl的值。用以下公式計算抑制率抑制率=100% Χ(抑制前A值-抑制 后A值)/抑制前A值4.MCF-7細胞的培養(yǎng)MCF-7細胞培養(yǎng)于含10%小牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中，37°C飽和濕度、5% C02 孵箱中培養(yǎng)。細胞貼壁生長，每3-5天胰蛋白酶消化細胞，傳代培養(yǎng)。5. Western blot 實驗將收集的MCF-7細胞(每管約2 X IO6個)加入20 μ 1 SDS-PAGE上樣緩沖液，混勻 后冰浴30min，沸水煮樣3-5min后進行12% SDS-PAGE電泳；半干式轉移槽IOOmA轉移2h， 將蛋白轉移到硝酸纖維素(NC)膜上；取出NC膜，PBST洗滌之后放入5%脫脂奶粉-PBST中 室溫封閉Ih ；將NC膜取出放入抗⑶K4單鏈抗體ANK4 (20 μ g/ml稀釋于5%脫脂奶粉-PBST 中)中室溫孵育；再以抗V5抗體(1 5000稀釋于5%脫脂奶粉-PBST中)為一抗，HRP 標記的羊抗小鼠IgG為二抗，ECL發(fā)光試劑盒檢測目的條帶的出現(xiàn)。
6.免疫沉淀實驗將培養(yǎng)在6孔板中對數(shù)生長的MCF-7細胞用含ImM PMSF的冷PBS洗滌兩次，每孔 加入500 μ 1細胞裂解液，用細胞刮子將其刮出，放于1.5ml Eppendorf管中，冰浴40min， 20%的能量超聲兩次，每次IOs ； 15000rpm 4°C離心IOmin ；取上清，加入純化的抗⑶K4單 鏈抗體ANK4 (20 μ g/ml)，于4°C緩慢顛倒?jié)幔辉偌尤? μ 1抗V5鼠單克隆抗體，于4°C緩慢 顛倒 2h;再加入 20μ1 Protein G onSepharose 4Bfast flow 4°C緩慢顛倒過夜,8000rpm 4°C離心3min，棄上清；加500 μ 1細胞裂解液洗滌一次；棄上清，500 μ 1冷PBS洗滌兩次，棄 上清；沉淀加入20 μ 1 SDS-PAGE上樣緩沖液，電泳，做Wfestern blot分析。Western blot 以抗CDK4兔多克隆抗體為一抗，HRP標記的羊抗兔IgG為二抗，ECL發(fā)光試劑盒檢測目的條 帶的出現(xiàn)。三、結果與分析1.純化的抗⑶K4單鏈抗體ANK4具有與重組人⑶K4的結合活性為了進一步檢測抗⑶K4單鏈抗體與重組人⑶K4蛋白結合活性，以未經IPTG誘 導的pEI^Sa-⑶K4/BL21 (DE3)菌體沉淀為陰性對照，將其和純化的重組人⑶K4蛋白經 SDS-PAGE后，轉移到NC膜上，首先與抗⑶K4單鏈抗體結合，進而與抗V5抗體和HRP標記 的羊抗小鼠IgG反應，ECL顯影觀察，純化的重組人⑶K4蛋白樣品在約34kD處出現(xiàn)一明顯 特異性條帶，而陰性對照組中未發(fā)現(xiàn)目的條帶(附圖幻，這一結果進一步驗證了純化的抗 ⑶K4單鏈抗體可以特異性結合人重組⑶K4蛋白。2.抗CDK4單鏈抗體ANK4親和力的測定應用非競爭性ELISA法，以抗體的濃度為橫坐標，以抗原抗體反應的0D490值 為縱坐標作標準曲線(附圖6)，根據(jù)曲線及計算公式(n[Abl]-[Ab])/(n-l)來計算 抗CDK4單鏈抗體的親和常數(shù)，η為抗CDK4單鏈抗體的稀釋倍數(shù)，Ab和Abl分別表示當 抗原濃度為Ag和Agl時，l/2Max0D490的抗體濃度。通過計算得到親和力的值分別為 (1. 79士0. 42) Xl(T8mol/L。3.抗CDK4多克隆抗體競爭性抑制抗CDK4單鏈抗體ANK4與抗原結合為了檢測抗CDK4多克隆抗體與抗CDK4單鏈抗體競爭性結合CDK4的能力，進行了 競爭性ELISA實驗。純化的抗CDK4單鏈抗體中混入兔抗CDK4多克隆抗體作為競爭性抑制 劑(以0. BSA-PBST按1 2000稀釋)為實驗組即抑制后，以只加抗⑶K4單鏈抗體不 加兔抗CDK4多克隆抗體作為陽性對照即抑制前，檢測兔抗CDK4多克隆抗體與抗CDK4單 鏈抗體競爭結合重組人⑶K4的能力，結果如附圖7所示，根據(jù)公式(抑制率=(抑制前A 值-抑制后A值)/抑制前A值xlOO 可以計算出兔抗CDK4多克隆抗體對抗CDK4單鏈 抗體ANK4的競爭性抑制率為38. 67%。實驗組與陽性對照有顯著性差異(ρ < 0. 01)。從 競爭性抑制率可以看出，兔抗CDK4多克隆抗體能夠競爭性抑制抗CDK4單鏈抗體ΑΝΚ4結合 重組人CDK4。4.抗⑶Κ4單鏈抗體ΑΝΚ4能與腫瘤細胞內⑶Κ4蛋白結合 由于本實驗所用的抗CDK4單鏈抗體是以原核表達的重組人CDK4蛋白為抗原從人 源噬菌體抗體庫中篩選得到的，因此須對其是否具有結合天然狀態(tài)下的CDK4蛋白的能力 進行檢測。為此，我們分別采用了 Western blot和免疫沉淀技術來檢測純化的抗CDK4單 鏈抗體與腫瘤細胞內表達的CDK4是否有相互作用。
4. 1 Western blot為了檢測抗CDK4單鏈抗體與細胞內源的CDK4蛋白結合活性，將收集得到的MCF-7 細胞裂解液經SDS-PAGE電泳，轉移到NC膜上，首先與抗CDK4單鏈抗體孵育，進而與抗V5 抗體和HRP標記的羊抗小鼠IgG反應，ECL發(fā)光試劑盒顯影。結果附圖8所示，在約34kD處 出現(xiàn)一明顯特異性條帶(附圖8B)，而在陰性對照組(未與ANK4反應，只加入抗V5抗體) 中未發(fā)現(xiàn)目的條帶(附圖8A)，以β-actin作為細胞裂解液ffesternblot蛋白加樣的內參 對照，各組樣品中β-actin均檢測出清晰的β-actin條帶。4. 2免疫沉淀將收集得到的MCF-7細胞裂解后在上清中依次加入抗CDK4單鏈抗體，V5單克隆抗 體和Protein G onSepharose 4B fast flow孵育，孵育沉淀進行SDS-PAGE和Westernblot 分析。Western blot檢測時以抗⑶K4兔多克隆抗體為一抗，HRP標記的羊抗兔IgG為二 抗，由于抗⑶K4單鏈抗體引入V5標簽，其表達產物具有結合抗V5抗體的活性，抗V5抗體 屬于 IgG 型抗體，能與 Protein G onSepharose 4B fast flow 中的 ProteinG 結合，如果 抗⑶K4單鏈抗體能與⑶K4結合，則形成的復合物通過抗V5抗體間接的結合到ftOtein G 上形成免疫沉淀復合物，免疫沉淀復合物進行Western blot分析，當以抗CDK4兔多克隆抗 體為一抗進行檢測時，如能夠檢測到相應的條帶出現(xiàn)，則可說明抗CDK4單鏈抗體確實能特 異性結合細胞內CDK4蛋白。實驗結果如附圖9所示，在34kD處出現(xiàn)了特異性條帶，而在不 加抗CDK4單鏈抗體的陰性對照組中無條帶出現(xiàn)，進一步證明了抗CDK4單鏈抗體和CDK4結 合的特異性。實施例3抗⑶K4人源胞內單鏈抗體基因的克隆及重組真核表達載體的構建。為 了便于閱讀，本專利“抗CDK4人源胞內單鏈抗體基因”以下簡稱“NANK4”一、實驗材料1.菌株和質粒pcDNA3. 1(+)質粒購自Invitrogen公司；大腸桿菌E. coli JM109購自北京鼎國 生物技術有限公司。2.分子克隆主要相關試劑限制性內切酶Hind III、EcoR I，T4DNA連接酶及其相應緩沖液，Taq DNA聚合酶 及其相應緩沖液，dNTP購自大連寶生物工程有限公司。質粒提取純化試劑盒購自Promega 公司。DNA回收試劑盒、核酸分子量標準(11Λ Ladder和DL-2000DNAMarker)購自北京鼎國 生物技術有限公司。瓊脂糖凝膠電泳所需瓊脂糖、溴化乙錠、Tris等購自Sigma公司。其 余試劑及材料參照實施例1和2。2.引物設計本實驗所用的引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。具體如下以 Pl (FP) (5’ -CCCAAGCTTATGGATCCGAAGAAGAAACGTAAGGTTCCGAAGAAGAAACGTAAGGTTCAGTCTGTGC TGACGCAGCC-3，)為正向引物，以 P2 (RP) (5，-GGAATTCTTAACGCGGTTCCAGCGGATCCGGATACGGCA CCGGCGCACCTGAAGAGACAGTGACCGGGGTTCC-3 ’)為反向引物引入核定位序列、檢測標簽及相應 酶切位點構建胞內抗體NANK4。二、實驗方法( 一 ) NANK4基因片段的獲得
1.聚合酶鏈式反應(PCR)為了通過定向克隆的方法制備抗人CDK4胞內單鏈抗體基因NANK4，并能構建入真 核表達載體PCDNA3. 1中，我們設計了 P1/P2兩條引物。引物設計根據(jù)抗CDK4人源單鏈抗 體基因序列及不同亞細胞區(qū)滯留型胞內抗體基因序列，并依據(jù)PCR引物設計原則引入符合 閱讀框的起始密碼子和終止密碼子以及相應的酶切位點。具體序列見材料部分。以從人源噬菌體單鏈抗體庫中篩選到的抗CDK4人源單鏈抗體基因ANK4序列為模 板，用PCR的方法擴增細胞核定位的抗人CDK4胞內單鏈抗體(NANK4)基因。PCR反應體系10 X Ex10 μ 1
Taq buffer8μ 1
dNTPs(2. 5mM each)2 μ 1 (respectively)
Pland P2(20 μ Μ)0. 5μ 1
Template(lOOng/μ 1)0. 5μ 1
ExTaq(5U/μ 1)77 μ 1
dd H2O
Total100 μ 1
操作程序(1) 94 "C，4min ； (2) 94 "C，45sec ； (3) 55 "C，45sec ； (4) 72 "C，45sec ；(5)72°C,10min.其中(2)-(4)進行 30 個循環(huán)。
2. PCR擴增產物的回收
PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分離、按照DNA回收純化試劑盒回收并檢驗。
(1)電泳結束后，在凝膠成像儀上用手術刀切取含目的片段的瓊脂糖；( 放入預
先稱量好的Eppendorf管中，稱重，搗碎，按1 3 (重量/mg 體積/ μ 1)的比例加入溶液 A ； (3) 50°C金屬浴lOmin，至膠完全溶解，在室溫下，加入溶液B，充分混勻，溶液分別轉移至 離心柱內靜置2min，8500rpm離心Imin棄液體(溶液若一次加不完，可以分兩次離心)；(4) 棄液體，加入500 μ 1溶液C，8500rpm離心Imin棄液體；重復一次；(5) 12000rpm離心Imin, 甩干剩余液體，除去殘余酒精；(6)將離心柱置于新的離心管中室溫敞蓋8min，使乙醇揮發(fā) 盡；⑵加預熱溶液D，15000rpm離心lOmin，管底即為目的DNA。取少量DNA進行瓊脂 糖凝膠電泳，檢驗回收片段的純度與濃度。3.目的片段的酶切與回收回收的PCR擴增片段產物的HindIII和EcoR I雙酶切反應體系ddH2012 μ 1IOXM buffer4μ 1HindIII2μ 1EcoRI2μ 1回收的PCR擴增片段20μ1_40 μ 1 上述混合液于37°C金屬浴消化1. 5_2h，產物進行瓊脂糖凝膠電泳，回收約 870bp的目的片段(方法同上)，1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗其回收效果，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> ( 二)pcDNA3. 1載體片段的獲得將質粒pcDNA3. 1進行Hind III和EcoR I雙酶切，37°C消化1. 5_濁，1 %瓊脂糖凝 膠，98mA電泳30-40min分離約5. 4kb的目的片段。載體質粒pcDNA3. 1的酶切體系如下
0125]ddH2012 μ 1
0126]IOXM buffer4μ 1
0127]Hind III2μ 1
0128]EcoRI2μ 1
0129]pcDNA3. 120 μ 1
0130]_
0131]40 μ 1用DNA回收試劑盒回收載體片段pcDNA3. 1，方法同上。1 %瓊脂糖凝膠電泳，檢驗 回收片段。(三)載體與目的基因的連接將目的基因片段和pcDNA3.1酶切大片段通過 T4DNA連接酶連接，獲得重組質粒ρΝΑΝΚ4。構建過程見圖1。連接體系如下
0134]dd H2O8. 5μ 10135]T41igase buffer2μ 10136]T41igase1 μ 10137]pcDNA3. 1 片段0. 5μ 10138]NANK4片段8μ 1_20 μ 1混勻，16°C金屬浴連接12_16h。(四)JM109感受態(tài)細胞的制備(1)以無菌接種環(huán)刮取凍存于_80°C冰箱的JM109菌種，劃線接種于不含氨芐青霉 素(Amp)的LB瓊脂平板，37°C培養(yǎng)1 左右；( 挑取單一菌落接種到5ml液體LB培養(yǎng)基 中，37°C ISOrpm振搖培養(yǎng)至0D60。= 0. 4 ； (3)將細菌培養(yǎng)管取出，迅速置于冰浴中15min 以上，使培養(yǎng)物冷卻到0°C ； (4)在無菌條件下將細菌培養(yǎng)液轉移到無菌、冰預冷的1.5ml Eppendorf管中(以下操作均需無菌)，4°C、4000rpm離心lOmin，棄上清；(5)以500 μ 1冰 預冷的0. lmol/L CaCl2溶液重懸細菌沉淀，冰浴30min ； (6) 4°C、4000rpm離心lOmin，收集 菌體，經80 μ 1冰預冷的CaCl2重新懸浮菌體，將感受態(tài)細胞置于4°C冰箱冰浴中備用。(五)質粒轉化(1)將每管80 μ 1感受態(tài)細胞加入到20 μ 1連接產物中，輕輕混勻，冰浴30min ； (2)將管放入42°C金屬浴中，熱休克anin;(3)快速轉移到冰浴中，冷卻aiiin ； (4)每管加 Λ 900 μ 1 37°C預熱的 LB 液體培養(yǎng)基，37°C、150rpm 振蕩培養(yǎng) 45min ;(5)4000rpm、4°C離心 5min ； (6)棄700-800 μ 1上清，用余下上清重懸細胞，涂布于含100 μ g/ml氨卞青霉素抗性 (Amp)的LB瓊脂培養(yǎng)基中，靜置IOmin ；37°C倒置培養(yǎng)12 16h，出現(xiàn)重組子菌落。轉化菌 盤4°C保存?zhèn)溆谩?六)表達質粒pNANK4的鑒定
1.表達質粒pNANK4的小量提取與純化(參照《分子克隆實驗指南》堿裂解法小量 提取質粒)(1)挑取轉化細胞單個陽性克隆，接種于5ml含100 μ g/ml Amp+的LB液體培 養(yǎng)基中，37°C、180-200rpm振蕩培養(yǎng)12 16h ;(2)菌液分裝于1. 5ml Eppendorf管中， 15000rpm、4°C離心5min收菌體沉淀；(3)加入0. ImL冰預冷的溶液I，吹懸沉淀，靜置5min ； ⑷加入現(xiàn)配的0. 2mL溶液II，顛倒混勻；(5)加入0. 15mL冰預冷溶液III，輕輕顛倒混勻； (6)冰浴15min，15000rpm 4°C離心5min ； (7)收集上清，加入2. 5倍體積的無水乙醇，室溫 靜置20min ； (8) 15000rpm 4°C離心15min ； (9)棄上清，加入2. 5倍體積預冷的70%乙醇洗 滌，15000rpm 4°C離心5min ； (10)棄上清，控干，真空旋轉蒸發(fā)干燥；(11)沉淀溶于50 μ 1 TE中(含50 μ g/ml RNaseA)，37°C 30min, 1 %瓊脂糖凝膠電泳檢驗，_20°C保存?zhèn)溆谩?.重組質粒的酶切鑒定利用限制性內切酶消化法初步檢驗提取的重組質粒。將重組質粒進行Hind III 和EcoR I雙酶切，37°C消化1. 5-濁，瓊脂糖凝膠，98mA電泳30-40min，凝膠成像分析儀 上觀測。pNANK4質粒的Hind III和EcoR I雙酶切反應體系ddH206 μ 1IOXM buffer2μ 1Hind III1 μ 1EcoRI1 μ 1pNANK410 μ 1_20 μ 13.重組質粒的序列測定由上海生工生物工程有限公司進行測序。三、結果與分析為了獲得定位于細胞核的抗CDK4人源胞內單鏈抗體基因，我們以抗CDK4人源單 鏈抗體ΑΝΚ4基因為模板，用含有細胞核定位信號、Hind III和EcoR I酶切位點序列以及 E-tag標簽肽序列的引物，通過PCR的方法擴增細胞核定位型抗CDK4人源胞內單鏈抗體 NANK4基因。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后發(fā)現(xiàn)，在約860bp處有一明顯的DNA條帶(見 附圖10A)；產物回收后克隆到真核表達質粒pcDNA3. 1的CMV啟動子下游的限制性內切酶 Hind III和EcoRI之間；陽性重組質粒經限制性內切酶Hind III和EcoRI雙酶切，瓊脂糖 凝膠電泳發(fā)現(xiàn)，在^OObp和840bp處分別出現(xiàn)一條明顯的DNA條帶(見附圖10B)。進一 步通過T7和BGH通用引物正反雙向測通載體pNANK4上的目的片段，測序結果表明，插入序 列與實驗設計一致，并且讀碼框完全正確，這說明通過PCR擴增成功地引入了細胞核定位 信號、E-tag檢測標簽等，NANK4基因全長834bp (序列見kquence No. 2),編碼278個氨基 酸。這說明我們已成功獲得了重組胞內抗體NANK4基因的真核表達載體PNANK4。實施例4抗CDK4單鏈抗體抗腫瘤活性分析一、實驗材料1.分子生物學相關試劑及材料
去內毒素質粒提取試劑盒購自OMEGA公司；逆轉錄PCR(RT_PCI )試劑盒購自大連 寶生物工程有限公司；其余參照實施例1-3。2.細胞培養(yǎng)及轉染及活性檢測試劑及材料脂質體(Lipofectamine2000)、G418、Trizol 為 hvitrogen 公司產品；DMS0、MTT、 溴化丙啶(PI)、RNase A、Hoechst 33342購自Sigma公司；RIPA裂解液購自碧云天生物技 術有限公司；抗E-tag抗體購自Wiamarcia公司；FITC標記山羊抗小鼠IgG購自北京中杉 金橋生物技術公司；Armexin V凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物技術有限公司；其余同 實施例1-3。3. RT-PCR所需引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。(1) RT-PCR擴增胞內抗體弓丨物序列正向引物P3為5’ -CCCAAGCTTATGGGATGGAGCTGT-3，， 反向引物P4為5’ -GGTAC0GCT0GAGGATAACT-3‘，擴增產物為460bp ；⑵擴增細胞內β -actin合成 的引物序列正向引物 P5 為 5，-TGGMTCCTGTGGCATCCATGMAC-3，，反向引物 P6 為 5，-TAMA0GCAGCT CAGTMCAGTC0G-3，。4.相關溶液的配制參照《分子克隆實驗指南》。二實驗方法1.轉染用質粒的準備(參照去內毒素質粒提取試劑盒說明書)1.1使用前準備工作將試劑盒中附帶的RNaseA加入Solution I中，4°C保存；向DNA Washing Buffer 中加入60mL無水乙醇進行稀釋，稀釋后的DNA Washing Buffer室溫保存。1. 2操作方案(所有步驟按照試劑盒說明書在室溫下進行)(1)過夜培養(yǎng)的細菌培養(yǎng)液轉移到一個干凈的5mL離心管中，5000g室溫離心 10!^11，棄上清、收集菌體沉淀；(幻加入50(^1^ Solution I，將菌體沉淀懸起，并將其轉 移至1.5mL離心管中；(3)加入500 μ L Solutionll，上下顛倒四次，室溫靜置^iin ； (4) 加入250 μ L冰浴的Buffer N3,上下顛倒四次，直到出現(xiàn)白色絮狀沉淀，12000g, 4°C，離心 IOmin ； (5)小心地將上清轉移到一個1. 5mL離心管中，加入0. 1體積的ETR Solution，冰 浴lOmin，其間顛倒幾次；(6)將裂解液42°C孵育5min, 12000g離心3min，ETR Solution會 在底部形成一藍色條帶；(7)將上清轉移至1. 5mL離心管中，并加入0. 5體積的無水乙醇， 充分混勻，室溫靜置Hmin ；⑶將以上混合物700 μ L轉移到一個套在2mL收集管中柱II 中，室溫離心，10000g，lmin ；將流出液倒掉，按上述操作，將剩余溶液再轉移到柱中并離心； (9)用500 μ L HB Buffer洗柱，室溫離心，IOOOOg, Imin ； (10)倒掉流出液，用700 μ L含乙醇 的DNA Wash Buffer洗柱，室溫離心，10000g，lmin，倒掉流出液，重復此操作一次；(11)倒 掉流出液，將空柱離心13000g，;3min，以干燥柱的介質，特別是將乙醇除去；(12)將柱置于 一個新的 1. 5mL 離心管中，加入 100 μ L 的 Endotoxin-Free Elution Buffer (70°C預熱)， 室溫靜置2min，13000g,離心;3min以洗脫DNA ； (13)棄回收柱，洗脫DNA保存于_20°C備用。1.3DNA的產量與質量把抽提得到的DNA樣品稀釋100倍，分別測量其在260nm和280nm處的吸光度，得 到DNA濃度(μ g/mL)和A260與A280的比值。A260與A280的比值可顯示核酸的純度，本 實驗要求的比值應該在1. 8-2. 0之間。2.細胞培養(yǎng)
MCF-7細胞和HeLa細胞培養(yǎng)于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，37°C飽和濕度、 5% C02孵箱中培養(yǎng)。細胞貼壁生長，每2-4天胰蛋白酶消化細胞，傳代培養(yǎng)。3.穩(wěn)定轉染細胞株的建立將生長狀態(tài)良好的24h前換液的MCF-7細胞按IX IO6Cells/孔的密度、HeLa細胞 按IXlO5ceIls/孔的密度分別接種至6孔板中，37°C、飽和濕度、5% C02孵箱中培養(yǎng)，當6 孔板內細胞生長達到90-95%匯合時即可轉染。具體如下(1)配制溶液A 將4 μ g質粒DNA與不含抗生素的DMEM培養(yǎng)液輕輕混合至總體積 為 250 μ L ； (2)配制溶液 B 將 10 μ L LipofectAMINETM2000 與 240 μ L 不含抗生素的 DMEM 培養(yǎng)液混合，室溫孵育5min ； (3)將溶液B加入到溶液A中，充分混合，室溫孵育20min ； (4) 將6孔板中的細胞用無血清不含抗生素的DMEM培養(yǎng)液洗兩遍，每孔加入2mL不含抗生素的 DMEM培養(yǎng)液；(5)加入上述混合物，37°C、飽和濕度，5% C02培養(yǎng)；(6)于轉染后7 將轉染 細胞消化，按照1 10傳代培養(yǎng)，同時加入600 μ g/mLG 418進行抗性篩選，每3天換液一 次并保持G 418的濃度。約2周后，空對照組細胞全部死亡，出現(xiàn)陽性克隆，逐步降低G 418 濃度至200 μ g/mL維持篩選。擴大培養(yǎng)穩(wěn)定轉染細胞株，凍存，相關檢測備用。4. ANAK4的穩(wěn)定表達分析4. IRT-PCR 檢測4. 1.1 總 RNA 的提取將篩選到的穩(wěn)定轉染的MCF-7細胞組、HeLa細胞組分別消化，冷PBS洗2次后，加 入0. 5ml Trizol提取液，室溫放置5min ；加入0. Iml氯仿劇烈震蕩15s，室溫靜置^iin ； 40C 12000g離心15min ；上層水相轉入新的離心管內，加入0. 25ml異丙醇，混勻，室溫放置 IOmin ；4°C 12000g 離心 IOmin ；沉淀用 Iml 75% 乙醇(DEPC 水配制)洗一次；4°C IOOOOg 離 心5min ；空氣中干燥，加入適量DEPC水溶解(55_60°C水浴IOmin助溶)，存于_80°C備用。4. 1. 2RT-PCR以提取的mRNA為起始物，按照RT-PCR試劑盒說明，分別加入逆轉錄反應所需的各 種成分進行 RT 反應，其條件為30°C 10min，45°C 30min，99°C 5min，5°C 5min ；94°C 2min。 從反應混合液中各取5 μ 1放入新的PCR管中，依次加入IOOpmol的上下游引物Ρ3和Ρ4或 β -actin 的上下游引物 P5 和 P6，5 μ 1 PCR 緩沖液(IOX)，2. 5mmol/L 的 dNTP 和 U 的 DNA 聚合酶(Taq DNA Polymerase)，最終體積為50 μ 1 ；放置PCR儀中進行PCR擴增，反應參數(shù) 為94°C 30S，50°C 30S，72°C lmin，30個循環(huán)；最后于72°C延伸lOmin。擴增后進行瓊脂 糖凝膠電泳檢驗。5.間接免疫熒光實驗將無菌處理的載玻片放到6孔培養(yǎng)板中，細胞按適當密度分別接種至6孔板中， 37°C飽和濕度、5% CO2孵箱中培養(yǎng)，細胞可自然貼附于載玻片上。當6孔板內細胞生長達 到80%以上匯合時將細胞爬片從6孔培養(yǎng)板中取出，370C D-Hanks洗滌2次，5min/次；將 D-Hanks液吸出，4%多聚甲醛固定30min ；dd H2O洗滌3次，分別為lOmin, lOmin, 5min ；風 機吹干，_20°C保存?zhèn)溆?；_20°C取出片子室溫水化20min ；PBST洗滌lOmin，PBS洗滌3次， 每次5min ；0. 01%胰酶消化40s，PBS洗滌3次，每次5min ；3% H2O2室溫阻斷20min，PBS洗 滌3次，每次5min ；3% BSA-PBST封閉20min，PBST洗滌3次，每次IOmin ；加入PBST稀釋 (1 12 的抗E-tag鼠單克隆抗體，4°C過夜；PBST洗滌3次，每次IOmin ；加入PBST稀釋(1 100)的FITC-山羊抗小鼠IgG，避光室溫20min ；PBST洗滌3次，每次IOmin ；加入 2 μ g/mL的Hoechst 33342，室溫避光20min ；PBST充分洗滌；甘油封片，上機觀察。6. Western-blot 分析收集穩(wěn)定轉染的MCF-7細胞，冷PBS洗2次；加入約500 μ L的RIPA強裂解液(含 ImM PMSF)，冰上裂解40min-lh ；超聲破碎，能量20%，10s，兩次；15000rpm離心3_5min，收 獲上清液；進行SDS-PAGE，用半干式電轉儀將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上；轉膜后，將膜置 于PBST中緩搖15min ；用含5%脫脂奶粉的PBST室溫封閉Ih ；膜置于PBST中緩搖3次，每 次IOmin ；加入封閉液稀釋的一抗，室溫緩搖池；膜置于PBST中緩搖3次，每次IOmin ；加 入封閉液稀釋(1 5000)的HRP標記的羊抗小鼠IgG，室溫緩搖Ih;膜置于PBST中緩搖3 次，每次IOmin ；利用ECL試劑盒顯影。注抗E_tag鼠單克隆抗體稀釋比例(1 1000)，抗 β-actin鼠單克隆抗體稀釋比例(1 5000)。7.免疫共沉淀實驗將培養(yǎng)在6孔板中對數(shù)生長的細胞用含ImM PMSF的冷PBS洗滌兩次，每孔加入 500 μ 1弱的RIPA裂解液(含ImM PMSF)，用細胞刮子將其刮出，放于1. 5ml Eppendorf 管中，冰浴40min，20%的能量超聲兩次，每次IOs ； 15000rpm 4°C離心5min ；取上清，向 各樣品上清中加入4yL抗E-tag抗體，4°C，緩慢顛倒，Ih以上；加入20 μ L Protein Gon S印harose，4°C，緩慢顛倒，過夜；8000rpm，4°C，離心!3min，棄掉上清；用500 μ L弱的 RIPA裂解液洗滌沉淀一次，再用0.01Μ PBS洗滌兩次，每次IOmin ；向沉淀中加入20 μ L 1 X SDS-PAGE上樣緩沖液，進行SDS-PAGE，之后將蛋白轉移到NC膜上，參照上述實驗方法， 以抗⑶Κ4多克隆抗體為一抗，HRP標記的羊抗兔IgG為二抗，進行Wfestern-blot實驗。8. MTT法檢測細胞增殖活性(1)接種細胞用0. 25%胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)細胞，用含10%小牛血清的DMEM 培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，MCF-7細胞按7X IO3ceIls/孔；HeLa細胞按5X IO3ceIls/孔的 密度接種至96孔培養(yǎng)板中，200 μ L/孔，每種設10個平行孔，同時以200 μ L/孔培養(yǎng)液作為 陰性對照。( 培養(yǎng)細胞將培養(yǎng)板移入CO2孵箱中，在371、5%0)2及飽和濕度條件下，分 別在培養(yǎng)4h、24h、幼h、7 、邪h、120h后取出培養(yǎng)板，每孔加入5mg/mL MTT溶液20 μ L，放回 培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。( 繼續(xù)培養(yǎng)4h后，小心吸棄孔內培養(yǎng)液。加入DMSO(150 μ L/孔)溶解 ΜΤΤ，振蕩IOmin混勻，使結晶物充分溶解。(4)比色選擇492nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀 上調定各孔吸收值，記錄結果。以培養(yǎng)液孔光吸收值作為陰性對照，計算每種細胞在492nm 波長處的平均光吸收值，以時間為橫軸，492nm光吸收值為縱軸繪制細胞生長曲線。9. FACS分析細胞周期收獲細胞并用冷PBS洗滌2次，然后用70%冷乙醇4°C固定過夜，檢測前用PBS洗 凈乙醇，重懸于200 μ L含50 μ g/mL的PI染液的PBS中，加入RNase A至終濃度50 μ g/mL, 避光孵育30min，上流式細胞分析儀檢測細胞周期的變化情況。10. Annexin V/PI雙染流式細胞術檢測分析(1)收集穩(wěn)定轉染的細胞，冷PBS洗滌細胞2次，收集5X IO5個細胞；(2)吸 取250μ L的2XBinding Buffer和250 μ L的滅菌去離子水混勻；(3)用上述500yL的 IXBinding Buffer 懸浮細胞；(4) WAlyL Annexin V-EGFP 混勻，加入 5 μ L ΡΙ，混勻； (5)避光反應IOmin ； (6)用流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況。
三、結果與分析1. pNANK4在腫瘤細胞中的穩(wěn)定表達為了檢測NANK4的表達情況以及其體外生物學活性，以脂質體LipofectameTM 2000介導重組質粒PNANK4及空對照質粒pcDNA3. 1轉染人乳腺癌細胞株MCF-7細胞和人子 宮頸癌細胞株HeLa細胞，經G 418抗性篩選，獲得穩(wěn)定轉染的陽性細胞克隆，為了鑒定這些 克隆，擴大培養(yǎng)后進行如下實驗。1. IRT-PCR 檢測 NANK4 的表達為了檢測NANK4在腫瘤細胞內的穩(wěn)定表達，我們分別提取了穩(wěn)定轉染細胞總RNA， 以P3和P4為引物進行了 RT-PCR分析，并且在實驗中以β-actin基因作為內參照。PCR 產物經瓊脂糖凝膠電泳后發(fā)現(xiàn)，在以特異性擴增β-actin的相應引物(P5，P6)進行 RT-PCR擴增時，所有樣品均能擴增出350bp的β-actin片段，而且每組內各樣品擴增出的 條帶亮度基本一致(附圖11)，而在以特異性擴增NANK4的相應引物進行RT-PCR擴增時，只 有穩(wěn)定轉染PNANK4的細胞，才能擴增出約460bp的產物，而以空載體轉染的細胞或空細胞 的RNA為模板時均無該條帶的出現(xiàn)(附圖11)，這一結果在mRNA水平上證明了我們選擇的 細胞克隆為穩(wěn)定表達NANK4的細胞株，表明已初步獲得穩(wěn)定表達NANK4的細胞克隆MCF-7/ PNANK4細胞株和HeLa/pNANK4細胞株。1. 2間接免疫熒光實驗分析以RT-PCR結果呈陽性的細胞為材料，經細胞爬片等一系列處理，以抗E-tag 的鼠單克隆抗體為一抗，F(xiàn)ITC-山羊抗小鼠IgG為二抗，進行間接免疫熒光實驗分析。 H0eChst33342與細胞核區(qū)域結合，發(fā)出藍色熒光。熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，PNANK4穩(wěn)定轉染 的MCF-7細胞和HeLa細胞的細胞核區(qū)域均發(fā)出明亮的黃綠色熒光，而pcDNA3. 1穩(wěn)定轉染 的MCF-7細胞和HeLa細胞以及空對照的MCF-7細胞和HeLa細胞的細胞核區(qū)域沒有熒光 (附圖12)，這表明NANK4基因在穩(wěn)定轉染的腫瘤細胞中得到有效表達，并且其表達產物定 位在細胞核，進一步驗證了我們所獲得的陽性細胞株。1. 3Western_blot 分析為了進一步檢測NANK4在穩(wěn)定轉染細胞株中的表達，我們分別裂解穩(wěn)定轉染 PNANK4以及穩(wěn)定轉染pcDNA3. 1的MCF-7細胞和HeLa細胞，并以空細胞作對照，用抗E_tag 鼠單克隆抗體進行Western-blot檢測，同時以各樣品內β -actin的表達水平為內參照。結 果如附圖13所示，各樣品內β-actin基因均有表達，且表達量均一。而在所篩選到的穩(wěn)定 轉染pNANK4的MCF-7細胞和HeLa細胞的細胞裂解液中檢測到NANK4基因的表達，即在大 約31kD的位置上檢測到一目的條帶。而穩(wěn)定轉染pcDNA3. 1以及空細胞的細胞裂解液中并 沒有檢測到相關目的條帶的產生。此結果證明了在穩(wěn)定轉染PNANK4的MCF-7細胞和HeLa 細胞中得到了穩(wěn)定的表達，同時也進一步驗證了我們所獲得的陽性細胞株。2.胞內抗體NANK4能夠與腫瘤細胞內的⑶K4蛋白結合為了檢測MCF-7細胞和HeLa細胞內胞內抗體NANK4的表達及其能否在細胞內 與CDK4結合，我們進行了免疫共沉淀實驗。我們以穩(wěn)定表達NANK4的MCF-7細胞和HeLa 細胞為材料，以轉染了 pcDNA3. 1空載體的細胞及空細胞做對照，將細胞進行裂解后，加入 抗E-tag的鼠單克隆抗體，進行孵育，之后加入ftOtein G-Sepharose進行結合，然后以抗 ⑶K4多克隆抗體為一抗，HRP標記的羊抗兔IgG為二抗進行ffestern-blot實驗，結果發(fā)現(xiàn)在約34kD的位置處可以出現(xiàn)一明顯的條帶，即為⑶K4與NANK4結合的⑶K4蛋白。結果如 附圖14所示，這說明胞內抗體NANK4在MCF-7細胞及HeLa細胞內得到了表達，并且與抗原 CDK4結合。4.NANK4抑制腫瘤細胞生長我們采用MTT比色法測定活細胞線粒體內i^ormazan含量以檢測腫瘤細胞群體增 殖能力。選用對數(shù)生長期的MCF-7細胞、HeLa細胞以5_7X IO3ceIls/孔的細胞量鋪96孔 板，每種細胞分為3組(pNANK4轉染、pcDNA3. 1轉染，空細胞組)，共設置l_6d六個時相點， 每天測定的比色值取10個重復孔的平均數(shù)，繪制生長曲線，平行組間進行t檢驗。結果如 附圖15所示，與pcDNA3. 1轉染細胞組和空細胞組相比，pNANK4組細胞R)rmazan的生成量 隨時間的延長明顯的減少，顯著差異(P < 0. 01)。這些結果說明，NANK4的表達對轉染細胞 的生長起到顯著的抑制作用。5. NANK4引起腫瘤細胞的細胞周期阻滯為了檢測NANK4基因的表達對腫瘤細胞細胞周期的影響，我們通過流式細胞儀測 定細胞中DNA含量，從而獲得各細胞周期時相的百分比。首先將空細胞、篩選的含有空載 體pcDNA3. 1的陽性細胞株以及表達NANK4基因的陽性細胞株分別擴增培養(yǎng)，收獲細胞經冷 PBS洗滌、70 %冷乙醇固定過夜、PI染色后，進行FACS分析。結果如圖3. 10所示，表達NANK4 基因的陽性細胞株與對照組相比，GO-Gl期的細胞比例增加，S期細胞比例減少。在MCF-7細 胞中，GO-Gl期細胞由40. 01 士 1. 0%增加到64. 91 士2. 4%，而S期細胞由40. 12士 1. 3%減 至24. 37士3.2%，與對照組相比，差異顯著(ρ <0. 01)(附圖16)；在HeLa細胞中，GO-Gl期 細胞由 40. 70士2. 增加到 67. 10士3. 9%，S 期細胞由 42. 06士3. 2%減至 24. 58士3. 4%, 與對照組相比，差異顯著(P < 0. 01)(附圖16)。這一結果說明，NANK4基因的表達可以引 起腫瘤細胞Gl期阻滯，抑制腫瘤細胞由Gl期向S期過渡，從而抑制腫瘤細胞增殖。6.NANK4能夠誘導腫瘤細胞凋亡樣品經處理后，用流式細胞儀檢測，以Armexin V為橫坐標，PI為縱坐標作圖發(fā) 現(xiàn)，MCF-7空細胞的自然凋亡率為4. 01 士0. 9%，表達NANK4基因的陽性細胞株的凋亡率為 26. 23士 1.4% (附圖17A) ；HeLa空細胞的自然凋亡率為3. 98士0. 4%，表達NANK4基因的 陽性細胞株的凋亡率為25. 75士2.0% (附圖17A)。經統(tǒng)計學分析，與對照組相比，差異顯 著(P < 0. 01)(附圖17B)。本結果說明NANK4基因的表達顯著誘導腫瘤細胞凋亡。
權利要求
1.一種抗腫瘤人源單鏈抗體，其特征在于是特異性抗人CDK4人源單鏈抗體，其核苷 酸序列如kquence NO. 1所述。
2.根據(jù)權利要求1所述的抗腫瘤人源單鏈抗體，其特征在于還包含核定位信號肽 NLS、E-tag標簽肽基因編碼序列，其核苷酸序列如kquence NO. 2所述。
3.如權利要求1或2所述的抗腫瘤人源單鏈抗體在制備具有抗腫瘤作用的藥物中的應用。
4.如權利要求3所述的抗腫瘤人源單鏈抗體的應用，所述的腫瘤為人乳腺癌和人宮頸癌。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗腫瘤人源單鏈抗體，屬于一種人源抗體。是特異性抗人CDK4人源單鏈抗體，其核苷酸序列如Sequence NO.1所述；還包含核定位信號肽NLS、E-tag標簽肽基因編碼序列，其核苷酸序列如Sequence NO.2所述；所述的抗腫瘤人源單鏈抗體在制備具有抗腫瘤作用的藥物中的應用；所述的腫瘤為人乳腺癌和人宮頸癌。本發(fā)明是一種低毒、高效、特異的抑制CDK4的活性的分子，具有分子量小、免疫原性低等優(yōu)點，通過使用腫瘤特異性真核表達載體，進行該抗體的腫瘤靶向治療，實現(xiàn)該治療基因的可控性，具有腫瘤特異性，確保治療的安全有效。
文檔編號C07K16/40GK102140139SQ20101010460
公開日2011年8月3日 申請日期2010年2月3日 優(yōu)先權日2010年2月3日
發(fā)明者馮晶, 李桂英, 王磊, 許晶晶 申請人:吉林大學