專(zhuān)利名稱(chēng)：可溶性轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子βⅡ型受體/γ－干擾素重組融合蛋白及其制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及基因工程藥物及其制備，具體為一種用于抗肝纖維化的可溶性轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子βII型受體/γ-干擾素重組融合蛋白及其制備。
背景技術(shù)：
肝纖維化是各種原因慢性肝損傷的共同反應(yīng)，以細(xì)胞外基質(zhì)(Extra Cellular Matrix ECM)尤其膠原產(chǎn)生增加為特征，是一個(gè)可逆的病理過(guò)程；但在此過(guò)程中，肝功能最終將產(chǎn)生缺陷，若損傷持續(xù)存在則將導(dǎo)致肝硬化與肝衰竭，而肝硬化是不可逆性的反應(yīng)，因此防止和逆轉(zhuǎn)肝纖維化對(duì)于慢性肝病的治療至關(guān)重要。肝纖維化是一個(gè)極其復(fù)雜的生理病理過(guò)程是各種慢性肝病的共同病理基礎(chǔ)，目前認(rèn)為，任何致病因子造成的肝臟損傷和炎癥，在多種炎癥因子的參與下，都可激活肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSC)、枯否細(xì)胞、竇內(nèi)皮細(xì)胞等而啟動(dòng)肝纖維化，其中肝臟星形細(xì)胞是最關(guān)鍵的細(xì)胞，1876年，von Kupffer首先描述了這種細(xì)胞，它被激活后轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞(MFB)，并伴隨平滑肌動(dòng)蛋白(d-SMA)的表達(dá)，向細(xì)胞外分泌膠原。而枯否細(xì)胞激活分泌TGF-α、TGF-β1、PDGF、Ito細(xì)胞刺激因子等細(xì)胞因子，進(jìn)一步促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、增殖和合成細(xì)胞外基質(zhì)。同時(shí)，受多種因素的影響，正常情況下，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成和降解的動(dòng)態(tài)平衡被破壞，細(xì)胞外基質(zhì)大量增加，而降解相對(duì)減少，進(jìn)一步發(fā)展則可引起肝小葉改建、假小葉和結(jié)節(jié)形成、而形成肝硬化。
TGFβ是最強(qiáng)的促HSC活化的細(xì)胞因子。TGFβ家族成員包括TGFβs、骨形成蛋白(bonemorphogenetic proteins BMPs)、抑制素(inhibition)和活化素(Activin)等40多個(gè)成員，是細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的調(diào)節(jié)者，參與調(diào)節(jié)許多生理功能，包括影響分化、增殖、凋亡與遷移，并在多種疾病的病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，是已知的最強(qiáng)的促纖維生成的細(xì)胞因子。哺乳動(dòng)物有3種TGFβ表達(dá)，分別是TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3，其中TGFβ1與纖維化關(guān)系最密切。TGFβ1是多功能的細(xì)胞因子，自從它的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)下游中介分子Smad被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，對(duì)TGFβ1作用機(jī)制研究迅速地發(fā)展。
在肝纖維化的形成過(guò)程中TGFβ/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)肝星狀細(xì)胞(HSC)的分化，增殖及合成膠原方面有著其重要的作用。TGFβ/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子機(jī)制包括三個(gè)階段(1)TGFβ與受體的結(jié)合及受體活化。TGFβ受體(TGFβR)家族為Ser/Thr激酶，包括三類(lèi)，分別稱(chēng)為I、II、III型受體。其中TGFβRII是TGFβ在體內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)活性所必須的受體，能傳導(dǎo)所有TGFβ同分異構(gòu)體的信號(hào)。TGFβ與TGFβRII結(jié)合后，使TGFβR I和TGFβRII結(jié)合成為穩(wěn)定的四聚體受體復(fù)合物，隨后TGFβRII激酶磷酸化TGFβR I的近膜處富含甘氨酸與絲氨酸殘基區(qū)域，啟動(dòng)TGFβ信號(hào)傳導(dǎo)。(2)Smad蛋白的活化和信號(hào)傳導(dǎo)。SMADs蛋白家族是首個(gè)被鑒定的TβR I激酶底物，它們?cè)谑荏w信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起到關(guān)鍵作用。1995年Raftery等先后提出果蠅的dpp基因編碼的MAD蛋白參與TGFβ超家族的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，隨后Svage等在新小桿線(xiàn)蟲(chóng)屬胞漿內(nèi)發(fā)現(xiàn)了與果蠅屬中的MAD蛋白功能相似的sma蛋白，在脊椎動(dòng)物體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似的蛋白。為了統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)把脊椎動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的sma和mad基因及其表達(dá)產(chǎn)物統(tǒng)稱(chēng)為SMAD。SMAD2，3直接和配體活化的TβR I相互作用后被磷酸化。R-SMADs磷酸化后，形成異源二聚體再和SMAD4相互作用，轉(zhuǎn)位到核內(nèi)調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。SMAD7可以和TβR I結(jié)合，阻礙R-SMAD磷酸化，也可以和E3泛素連接酶Smurf1和Smurf2相互作用，招募它們到TβR復(fù)合物，誘導(dǎo)活化TβR的降解。(3)Smad蛋白的核轉(zhuǎn)位及對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。SMADs復(fù)合物一旦進(jìn)入核內(nèi)，就直接結(jié)合到DNA上調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。
由于TGF-β/Smad信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)在肝纖維化中的重要作用，通過(guò)拮抗這條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)達(dá)到抗纖維化的作用是目前的研究熱點(diǎn)。關(guān)于針對(duì)TGF-β/Smad信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的抗纖維化策略也很多，主要從以下兩個(gè)水平來(lái)進(jìn)行干預(yù)(1)TGFβ/TGFβR水平目前常用的TGFβ受體拮抗劑有缺陷型TGFβRII、sTGFβRII和反意寡核苷酸。sTGFβRII能特異性結(jié)合TGFβ，但因缺乏絲氨酸/蘇氨酸激酶區(qū)而不能傳導(dǎo)信號(hào)，從而阻斷TGFβ的生物作用，有抗肝纖維化的作用。雖然TGFβ及其受體在哺乳動(dòng)物的組織細(xì)胞有廣泛表達(dá)，但是Yu-an等在長(zhǎng)期應(yīng)用TGFβ拮抗劑(sTGFβRII)進(jìn)行基因治療的研究中并未發(fā)現(xiàn)副作用，這可能是因?yàn)門(mén)GFβ拮抗劑選擇性中和與疾病相關(guān)的過(guò)度表達(dá)的TGFβ的作用，而對(duì)TGFβ的正常生理調(diào)節(jié)功能沒(méi)有影響，因此sTGFβRII有臨床長(zhǎng)期應(yīng)用的可能。Qi等發(fā)現(xiàn)通過(guò)腺病毒載體將TGFβIIR胞外區(qū)轉(zhuǎn)染至肝臟，能改善Dimthlymitrosamine(DMN)誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化，顯著降低血清透明質(zhì)酸和轉(zhuǎn)氨酶活性，但是通過(guò)腺病毒轉(zhuǎn)染至肝臟的基因表達(dá)十分短暫，且反復(fù)給予可能因?yàn)橐饘?duì)載體的強(qiáng)免疫應(yīng)答而使治療無(wú)效。Jacob G等則發(fā)現(xiàn)sTGFβR II/IgG融合蛋白能顯著抑制大鼠膽總管結(jié)扎引起的肝纖維化，減少I(mǎi)型膠原表達(dá)，抑制HSC活性，并有一定的預(yù)防作用；Yata Y等研究也表明sTGFβRII能明顯抑制CCL4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化，作用呈劑量依賴(lài)關(guān)系；以上提示sTGFβRII是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)性慢性肝損傷、肝纖維形成的有效抑制劑，有抗肝纖維化作用。此外Yoshitaka I等發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染sTGFβRII能減少腎炎大鼠腎小球ECM的累積、擴(kuò)散；Qingiian W等的研究則表明sTGFβRII能顯著改善實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肺纖維化；國(guó)內(nèi)汪玲等也報(bào)道，缺陷型TGFβRII質(zhì)粒對(duì)大鼠肝纖維化有治療作用。
(2)Smad信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)控水平是目前研究的熱點(diǎn)，Smad2、3、4是TGFβ/Smad信號(hào)傳導(dǎo)的中間環(huán)節(jié)，理論上無(wú)論抑制他們的生成，磷酸化或核轉(zhuǎn)為都能抑制肝纖維化。Smad7被認(rèn)為是TGFβ/Smad信號(hào)傳導(dǎo)最重要的負(fù)性調(diào)節(jié)因子之一。Dooley等應(yīng)用轉(zhuǎn)染了Smad7的eDNA的腺病毒載體注射肝纖維化大鼠，發(fā)現(xiàn)抑制了HSC的分化和增殖，抑制了Smad2、3的磷酸化和核轉(zhuǎn)位，且肝內(nèi)的膠原和d-SMA表達(dá)下降。IFN-γ無(wú)論在動(dòng)物還是臨床實(shí)驗(yàn)中都具有很好的抗纖維化作用。早期研究認(rèn)為，IFN-γ的抗纖維化機(jī)制是通過(guò)JAK/STAT信號(hào)傳導(dǎo)通路誘導(dǎo)Smad7產(chǎn)生。但Ghosh等發(fā)現(xiàn)用反義核酸技術(shù)封閉Smad7基因，對(duì)IFN-γ抑制TGFβ誘導(dǎo)I型膠原轉(zhuǎn)錄沒(méi)有影響，提示IFN-γ不是通過(guò)誘導(dǎo)Smad7來(lái)發(fā)揮抗纖維化作用的；進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)顯示IFN-γ誘導(dǎo)STAT1進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與Smad3結(jié)合，抑制Smad3活性來(lái)拮抗Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)一種共刺激因子P300/CBP可與Smad3和STAT1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，于是這兩條信號(hào)通路在此整合，當(dāng)P300/CBP大量表達(dá)時(shí)，IFN-γ就失去對(duì)TGFβ/Smad信號(hào)傳導(dǎo)的抑制作用。
基于國(guó)內(nèi)外對(duì)肝纖維化發(fā)生機(jī)制及治療的研究，考慮到sTGFβRII和IFN-γ能在不同位點(diǎn)阻斷TGFβ1/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、抑制HSC活化，聯(lián)合應(yīng)用兩者將可能產(chǎn)生抗肝纖維化的協(xié)同效應(yīng)，并因減少各自用量而降低副作用。且目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)聯(lián)合應(yīng)用sTGFβRII和hIFN-γ治療肝纖維化的有關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
綜合sTGFβRII和IFN-γ在抗肝纖維化中潛在的協(xié)同作用及融合表達(dá)相對(duì)單獨(dú)細(xì)胞因子對(duì)活性的增強(qiáng)作用，本發(fā)明的目的是應(yīng)用基因重組技術(shù)構(gòu)建出sTGFβRII/hIFN-γ融合基因的PCDNA3.1(+)真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染dhfr-CHO細(xì)胞，以期獲得高效、穩(wěn)定表達(dá)sTGFβRII/hIFN-γ融合蛋白的dhfr-CHO細(xì)胞株。提供一種制備抗肝纖維化的藥物及其制備方法。
本發(fā)明的可溶性轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子βII型受體/γ-干擾素重組融合蛋白，其核苷酸序列和相應(yīng)氨基酸序列如序列表SEQID NO.1所述。
可溶性轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子βII型受體/γ-干擾素重組融合蛋白的制備方法為如下步驟(1)構(gòu)建sTGFβRII/hIFN-γ的PCDNA3.1(+)真核表達(dá)載體；(2)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增IFN-γ；(3)在哺乳動(dòng)物dhfr缺陷型CHO細(xì)胞株DG44表達(dá)sTGFβRII/hIFN-γ融合蛋白(4)鑒定sTGFβRII/hIFN-γ融合蛋白的表達(dá)；(5)sTGFβRII/hIFN-γ融合蛋白的純化。
本發(fā)明的可溶性轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子βII型受體/γ-干擾素重組融合蛋白應(yīng)用于制備抗肝纖維化藥物。


圖1pcDNA3.1(+)-sTGFβRII/hIFN-γ重組質(zhì)粒構(gòu)建流程圖。
圖2hIFN-γ、sTGFβRII的PCR產(chǎn)物電泳圖MGene Ruler_100bp DNA ladder；1hIFN-γPCR product；2sTGFβRII PCR product；圖3TOPO-hIFN-γ重組質(zhì)粒EcoR I酶切圖1TOPO-hIFN-γ質(zhì)粒用EcoR I酶切；2Control未切圖4TOPO-sTGFβRII/hIFN-γ重組質(zhì)粒HindIII/XbaI酶切圖1～3TOPO-sTGFβRII/hIFN-γwith HindIII/XbaI double digestion圖5PCDNA3.1(+)-sTGFβRII/hIFN-γ重組質(zhì)粒HindIII/XhoI酶切圖M為DNA Marker，1～2PCDNA3.1(+)-sTGFβRII/hIFN-γwith double digestion3PCDNA3.1(+)with double digestion圖6MTX濃度梯度篩選中IFN-□表達(dá)量/105cells圖7有限稀釋中hIFN-γ表達(dá)量/105cells圖8滾瓶培養(yǎng)上清液hIFN-γ表達(dá)量圖9融合蛋白抗TGF- 1生物活性Auntreated cell，CTGFβ1(800pg/ml)BTGFβ1(800pg/ml)+TGFβRII Rabbit Polyclonal IgG0.1～10ng/mlserially diluted the sTGFβRII/hIFN-γprotein+TGFβ1(800pg/ml)圖10融合蛋白對(duì)NK細(xì)胞活性的影響空白u(yù)ntreated cells0.1ng/ml～5ng/mlserially diluted sTGFβRII/hIFN-γprotein圖11融合蛋白抗病毒活性DVSV，BVSV+rhIFN-γ(2ng/ml)，Auntreated cellsCVSV+2ng/ml sTGFβRII/hIFN-γ+2ug/ml hIFN-γRabbit Polyclonal IgG0.1ng/ml-10ng/mlVSV+serially diluted sTGFβRII/hIFN-γprotein圖12大鼠肝臟Col III、α-SMA、TGFβ1、TGFβRII mRNA熒光定量RT-PCR電泳13大鼠肝臟Col III、α-SMA、TGFβ1、TGFβRII mRNA熒光定量RT-PCR圖14Col III、α-SMA、TGFβ1和TGFβRII的Western印跡實(shí)驗(yàn)我們對(duì)所表達(dá)的蛋白作了生物學(xué)活性分析，結(jié)果表明獲得的sTGFβRII/hIFN-γ融合蛋白具有sTGFβRII拮抗TGFβ1生物學(xué)活性的作用，和hIFN-γ刺激NK細(xì)胞殺傷活性及抗病毒活性。體外抗肝纖維化研究結(jié)果表明sTGFβRII/hIFN-γ融合蛋白能有效拮抗TGFβ1/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制Smad2磷酸化。sTGFβRII/hIFN-γ融合蛋白也能有效抑制TGFβ1誘導(dǎo)的HSC活化，減少膠原等ECM的表達(dá)，具有潛在的抗肝纖維化作用。
具體實(shí)施例方式
以下通過(guò)詳細(xì)的技術(shù)流程表達(dá)本發(fā)明的技術(shù)方案1、可溶性TGFβII型受體(sTGFβRII)與人γ干擾素融合蛋白的表達(dá)、純化1.1 質(zhì)粒、細(xì)胞株、菌株l hIFN-γ質(zhì)粒、TGFβIIR質(zhì)粒，本所保存l PCDNA3.1(+)載體質(zhì)粒，Invitrogen產(chǎn)品；l PSV2-dhfr質(zhì)粒，ATCC產(chǎn)品；
l Dhff缺陷型CHO細(xì)胞系DG44細(xì)胞株，本所保存；l 貂肺上皮細(xì)胞Mv1Lu、肝星狀細(xì)胞HSC、K562細(xì)胞，本所常規(guī)傳代培養(yǎng)；l DH5α感受態(tài)細(xì)胞、TOP 10F感受態(tài)細(xì)胞，Invitrogen產(chǎn)品；l 皰疹性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus，VSV)，上海第二軍醫(yī)大學(xué)免疫所惠贈(zèng)。
1.2 PCR引物(表1)，參考Genebank設(shè)計(jì)，由上海生物工程有限公司(SANGON)合成表1PCR引物Table1List of Primers of PCR

1.3主要試劑l 限制性?xún)?nèi)切酶(HindIII、BamH I、XhoI、XbaI)及RevertAid_M-MuLv First Strand；cDNASynthesis Kit， MBI Fermentas；l QIAquick_DNA凝膠膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒，QIAGEN GmbH；l TOPO T-A Cloning Kit、T4 DNA Ligase Kit，Invitrogen；l UNIQ-10柱式小量質(zhì)粒抽提試劑盒、UNIQ-5柱式大量質(zhì)粒抽提試劑盒，SANGON；l CD CHO Medium及DMEN/F12(1∶1)粉劑，Invitrogen；l Methotrexate(MTX)，Invitrogen；l 胎牛血清(Fetal Calf Serum，F(xiàn)CS)，Hyclone；l human IFN-γELISA Kit，R&D Systems；l 各類(lèi)抗體IFN-γ兔多克隆抗體、TGFβRII兔多克隆抗體，小鼠抗兔HRP，Santa Cruz；2 構(gòu)建方法2.1 構(gòu)建sTGFβRII/hIFN-γ的PCDNA3.1(+)真核表達(dá)載體(見(jiàn)圖1)圖1PCDNA3.1(+)-sTGFβRII/hIFN-γ重組質(zhì)粒構(gòu)建流程圖(Fig1Construction ofPCDNA3.1(+)-sTGFβRII/hIFN-γplasmid)2.1.1 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增IFN-γ參考Genebank E00692設(shè)計(jì)hIFN-γ的一對(duì)引物，Taq DNApolymerase進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增，以hIFN-γ質(zhì)粒為模板，模板(100ng) 3μlLA Taq DNA聚合酶(5u/μl) 0.5μl10×LA Taq Buffer 5μl
IFN-γsense(20pmol/μl)1μlIFN-γantisense(20pmol/μl)1μl2.5mM dNTP mix 4μlH2O35μl
總體積 50μlPCR反應(yīng)條件95℃預(yù)變性3min 72℃延伸 10minPCR產(chǎn)物作瓊脂糖凝膠電泳鑒定并將片段切下膠回收。
2.1.2 PCR擴(kuò)增攜帶HindIII/BamH I限制性酶切位點(diǎn)的sTGFβRII 參考Genebank AH003678設(shè)計(jì)sTGFβRII的一對(duì)引物，在5’端、3’端分別引入HindIII識(shí)別位點(diǎn)、BamH I識(shí)別位點(diǎn)，用PyrobestDNA polymerase高保真擴(kuò)增sTGFβRII，PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同上。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后純化，作HindIII/BamH I雙酶切sTGFβRII PCR產(chǎn)物20μlHindIII(10u/μl) 2μlBamH I(10u/μl) 2μl10×BufferY+/T 5μlH2O 21μl
總體積 50μl混勻，37℃作用2h。
酶切產(chǎn)物作瓊脂糖凝膠電泳鑒定并將片段切下膠回收。
2.1.3 構(gòu)建TOPO-hIFN-γ克隆載體將hIFN-γ基因片段用T-A克隆的方法插入TOPO T-A克隆載體IFN-γPCR膠回收產(chǎn)物3μlTOPO T-AVetor 1μlSalt Solution(6×) 1μl
加水至 6μl混勻，室溫作用10min連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP 10F感受態(tài)細(xì)胞，挑取單個(gè)白色菌落若干，分別接種于3ml含Amp 100μg/ml的LB培養(yǎng)基中，抽提TOPO-hIFN-γ重組質(zhì)粒DNA，作EcoR I單酶切鑒定
TOPO-hIFN-γ質(zhì)粒20μlEcoR I(10u/μl) 2μl10×BufferY+/T 5μlH2O 23μl
總體積 50μl混勻，37℃作用2h。
酶切產(chǎn)物作瓊脂糖凝膠電泳鑒定并將陽(yáng)性克隆進(jìn)行核酸序列測(cè)定。
2.1.4 構(gòu)建TOPO-sTGFβRII/hIFN-γ克隆載體將測(cè)序正確的TOPO-hIFN-γ質(zhì)粒用HindIII/BamH I雙酶切TOPO-hIFN-γ質(zhì)粒20μlHindIII(10u/μl)2μlBamH I(10u/μl) 2μl10×BufferY+/T 5μlH2O 21μl
總體積 50μl混勻，37℃作用2h。
酶切產(chǎn)物作瓊脂糖凝膠電泳鑒定并將含hIFN-γ的載體片段切下膠回收。連接TOPO-hIFN-γ載體片段和sTGFβR II的HindIII/BamH I雙酶切產(chǎn)物sTGFβRII酶切片段 3μlTOPO-hIFN-γ載體片段5μl5×Ligation Buffer 3μlT4 DNA Ligase 1μlH2O 3μl
總體積 15μl混勻，室溫作用2h。
連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP 10F感受態(tài)細(xì)胞，操作同前。挑單個(gè)白色菌落擴(kuò)增，抽提TOPO-sTGFβRII/hIFN-γ重組質(zhì)粒DNA，作HindIII/XbaI雙酶切鑒定TOPO-sTGFβRII/hIFN-γ質(zhì)粒 20μlHindIII(10u/μl)2μlXbaI(10u/μl) 2μl10×BufferY+/T 5μlH2O 21μl
總體積 50μl混勻，37℃作用2h。
酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，陽(yáng)性質(zhì)粒-20℃保存。
2.1.5 構(gòu)建PCDNA3.1(+)-sTGFBRII/hIFN-γ真核表達(dá)載體用HindIII/XhoI雙酶切PCDNA3.1(+)真核表達(dá)質(zhì)粒和TOPO-sTGFβR II/hIFN-γ重組質(zhì)粒TOPO-sTGFβRII/hIFN-γ質(zhì)粒 20μlHindIII(10u/μl)2μlXhoI(10u/μl) 2μl10×BufferY+/T 5μlH2O 21μl
總體積 50μlPCDNA3.1(+)質(zhì)粒 20μlHindIII(10u/μl)2μlXhoI(10u/μl) 2μl10×BufferY+/T 5μlH2O 21μl
總體積 50μl混勻，37℃作用2h。
酶切產(chǎn)物作瓊脂糖凝膠電泳鑒定并將目的片段切下膠回收。
將sTGFβRII/hIFN-γ片段克隆入PCDNA3.1(+)質(zhì)粒sTGFβRII/hIFN-γ酶切片段 3μlPCDNA3.1(+)酶切載體片段5μl5×Ligation Buffer 3μlT4 DNALigase 1μlH2O3μl
總體積 15μl混勻，室溫作用2h。
連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，操作同前，鋪含Amp 100μg/ml的1.5％瓊脂LB培養(yǎng)基，挑單個(gè)菌落擴(kuò)增，抽提PCDNA3.1(+)-sTGFβRII/hIFN-γ重組質(zhì)粒DNA，進(jìn)行HindIII/XhoI鑒定，操作同前。并將酶切陽(yáng)性的質(zhì)粒進(jìn)行核酸測(cè)序。
2.2 在哺乳動(dòng)物dhfr缺陷型CHO細(xì)胞株DG44表達(dá)sTGFβRII/hIFN-γ融合蛋白
2.2.1 DG44細(xì)胞的培養(yǎng)Dhfr缺陷型CHO細(xì)胞為營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞，貼壁生長(zhǎng)，培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基，即含0.03mmol/L次黃嘌呤，0.003mmol/L胸腺嘧啶脫氧核苷，0.1mmol/L脯氨酸，0.1mmol/L甘氨酸，青霉素100u/ml，鏈霉素100u/ml，谷氨酰胺2mmol/L及10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)于缺乏次黃嘌呤、胸腺嘧啶脫氧核苷及甘氨酸的選擇性培養(yǎng)基中。
2.2.2 PCDNA3.1(+)-sTGFβRII/hIFN-γ重組質(zhì)粒和PSV2-dhfr質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染DG44細(xì)胞以及篩選、加壓接種1×106個(gè)DG44細(xì)胞于25cm2培養(yǎng)瓶中，以含次黃嘌呤(H)、胸腺嘧啶脫氧核苷(T)和脯氨酸(Pro)、甘氨酸(Gly)的DMEM完全培養(yǎng)液，5％CO2、37℃培養(yǎng)36h。取構(gòu)建好的sTGFβRII/hIFN-γ的PCDNA3.1(+)真核表達(dá)載體和PSV2-dhfr質(zhì)粒(10∶1)按LipofectamineTM2000試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后六小時(shí)換液，48小時(shí)1∶10傳代，采用不含H、T、Gly的選擇培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，待克隆形成后再采用含800ug/ml的G418的選擇培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，三天換液一次，持續(xù)兩周。用間接ELISA方法選取融合蛋白表達(dá)量高的克隆進(jìn)行5～1000nmolMTX梯度加壓篩選。5nmol/mlMTX加壓篩選10天，用間接ELISA方法選取融合蛋白表達(dá)量高的孔做有限稀釋(每孔10個(gè)細(xì)胞)；用10nmol/mlMTX加壓篩選20天，取最高表達(dá)孔再做有限稀釋?zhuān)挥?0nmol/mlMTX加壓篩選20天，取最高表達(dá)孔再做有限稀釋?zhuān)挥?00nmol/mlMTX加壓篩選20天，取最高表達(dá)孔再做有限稀釋?zhuān)?00nmol/ml加壓篩選20天，取最高表達(dá)孔再做有限稀釋?zhuān)?000nmol/ml加壓篩選20天，取最高表達(dá)孔，擴(kuò)大培養(yǎng)。
2.2.3 篩選穩(wěn)定高效表達(dá)sTGFβRII/hIFN-γ融合蛋白的DG44細(xì)胞株并無(wú)血清培養(yǎng)基滾瓶大量培養(yǎng)MTX加壓篩選后的dhfr缺陷型CHOS細(xì)胞做有限稀釋?zhuān)?6孔板，每孔一個(gè)細(xì)胞，挑選單個(gè)克隆的孔做上記號(hào)，十天換液，第15天雙抗夾心法檢測(cè)標(biāo)記的孔，挑選六個(gè)較高的孔傳至六孔板，等長(zhǎng)滿(mǎn)后再檢測(cè)一次，取最高孔進(jìn)行下一輪有限稀釋?zhuān)还策M(jìn)行四輪。將篩選后的穩(wěn)定高水平表達(dá)的克隆細(xì)胞株傳至25cm2培養(yǎng)瓶，換用CD CHO Medium 37℃、5％CO2培養(yǎng)過(guò)夜，以1×10e 5/瓶轉(zhuǎn)入WHEATON-33滾瓶，加50ml培養(yǎng)基以2轉(zhuǎn)/分鐘速度37℃、5％CO2培養(yǎng)，至培養(yǎng)基變黃，傳代。收集滾瓶培養(yǎng)上清。
2.3 鑒定sTGFβRII/hIFN-γ融合蛋白的表達(dá)2.3.1 ELISA檢測(cè) 取轉(zhuǎn)染后48h的細(xì)胞培養(yǎng)上清液用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)hIFN-γ的表達(dá)、用直接ELISA法檢測(cè)sTGFβRII的表達(dá)。
2.3.2 Western-blot檢測(cè)e 將50μl培養(yǎng)上清與等量2×SDS上樣緩沖液(0.125mol/L Tris-HCl，20％Glycerol，4％SDS，0.2mol/L DTT，0.02％溴酚藍(lán))混合，煮沸10min。
SDS-PAGE各孔中加入樣品20μl，并加蛋白分子量Marker 5μl。110v穩(wěn)流電泳，至溴酚藍(lán)指示劑全部電泳至凝膠下緣，停止電泳。
l 蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜將與凝膠大小相同的PVDF膜先后用甲醇和轉(zhuǎn)膜緩沖液浸泡數(shù)分鐘，濾紙、墊片用轉(zhuǎn)膜緩沖液浸泡數(shù)分鐘，PVDF貼于凝膠陽(yáng)極面，兩面再各覆蓋一層濾紙，400mA穩(wěn)壓轉(zhuǎn)110min。
l Western-blot檢測(cè)加兔抗sTβRII或小鼠抗IFNγ抗體4℃反應(yīng)過(guò)夜，TBST漂洗4次每次10min，加入羊抗兔IgG-HRP(以TBST 1∶2000稀釋)，室溫反應(yīng)1h。ECL顯色，X線(xiàn)膠片曝光并顯影。
2.4 sTGFβRII/hIFN-γ融合蛋白的純化將收集的滾瓶培養(yǎng)上清12000rpm離心30min，用Labscale TFF超濾裝置純化濃縮上清液，先后用100KD和10KD的膜包去除雜蛋白并濃縮上清液。超濾后上清用AKTA-100蛋白純化儀進(jìn)行純化，先用HiTrap Desalting脫鹽，脫鹽后根據(jù)融合蛋白的等電點(diǎn)先后用陽(yáng)離子交換層析和陰離子交換層析進(jìn)行純化，收集融合蛋白所在的峰。SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)R250染色后用凝膠掃描儀掃描檢測(cè)樣品純度。收集的融合蛋白于Beckman DU640蛋白核酸分析系統(tǒng)進(jìn)行定量，-80℃?zhèn)溆?。融合蛋白于Savant真空低溫干燥系統(tǒng)凍干后保存。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.PCDNA3.1(+)-sTGFβRII/hIFN-γ的構(gòu)建及鑒定1.1 用所設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增hIFN-γcDNA，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，可見(jiàn)預(yù)期大小(431bp)的特異性條帶(見(jiàn)圖2)。將其膠回收片段T-A克隆至TOPO克隆載體，所得TOPO-hIFN-γ質(zhì)粒用EcoR I進(jìn)行單酶切鑒定見(jiàn)到預(yù)期大小的4kb左右載體條帶和430bp左右目的條帶(見(jiàn)圖3)。酶切陽(yáng)性質(zhì)粒測(cè)序(SANGON)，樣本的所插入的hIFN-γ序列與標(biāo)準(zhǔn)序列(Genebank E00692)完全一致(見(jiàn)序列表1)。陽(yáng)性質(zhì)粒酶切產(chǎn)物膠回收以備進(jìn)一步克隆。
1.2 sTGFβRII PCR產(chǎn)物經(jīng)HindIII/BamH I雙酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析(圖3)，可見(jiàn)預(yù)期大小的(483bp)特異性條帶；膠回收雙酶切片段以備下一步克隆。
1.3 真核表達(dá)載體PCDNA3.1(+)-sTGFβRII/hIFN-γ的構(gòu)建和鑒定 將sTGFβRII與TOPO-hIFN-γ的HindIII/BamH I雙酶切片段連接，獲得sTGFβRII/hIFN-γ的融合基因，將其插入真核表達(dá)載體PCDNA3.1(+)的真核啟動(dòng)子CMV下游的HindIII/XhoI多克隆位點(diǎn)上，構(gòu)建成真核表達(dá)質(zhì)粒PCDNA3.1(+)-sTGFβRII/hIFN-γ。
1.3.1 TOPO-sTGFβRII/hIFN-γ質(zhì)粒鑒定HindIII/XbaI雙酶切質(zhì)粒產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析可見(jiàn)到1kb的左右的目的重組片段條帶(sTGFβRII+hIFN-γ)和4kb左右的載體片段(3872bp)條帶(見(jiàn)圖4)，證實(shí)sTGFβRII/hIFN-γ融合基因重組在TOPO載體的HindIII和XbaI多克隆位點(diǎn)之間，成功構(gòu)建了TOPO-sTGFβRII/hIFN-γ質(zhì)粒。
1.3.2 PCDNA3.1(+)-sTGFβRII/hIFN-γ質(zhì)粒鑒定HindIII/XhoI雙酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析(圖5)，可見(jiàn)1kb左右的目的片段和5.4kb左右的載體片段條帶，證明sTGFβRII/hIFN-γ被插入到PCDNA3.1(+)載體的HindIII和XhoI位點(diǎn)之間；其核酸測(cè)序結(jié)果與預(yù)期序列完全一致(見(jiàn)序列表1)；此質(zhì)粒進(jìn)一步在分別含ampicillin和Neonycin的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，均能良好生長(zhǎng)，以上提示PCDNA3.1(+)-sTGFβRII/hIFN-γ構(gòu)建準(zhǔn)確無(wú)誤。
2.sTGFβRII/hIFN-γ融合蛋白的鑒定PCDNA3.1(+)-sTGFβRII/hIFN-γ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染dhfr-CHO細(xì)胞DG44 48h后所保留的細(xì)胞培養(yǎng)上清用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)hIFN-γ表達(dá)水平，A450值為2.27±0.18，空白對(duì)照A450值分別為0.07±0.01(p＜0.01)。用直接ELISA檢測(cè)sTGFβRII，A450為1.78±0.51，空白對(duì)照A450分別為0.19±0.04(p＜0.01)。Western-blot顯示，hIFN-γ和sTGFβRII在相同部位(約40kDa處)出現(xiàn)特異性條帶，以上說(shuō)明sTGFβRII/hIFN-γ融合基因已整合到細(xì)胞基因組，在DG44細(xì)胞培養(yǎng)上清中有sTGFβRII/hIFN-γ融合蛋白的表達(dá)。
3.獲得穩(wěn)定高效表達(dá)sTGFβRII/hIFN-γ融合蛋白的DG44細(xì)胞株3.1 轉(zhuǎn)染PCDNA3.1(+)-sTGFβRII/hIFN-γ重組質(zhì)粒的DG44細(xì)胞在G418 800μg/ml加壓篩選一周左右開(kāi)始死亡，兩周左右空白孔細(xì)胞全部死亡。將形成克隆的細(xì)胞經(jīng)過(guò)有限稀釋?zhuān)暨x表達(dá)水平最高孔再用MTX5～1000nmol/ml加壓篩選。隨著MTX濃度升高，dhfr基因拷貝大量擴(kuò)增，目的基因也隨之大量擴(kuò)增，sTGFβRII/hIFN-γ表達(dá)穩(wěn)定上升，并達(dá)到峰值(圖6)。當(dāng)MTX濃度為500nM時(shí)，sTGFβRII/hIFN-γ表達(dá)量達(dá)到最大值，并隨著濃度的增加sTGFβRII/hIFN-γ表達(dá)量不再上升，因此我們將500nM作為穩(wěn)定篩選的MTX濃度。
3.2 加壓篩選后的細(xì)胞再經(jīng)有限稀釋篩選出穩(wěn)定高效的細(xì)胞株，總共進(jìn)行了四輪有限稀釋?zhuān)谝惠営邢尴♂尯螅诤系鞍椎谋磉_(dá)水平大大增高，到第三輪稀釋后表達(dá)水平基本穩(wěn)定(圖7)。篩選完畢后的細(xì)胞以1×10E5轉(zhuǎn)入滾瓶培養(yǎng)。滾瓶培養(yǎng)期間用ELISA法跟蹤檢測(cè)上清中的hIFN-γ水平，顯示表達(dá)水平穩(wěn)定持續(xù)上升并達(dá)到峰值，最高表達(dá)量超過(guò)6ug/105細(xì)胞/ml(圖8)。獲得穩(wěn)定、高效表達(dá)sTGFβIIR/hIFN-γ融合蛋白的DG44細(xì)胞株。
4.TGFβRII/hIFN-γ融合蛋白的純化將收集的滾瓶培養(yǎng)上清離心后，用Labscale TFF超濾裝置純化濃縮上清液，超濾后上清用AKTA-100蛋白純化儀進(jìn)行純化，先用HiTrap Desalting脫鹽，脫鹽后根據(jù)融合蛋白的等電點(diǎn)先后用陽(yáng)離子交換層析和陰離子交換層析進(jìn)行純化，收集融合蛋白所在的峰，檢測(cè)蛋白純度達(dá)80％以上。
為驗(yàn)證本發(fā)明sTGFβRII/hIFN-γ融合蛋白生物學(xué)活性以及實(shí)際使用效果，進(jìn)行以下三部分試驗(yàn)以下所有結(jié)果均以( )表示，采用SPSS10軟件進(jìn)行雙側(cè)t檢驗(yàn)分析。
一、sTGFβRII/hIFN-γ融合蛋白生物學(xué)活性的檢測(cè)1、sTGFβRII對(duì)TGFβ1的拮抗活性的檢測(cè)將Mv1Lu按1×104接種于96孔板，待其貼壁后加入用hIFN-γ抗體(2μg/ml)預(yù)處理的不同濃度的融合蛋白和800pg/ml的人TGFβ1重組蛋白，37℃、5％CO2培養(yǎng)72h，在培養(yǎng)結(jié)束前4h加MTT 50μl/孔(2mg/ml inPBS)，繼續(xù)培養(yǎng)至72h，1000rpm離心10min，棄上清，加二甲基亞砜(DMSO)150μl/孔，振蕩10min，于酶標(biāo)儀570nm處讀A值，檢測(cè)Mv1Lu的生長(zhǎng)狀況。本實(shí)驗(yàn)連續(xù)檢測(cè)3次，每次作3個(gè)復(fù)孔，設(shè)sTGFβRII活性封閉對(duì)照(加sTGFβRII抗體)、TGFβ1對(duì)照、空白對(duì)照。
2、hIFN-γ對(duì)NK細(xì)胞的刺激活性的檢測(cè)用不同濃縮度的融合蛋白預(yù)處理6h的正常人外周血淋巴細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562細(xì)胞作為靶細(xì)胞，采用LDH釋放法(Cytotox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay)檢測(cè)NK細(xì)胞活性，操作按照說(shuō)明書(shū)將淋巴細(xì)胞和K562細(xì)胞接種于96孔板(效、靶比為20∶1)。于37℃、5％CO2培養(yǎng)4h后加底物液，室溫避光30min后加終止液終止反應(yīng)，于酶標(biāo)儀490nm處測(cè)A值。本實(shí)驗(yàn)連續(xù)檢測(cè)3次，每次作3個(gè)復(fù)孔，設(shè)空白對(duì)照。結(jié)果計(jì)算如下 3、hIFN-γ的抗病毒活性的檢測(cè)將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的WISH細(xì)胞按2×104/孔接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后加入以10％FCS DMEM系列稀釋的sTGFβRII/hIFN-γ融合蛋白100μl/孔預(yù)處理孵育3h，加約500～1000TCID50的VSV病毒25μl/孔，繼續(xù)孵育至24h，用MTT法檢測(cè)WISH細(xì)胞生長(zhǎng)情況，設(shè)細(xì)胞對(duì)照孔、VSV病毒對(duì)照孔、rhIFN-γ對(duì)照孔、hIFN-γ活性封閉對(duì)照孔(加hIFN-γ抗體)。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)3個(gè)復(fù)孔。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果1 融合蛋白拮抗TGFβ1對(duì)Mv1Lu的生長(zhǎng)抑制作用 用不同濃縮度的sTGFβRII/hIFN-γ蛋白及一定量TGFβ1(800pg/ml)和Mv1Lu細(xì)胞共同哺育72h，經(jīng)MTT法檢測(cè)(圖9)。10ng/ml、5ng/ml、2ng/ml、1ng/ml和0.1ng/ml的sTGFβRII/hIFN-γ蛋白各孔的A570值分別為1.633±0.09、1.603±0.07、1.203±0.07、0.61±0.04、0.44±0.04。各sTGFβRII/hIFN-γ蛋白孔和TGFβ1對(duì)照孔0.33±0.04比較有顯著性差異(p＜0.01)；sTRII中和抗體孔和TGFβ1對(duì)照孔比較無(wú)顯著差異(P＞0.1)。提示所表達(dá)的融合蛋白中的sTGFβRII能拮抗TGFβ1對(duì)Mv1Lu的生長(zhǎng)抑制作用，說(shuō)明本研究得到的融合蛋白具有拮抗TGFβ1生物學(xué)活性的作用。
2 融合蛋白刺激NK細(xì)胞殺傷活性 20∶1效靶比的淋巴細(xì)胞和K562細(xì)胞，在不同濃度的融合蛋白的作用下，用LDH釋放法檢測(cè)NK細(xì)胞活性(圖10)。添加5ng/ml、2ng/ml、lng/ml、0.5ng/ml融合蛋白的NK活性分別為(72.90±5.07)％、(68.67±9.38)％、(54.14±3.67)％、(35.92±3.81)％，與空白對(duì)照孔(18.05±6.09)％比較有顯著性差異(p＜0.01)；添加0.1ng/ml融合蛋白的NK活性為(20.82±6.90)％，和空白孔比較無(wú)顯著性差異(p＞0.1)。表明所表達(dá)的融合蛋白中的hIFN-γ能夠刺激NK細(xì)胞的殺傷活性，得到的融合蛋白具有hIFN-γ生物學(xué)活性。
3 融合蛋白的抗病毒活性 處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的WISH細(xì)胞在不同稀釋度融合蛋白及約500～1000TCID50的VSV病毒作用24h后，用MTT法檢測(cè)hIFN-γ對(duì)WISH細(xì)胞的保護(hù)情況(圖11)，加有10ng/ml、5ng/ml、2ng/ml、1ng/ml、0.5ng/ml融合蛋白及rhIFN-γ對(duì)照的A570值分別為1.792±0.11、1.487±0.07、1.14±0.02、0.647±0.07、0.357±0.07、1.538±0.05，顯著高于VSV病毒對(duì)照孔0.147±0.03(p＜0.01)，表明所表達(dá)的融合蛋白中的hIFN-γ具有抗病毒活性，得到的融合蛋白具有hIFN-γ生物學(xué)活性。
二、為驗(yàn)證可溶性TGFβII型受體(sTGFβRII)與人γ干擾素融合蛋白的體外抗肝纖維化作用，進(jìn)行以下分子機(jī)制研究的試驗(yàn)1.主要試劑l 重組TGFβ1標(biāo)準(zhǔn)品，R&D Systems；l 各類(lèi)抗體IFN-γ兔多克隆抗體、TGFβRII兔多克隆抗體，CollagenI兔多克隆抗體、CollagenIII兔多克隆抗體、α-SMA小鼠單克隆抗體，Desmin小鼠單克隆抗體為Santa Cruz公司產(chǎn)品；Phospho-Samd2兔單克隆抗體，cell signaling technology公司產(chǎn)品；Smad2小鼠單克隆抗體、Smad7小鼠單克隆抗體為Abcam產(chǎn)品；羊抗小鼠FITC熒光二抗、羊抗兔FITC熒光二抗為Santa Cruz產(chǎn)品。
2.方法2.1 sTGFβRII/hIFN-γ融合蛋白體外抗肝纖維化實(shí)驗(yàn)2.1.1 將HSC按1×106接種于10cm的培養(yǎng)皿，待細(xì)胞貼壁，加不同濃度融合蛋白預(yù)處理2h后加入500pg/ml重組TGFβ1，37℃、5％CO2培養(yǎng)72h。加200μl/dish的裂解液(10mmol/LTris-HCl pH＝7.4，150mmol/LNaCl，0.5％NP-40，0.1％SDS，0.5％膽酸鈉，1mmol/L釩酸鈉)，用機(jī)械法收集細(xì)胞，冰浴30min，10000rpm離心10min，取上清液加等量2×SDS-PAGE上樣緩沖液煮沸10min，按常規(guī)方法作CollagenI、CollagenIII、α-SMA的Western-blot分析。設(shè)空白對(duì)照、TGFβ1刺激對(duì)照、sTGFβRII對(duì)照和hIFN-γ對(duì)照。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)2復(fù)孔。
2.1.2 將HSC按8×103接種于24孔板，待細(xì)胞貼壁，加入10ng/ml濃度融合蛋白預(yù)處理2h后加入500pg/ml重組TGFβ1，37℃、5％CO2培養(yǎng)72h。作空白對(duì)照、TGFβ1刺激對(duì)照。培養(yǎng)后細(xì)胞作CollagenI、CollagenIII、α-SMA、Desmin表達(dá)的間接免疫熒光細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)。
2.2 sTGFβRII/hIFN-γ融合蛋白體外抑制TGFβ1/SAMD信號(hào)通路實(shí)驗(yàn)將HSC按1×106接種于10cm的培養(yǎng)皿，細(xì)胞長(zhǎng)至80％滿(mǎn)，加不同濃度融合蛋白預(yù)處理2h后加入500pg/ml重組TGFβ1，37℃、5％CO2培養(yǎng)30min。加200μl/dish的裂解液(10mmol/LTris-HCl pH＝7.4，150mmol/LNaCl，0.5％NP-40，0.1％SDS，0.5％膽酸鈉，1mmol/L釩酸鈉)，用機(jī)械法收集細(xì)胞，冰浴30min，10000rpm離心10min，取上清液加等量2×SDS-PAGE上樣緩沖液煮沸10min，按常規(guī)方法作Westem-blot分析，檢測(cè)SAMD2、磷酸化的SAMD2。作空白對(duì)照、TGFβ1刺激對(duì)照、sTGFβRII對(duì)照和hIFN-γ對(duì)照。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)2復(fù)孔。SMAD7的檢測(cè)方式同2.1.1。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.HSC細(xì)胞在不同濃度的融合蛋白和一定量的TGFβ1(500pg/ml)共同作用72小時(shí)后，收集細(xì)胞做Western-blot比較各融合蛋白作用組、TGFβ1刺激、sTGFβRII和hIFN-γ對(duì)照及空白對(duì)照之間I型膠原、III型膠原、α-SMA。在本研究中Western-blot分析有顯著差別。
2.HSC細(xì)胞在20ng/ml融合蛋白和一定量的TGFβ1(500pg/ml)共同作用72小時(shí)后，做間接免疫熒光細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)，比較融合蛋白作用組和TGFβ1刺激及空白對(duì)照之間I型膠原、III型膠原、α-SMA。在本研究中間接免疫熒光細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)有顯著差異。
3.HSC細(xì)胞在不同濃度的融合蛋白和一定量的TGFβ1(500pg/ml)共同作用30min后，收集細(xì)胞做Western-blot比較融合蛋白作用組、TGFβ1刺激組、sTGFβRII、hIFN-γ對(duì)照及空白對(duì)照之間SMAD2、Phospho-Smad2、Smad7。其中Phospho-Smad2有顯著性差異。Smad2、Smad7個(gè)組之間無(wú)顯著性差異。
三、為驗(yàn)證可溶性TGFβII型受體(sTGFβRII)與人γ干擾素融合蛋白的體內(nèi)抗肝纖維化作用，進(jìn)行以下動(dòng)物試驗(yàn)可溶性TGFβII型受體(sTGFβRII)與γ-干擾素融合蛋白抗大鼠肝纖維作用的試驗(yàn)。
按本發(fā)明的上述方法獲得大鼠可溶性TGFβII型受體(sTGFβRII)與γ-干擾素融合的純化蛋白并經(jīng)體外活性鑒定，然后進(jìn)行以下動(dòng)物試驗(yàn)試驗(yàn)材料1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性Sprague Dawley大鼠120只，6～7周齡，重135～150g，由中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
2.Recombinant Rat RIFN-γR&D公司產(chǎn)品。
3.四氯化碳(CCl4)上海凌峰化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。
4.山茶油浙江省江山市綠土源糧油食品有限公司產(chǎn)品。
5.即用型SABC免疫組化染色試劑盒武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品。
6.天狼猩紅染料由本所配制，常規(guī)保存。
7.PCR引物根據(jù)Genebank登錄的Col III、α-SMA、TGFβ1、TGFβRII和β-actin全部或部分cDNA序列設(shè)計(jì)引物，由上海生物工程技術(shù)公司合成。見(jiàn)表1，表1PCR引物Table 1 Sequences of PCR primers used in this study


試驗(yàn)過(guò)程1.肝纖維化模型的建立將CCl4用等體積的山茶油配成50％濃度的混合液，除正常組外，從第0天開(kāi)始按0.3ml/100g體重背部皮下注射，每周一、四兩次給藥，持續(xù)8周，每周根據(jù)體重調(diào)整藥量，以誘導(dǎo)慢性肝損傷和肝纖維化，六組均給予正常飲食。CCl4皮下注射后第8周，處死六只大鼠取肝組織行組織病理學(xué)檢查，治療結(jié)束后兩周處死所有大鼠，取肝臟，一部分用10％福爾馬林固定，石蠟切片。另一部分-80℃凍存。
2.治療將肝纖維化模型大鼠(n＝130)隨機(jī)分為5組，每組26只，分入A、B、C、D、E組，另設(shè)正常對(duì)照一組Nor組(n＝10)。根據(jù)第一部分測(cè)定的RsTβRII-IFN-γ融合蛋白中RsTβRII及RIFN-γ的活性，融合蛋白的量采用每次每只大鼠0.136mg，RsTβRII的量采用每次每只大鼠0.048mg，并根據(jù)文獻(xiàn)資料，IFN-γ采用每次每只大鼠7.5萬(wàn)IU。
□ A組(RsTβRII-IFN-γ重組融合蛋白治療組)隔天注射一次，融和蛋白的量每次每只大鼠肌肉注射0.136mg，共持續(xù)8周；□ B組(IFN-γ治療組)隔天注射一次，每次每只大鼠肌肉注射IFN-γ7.5萬(wàn)IU，共持續(xù)8周；□ C組(可溶性受體蛋白R(shí)sTβRII治療組)隔天注射一次，每次每只大鼠肌肉注射RsTβRII 0.048mg，共持續(xù)8周；□ D組(IFN-γ+可溶性受體蛋白R(shí)sTβRII治療組)隔天注射一次，每次每只大鼠肌肉注射RIFN-γ7.5萬(wàn)IU+RsTβRII 0.048mg，共持續(xù)8周；□ E組(未處理的肝纖維化組)隔天注射生理鹽水100μl/只；□Nor(正常對(duì)照組，N組)不作任何處理，自由飲食，共持續(xù)8周；皮下注射方法皮下注射給藥部位是真皮和皮下結(jié)締組織之間，常選項(xiàng)背或大腿內(nèi)側(cè)的皮膚。操作時(shí)，用1ml注射器吸取蛋白質(zhì)溶液，75％酒精常規(guī)消毒大鼠注射部位皮膚，然后將皮膚提起，注射針頭取一鈍角角度刺入皮下，把針頭輕輕向左右擺動(dòng)，易擺動(dòng)則表示已刺入皮下，再輕輕抽吸，如無(wú)回血，可緩慢地將藥物注入皮下。拔針時(shí)左手拇、食指捏住進(jìn)針部位片刻，以防止藥物外漏。
結(jié)果觀察2.1HE染色觀察大體病理變化，40×鏡下觀察肝纖維化程度。
2.2天狼猩紅Siriured染色法觀察I、III型膠原，100×鏡下觀察肝纖維化程度。
2.3免疫組織化學(xué)檢測(cè)大鼠肝組織Col III、α-SMA、TGFβ1及TGFβRII的表達(dá)2.4熒光定量RT-PCR檢測(cè)大鼠肝組織Col III、α-SMA、TGFβ1、TGFβRII表達(dá)大鼠股動(dòng)脈放血處死，取肝組織約1g，-80℃保存。
l 大鼠肝臟總RNA的提取l cDNA第一鏈的合成 以總RNA為模板合成cDNA第一鏈l 熒光定量PCR(Light Cycler FastStart SYBR Green I Master，Roche)檢測(cè)ColIII、α-SMA、TGFβ1、TGFβRII mRNA表達(dá)水平每個(gè)Light Cycler PCR(15μl)反應(yīng)體系為1.5μl Light Cycler FastStart DNA Master Mix，1.8μlMgCl2(25mM)，0.4μl of each primer(10μM)，2μl經(jīng)10倍稀釋的cDNA，9.3μl H2O。PCR程序?yàn)?5℃預(yù)變性10min；94℃變性10sec，65℃復(fù)性15sec，72℃延伸15sec，擴(kuò)增50個(gè)循環(huán)；PCR產(chǎn)物95℃變性1min后迅速降溫至55℃維持30sec，緩慢升溫(0.1℃steps)至95℃，收集熒光信號(hào)，熔解曲線(xiàn)分析。結(jié)果以目的基因與相應(yīng)的β-actin比值表示。反應(yīng)結(jié)束后，取5μl PCR產(chǎn)物作瓊脂糖凝膠(1.5％)電泳檢測(cè)。
2.5 Western Blotting檢測(cè)大鼠肝組織Col III、α-SMA、TGFβ1、TGFβRII蛋白表達(dá)l 組織蛋白的提取，蛋白的定量l SDS-PAGE和Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.同步構(gòu)建了大鼠sTβRII-IFN-γ融合蛋白表達(dá)載體。
2.體外細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)表達(dá)的RsTβRII-IFN-γ融合蛋白具有抵抗VSV對(duì)L929細(xì)胞的破壞作用及拮抗TGFβ對(duì)CCL-64細(xì)胞的增殖抑制作用，證明該融合蛋白同時(shí)具有sTβRII和IFN-γ的生物學(xué)活性測(cè)定了RsTβRII-IFN-γ融合蛋白中RIFN-γ的活性單位，為1mgRsTβRII-IFN-γ融合蛋白中RIFN-γ的效價(jià)為55萬(wàn)IU；測(cè)定了RsTβRII的比活性，得出RsTβRII-IFN-γ融合蛋白50％抑制率的用量是52.8ng/ml，單純RsTβRII蛋白為18.6ng/ml，兩者比值2.84∶1。
3.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)(1)組織病理學(xué)肝纖維化模型大鼠分別給予肌肉注射重組融合蛋白R(shí)sTβRII-IFN-γ、RIFN-γ、可溶性受體蛋白R(shí)sTβRII、RIFN-γ+可溶性受體蛋白R(shí)sTβRII或生理鹽水，隔天一次，持續(xù)8周。最后一次給藥后2周處死全部大鼠，取部分肝組織，用10％福爾馬林固定，石蠟切片，采用HE和天狼猩紅纖維染色法觀察肝纖維化程度。在HE和天狼猩紅纖維染色的切片中均可見(jiàn)到E組和C組中央靜脈擴(kuò)張，大量纖維結(jié)締組織(膠原)分割包繞肝小葉，形成假小葉，并可見(jiàn)大量結(jié)節(jié)。在天狼猩紅纖維染色的片子中，膠原纖維在普通光鏡下呈鮮紅色，而A、B、D組纖維成分(膠原)較少，其中A組纖維成分(膠原)較B、D組更少，說(shuō)明A組纖維化程度明顯較其余各組輕。
(2)免疫組織化學(xué)檢測(cè)大鼠肝組織Col III、α-SMA、TGFβ1及TGFβRII的表達(dá)肝纖維化模型大鼠分別給予肌肉注射重組RsTβRII-IFN-γ融合蛋白、RIFN-γ、RsTβRII可溶性受體蛋白、RIFN-γ+RsTβRII可溶性受體蛋白或生理鹽水，隔天一次，持續(xù)8周。最后一次給藥后2周處死全部大鼠，取部分肝組織，用10％福爾馬林固定，石蠟切片，采用免疫組織化學(xué)染色的方法觀察Col III，α-SMA、TGFβ1及TGFβRII的表達(dá)。E組和C組這四個(gè)分子的表達(dá)均較高，A、B、D組表達(dá)較少，其中A組表達(dá)較B、D組更少，說(shuō)明A組纖維化程度明顯較其余各組輕。
(3)RT-PCR檢測(cè)大鼠肝組織Col III、α-SMA、TGFβ1、TGFβRII mRNA表達(dá)大鼠肝臟組織提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，分別用大鼠Col III、α-SMA、TGFβ1、TGFβRII引物PCR擴(kuò)增，并與內(nèi)參照β-actin比較，結(jié)果顯示A、B、D組大鼠肝臟Col III、α-SMA、TGFβ1、TGFβRII mRNA表達(dá)水平較C組和E組低，其中A組最低，見(jiàn)圖12。定量分析也表明了同樣的結(jié)果，見(jiàn)圖13。
(4)Western Blotting檢測(cè)大鼠肝組織中Col III、α-SMA、TGFβ1、TGFβRII表達(dá)提取大鼠肝組織蛋白，用western blotting檢測(cè)Col III、α-SMA、TGFβ1、TGFβRII，ECL顯色后與內(nèi)參照β-actin比較，可見(jiàn)RsTβRII-IFN-γ融合蛋白治療組(A組)這四個(gè)蛋白的表達(dá)量明顯低于其余治療組。見(jiàn)圖14。
以上試驗(yàn)結(jié)果表明1.成功構(gòu)建了PCDNA3.1(+)-sTGFβRII/hIFN-γ真核表達(dá)質(zhì)粒。
2.獲得高效、穩(wěn)定表達(dá)具有生物學(xué)活性的sTGFβRII/hIFN-γ融合蛋白的DG44細(xì)胞株。
3.建立了大規(guī)模無(wú)血清滾瓶培養(yǎng)體系及融合蛋白的大量表達(dá)及純化。
4.體外細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)表達(dá)純化的sTGFβRII/hIFN-γ重組融合蛋白分別具有sTGFRII和IFN-γ生物學(xué)活性，在體外能夠顯著抑制TGFβ誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞的活化，抑制細(xì)胞外基質(zhì)的合成。
5.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，sTGFβRII/hIFN-γ重組融合蛋白能顯著減輕大鼠肝纖維化模型的肝纖維化程度，具有明顯的抗肝纖維化作用。
研究結(jié)果1.PCDNA3.1(+)-sTGFβRII/hIFN-γ進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序分析結(jié)果與預(yù)期一致，說(shuō)明成功構(gòu)建了PCDNA3.1(+)-sTGFβRII/hIFN-γ真核表達(dá)質(zhì)粒。
2.分析PCDNA3.1(+)-sTGFβRII/hIFN-γ轉(zhuǎn)染DG44細(xì)胞后的蛋白表達(dá)。ELISA檢測(cè)顯示(OD值450nm)重組質(zhì)粒的表達(dá)上清中hIFN-γ和sTGFβRII顯著高于空白對(duì)照(p＜0.01)；Western-blot分析顯示hIFN-γ和sTGFβRII在相同部位(約40kDa處)出現(xiàn)特異性條帶；表明在DG44細(xì)胞培養(yǎng)上清中有sTGFβRII/hIFN-γ融合蛋白的表達(dá)。
3.轉(zhuǎn)染的DG44經(jīng)過(guò)多次有限稀釋培養(yǎng)，上清中hIFN-γ維持在較高水平，表明獲得高效、穩(wěn)定表達(dá)的DG44細(xì)胞株。滾瓶培養(yǎng)最高達(dá)6ug/105細(xì)胞/ml。用Labscale TFF超濾裝置和AKTA-100純化儀純化的融合蛋白純度達(dá)80％以上。
4.sTGFβRII/hIFN-γ融合蛋白生物學(xué)活性將融合蛋白和TGFβ1與Mv1Lu共同孵育后，顯著拮抗TGFβ1的增殖抑制作用；與正常人淋巴細(xì)胞共同孵育，融合蛋白能明顯刺激NK細(xì)胞活性；和VSV病毒與WISH細(xì)胞一起孵育，能顯著抑制VSV引起的WISH細(xì)胞病變。表明獲得的融合蛋白具有sTGFβRII和hIFN-γ的生物學(xué)活性。
5.sTGFβRII/hIFN-γ融合蛋白體外抗肝纖維化分子機(jī)制將融合蛋白和TGFβ1與HSC一起孵育，發(fā)現(xiàn)能顯著抑制TGFβ1刺激誘導(dǎo)的SMAD2/3磷酸化，也能明顯減少TGFβ1刺激誘導(dǎo)的HSC的ColI、ColIII、α-SMA、Desmin表達(dá)，表明該融合蛋白通過(guò)抑制TGFβ1/SAMD信號(hào)通路抑制HSC活化和膠原合成，有抗肝纖維化潛力。
6.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)同步構(gòu)建的大鼠sTβRII-IFN-γ融合蛋白治療大鼠肝纖維化，能明顯減少CCl4誘導(dǎo)的大鼠HSC活化，減少α-SMA、TGFβ1、TβRII和Col III等ECM的表達(dá)，減輕肝纖維化程度，效果較單獨(dú)使用RsTβRII蛋白、RIFN-γ或RsTβRII與RIFN-γ混合應(yīng)用更明顯。證明sTβRII/IFN-γ融合蛋白具有一定的抗肝纖維化作用。
序列表SEQID NO.1sTGFβRII/hIFN-γ融合基因測(cè)序結(jié)果及相應(yīng)氨基酸序列1. ATG GGT CGG GGG CTG CTC AGG GGC CTG TGGM G R G L L R G L W31 CCG CTG CAC ATC GTC CTG TGG ACG CGT ATCP L H I V L W T R I61 GCC AGC ACG ATC CCA CCG CAC GTT CAG AAGA S T I P P H V Q K91 TCG GTT AAT AAC GAC ATG ATA GTC ACT GACS V N N D M I V T D121 AAC AAC GGT GCA GTC AAG TTT CCA CTG TGTN N G A V K F P Q L151 TGT AAA TTI TGT GAT GTG AGA TIT TCC ACCC K F C D V R F S T181 TGT GAC AAC CAG AAA TCC TGC ATG AGC AACC D N Q K S C M S N211 TGC AGC ATC ACC TCC ATC TGT GAG AAG CCAC S I T S I C E K P241 CAG GAA GTC TGT GTG GCT GTA TGG AGA AAGQ E V C V A V W R K271 AAT GAC GAG AAC ATA ACA CTA GAG ACA GTTN D E N I T L E T V301 TGC CAT GAC CCC AAG CTC CCC TAC CAT GAC
C H D P K L P Y H D331 TTT ATT CTG GAA GAT GCT GCT TCT CCA AAGF I L E D A A S P K361 TGC ATG ATG AAG GAA AAA AAA AAG CCT GGTC I M K E K K K P G391 GAG ACT TTC TTC ATG TGT TCC TGT AGC TCTE T F F M C S C S S421 GAT GAG TGC AAT GAC AAC ATC ATC TTC TCAD E C N D N I I F S451 GAA GAA TAT AAC ACC AGC ATT CCT GAC TTGE E Y N T S N P D L481 GAT CCA CTA GTA ACG GCC GCC AGT GTG CTGD P L V T A A S V L511 GAA TTC GCC CTT TCT CTT GGC TGT TAC TGCE F A L S L G C Y C541 CAG GAC CCA TAT GTA AAA GAA GCA GAA AACQ D P Y V K E A E N571 CTT AAG AAA TAT TTT AAT GCA GGT CAT TCAL K K Y F N A G H S601 GAT GTA GCG GAT AAT GGA ACT CTT TTC TTAD V A D N G T L F L631 GGC ATT TTG AAG AAT TGG AAA GAG GAG AGTG I L K N W K E E S661 GAC AGA AAA ATA ATG CAG AGC CAA ATT GTCD R K I M Q S Q I V691 TCC TTT TAC TTC AAA CTT TTT AAA AAC TTTS F Y F K L F K N F721 AAA GAT GAC CAG AGC ATC CAA AAG AGT GTGK D D Q S I Q K S V751 GAG ACC ATC AAG GAA GAC ATG AAT GTC AAGE T I K E D M N V K781 TTT TTC AAT AGC AAC AAA AAG AAA CGA GATF F N S N K K K R D811 GAC TTC GAA AAG CTG ACT AAT TAT TCG GTAD F E K L T N Y S V841 ACT GAC TTG AAT GTC CAA CGC AAA GCA ATAT D L N V Q R K A I871 CAT GAA CTC ATC CAA GTG ATG GCT GAA CTGH E L I Q V M A E L901 TCG CCA GCA GCT AAA ACA GGG AAG CGA AAAS P A A K T G K R K931 AGG AGT CAG ATG CTG TTT CGA GGT AAG GGCR S Q M L F R G K G961 GAA TTC TGC AGA TAT CCA TCA CAC TGG CGGE F C R Y P S H W R991 CCG CTC GAG AGA GGG CCC GAA CAA AAA CTCP L E R G P E Q K L1021ATC TCA GAA GAG GAT CTG AAT AGC GCC GTCI S E1051GAC TAG
權(quán)利要求
1.可溶性轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β II型受體/γ-干擾素重組融合蛋白，其特征在于其核苷酸序列和相應(yīng)氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所述。
2.按權(quán)利要求1所述可溶性轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β II型受體/γ-干擾素重組融合蛋白的制備方法為如下步驟(1)構(gòu)建sTGFβRII/hIFN-γ的PCDNA3.1(+)真核表達(dá)載體；(2)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增IFN-γ；(3)在哺乳動(dòng)物dhfr缺陷型CHO細(xì)胞株DG44表達(dá)sTGFβRII/hIFN-γ融合蛋白(4)鑒定sTGFβRII/hIFN-γ融合蛋白的表達(dá)；(5)sTGFβRII/hIFN-γ融合蛋白的純化。
3.按權(quán)利要求1所述可溶性轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β II型受體/γ-干擾素重組融合蛋白應(yīng)用于制備抗肝纖維化藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種可溶性轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子βⅡ型受體/γ－干擾素重組融合蛋白。應(yīng)用基因技術(shù)構(gòu)建sTGFβRII/hIFN－γ融合基因的PCDNA3.1(+)真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染dhfr－CHO細(xì)胞，獲得高效、穩(wěn)定表達(dá)sTGFβRII/hIFN－γ融合蛋白的dhfr－CHO細(xì)胞株。其制備方法包括構(gòu)建sTGFβRII/hIFN－γ的PCDNA3.1(+)真核表達(dá)載體；聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增IFN－γ；在哺乳動(dòng)物dhfr缺陷型CHO細(xì)胞株DG44表達(dá)sTGFβRII/hIFN－γ融合蛋白；鑒定sTGFβRII/hIFN－γ融合蛋白的表達(dá)，以及純化。綜合sTGFβRII和IFN－γ在抗肝纖維化中潛在的協(xié)同作用及融合表達(dá)相對(duì)單獨(dú)細(xì)胞因子對(duì)活性的增強(qiáng)作用，該重組融合蛋白可應(yīng)用于制備抗肝纖維化藥物。
文檔編號(hào)A61K38/16GK101016548SQ20071006698
公開(kāi)日2007年8月15日 申請(qǐng)日期2007年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月30日
發(fā)明者張立煌, 姚航平 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)