專利名稱：C1抑制劑在預防缺血-再灌注損傷中的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及C1抑制劑在預防、降低和治療缺血-再灌注損傷中的治療
和預防性應用，特別在由于中風的結(jié)果而發(fā)生的腦缺血-再灌注損傷中的應 用。
背景技術(shù)：
缺血-再灌注損傷是一種熟知的發(fā)生中的(occuring)病理狀況。其可 以是預見的病理狀況或者無法預見的病理狀況。中風是一種最常見的無法 預見的缺血-再灌注損傷。中風是工業(yè)化國家中導致死亡的第三大因素，導 致長期傷殘。中風是一種典型的心血管疾病，影響通向腦部或者腦內(nèi)的動 脈。當這種動脈被血栓阻塞或者破裂時發(fā)生中風，導致由所述阻塞的動脈 供養(yǎng)的腦組織缺血。對腦的直接損害是由于血流中斷所致，主要是由于喪 失維持組織存活的氧化作用，如果不能逆轉(zhuǎn)而最后導致梗塞形成所致。然 而，如果所述損害是可逆的(自然或經(jīng)治療而逆轉(zhuǎn))，則缺血組織的再灌注可 自相矛盾地導致進一步的間接損害。當存在長期缺血時，得自單獨缺氧的 "直接"損害是主要機制。對于較短時間的缺血，間接或再灌注介導的損 害令人感興趣地成為對于最終的結(jié)果更重要的因素。
據(jù)報道補體C1的抑制劑-Cl抑制劑(ClINH)在嚙齒動物的腦缺血-再灌 注模型中通過降低缺血-再灌注損傷而展示神經(jīng)保護作用(De Simoni et al, 2003， J Cereb Blood Flow Metab. 23: 232-9; Akita et al,, 2003， Neurosurgeiy 52: 395-400)。 CIINH對于腦缺血-再灌注損傷的神經(jīng)保護作用不需要CIq (De Simoni et al.， 2004， Am J Pathol. 164: 1857-63)。最近，Storini等(2005， NeurobiolDis. 19: 10-7)報道了 CIINH通過抑制炎癥和細胞從血管系統(tǒng)中募 集至缺血部位而對缺血-再灌注損傷發(fā)揮抗炎和抗凋亡作用。然而，給予
C1INH有療效的中風周時間窗較窄。因此，本發(fā)明的一個目的是提供具有 較寬給藥時間窗的C1INH。
發(fā)明描述
本發(fā)明基于令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，即在小鼠短暫局灶性腦缺血模型中，天 然存在的血漿衍生的Cl抑制劑(C1INH)在缺血之后給予時喪失其大部分降 低缺血-再灌注損傷的能力，而重組的C1INH制備物在缺血和/或再灌注至 少l小時后注射仍能發(fā)揮其神經(jīng)保護作用。令人驚奇地，當在缺血和/或再 灌注后18小時注射時，仍能達到神經(jīng)保護作用。天然存在的血漿衍生的 C1INH與重組C1INH制備物的差異是前者血漿半衰期為至少24小時并且 是完全唾液酸化的糖蛋白，后者具有降低的血漿半衰期并且具有與血漿產(chǎn) 物不同的糖基化。
天然存在的血漿衍生的C1INH與重組C1INH制備物之間的已知差異 是糖基化的程度和類型。重組的糖蛋白含有大量不同的N-聚糖，包括寡甘 露糖型、雜合型和復合型結(jié)構(gòu)，而血漿衍生的C1INH的N-聚糖主要由完全 唾液酸化的復合型結(jié)構(gòu)組成。由于糖基化的不同，因此血漿衍生的糖蛋白 的血漿半衰期為至少24小時，而重組C1INH具有降低的血漿半衰期。
因此，本發(fā)明的一方面涉及預防、降低或治療至少一種缺血和再灌注 損傷的方法，其中Cl抑制劑在缺血和/或在再灌注之后被給予。所述方法 優(yōu)選包括給予有效量的血漿半衰期比血楽衍生的C1INH的半衰期短的 C1INH的步驟?；蛘?，所述方法優(yōu)選包括給予有效量的具有與血漿衍生的 C1INH不同的糖基化的C1INH的步驟。這種方法涉及Cl抑制劑在預防、
降低和/或治療任何類型的缺血-再灌注損傷中的治療和/或預防性應用。
Cl抑制劑，也稱作Cl酯酶抑制劑，在本文是指補體Cl的抑制劑。 C1INH屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族，是補體系統(tǒng)的Cir和CIs的唯一 抑制劑，且是接觸系統(tǒng)的因子XIIa和激肽釋放酶的主要抑制劑。另外， C1INH還抑制凝血和纖溶系統(tǒng)的其它絲氨酸蛋白酶，如因子XI、組織血纖 維蛋白溶酶原激活物和纖溶酶(Schapira et al. 1985， Complement 2: 111;
Davis， 1988, Ann. Rev. Immunol. 6: 595)。人CIINH是由500個氨基酸組成 的蛋白質(zhì)，包括一個22個氨基酸組成的信號序列(Carter et al. 1988， Euro. J. Biochem. 173; 163)。血漿CIINH是分子量為大約76 kDa及大量糖基化的 糖蛋白，其分子量中接近26。/。由碳水化合物組成(Perkins et al.， 1990， J. Mol. Biol. 214 , 751)。用于本發(fā)明方法中的CIINH優(yōu)選是具有與SEQ ID NO:l 所示成熟人CIINH的氨基酸序列具有至少65、 67、 68、 69、 70、 75、 80、 85、 90、 95、 98或99%相同性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
對于本發(fā)明而言，兩個氨基酸序列之間的相同性程度是指兩個序列之 間相同的氨基酸的百分比。首先，使用如Altschul，etal., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)所述Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)算法檢索同 源多肽序列。進行BLAST分析的軟件可公開得自美國國家生物技術(shù)信息中 'l>(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)0 BLAST算法參數(shù)W、 B和E決定了序列 排列對比的靈敏性和速度。BLAST程序使用默認參數(shù)字長(W)-3， BLOSUM62評分矩陣(scoring matrix)(見Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA89: 10915 (1989))序列對比(B)=50，期望值(E)-IO， M=5， N=-4。接著，使用ClUSTALW排列對比算法(Higgins D. et al (1994). Nucleic Acids Res. 22:4673-4680)，利用如下參數(shù)確定同源序列的相同性程度(如上 述)缺口大小5，缺口開放(Gap open) : 11，缺口延伸(Gap extension): 1，錯配:-15，字大小3。
CIINH優(yōu)選具有可例如由Drouet et al. (1988， Clin Chim Acta. 174:121-30)所述測定的CIINH活性。更優(yōu)選地，CIINH是人CIINH (hCHNH)，意味著所述CIINH具有在人體內(nèi)天然存在的氨基酸序列(例如 SEQ ID NO:l或CAA30314所示)，但是不意味著所述CIINH是在例如人 血漿中產(chǎn)生或得自人血漿。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明方法中使用的CIINH優(yōu)選具有比血漿 衍生的CIINH的血漿半衰期短的血漿半衰期，更優(yōu)選本發(fā)明的CIINH血 漿半衰期低于得自人血漿的CIINH的血漿半衰期。"降低的血漿半衰期" 是指本發(fā)明CIINH的循環(huán)半衰期相對于血漿衍生的CIINH的循環(huán)半衰期 的負向變化。在本文中，血漿衍生的C1INH是指天然存在的C1INH，其典 型得自血漿且可以從血漿中純化，但是未經(jīng)化學或酶修飾。
血漿半衰期是通過在給予C1INH之后不同時間點取血樣，并確定每個 樣品中C1INH的濃度而測量。血清濃度與時間的相關(guān)性也可以用于計算血 漿半衰期。本發(fā)明C1INH的血漿半衰期比血漿衍生的C1INH的循環(huán)半衰 期優(yōu)選降低至少2倍、3倍、4倍、6倍，更優(yōu)選降低至少大約8倍，最優(yōu) 選降低至少大約10倍。換句話說，本發(fā)明C1INH的血漿半衰期優(yōu)選低于 血漿衍生的C1INH(即其天然存在的對應物)的血漿半衰期的60、 50、 40、 30、 25、 20、 15、 12.5或10%。
例如，本發(fā)明的實施例中應用的C1INH(得自轉(zhuǎn)基因兔的乳汁)的血漿 半衰期在人體內(nèi)為大約3小時，比血漿衍生的C1INH在人體內(nèi)的平均血漿 半衰期低大約4-8倍。應理解的是本發(fā)明C1INH比血漿衍生的C1INH的血 漿半衰期降低的測定優(yōu)選在相似條件(如果不是相同條件)下進行，即優(yōu)選 在相應的劑量、樣品、相同的生物體(可以是實驗室動物如小鼠或人對象) 及相同數(shù)量的測試對象的條件下進行。另外，可以通過標準統(tǒng)計學分析方 法對比這兩種C1INH制備物的平均血漿半衰期。
可以通過任何常規(guī)方法制備具有更短半衰期的C1INH，無論是天然發(fā) 生還是重組產(chǎn)生的C1INH。例如可以在重組宿主細胞或生物體中體內(nèi)制備， 獲得具有修飾的碳水化合物結(jié)構(gòu)的C1INH(與血漿衍生的C1INH相比)，或 者天然存在的C1INH的碳水化合物結(jié)構(gòu)可以在體外經(jīng)化學或酶修飾。優(yōu)選 地，與血漿衍生的C1INH相比本發(fā)明的C1INH通過如下方式進行修飾:(從 糖蛋白的天然存在的變體或重組表達的變體中)除去碳水化合物成分，優(yōu)選 從N-連接的碳水化合物鏈中除去唾液酸和/或半乳糖，和/或除去碳水化合 物鏈從而暴露甘露糖、半乳糖、N-乙酰葡糖胺和/或巖藻糖殘基。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明方法中應用的C1INH優(yōu)選具有與血漿 衍生的C1INH不同的糖基化。對本發(fā)明C1INH的碳水化合物結(jié)構(gòu)進行的 修飾包括導致低糖基化、過糖基化至無唾液酸(asialio)形式C1INH的修飾， 或者導致不同糖基化模式的任何其它修飾。
體外低糖基化可以是缺失C1INH的碳水化合物成分或者全部碳水化合 物鏈的結(jié)果。修飾可包括對N-或O-連接的碳水化合物鏈或者僅一種類型的 鏈進行修飾?？砂▽λ墟溁蛘邇H一些鏈進行修飾。過糖基化可例如是 向C1INH分子中添加額外的碳水化合物成分或者完全的碳水化合物鏈的結(jié) 果。無唾液酸形式的C1INH或者末端唾液酸殘基水平降低形式的C1INH 可典型通過除去唾液酸基團而獲得。本領(lǐng)域熟知血液中糖蛋白的半衰期高 度依賴于其N-和O-連接的碳水化合物基團的成分和結(jié)構(gòu)。通常地，糖蛋白 的最大半衰期要求其N-和O-連接的碳水化合物基團具有末端唾液酸。如果 這個末端唾液酸不存在，則所述糖蛋白由于半乳糖殘基暴露而被迅速從血 液中清除。已經(jīng)充分確定糖蛋白的碳水化合物成分中末端半乳糖殘基的存 在導致肝臟中唾液酸糖蛋白受體對其的血槳清除率增強。因此，在優(yōu)選的 實施方案中，本發(fā)明方法中應用的C1INH優(yōu)選具有較血漿衍生的人C1抑 制劑降低水平的末端唾液酸殘基。唾液酸可以通過一些方式除去。例如， 可以通過化學或酶處理方法除去，例如通過用唾液酸酶處理而除去。適于 這個目的的唾液酸酶由Chou et al, (1996, J Biol Chem. 271.(32): 19219-24; and 1994， J Biol Chem. 269(29): 18821-6)描述，可例如得自V-labs， Inc. (Covington, Louisiana, USA)。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明方法中 應用的C1INH優(yōu)選具有暴露的甘露糖、N-乙酰葡糖胺磷酸甘露糖、半乳糖 和/或N-乙酰半乳糖胺殘基。暴露的糖殘基通常是位于聚糖分支上的末端糖 殘基或者至少是可易于與對所述殘基具有親和性的成分相互作用的糖殘基 (如碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域)。具有暴露的半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、N-乙 酰葡糖胺、甘露糖、巖藻糖或磷酸甘露糖殘基的C1INH可例如通過用如下 一或多種酶進行酶處理而獲得(3-D-N-乙酰己糖胺酶、內(nèi)-P-D-半乳糖苷酶 和/或oc-D-N-乙酰氨基半乳糖苷酶(也可得自例如V-labs， Inc., Covington, Louisiana, USA)。
對C1INH的碳水化合物鏈的體內(nèi)修飾可以通過使用重組生產(chǎn)系統(tǒng)進 行?？梢允褂迷思毎驼婧思毎囵B(yǎng)物，如酵母細胞、真菌細胞、昆蟲 細胞和哺乳動物細胞。例如，COS細胞和CHO細胞是合適的哺乳動物生
產(chǎn)系統(tǒng)。盡管哺乳動物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)有能力產(chǎn)生具有唾液酸化的碳水化合 物基團的糖蛋白，但是通常難以實現(xiàn)理想的天然或完全的糖基化，因此重 組產(chǎn)生的糖蛋白通常具有與其天然對應物不同的糖基化模式。通常這種不
同的糖基化模式是不完全的(與天然對應物相比)，具有暴露的半乳糖、N-乙酰葡糖胺和/或甘露糖殘基。另外，在真核微生物如酵母或真菌中產(chǎn)生 C1INH將獲得具有暴露的甘露糖殘基的C1INH。
具有修飾的碳水化合物結(jié)構(gòu)的C1INH也可以在轉(zhuǎn)基因動物中制備，優(yōu) 選在非人動物中制備，如在轉(zhuǎn)基因兔、牛、小鼠、大鼠、山羊和綿羊中。 優(yōu)選這種糖蛋白在這些非人轉(zhuǎn)基因動物的乳腺中表達，由此所述糖蛋白可 以得自所述動物的乳汁。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知這將依賴于產(chǎn)生的特異性糖 蛋白及產(chǎn)生的量、最適用于生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因動物。特別優(yōu)選用于本發(fā)明的 C1INH是得自轉(zhuǎn)基因?；蛘咄胊agomo^p/z。)目動物的乳汁的C1INH，所 述兔目動物優(yōu)選Ie; onWfle科，更優(yōu)選是O^ycto/agw屬，最優(yōu)選是 Oycto/agws c訓'cm/ws禾中o
與其天然的血槳衍生的對應物相比，對C1INH蛋白的碳水化合物鏈的 結(jié)構(gòu)進行的不同類型的修飾可得自重組生產(chǎn)系統(tǒng)，例如可以同時或連續(xù)地 單獨或者組合導入不同的糖基化、低糖基化或過糖基化， 一些修飾可以導 入所述分子的一部分中，另一些修飾可以導入所述分子的另一部分中。有 助于所述蛋白質(zhì)的治療功效的優(yōu)選的修飾組合包括本發(fā)明C1INH上的表達 的半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡糖胺、甘露糖、巖藻糖和/或磷酸甘 露糖殘基。本發(fā)明的C1INH可以例如具有寡甘露糖型聚糖或者高甘露糖型 聚糖。優(yōu)選C1INH上的聚糖的至少大約5、 10、 15、 20、 40或60%的末端 殘基選自半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡糖胺、甘露糖、巖藻糖和磷 酸甘露糖殘基。例如，用于本發(fā)明中的優(yōu)選C1INH含有比其天然對應物少 大約2、 4、 5、 6-倍的唾液酸，和/或其至少大約5、 10、 15、 20、 40或60% 的N連接的聚糖是中性的，攜帶具有平伏的3-和4-OH基團的末端己糖， 如甘露糖和N-乙酰葡糖胺。相反，血漿衍生的C1INH無寡甘露糖型糖基化。 用于本發(fā)明中的優(yōu)選C1INH例如是在兔乳腺中產(chǎn)生的重組人C1INH，其比 天然對應物缺少5-6倍的唾液酸，其大約15。/。的N-連接的聚糖是中性的， 攜帶末端甘露糖殘基。
在一個優(yōu)選的實施方案中，用于本發(fā)明中的C1INH的不同糖基化導致 對甘露糖結(jié)合蛋白具有比其血漿衍生的對應物更高的親和性。甘露糖結(jié)合 蛋白(MBP)也被稱作甘露聚糖結(jié)合蛋白、甘露糖-結(jié)合凝集素(MBL)、甘露 聚糖-結(jié)合凝集素，或者殺菌Ra-反應因子。MBP是屬于一種可溶的C^+依 賴性(C型)凝集素家族的膠原凝集素。MBP通過(與補體激活的經(jīng)典途徑和 旁路途徑不同的)凝集素途徑作為補體激活物。補體系統(tǒng)是先天免疫防御的 重要成分，由如下三個途徑激活經(jīng)典途徑、旁路途徑和最近揭示的凝集 素或甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)途徑。
當催化結(jié)構(gòu)域Clr和Cls通過識別蛋白Clq結(jié)合免疫復合物時，經(jīng)典 途徑開始激活(見

圖11)。
旁路途徑以抗體非依賴性方式低速持續(xù)進行(turningover),攻擊未針 對補體而被特異性保護的顆粒。
凝集素或MBL途徑基于MBL與各種病原體或其它細胞結(jié)構(gòu)上存在的 碳水化合物結(jié)構(gòu)的結(jié)合而起始或激活。兩種絲氨酸蛋白酶-甘露聚糖結(jié)合凝 集素相關(guān)的絲氨酸蛋白酶(MASP)-I和-2 (見圖ll)與MBL相關(guān)，顯示出與 絲氨酸蛋白酶Cls和Clr的顯著相似性。所述復合物基于與甘露聚糖的結(jié) 合而具有C4和C3激活能力。所述復合物含有由二硫鍵連接的兩種絲氨酸 蛋白酶MASP-I和MASP-2。在這種形式中，MASP能裂解C4和C3，導 致其失活。與其血漿衍生的對應物相比本發(fā)明的C1INH對于人MBP優(yōu)選
具有更高的親和性。
MBP識別具有平伏的3-和4-OH基團的暴露的己糖，如甘露糖和N-乙酰葡糖胺和/或N-乙酰-己糖胺。因此本發(fā)明優(yōu)選的C1INH具有這種末端 己糖。本發(fā)明C1INH比其沒有暴露的甘露糖和N-乙酰葡糖胺殘基的天然血 漿衍生的對應物對于MBP、優(yōu)選人MBP的更高親和性使得可以更有效地 耙向、結(jié)合和/或抑制MBP。人MBP在本文是指由Kawasakietal. (1983， J. Biochem 94:937-47)鑒定的蛋白質(zhì)，具有Taylor et al. (1989， Biochem. J. 262
(3), 763-771; NCBI登記號CAA34079)所述的氨基酸序列。與寡糖復合的 大鼠MBP的結(jié)構(gòu)由Weisetal. (1992，Nature. 360:127-34)描述。關(guān)于人MBP 的進一步描述見例如US 6,846,649及其中引用的參考文獻所述。
所有這些途徑(經(jīng)典途徑、旁路途徑和凝集素或MBL途徑)均產(chǎn)生至關(guān) 重要的酶活性，最后導致膜攻擊復合物(MAC或C5b-C9)的裝配(見圖11)。 在生理學條件下，補體系統(tǒng)的激活由可溶的和膜結(jié)合的調(diào)節(jié)蛋白的協(xié)同作 用而有效控制。這些蛋白質(zhì)之一是Cl抑制劑(C1INH)，這是結(jié)合Cls和Clr 的一種絲氨酸蛋白酶抑制劑，是目前唯一已知的經(jīng)典途徑的生理學抑制劑。 另外，C1INH通過結(jié)合并抑制MASP-1和MASP-2而失活MBL-介導的補 體活化。
不同補體途徑的激活優(yōu)選在人血清中通過Wielisa試劑盒(產(chǎn)品no. COMPL300,Wieslab，Sweeden)測量。這是一種可商購的酶免疫測定，利用 C5b-C9的沉積作為常規(guī)讀數(shù)(common read-out)而特異性檢測三種補體途 徑的每一途徑。簡而言之，將微滴定條的孔用三種補體途徑的每一途徑的 特異性激活物包被。人血清在含有特異性封閉劑的稀釋劑中稀釋，以保證 僅激活各自的途徑。進一步加入濃度在0-75}imol范圍內(nèi)的本發(fā)明的C1INH 或其血漿衍生的對應物，在室溫保溫30分鐘，加入所述孔中。在隨后所述 稀釋的人血清在所述孔中于37-C保溫60分鐘期間，補體通過特異性包被而 被激活。然后洗滌所述孔，形成的C5b- C9用特異性堿性磷酸酶標記的抗 C5b-C9抗體檢測。在進一步洗滌后，通過與堿性磷酸酶底物溶液保溫對特 異性抗體進行檢測。使補體激活量與色強度相關(guān)，并作為吸光度測量(光密 度OD)。使用這種試劑盒，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的重組人C1INH (rhCHNH)及血漿 衍生的C1INH (pdCHNH)對于經(jīng)典途徑具有相似的抑制能力。然而，發(fā)現(xiàn) 本發(fā)明的CIINH比血漿衍生的C1INH對于MBL途徑的抑制能力高大約 20% (見實施例3)。
因此，在這個優(yōu)選的實施方案中，用于本發(fā)明中C1INH的不同糖基化 導致對于MBP具有比其血漿衍生的對應物更高的親和性，這導致對MBP 更有效的抑制，使得可以更有效抑制凝集素途徑。對凝集素途徑的更有效
抑制優(yōu)選是指至少高5%的抑制、還更優(yōu)選至少高10%的抑制、還更優(yōu)選至 少高15%的抑制、還更優(yōu)選至少高20%的抑制、還更優(yōu)選至少高25°/。的抑 制、還更優(yōu)選至少高30%的抑制、還更優(yōu)選至少高35%的抑制、還更優(yōu)選 至少高40%的抑制、還更優(yōu)選至少高45%的抑制、還更優(yōu)選至少高50%的 抑制、還更優(yōu)選至少高55%的抑制、還更優(yōu)選至少高60%的抑制、還更優(yōu) 選至少高65%的抑制、還更優(yōu)選至少高70%的抑制、還更優(yōu)選至少高75% 的抑制、還更優(yōu)選至少高80%的抑制、還更優(yōu)選至少高85%的抑制、還更 優(yōu)選至少高90%的抑制、還更優(yōu)選至少高95%的抑制及最優(yōu)選至少高98% 的抑制。凝集素途徑的活化優(yōu)選通過上述Widisa試劑盒測量。
本發(fā)明的方法可用于預防、降低或治療任何類型的缺血和再灌注損傷。 優(yōu)選地，本發(fā)明的方法應用于其中缺血和再灌注損傷已知至少部分通過、 更優(yōu)選主要通過凝集素途徑而產(chǎn)生的情況中。對于心肌缺血和再灌注損傷 (JImmunology 2005, 175:541-546)、腎缺血-再灌注損傷(Am J Pathol. 2004 165(5): 1677-88)、 胃腸道缺血-再灌注損傷(J Immunol. 2005 15:174(10):6373-80)及中風(deShnoni et al, 2004 Am J. Pathol. 164:1857-63)， 已經(jīng)示出再灌注損傷主要是通過凝集素途徑產(chǎn)生，很少通過經(jīng)典途徑產(chǎn)生。 因此，本發(fā)明的C1INH優(yōu)選是比其天然血漿衍生的對應物更強的凝集素途 徑抑制劑。優(yōu)選本發(fā)明的C1INH在人體內(nèi)是比其天然血漿衍生的對應物更 強的凝集素途徑的抑制劑。
與本發(fā)明實施例中使用的實驗模型不同，現(xiàn)實生活中缺血的發(fā)生通常 是無法預見的事件。因此在缺血和/或隨后的再灌注發(fā)生之前給予ClINH通 常是不現(xiàn)實的，在現(xiàn)實中ClINH將不得不在缺血和/或隨后的再灌注之后幾 個小時給予。然而，這嚴重限制了常規(guī)血漿衍生的C1INH的治療功效，因 為當在缺血-再灌注之后給予時其大部分失效，并且僅具有極小的治療功效 時間窗(見圖2及deSimoni et al, 2004 Am J. Pathol. 164:1857-63所述)。相反， 當也在缺血或者在缺血發(fā)作之后至少1小時和/或在開始再灌注之后30分 鐘注射本發(fā)明的C1INH，其仍能發(fā)揮其神經(jīng)保護作用。因此，在本發(fā)明的 用于預防、降低或治療至少一種無法預見的或預見的缺血和再灌注損傷發(fā)
生的方法的一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的C1INH至少在缺血結(jié)束或之后 (即當缺血的組織被再灌注時)給予。更優(yōu)選地，本發(fā)明的C1INH在缺血之 后或者在開始再灌注之后至少10、 15、 20、 30、 45、 60、 90或120分鐘給 予。優(yōu)選地，本發(fā)明ClINH在缺血之后或者在缺血和/或再灌注發(fā)生之后不 超過24、 12、 6、 4或3小時時間內(nèi)給予。在另一個優(yōu)選的實施方案中，Cl 抑制劑在缺血之后或者在缺血和/或再灌注發(fā)生之后至少3小時、優(yōu)選至少 6小時、更優(yōu)選至少9小時、更優(yōu)選至少18小時給予。
在一個優(yōu)選的實施方案中，所述方法用于預防、降低或治療無法預見 的、突然的或者急性發(fā)生的缺血-再灌注。與無法預見的、突然的或者急性 發(fā)生的缺血-再灌注損傷相關(guān)的病變或疾病包括但非限于在急性心肌梗塞 (AMI)、中風包括圍產(chǎn)期中風、失血性休克、腸缺血、經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)成 形術(shù)(PCTA)失敗后的急診冠狀動脈手術(shù)、具有血管夾緊(blood vessel cross clamping)的任何血管手術(shù)(例如大動脈夾緊，引起骨骼肌缺血)或者在處理胰 管或膽管之后的胰腺炎處理(ERCP)之后的缺血-再灌注損傷。在這種情況 中，本發(fā)明的C1INH優(yōu)選在急性心肌梗塞(AMI)、中風包括圍產(chǎn)期中風、 失血性休克、腸缺血、經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)成形術(shù)(PCTA)失敗后的急診冠狀 動脈手術(shù)、具有血管夾緊的任何血管手術(shù)(例如大動脈夾緊，引起骨骼肌缺 血)或者在處理胰管或膽管之后的胰腺炎處理(ERCP)之后至少1、5、 10、 15、 20、 30、 45、 60、卯或120分鐘給予。或者，給予本發(fā)明C1INH的時間優(yōu) 選在開始再灌注后至少l、 5、 10、 15、 20、 30、 45、 60、 90或120分鐘。
另外，無法預見的缺血-再灌注損傷優(yōu)選是指其中是治療或手術(shù)誘導再
灌注而不是缺血的情況。這種治療或手術(shù)包括但非限于
-藥物溶栓，包括對中風、急性冠狀動脈綜合癥、外周動脈閉塞、肺
栓塞、腎動脈閉塞進行的靜脈內(nèi)和血管內(nèi)治療方法；
-機械溶栓，例如經(jīng)皮冠狀動脈介入治療、外周動脈血管成形術(shù)、內(nèi) 臟動脈血管成形術(shù)；
-冠狀動脈搭橋術(shù)；
-頸動脈內(nèi)膜剝除術(shù)；
-腸系膜缺血；
休克，包括失血性休克、心源性休克、神經(jīng)性休克、過敏性休克；
-皮瓣壞死(flap-failure)，例如整形手術(shù)； -手指或足趾及肢體的再植； -絞窄性腸梗阻。
或者，在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述方法用于預防、降低或治療 預見的缺血-再灌注發(fā)生。預見的缺血-再灌注的發(fā)生優(yōu)選包括其中治療或手 術(shù)誘導缺血及隨后的再灌注的情況。下文列出了其中治療或手術(shù)誘導暫時 無血流或血流減少，即缺血或缺氧，然后出現(xiàn)再灌注的情況
-心肺轉(zhuǎn)流術(shù)；
-動脈瘤修復，包括大動脈瘤、腦動脈瘤的修復； -頸動脈內(nèi)膜剝除術(shù)，其中在手術(shù)期間使用夾子； -深低溫停循環(huán)術(shù)；
-止血帶的應用，即在外傷處置中使用止血帶
-實體器官移植；
-任何其它醫(yī)源性血流中斷。
另外，與預見的缺血-再灌注損傷的發(fā)生相關(guān)的病變或疾病包括但非限 于在器官移植(肺、肝、腎、心臟)之后、具有血管夾緊的任何血管手術(shù)(例 如大動脈夾緊，引起骨骼肌缺血)之后、或者在對胰管或膽管進行處理(ERCP)
之后的胰腺炎之后、體外循環(huán)(ECC)期間或之后發(fā)生的缺血-再灌注損傷。
在預防、降低或治療至少一種預見的缺血和再灌注損傷發(fā)生的方法的 —個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的C1INH至少在缺血期末或之后給予，即當 缺血組織再灌注時給予。更優(yōu)選地，本發(fā)明的C1INH在缺血期之后或者在 開始再灌注之后至少IO、 15、 20、 30、 45、 60、 90或120分鐘給予。優(yōu)選 地，本發(fā)明的C1INH在缺血之后或者在缺血和/或再灌注發(fā)生之后不超過 24、 12、 6、 4或3小時給予。在另一個優(yōu)選的實施方案中，Cl抑制劑在 缺血之后或者在缺血和/或再灌注發(fā)生之后至少1小時、3小時、優(yōu)選至少 6小時、9小時、更優(yōu)選至少18小時給予?；蛘?，本發(fā)明另一方面提供了一種預防、降低或治療至少一種預見的
缺血和再灌注損傷發(fā)生的方法，其中本發(fā)明的C1INH在缺血和再灌注之前 或在此期間給予。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知根據(jù)本發(fā)明C1INH的血漿半衰期， 可以調(diào)整給予本發(fā)明C1INH的最早的可能時間點以獲得最佳結(jié)果。
根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明的C1INH持續(xù)給予需要其的對象和 /或在器官移植情況中持續(xù)給予待移植的器官。待移植的器官優(yōu)選在具有合 適培養(yǎng)基及適量C1INH的組合物中保存。
或者，或與前述優(yōu)選的實施方案組合，在預見的缺血和再灌注損傷發(fā) 生之前優(yōu)選是指在至少一種預見的缺血和再灌注損傷發(fā)生之前至多3小時、 優(yōu)選2小時、l小時、更優(yōu)選至多30分鐘給予本發(fā)明C1INH。
需要本發(fā)明C1INH的對象是指可發(fā)生預見的缺血和再灌注損傷的對 象。預見的缺血和再灌注損傷的發(fā)生已經(jīng)在本文描述。
優(yōu)選在預見的缺血和再灌注損傷發(fā)生之前給予C1INH，因為其可與在 缺血和再灌注損傷發(fā)生之后給予C1INH相同或更好的方式預防與缺血和再 灌注損傷相關(guān)的大多數(shù)(如果不是全部)損害的發(fā)生。
在一個更優(yōu)選的實施方案中，所述方法用于無法預見的缺血-再灌注的 發(fā)生。更優(yōu)選地，缺血-再灌注損傷發(fā)生在中風或圍產(chǎn)期中風之后。在這些 類型的無法預見的缺血-再灌注發(fā)生中，我們證實了本發(fā)明的C1抑制劑在 缺血半影區(qū)(pneumbra)中的神經(jīng)保護作用。缺血半影區(qū)優(yōu)選是指海馬和/或 皮質(zhì)。神經(jīng)保護作用優(yōu)選是指在海馬中發(fā)生缺血之后至多3小時及在皮質(zhì) 中發(fā)生缺血之后至多9小時用本發(fā)明的Cl抑制劑處理后減少海馬和/或皮 質(zhì)中的神經(jīng)變性。更優(yōu)選地，在海馬缺血至多4、 5、 6或更多小時及在皮 質(zhì)缺血至多IO、 11、 12或更多小時減少神經(jīng)變性。神經(jīng)變性優(yōu)選如實施例 2所述評價將腦組織切片用特異于神經(jīng)元變性的標記物優(yōu)選Jade (SchnmedLC等，參考文獻4)染色，通過熒光顯微鏡分析。使用這種方法， 減少神經(jīng)變性是指在處理的樣品中較未處理的樣品中觀測到染色的細胞減 少至少2%。優(yōu)選地，神經(jīng)變性的減少是指染色的細胞減少至少5%、 7%、 10%、 15%、 20%、 25%、 30%、 35%、 40%或更多。
或者，或與前述實施方案組合，應用Cl抑制劑可降低缺血和域再灌
注導致的損傷。更優(yōu)選地，當缺血-再灌注損傷在中風或圍產(chǎn)期中風之后發(fā)
生時，應用本發(fā)明的C1抑制劑可減小梗塞面積。更優(yōu)選地，梗塞面積如實 施例2所述量化。更優(yōu)選地，使用這種量化方法，在缺血發(fā)生至少3小時 后，梗塞面積減小至少10%、優(yōu)選至少20%、 40%、 60%、 70%、 80%，及 最優(yōu)選梗塞面積減少90%。
用于本發(fā)明方法中的C1INH可以作為本領(lǐng)域藥物組合物的一部分或者 與本領(lǐng)域藥物組合組合應用。這些藥物組合物典型包含所述C1INH及藥物 學可接受的載體或賦形劑。根據(jù)希望的局部或系統(tǒng)治療方案、治療區(qū)域及 活性化合物的穩(wěn)定性，可以通過多種方式給予這些藥物學組合物。根據(jù)給 予方法確定合適的配方。所述藥物組合物優(yōu)選通過腸道外方法給予，例如 通過靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或肌內(nèi)注射或輸注方式給予；或者通 過鞘內(nèi)注射或顱內(nèi)給予方法給予。在一個優(yōu)選的實施方案中，通過靜脈內(nèi) 輸注方法給予。通過腸道外給予的合適配方為本領(lǐng)域所已知，典型是液體 配方。腸道外給予的C1INH制備物必須是無菌的。滅菌可在凍干和重建之 前或之后通過無菌過濾膜過濾而易于實現(xiàn)。C1INH制備物可通過輸注或推 注方法持續(xù)給予。液體C1INH配方可例如通過輸液泵給予。典型的靜脈內(nèi) 輸注的組合物可以含有100-500 ml無菌的0.9% NaCl或5%葡萄糖溶液， 任選補加20%白蛋白溶液及100-500 mg的C1INH。用于靜脈內(nèi)注射的藥物 組合物含有例如1 - 10 ml無菌緩沖的水和1-250 mg本發(fā)明的ClINH。制備 可經(jīng)腸道外給予的組合物的方法為本領(lǐng)域所熟知，在多個資料中詳細描述， 例如在以其全部內(nèi)容并入作參考的Remington's Pharmaceutical Science (15th ed.， Mack Publishing, Easton, PA, 1980)中描述。
本發(fā)明方法中使用的CIINH的有效劑量即有效濃度和頻率依賴于使用 的特定藥物組合物、病變的嚴重性及患者的一般狀況。通常地，可以通過 常規(guī)優(yōu)選法確定基于本發(fā)明方法中使用的CIINH的藥物組合物的有效劑 量。合適的起始點是基于血漿衍生的CIINH的等價藥物組合物的使用劑量。 本發(fā)明的藥物組合物的優(yōu)勢是在治療時可以應用高初始劑量，提高成功治
療的可能性。這個高初始劑量是可能的，因為本發(fā)明藥物組合物中的C1INH 較其天然對應物示出較快的清除率。特別是對于急性病例的治療，本發(fā)明 的高初始劑量的C1INH可以是有利的。這個高初始劑量可以是天然存在的 對應物劑量的至少1.5、 2、 3或4倍。
在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的C1INH經(jīng)靜脈內(nèi)給予，劑量為大 于50、 100、 200、 400、 600、 800或1000 U/kg個體體重，優(yōu)選為50-2000、 100 - 1000、 200 - 800、 400-700或500-700 U/kg個體體重。1單位(U)的 C1INH是在lml人血液中存在的C1INH的量。 一個這樣的單位相應于大約 275jig血漿衍生的ClINH。假定分子量為110,000道爾頓，人血漿中C1INH 的濃度為2.5|iimol/L(Nuijens et al. (1989), J. Clin. Invest. 84:443)。
在本發(fā)明方法的另一個優(yōu)選實施方案中，所述藥物組合物進一步含有 溶血栓藥或者與溶血栓藥組合應用或者在用這種溶血栓藥隨后治療之后使 用。本文所述溶血栓藥是指能溶解血凝塊(血栓)及重新開放動脈或靜脈的藥 劑(藥物)。溶血栓藥通常是絲氨酸蛋白酶，將血纖維蛋白溶酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w溶 酶，使得纖維蛋白原和纖維蛋白分解及血栓溶解。優(yōu)選的溶血栓藥包括 reteplase (r-PA或Retavase)、alteplase (t-PA或Activase)、尿》敫酶(Abbokinase)、 尿激酶原、茴香?；募兓逆溂っ讣せ钗飶秃衔?APSAC)，及鏈激酶。
另一方面，特別是除了美國之外的權(quán)限，本發(fā)明涉及本發(fā)明的C1INH 根據(jù)上述任何方法在生產(chǎn)預防、降低或治療再灌注損傷的藥物中的應用。
在本文及其權(quán)利要求書中，動詞"包含"以其非限制性含義應用，是 指包括該單詞后面的項目，不排除未特別指出的項目。另外，文中"一個"、 "一種"等不排除存在一個以上的因素，除非文中需要其是一個且只有一 個因素。因此，"一個"通常是指"至少一個"。
附圖描述
圖h在缺血之前、之后及1小時后，用鹽水或每只小鼠15UrhClINH (重組人C1INH，見實施例1.2)處理后的小鼠在缺血后48小時梗塞面積的 評價。
在缺血之前、之后及l(fā)小時后，用鹽水或每只小鼠15U血漿衍 生的hClINH處理后的小鼠在缺血后24小時梗塞面積的評價.
從缺血開始后在不同時間點接受鹽水或每只小鼠15U兔 rhCl-INH的小鼠在缺血48小時后梗死灶體積評價。數(shù)據(jù)以平均值土 SEM 表示(每組6只小鼠)。*P<0.05， **P<0.01，相對于鹽水，單向ANOVA和 Dunnett作為post-hoc檢驗。
圖4: Fluoro-Jade染色的半定量評估。-=無陽性，+=低陽性，= 中等陽性，+++=高陽性。
圖5:在缺血發(fā)生后不同時間點接受鹽水或每只小鼠15U兔rhCl-INH 的缺血小鼠的紋狀體中通過Fluoro-Jade染色顯示的神經(jīng)變性代表性圖像。 條桿100pm。
圖6:在缺血發(fā)生后不同時間點接受鹽水或每只小鼠15U兔rhCl-INH 的缺血小鼠的海馬齒狀回中通過Fluoro-Jade染色示出的神經(jīng)變性代表性圖 像。條桿10(Him。
圖7:在缺血發(fā)生后不同時間點接受鹽水或每只小鼠15U兔rhCl-INH 的缺血小鼠的皮質(zhì)中通過Fluoro-Jade染色示出的神經(jīng)變性代表性圖像。條 桿lOO(im。
圖8:在缺血發(fā)生后3小時接受鹽水或每只小鼠5、 10、 15U兔rhCl-INH 的小鼠在缺血48小時后的梗死灶體積評價。數(shù)據(jù)以平均值士SEM表示(每 組6只小鼠)。**P<0.01 ，相對于鹽水，單向ANOVA和Dunnett作為 post-hoc檢驗。
1_2:在缺血發(fā)生后3小時接受鹽水或每只小鼠15UpdCl-INH或者牛 或兔rhCl-INH的小鼠在缺血48小時后的梗死灶體積評價。數(shù)據(jù)以平均值 士SEM表示(每組6只小鼠)。*PO.05, **P<0.01，相對于鹽水，單向 ANOVA禾口 Dunnett作為post-hoc檢驗。
圖10:在缺血發(fā)生后3小時接受鹽水或每只小鼠15UpdCl-INH或者 牛或兔rhCl-INH的小鼠在缺血48小時后評價的總體神經(jīng)功能缺損(上方 10a)和局灶性神經(jīng)功能缺損(下方10b)(每組6只小鼠)。**P<0.01，相對于
鹽水，單向ANOVA和Kruskal-Wallis作為post-hoc檢驗。
圖11:補體激活的不同途徑概述。
圖12、 13: rhClINH和pdClINH對經(jīng)典補體途徑激活的作用。向正常 人血清的兩個不同樣品(上方是樣品1，下方是樣品2)中加入增加劑量的 rhClINH或pdClINH(x-軸)。作為對照，利用其中溶解有與rhClINH同樣 稀釋的rhClINH的緩沖液(20 mM檸檬酸鹽，0.19 M蔗糖pH 6.8;經(jīng)0.22|im 濾膜過濾)。讀數(shù)為C5b-9的沉積，測定中正常血清對照規(guī)定為100。/。(y-軸)。 數(shù)據(jù)以平均值和SD表示(n = 3)。
圖14、 15: rhClINH和pdClINH對MBL補體途徑激活的作用。向正 常人血清的兩個不同樣品(上方是樣品1，下方是樣品2)中加入增加劑量的 rhClINH或pdClINH(x-軸)。作為對照，利用其中溶解有與rhClINH同樣 稀釋的rhClINH的緩沖液(20 mM檸檬酸鹽，0.19 M蔗糖pH 6.8;經(jīng)0.22|im 濾膜過濾)。讀數(shù)為C5b-9的沉積，該測定中正常血清對照規(guī)定為100%(y-軸)。數(shù)據(jù)以平均值和SD表示(n-3)。
圖16: rhClINH和pdClINH對經(jīng)典補體途徑和MBL補體途徑激活的 作用。向正常人血清的兩個不同樣品(上方是樣品1，下方是樣品2)中加入 增加劑量的rhClINH或pdClINH (x-軸)。作為對照，利用其中溶解有與 rhClINH同樣稀釋的rhClINH的緩沖液(20 mM檸檬酸鹽，0.19 M蔗糖pH 6.8;經(jīng)0.22pm濾膜過濾)，讀數(shù)為C5b-9的沉積，每次測定的補體激活百 分比以下式計算(樣品-NC)/(PC-NC)X100。 PC設(shè)為100%。結(jié)果以在每 個測試濃度的3個獨立vei'dunning的平均值SD表示。
實施例
實施例1
先前的實驗示出在腦局灶性缺血小鼠模型中在缺血后48小時評價發(fā) 現(xiàn)，在缺血開始時給予單劑量rhClINH (15U/小鼠)以與血漿衍生的C1INH 非常相似的方式顯著降低缺血體積。在這個實施例中，我們研究了 rhClINH 神經(jīng)保護活性對于缺血體積和功能缺損的功效時間窗。我們還通過評價神
經(jīng)變性和神經(jīng)膠質(zhì)應答研究了 rhCl腿對于七天結(jié)果(seven-days outcome) 的作用。
1.方法
1.1 一過性局灶腦缺血
如先前所述通過大腦中動脈栓塞(MCAO)實現(xiàn)缺血(De Simoni et al, 2003和2004，見上文)。通過在N20/02 (70/30%)混合物中的5°/。異氟醚誘導 麻醉，用在相同混合物中的1.5-2%異氟醚維持。為了證實每只動物中血管 閉塞的合適度，使用激光多普勒血流儀(Transonic BLF-21)利用位于腦表面 上并用印模材料固定在顱骨上的柔軟的0.5 mm光纖探頭(Transonic， Type M， 0.5 mm直徑)測量血流，坐標為AP--lmm， L=-3，5mm。簡而言之，暴露 右頸總動脈，通過在頸總動脈上做的切口將硅絲(7-0)導入頸內(nèi)動脈中并行 進至大腦前動脈，以阻斷其分支進入大腦前動脈和MCA。使所述硅絲行進 直至觀測到與缺血前基線相比血流減少>70%。在缺血30分鐘后，小心除 去所述尼龍絲恢復血流。
1.2藥物治療
在缺血后不同時間經(jīng)靜脈內(nèi)單次注射給予小鼠的15U/小鼠 rhClINH或者相同體積的鹽水
一在缺血期開始時(rhClINH-前)， —在缺血期結(jié)束時(rhClINH-后)， 一在缺血期開始后1小時(rhClINH lh-后)。
這項研究中使用的rhClINH是在乳腺中表達人ClINH的轉(zhuǎn)基因兔中產(chǎn) 生，并從得自這些動物的乳汁中純化，如WO01/57079所述。 1.3神經(jīng)功能缺損的評估
在缺血48小時后，由有經(jīng)驗的未知實驗條件的研究人員針對小鼠獨特 的兩項神經(jīng)功能評分而對每只小鼠進行評估。總體神經(jīng)功能缺損小鼠的如 下類別的每一項得分為0-28:毛發(fā)、耳、目艮、姿勢、自發(fā)活動、癲癇行為。 局灶性神經(jīng)功能缺損小鼠的如下類別的每一項得分為0-28:身體對稱性、 步態(tài)、攀爬、旋轉(zhuǎn)行為、前肢對稱性、強制性旋轉(zhuǎn)、感覺應答。數(shù)據(jù)以中
位值和第25至第75百分位值表示。 1.4梗塞面積的量化
在缺血48小時后，將小鼠用Equitensin(120W/小鼠，腹膜內(nèi)注射)深度 麻醉，經(jīng)心灌注30ml的PBS0.1mo1/1、 pH7.4，隨后灌注在PBS中的60ml 冰冷多聚甲醛(4n/。)。在從顱腔中小心取出腦之后，將其移至在PBS中的30% 蔗糖溶液中，在4'C低溫保護過夜。然后將腦沉浸在異戊烷中于-45。C速凍 3分鐘，之后密封于小瓶中，在-7(TC貯存直至使用。為了確定損傷面積， 以240|am間隔依次制作20|im腦冠狀切片，用中性紅(Neutral Red Gurr Certistain,BDH，England)染色。在每個切片上，梗塞面積經(jīng)盲式(blindly) 評價并通過組織學染色的相對蒼白度(relative paleness)而描繪。梗塞面積 通過從每個切片上的對側(cè)半球的面積中減去同側(cè)半球中的正常組織面積而 確定。通過使用計算機輔助圖像分析儀并通過圖像分析系統(tǒng)(Analytical Image System)計算進行量化，綜合每個腦組織切片上的梗塞面積而計算梗
死體積。
1.5曠場試驗(open field test)
在缺血7天之后，通過曠場試驗評估小鼠行為。這個試驗可用于檢測 長期缺血小鼠中的焦慮狀態(tài)和探究行為及活動。曠場由一個包括4個不同 物體的塑料箱組成(41 x41 x41cm)。曠場區(qū)域分成28 x28cm的中心帶及周 圍的邊緣帶。將小鼠單獨置于曠場的中心，由未知實驗條件的研究人員對 小鼠的行為觀測5分鐘。記錄inside crossings(主要與焦慮行為相關(guān))、outside crossings (主要與運動活性相關(guān))、后腿站立(rears)(主要與探究行為相關(guān)) 及與物體接觸(主要與感覺/運動活性相關(guān))的次數(shù)。
1.6神經(jīng)元計數(shù)
在缺血7天之后，如前所述對小鼠進行經(jīng)心灌注。為了確定神經(jīng)元計 數(shù)，以640pm間隔依次切割成20pm腦組織冠狀切片，用甲酚紫(Cresyl Violet acetate, Sigma, St. Louis, MO)染色。選擇同側(cè)和對側(cè)半球的三個20|im 切片進行神經(jīng)元計數(shù)測定。第一個切片是位于距離前囟+0.86的前后方向立 體定向坐標。神經(jīng)元數(shù)量的減少通過集合兩個半球的三個切片中的存活神
經(jīng)元數(shù)而計算，以占對側(cè)半球的百分比表示。使用連接有Soft Imaging System Colorview攝像機和AnalySIS軟件的Olympus BX61顯微鏡。由未 知處理情況的研究人員在40X放大率進行定量分析。
1.7對星形膠質(zhì)細朐和小膠質(zhì)細胞進行免疫組織化學分析 在缺血7天之后，制備厚度為20jam的經(jīng)心灌注的缺血小鼠腦組織的 冠狀截面切片，用于評價星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞免疫染色。 簡而言之，將切片在含0.4% Triton X-100的0.1 mol/L PBS溶液中漂洗30 分鐘，隨后在含0.1°/。 Triton X-100和3。/。正常山羊血清(NGS)的PBS溶液 中漂洗15分鐘。然后將切片與星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞的抗體(抗-GFAP 1:1500， Chemicon;抗-CDllb 1:250，由Dr. A. Doni， Mario Negri Institute惠 贈)保溫過夜。第二天，將切片在PBS中洗滌，與生物素?；亩贡豯 小時，洗滌并與抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶保溫。在與3'-3-二氨基 聯(lián)苯胺四鹽酸鹽反應之后，洗滌切片，干燥，通過梯度乙醇脫水，在二甲 苯中固定，用DPX封固劑封蓋，之后經(jīng)光學顯微鏡分析。 2.結(jié)果
2.1功效的時間窗
2丄1神經(jīng)功能缺損的評估
在缺血48小時后接受rhClINH或鹽水的缺血小鼠中評估神經(jīng)功能缺 損情況。觀測到與鹽水處理的缺血小鼠相比，經(jīng)rhCHNH-處理的每組小鼠 均有輕微(盡管不顯著)的降低(rhCl腿-前9和12; rhCl腿-后7和11; rhClINH lh-后9和13;鹽水10和12.5，分別為總體和局灶性功能缺損 的中位值)(數(shù)據(jù)未示出)。
2丄2梗死面積的評價
在缺血48小時后，與鹽水處理的小鼠(41.51士7.01mm"相比，劑量為 15U/小鼠-前、-后及l(fā)h-后的rhClINH-處理的小鼠示出缺血體積明顯降低(缺 血體積分別為13.67 + 2.59mm3、 9.06 + 0.77mm3和8.24 + 1.00 mm3)(圖1 ， 數(shù)據(jù)以平均值土SEM表示)。
2.2七天結(jié)果
2.2.1曠場實驗
缺血誘導抬頭次數(shù)較未試驗過的動物顯著減少，在rhClINH-處理組中 這個參數(shù)與未缺血的小鼠無差異。評估的其它參數(shù)在這三組中未示出任何 差異。
2.2.2神經(jīng)元計數(shù)
為了評估rhClINH的保護作用是否長期存在，我們評價了在誘導缺血 和用藥物治療之后7天神經(jīng)元的喪失情況。結(jié)果示出rhClINH保護作用在 此時仍然存在神經(jīng)元喪失14%±2.18%均值(鹽水處理的小鼠)相對于4% ± 1.24%均值(rhC 1INH處理的小鼠)(數(shù)據(jù)未示出)。
2.2.3對小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞和星形膠質(zhì)細胞進行免疫組織化學分析
在缺血7天之后，在接受鹽水的缺血小鼠的損傷的海馬和紋狀體中觀 測到大量激活的小膠質(zhì)細胞和浸潤的巨噬細胞(數(shù)據(jù)未示出)。15單位的 rhClINH-pre在這兩個區(qū)域中均能削弱這種激活和浸潤作用(數(shù)據(jù)未示出)。 經(jīng)鹽水處理的缺血小鼠的同側(cè)海馬示出輕微的星形膠質(zhì)細胞增生，這與在 rhCHNH-處理的缺血小鼠中觀測到的結(jié)果無差異(數(shù)據(jù)未示出)。在任一組中 的其它腦部區(qū)域未示出任何相關(guān)星形膠質(zhì)細胞的激活。
3.結(jié)論
本發(fā)明數(shù)據(jù)示出劑量為15U/小鼠的rhClINH當在缺血開始(-pre)或結(jié) 束(-后，即在再灌注時)給予對象時，在降低缺血體積方面作用相似。更重 要的是當在缺血發(fā)生后1小時(lh-后)注射該抑制劑時其也能發(fā)揮神經(jīng)保護 作用。另外，rhClINH的保護作用在缺血后7天仍存在。這些結(jié)果與血漿 衍生的hClINH形成鮮明對比，當在缺血后1小時注射后者時，其幾乎完 全喪失發(fā)揮神經(jīng)保護作用的能力(見圖2)。
這項研究的主要結(jié)果如下
1. 小鼠血漿中rhClINH的半衰期為大約3小時(在15U/小鼠的劑量)。 抗原與功能活性之間的良好相關(guān)性表明所述重組蛋白質(zhì)在血漿中僅以其活 性形式循環(huán)；可能是組織分布有助于血漿水平的降低。
2. 15U/小鼠-pre劑量的rhClINH非常有效地降低缺血體積(降低
69%) o
3. 通過染色評價，15U/小鼠的劑量的rhClINH能明顯降低海馬中的變 性神經(jīng)元數(shù)，因此表明缺血體積的降低歸因于神經(jīng)元免于損傷。
4. 當在缺血開始(-前)、結(jié)束(-后)或缺血發(fā)生1小時后(lh后后，即再 灌注開始30分鐘)給予時，rhClINH在降低缺血體積方面作用相似。因此， rhClINH較pdClINH (當在缺血1小時后給予pdClINH時其不再起作用) 的作用功效時間窗寬大。
5. rhClINH-前劑量的神經(jīng)保護作用時長期的，通過在缺血開始后7天 進行的神經(jīng)元計數(shù)而示出。
6. 在缺血之后48小時評價發(fā)現(xiàn)，rhCHNH使得總體和局灶性功能缺損 略為改善。這個發(fā)現(xiàn)與用pdClINH觀測到的結(jié)果相似。為了評估rhClINH 對于長期行為功能表現(xiàn)的影響，我們通過曠場實驗分析了小鼠的行為。結(jié) 果示出缺血之后7天rearing行為在缺血小鼠中比未經(jīng)試驗的小鼠中的得分 顯著降低。這種降低在rhClINH處理的小鼠中不存在，其得分與對照小鼠 無差異。
7. 在早期(48小時)和晚期(7天)時間點進行評價，示出rhClINH能削 弱缺血小鼠腦組織中小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞的激活/募集。這些細胞是腦組織 炎癥應答的標志。
8. 在48小時由缺血激發(fā)的星形膠質(zhì)細胞的強應答由rhClINH削弱。 在兩個實驗組中星形膠質(zhì)細胞激活均明顯降低，在鹽水和rhClINH-處理的 小鼠中可觀測到無差異。
實施例2:對rhCl-INH在局灶性腦缺血的小鼠模型中的神經(jīng)保護作用的研 究
我們先前已經(jīng)證實了 15U的rhCl-INH在小鼠腦缺血/再灌注模型中具 有明顯的神經(jīng)保護作用，當在缺血/再灌注發(fā)生之后1小時給予時也如此， 而pdCl-ENH在治療后這個時間點不再有效。這種神經(jīng)保護作用是長期的， 事實上在缺血及治療之后7天，用rhCl-INH治療的小鼠缺血的腦組織仍示
出梗死面積降低。在如下實驗中，我們確定了rhCl-INH的神經(jīng)保護作用對 缺血體積的功效時間窗(超過1小時后)和劑量應答。另外，我們使用相同方 案直接對比了 pdCl-INH、兔和牛rhCl-INH的作用(對于兔rhCl-INH是在 最有效劑量和時間點)
方法
動物
涉及動物及其照顧的程序根據(jù)符合國家(D丄.n.116, G.U. suppl. 40， 18 February 1992)和國際法和政策(EEC Council Directive 86/609， OJ L 358,1; Dec. 12,1987; NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, U.S. National Research Council 1996)的研究機構(gòu)指導進行。將雄性C57B1/6小鼠 (26-28 g， Charles River, Calco,Italy)圈養(yǎng)，5只/籠，保持在恒定的溫度(21士 1°C)和相對濕度(60%)，規(guī)律光照/黑暗(7am-7pm)。隨意取食(小鼠食用 Altromin顆粒)和水。
一過性局灶性腦缺血
如前所述通過大腦中動脈閉塞(MCAO)實現(xiàn)缺血u。利用含5%異氟 醚的NaO/Oa (70/30%)混合物誘導麻醉，并用在相同混合物中的1.5-2%異 氟醚保持麻醉狀態(tài)。為了證實每只動物中血管閉塞的合適性，通過激光多 普勒血流儀(Transonic BLF-21)使用位于腦表面并用壓模材料固定在顱骨上 的柔軟的0.5mm光纖探頭(Transonic, Type M, 0.5 mm直徑)測量血流，使 用如下坐標AP--lmm， L=-3，5mm。簡而言之，暴露右頸總動脈，通過 在頸總動脈上做的切口將硅絲(7-0)導入頸內(nèi)動脈中并行進至大腦前動脈， 以阻斷其分支進入大腦前動脈和MCA。使所述硅絲行進直至觀測到與缺血 前基線相比血流減少>70%。在缺血30分鐘后，小心除去所述尼龍絲恢復 血流。
藥物治療
在缺血后不同時間以不同劑量給予小鼠單劑量靜脈內(nèi)注射C1-INH (兔 rhCl-INH、牛rhCl-INH或者pdCl-INH)。對照小鼠接受相同體積的鹽水。 神經(jīng)功能缺損評估
在缺血48小時后，由有經(jīng)驗的未知實驗條件的研究人員針對小鼠獨特 的兩項神經(jīng)功能評分對每只小鼠進行評估。總體神經(jīng)功能缺損小鼠的每一 項如下類別的得分為0-28:毛發(fā)、耳、眼、姿勢、自發(fā)活動、癲癇行為。 局灶性神經(jīng)功能缺損小鼠的每一項如下類別的得分為0-28:身體對稱性、 步態(tài)、攀爬、旋轉(zhuǎn)行為、前肢對稱性、強制性旋轉(zhuǎn)、感覺應答。數(shù)據(jù)以中 位值和百分位值表示。
梗死面積的量化
在缺血48小時后，將小鼠用Equitensin(120ial/小鼠，腹膜內(nèi)注射)深度 麻醉，經(jīng)心灌注30ml的PBS 0.1mol/l、 pH7.4，隨后灌注在PBS中的60ml 冰冷多聚甲醛(4%)。在從顱腔中小心取出腦之后，將其移至30%蔗糖的 PBS溶液中，在4"C低溫保護過夜。然后將腦沉浸在異戊垸中在-45t:速凍 3分鐘，之后密封于小瓶中，在-7(TC貯存直至使用。為了確定損傷面積， 以240|im間隔依次制作厚度為20pm的腦冠狀切片，用中性紅(Neutral Red Gurr Certistain， BDH, England)染色。在每個切片上，梗塞面積經(jīng)盲式評價 并通過組織學染色的相對蒼白度(relativepaleness)而描繪。梗塞面積通過
從每個切片上的對側(cè)半球的面積中減去同側(cè)半球中的正常組織面積而確 定。通過使用計算機輔助圖像分析儀并通過圖像分析系統(tǒng)(Analytical Image
System)計算進行量化，綜合每個腦組織切片上的梗塞面積而計算梗死體積。
神經(jīng)變性的評價
通過用Fluoro-Jade"染色(這是神經(jīng)元變性的標志物)在厚度為20|am的 切片上評估神經(jīng)變性的存在。簡而言之，將切片干燥，在乙醇(100%-75%) 和蒸餾水中再水化。然后將其在0.06%高錳酸鉀中保溫15分鐘，在蒸餾 水中洗滌，移至0.001% Fluoro-Jade染色溶液中染色30分鐘。在染色后， 將切片在蒸餾水中漂洗，干燥，浸入二甲苯中，用DPX封固劑(BDH，Poole， UK)封蓋，之后進行熒光顯微鏡分析。
結(jié)果
短暫缺血中的功效時間窗 為了評估功效時間窗，從缺血開始后3、 6、 9、 18和24小時給予15U 的兔rhCl-INH或鹽水。48小時后，在缺血發(fā)生后3和6小時用兔rhCl-INH 3處理的缺血小鼠比用鹽水處理的缺血小鼠(44.43土5.94mm"示出缺血體積 明顯降低(分別為11.71 土0.63mm3和20.38士2.37mm3)。當在缺血后9和18 小時給予兔rhCl-INH時，其仍有效，但是功效較小(分別為23.63士4.11mm3 和27.13土2.58mm3)。在缺血后24小時給予時，該抑制劑喪失其有益作用 (41,92±2.76,3)(圖3)。在鹽水處理的小鼠中，F(xiàn)Iuoro-Jade染色示出在紋 狀體皮質(zhì)和海馬中存在神經(jīng)變性。當在早期時間點給予時，rhCl-INH能減 少海馬(直至3小時)和皮質(zhì)(直至9小時)中的神經(jīng)變性。當在缺血后6和9 小時用這種抑制劑處理小鼠時，在海馬中觀測到一些變性神經(jīng)元。在稍后 的處理時間點(18和24小時)，當缺血體積較大時，F(xiàn)luoro-Jade染色示出在 皮質(zhì)中存在神經(jīng)變性的神經(jīng)元。在所有測試時間點，在鹽水和rhCl-INH處 理的動物中紋狀體均示出廣泛的神經(jīng)變性(圖5、 6、 7)。由未知實驗條件的 ff究人員對每只動物進行Fluoro-Jade染色半定量評估(圖4)。
短暫缺血中的劑量應答
由于在人遺傳性血管性水腫中使用的C1-INH劑量低于本發(fā)明在小鼠 中風治療中的用量，因此在本發(fā)明的缺血模型中使用較低的劑量?；谙?前的實驗結(jié)果，選擇處理后3小時進行劑量應答實驗。在缺血和再灌注發(fā) 生后3小時給予不同劑量的兔rhCl-INH (5和IO單位)。10U/小鼠的劑量 在降低缺血體積方面仍有效(22.10士3.65mm3)，而5U的兔rhCl-INH不再 改變腦損傷的程度(47.39±4.081111113)。這些數(shù)據(jù)示出兔rhCl-INH能以劑量 依賴性方式改變?nèi)毖獡p傷(圖8)。
在用10U rhCl-INH處理的小鼠中，通過Fluoro-Jade染色在紋狀體觀 測到一些神經(jīng)變性的神經(jīng)元，但在海馬和皮質(zhì)中未觀測到；而用5U處理的 缺血小鼠在紋狀體皮質(zhì)中出現(xiàn)大量神經(jīng)變性(數(shù)據(jù)未示出)。
在功效時間窗或劑量應答實驗中均未示出總體和局灶性神經(jīng)功能缺損 的任何明顯變化(數(shù)據(jù)未示出)。
pdC 1-INH與rhC 1-INH (來自兔和牛)作用的對比
先前關(guān)于pdCl-INH的數(shù)據(jù)得自一種不同的短暫腦缺血模型。為了直 接對比pdCl-INH、牛rhCl-INH和兔rhCl-INH，將這些化合物給予使用相 同實驗方案(硅涂覆的絲)誘導的缺血小鼠。在缺血發(fā)生后3小時給予劑量為 15U/小鼠的所述抑制劑。
正如所預期的，pdCl-INH在此時間點不能發(fā)揮神經(jīng)保護作用(47.39± 4.08mm3)。然而，牛rhCl-INH-處理的缺血小鼠較鹽水處理的小鼠示出明顯 降低的缺血體積，但是程度較兔rhCl-INH-處理的小鼠低(圖9)。令人驚奇 的是總體和局灶性神經(jīng)功能缺損均通過牛rhCl-INH得以改善(圖10)。
Fluoro-Jade染色示出在用pdCl-INH處理的缺血小鼠腦組織的所有考 慮的區(qū)域(皮質(zhì)、紋狀體和海馬)中均存在大量神經(jīng)變性。牛rhCl-INH處理 的小鼠腦組織染色示出皮質(zhì)和海馬中不同程度的神經(jīng)變性，因為在6只小 鼠中有3只小鼠在這兩個區(qū)域均觀測到明顯的神經(jīng)變性，而其它3只小鼠 的神經(jīng)變性量很少。在6只小鼠中均示出紋狀體廣泛的Fluoro-Jade染色。
評論
這項工作的最相關(guān)數(shù)據(jù)是兔rhCl-INH的功效時間窗。劑量為15U/小 鼠的兔rhCl-INH在缺血發(fā)生之后直至18小時仍能顯著降低缺血體積，而 pdCl-INH在缺血3小時之后已經(jīng)喪失其神經(jīng)保護作用。這個令人驚奇的特 征使得rhCl-INH成為人類中風治療的一種可能的候選物。pd和rhCl-INH 的不同功效可歸因于這兩種分子的不同糖基化，導致與血漿衍生的C1-INH 相比rhCl-INH對于甘露糖結(jié)合蛋白(MBP)的親和性較高。通過與MBP的 結(jié)合，rhCl-MH導致參與心、腎和胃腸道缺血/再灌注損傷發(fā)病機制的補體 凝集素途徑受抑制7'9。這個未經(jīng)充分鑒定的途徑在腦缺血中的作用還未知， 需要進一步的實驗以闡明rhCl-INH神經(jīng)保護作用的機制。
rhClINH較pdClINH在缺血發(fā)生后時間窗中的良好神經(jīng)保護作用可如 下進一步解釋，即所述重組分子通過結(jié)合細胞表面抗原而更有效地靶向組 織損傷部位和/或更有效的組織穿透。需要進行更多的研究以充分闡明本發(fā) 明所述觀測結(jié)果的精確分子學機制。
Fluoro-Jade染色提供了損傷隨著時間進展的間接證據(jù)。用rhCl-INH早
期處理可以完全挽救缺血半影區(qū)(海馬和皮質(zhì))。處理給予得越晚，在缺血半
影區(qū)就有越多的神經(jīng)元變性。這些發(fā)現(xiàn)證實rfiCl-INH對于缺血半影區(qū)發(fā)揮 神經(jīng)保護作用。兔riiCl-INH能以劑量依賴性方式降低缺血體積。功效時間 窗實驗中使用的rhCl-INH最有效的劑量(15U/小鼠，相應于大約600U/kg) 高于在人遺傳性血管性水腫中的使用劑量(大約25-100U/kg)。為了證實較低 的劑量在降低神經(jīng)變性和缺血性梗死中是否仍有效，進行劑量應答實驗。 結(jié)果示出400U/kg(10U/小鼠)的rhCl-INH仍能顯著減少缺血性損傷，但是 程度降低。高于HAE所用劑量(5U/小鼠，200U/kg)8倍的劑量無效。這些 發(fā)現(xiàn)與所表明的在各種炎癥的治療中需要大劑量C1-INH的結(jié)果5—致。特 別是這種劑量是達到對內(nèi)皮粘附分子的重要抑制作用所必需的6，這是參與 腦缺血/再灌注損傷病理學的一種機制。最后，在缺血之后3小時給予劑量 為15U/小鼠的牛rhCl-INH提供神經(jīng)保護作用，但是顯著低于兔rhCl-INH 的神經(jīng)保護作用。與鹽水處理的小鼠相比，所述牛來源的抑制劑也能改善 神經(jīng)損傷。這些發(fā)現(xiàn)表明這種分子能改善缺血小鼠的一般狀況。
實施例3: rhCl!NH與血漿衍生的C1INH抑制經(jīng)典途徑和MBL途徑的激 活的能力對比 材料與方法
rhClINH和pdClINH (Cetor， Sanquin, Amsterdam, The Netherlands)對于 經(jīng)典和凝集素途徑功能的作用在Wieslab TM complement system Screen (Euro-Diagnostica, Malmo, Sweeden)中使用兩種不同來源的血清來檢測。一 種血清是試劑盒中包含的血清，用作陽性對照(后文稱作血清樣品1)。另一 血清樣品得自可商購人血清庫(25個不同供體的血清庫；Kordia, Leiden，荷 蘭)，后文稱作血清樣品2。將這兩個血清樣品一式三份單獨與0、 15、 30 和75 iumol rhClINH或pdClINH在室溫保溫30分鐘。為此，將pdClINH 和rhClINH原液在水中稀釋為適當濃度。取相應于15、 30和75pmol rhClINH或pdClINH的體積，用水調(diào)節(jié)為15^1。取與rhClINH相同稀釋 度的溶解有rhClINH的緩沖液(20 mM檸檬酸鹽，0.19 M蔗糖pH 6.8;經(jīng)
0.22(im濾膜過濾)作為對照以干擾Wieslab補體系統(tǒng)。根據(jù)廠商指導，將經(jīng) 典途徑和MBL途徑的陽性對照(PC)和陰性對照(NC)(試劑盒中提供)及兩種 血清樣品在稀釋劑CP(經(jīng)典途徑)和稀釋劑MP(MBL途徑)中稀釋為1/101。 為127.5jil這些稀釋的血清補加22.5|il水、pdClINH、rhClINH或者緩沖液， 在室溫保溫30分鐘。接著，將100nl/孔的PC、 NC、稀釋劑CP或MP (空 白)及樣品移液至合適的平板上，在37t:保溫l小時。在保溫后，用300)il/ 洗滌溶液將孔洗滌3次，隨后在室溫與10(Hil/孔的結(jié)合物保溫30分鐘。再 次洗滌后，將孔與100^d/孔的底物再次在室溫保溫30分鐘。通過加入100^1/ 孔的5mMEDTA終止反應，在405nm讀取吸光度。
為了計算結(jié)果，從PC、 NC和樣品組中減去空白組(稀釋劑CP或MP) 的吸光度。補體激活的百分比利用如下公式計算(樣品-NC)/(PC-NC)X 100。這意味著PC總是設(shè)定為100%。對于每種條件，計算平均值、標準 偏差及CV%。
結(jié)果
通過Wielisa檢査rhClINH和pdClINH對經(jīng)典途徑的作用 在兩個不同血清樣品中分析rhClINH和pdClINH對經(jīng)典途徑激活的抑 制作用。如圖12、 13和16所示，rhClINH和pdClINH在這兩個血清樣品 中均劑量依賴性降低經(jīng)典途徑介導的C5b-9沉積。而75nm濃度的rhClINH 與pdClINH相比似乎在血清樣品1中略強地抑制經(jīng)典途徑激活，這種作用 在血清樣品2中未觀測到。在所有其它測試濃度，在rhClINH與pdClINH 之間未觀測到抑制作用的差異。因此，推斷rhClINH和pdClINH在人血清 中抑制經(jīng)典途徑激活方面效果相同。
通過Wielisa檢查rhClINH和pdClINH對MBL途徑的作用 在相同的實驗設(shè)置中，分析rhClINH和pdClINH對MBL途徑激活的 抑制作用。如圖14、 15和16所示，rhClINH和pdClINH也均劑量依賴性 降低MBL途徑的激活。然而，與其中未觀測到差異的經(jīng)典途徑相反， rhClINH與pdClINH相比呈現(xiàn)出是MBL途徑的更強的抑制劑。在所有三 個測試濃度及在這兩個血清樣品中，rhClINH-介導的MBL途徑的抑制比
pdClINH高 20。/。。因此，推斷rhClINH與pdClINH相比是MBL途徑的
更有效的抑制劑。 結(jié)論
結(jié)果示出rhClINH和pdClINH在抑制經(jīng)典途徑中效果相等，但是 rhClINH是MBL途徑的更強的抑制劑。在所有測試濃度，rhClINH比 pdClINH介導的MBL途徑抑制強~20%。 參考文獻
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權(quán)利要求
1.血漿半衰期小于6小時的C1抑制劑在制備用于預防、降低或治療至少一種缺血和再灌注損傷的藥物組合物中的應用，其中所述C1抑制劑在缺血和再灌注后給予。
2. 權(quán)利要求1的應用，其中所述Cl抑制劑與得自血漿的人Cl 抑制劑相比具有降低的末端唾液酸殘基水平。
3. 權(quán)利要求1或2的應用，其中所述C1抑制劑包含一種聚糖， 所述聚糖具有選自半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡糖胺、甘露 糖和巖藻糖的末端殘基。
4. 前述任一項權(quán)利要求的應用，其中所述Cl抑制劑具有與SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列至少65%相同性的氨基酸序列。
5. 前述任一項權(quán)利要求的應用，其中所述C1抑制劑得自遺傳工 程化細胞或生物體。
6. 權(quán)利要求5的應用，其中所述C1抑制劑得自轉(zhuǎn)基因非人動物。
7. 權(quán)利要求6的應用，其中所述Cl抑制劑得自轉(zhuǎn)基因非人動 物的乳汁。
8. 權(quán)利要求6或7的應用，其中所述轉(zhuǎn)基因非人動物是?；蛘?Z^go附or; /za目的動物，優(yōu)選兔。
9. 前述任一項權(quán)利要求的應用，其中所述Cl抑制劑以50-2000 單位/kg體重范圍的量被應用。
10. 前述任一項權(quán)利要求的應用，其中所述C1抑制劑在缺血和/ 或再灌注后至少1小時、優(yōu)選至少3小時、更優(yōu)選至少6小時、更 優(yōu)選至少9小時、更優(yōu)選至少18小時給予。
11. 前述任一項權(quán)利要求的應用，其中所述藥物組合物還含有溶 血栓藥或者與溶血栓藥組合應用或者在用這種溶血栓藥治療后應 用。
12. 前述任一項權(quán)利要求的應用，其中所述藥物組合物用于預防、降低或治療至少一種無法預見的缺血和再灌注損傷的突然或急性發(fā) 生。
13. 權(quán)利要求12的應用，其中所述藥物組合物用于預防、降低或 治療在中風或圍產(chǎn)期中風之后的至少一種缺血和再灌注損傷。
14. 權(quán)利要求1-11任一項的應用，其中所述藥物組合物用于預 防、降低或治療至少一種預見的缺血和再灌注損傷的發(fā)生，優(yōu)選在 器官移植后的發(fā)生。
15. 如權(quán)利要求1-9的C1抑制劑在制備用于預防、降低或治療 至少一種缺血和再灌注損傷的藥物組合物中的應用，其中所述Cl 抑制劑是在至少一種預見的缺血和再灌注損傷發(fā)生之前或發(fā)生期間 給予。
16. 權(quán)利要求15的應用，其中所述C1抑制劑在至少一種預見的 缺血和再灌注損傷發(fā)生之前至多3小時、優(yōu)選至多2小時、更優(yōu)選 至多1小時、最優(yōu)選至多30分鐘給予，和/或其中本發(fā)明的Cl抑制 劑被持續(xù)給予需要其的對象和/或在器官移植情況中被持續(xù)給予待 移植的器官。
17. 權(quán)利要求15或16的應用，其中預見的缺血和再灌注損傷的 發(fā)生是在器官移植情況中。
18. 權(quán)利要求1-17任一項的應用，其中所述藥物組合物用于預 防、降低或治療已知通過凝集素途徑產(chǎn)生的至少一種缺血和再灌注 損傷，優(yōu)選心肌、腎、胃腸道缺血和再灌注損傷或中風。
19. 權(quán)利要求13的應用，其中C1抑制劑發(fā)揮神經(jīng)保護作用，優(yōu) 選在海馬和/或皮質(zhì)中發(fā)揮神經(jīng)保護作用。
20. 前述任一項權(quán)利要求的應用，其中所述Cl抑制劑發(fā)揮降低 由缺血和/或再灌注誘導的損傷的作用。
全文摘要
本發(fā)明涉及C1抑制劑在預防、降低和治療缺血和再灌注損傷中的治療和預防性應用。本發(fā)明的C1抑制劑在缺血和再灌注后給予仍具有治療作用，并因此特別可用于無法預見的缺血-再灌注的發(fā)生如中風。
文檔編號A61P41/00GK101365478SQ200680048287
公開日2009年2月11日 申請日期2006年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月21日
發(fā)明者F·皮珀, G·J·齊瑞, J·H·努延斯, M·G·德西莫尼, M·曼奈斯 申請人:法明知識產(chǎn)權(quán)股份有限公司