Mindin基因在肝臟缺血再灌注損傷中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種Mindin及其抑制劑在肝臟缺血再灌注損傷中的應(yīng)用，屬于基因的功能與應(yīng)用領(lǐng)域。本發(fā)明以Mindin基因敲除小鼠和肝細(xì)胞特異性Mindin轉(zhuǎn)基因小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過肝臟缺血再灌注損傷模型，結(jié)果表明與野生型C57小鼠對(duì)比，Mindin基因敲除小鼠肝臟壞死明顯被抑制，肝功能也明顯好轉(zhuǎn)，而肝細(xì)胞特異性Mindin轉(zhuǎn)基因小鼠的肝臟壞死則明顯增加，且肝功能明顯惡化。因此Mindin基因具有惡化肝功能的作用，特別是Mindin基因能夠惡化肝臟缺血再灌注損傷的作用。針對(duì)Mindin的上述功能，提供Mindin可作為藥物靶標(biāo)篩選治療肝臟缺血再灌注損傷的藥物，Mindin的抑制劑可用于制備治療肝臟缺血再灌注損傷的藥物。
【專利說明】M i nd i η基因在肝臟缺血再灌注損傷中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因的功能與應(yīng)用領(lǐng)域，特別涉及一種Mindin (Spondin 2)作為藥物 靶標(biāo)在篩選治療肝臟缺血再灌注損傷的藥物中應(yīng)用，以及Mindin的抑制劑在制備治療肝 臟缺血再灌注損傷的藥物中應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 缺血再灌注損傷是指組織缺血缺氧達(dá)到一定的時(shí)間和程度引起細(xì)胞發(fā)生病理改 變，在恢復(fù)血液供應(yīng)后不一定使病變的細(xì)胞恢復(fù)功能，反而在一定條件下出現(xiàn)進(jìn)一步加重 的現(xiàn)象。臨床上廣泛的肝葉切除術(shù)以及肝移植術(shù)等常需部分或完全阻斷肝臟血流，而肝臟 是一個(gè)對(duì)缺血缺氧非常敏感的器官，因此不可避免地發(fā)生缺血再灌注損傷。肝臟缺血再灌 注損傷（Hepatic Ischemia Reperfusion Injury, HIRI)機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，確切的發(fā)病機(jī)制仍 不十分清楚。目前，對(duì)于肝臟缺血再灌注損傷發(fā)生機(jī)制的研究己成為移植界關(guān)注的熱點(diǎn)。 肝臟缺血過程中由于肝細(xì)胞內(nèi)ATP迅速耗盡，導(dǎo)致乳酸酮體等的堆積，及線粒體氧化磷酸 化功能低下，引發(fā)代謝性酸中毒；ATP含量的下降，導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)外Ca 2+重新分布，S卩Ca2+內(nèi) 流，引起線粒體的損傷；肝臟缺血再灌注損傷可以分為兩個(gè)時(shí)限，早期階段以Kupffer細(xì)胞 激活為主要特征。Kupffer細(xì)胞可以釋放大量的氧自由基或超氧陰離子，可以引起肝細(xì)胞的 急性損傷。在缺血再灌注損傷的第二階段，Kupffer細(xì)胞激活以后，可以引起大量的炎癥因 子的釋放，激活炎癥反應(yīng)通路，使大量的中性粒細(xì)胞在肝臟內(nèi)浸潤(rùn)。中性粒細(xì)胞在肝臟內(nèi)浸 潤(rùn)后可以通過釋放氧自由基和蛋白酶，引起嚴(yán)重的肝功能損害。
[0003] 眾多文獻(xiàn)資料表明缺血再灌注損傷可能與下列因素有關(guān)：1.氧自由基的生成；2. 鈣超載；3.細(xì)胞因子的參與；4. Kupffer細(xì)胞及中性粒細(xì)胞激活；5.內(nèi)皮素和一氧化氮濃 度的失衡?？傊?，肝臟缺血再灌注損傷是由各種機(jī)制相互影響，綜合作用的結(jié)果，進(jìn)一步了 解及明確其作用機(jī)制，將對(duì)臨床防治肝臟缺血再灌注損傷有著重要的意義。
[0004] Mindin又稱為Spondin 2,屬于Mindin-F-Spondin細(xì)胞外基質(zhì)蛋白家族，于1997 年由Higashi jima等首次在斑馬魚中克隆，并發(fā)現(xiàn)其能促進(jìn)海馬神經(jīng)元的粘附與生長(zhǎng)。隨 后的研究證實(shí)Mindin廣泛表達(dá)于哺乳動(dòng)物的各組織，其結(jié)構(gòu)包含一個(gè)氨基末端的F底板 反應(yīng)蛋白（F-spondin，F(xiàn)S)結(jié)構(gòu)域和一個(gè)羧基末端的血小板反應(yīng)蛋白1型重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域 (thrombospondin type 1 repeat，TSR)。Mindin在不同種屬間結(jié)構(gòu)高度保守，例如小鼠和人 的Mindin氨基酸序列的同源性達(dá)85%，提示Mindin可能具有重要的生物學(xué)功能。Mindin 是一種模式識(shí)別分子，能夠與病原體和PAMPs結(jié)合，并作為一種噬菌素調(diào)控巨噬細(xì)胞的吞 噬功能，參與調(diào)節(jié)天然免疫的宿主防御反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)Mindin通過整合素與中性粒細(xì)胞結(jié) 合，調(diào)控中性粒細(xì)胞的募集、粘附和遷移功能；而Mindin基因敲除使骨髓來(lái)源的樹突狀細(xì) 胞中小分子G蛋白R(shí)ac-Ι與Rac-2的表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致其活化T細(xì)胞能力受損，而Mindin仍然 是通過整合素與樹突狀細(xì)胞結(jié)合并介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控；進(jìn)一步分析Mindin的蛋 白結(jié)構(gòu)，確定了 Mindin識(shí)別PAMPs的結(jié)構(gòu)為TSR結(jié)構(gòu)域，而F-spondin結(jié)構(gòu)域則是Mindin 與整合素的結(jié)合位點(diǎn)。越來(lái)越多的研究證明Mindin不僅在免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重 要作用（JIA W et al, The extracellular matrix protein mindin serves as an integrin ligand and is critical for inflammatory cell recruitment. Blood (2005) ; 106 ( 12): 3854-2859)，而且還參與多種疾病的病理過程。我們已有研究表明Mindin在心肌肥厚、腦 卒中及糖尿病疾病模型中發(fā)揮著重要的作用：在心肌肥厚模型中，Mindin作為內(nèi)源性保護(hù) 因子，通過抑制AKT/GSK3 β信號(hào)通路，從而抑制因適應(yīng)不良引起心臟重構(gòu)而導(dǎo)致的心力衰 3§(Bian ZY etl,Disruption of mindin exacerbates cardiac hypertrophy and fibrosis. J Mol Med (Berl)(2012);90(8) :895-910);在缺血性腦損傷中Mindin通過Akt信號(hào)通路從而 發(fā)揮生物學(xué)功會(huì)泛（Wang L et al，Mindin is a critical mediator of ischemic brain injury in an experimental stroke model. Exp Neurol (2013) ;247:506_516);在糖尿病模型中， Mindin通過與PPAR α作用，從而調(diào)節(jié)小鼠的肝臟脂質(zhì)代謝以及減輕肝脂肪變性、肥胖、炎 癥等（Zhu LH et al,Mindin/Spondin 2 inhibits hepatic steatosis, insulin resistance, and obesity via interaction with peroxisome proliferator-activated receptor a in mice. J Hepatol (2014);60 (5): 1046-1054)。由于肝臟缺血再灌注損傷機(jī)制中涉及炎癥等 反應(yīng)，推測(cè)Mindin在其中發(fā)揮重要作用。到目前為止國(guó)際上無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道有關(guān)Mindin基因 在肝臟缺血再灌注損傷中應(yīng)用的內(nèi)容。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決臨床防治肝臟缺血再灌注損傷現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，本發(fā)明的目的是確 定Mindin基因的表達(dá)與肝臟缺血再灌注損傷之間的相互關(guān)系，提供一種Mindin作為藥物 靶標(biāo)在篩選防治肝臟缺血再灌注損傷的藥物中的應(yīng)用，進(jìn)而提供一種Mindin的抑制劑在 制備防治肝臟缺血再灌注損傷的藥物中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)： 本發(fā)明以Mindin基因敲除小鼠和肝細(xì)胞特異性Mindin轉(zhuǎn)基因小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過 肝缺血再灌注損傷模型，結(jié)果表明與野生型C57小鼠對(duì)比，Mindin基因敲除小鼠肝臟壞死 面積明顯被抑制，而肝細(xì)胞特異性Mindin轉(zhuǎn)基因小鼠的肝臟壞死面積則明顯增加。這提示 Mindin基因具有惡化肝功能的作用，為Mindin在研究防治肝缺血的新靶點(diǎn)和新策略中所 發(fā)揮的作用提供了理論依據(jù)和臨床基礎(chǔ)。
[0007] 因此，Mindin基因可作為藥物靶點(diǎn)，構(gòu)建Mindin基因過表達(dá)的體外細(xì)胞模型或 動(dòng)物模型，用于篩選預(yù)防、緩解和/或治療肝臟缺血再灌注損傷的藥物；Mindin基因也可 作為基因治療中的靶基因，設(shè)計(jì)并制備預(yù)防、緩解和/或治療肝臟缺血再灌注損傷的藥物 和/或生物學(xué)試劑，通過基因工程技術(shù)達(dá)到預(yù)防、緩解和/或治療肝臟缺血再灌注損傷的 目的。例如以Mindin為祀基因，設(shè)計(jì)可干擾Mindin表達(dá)的雙鏈siRNA，通過化學(xué)方法合成 以后，注射入人體通過RNA干擾的方法使Mindin基因沉默來(lái)治療肝臟缺血再灌注損傷；還 可以設(shè)計(jì)并構(gòu)建Mindin的突變體，注射后進(jìn)入細(xì)胞，競(jìng)爭(zhēng)Mindin原形的作用底物，從而抑 制Mindin的功能，起到治療目的；此外，還可以以Mindin為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)小分子化合物抑制劑， 利用Mindin基因過表達(dá)的體外細(xì)胞模型或動(dòng)物模型，通過篩選，發(fā)現(xiàn)其中能夠特異性抑制 Mindin的分子，從而為肝臟缺血再灌注損傷的治療提供新的治療性分子。
[0008] 針對(duì)Mindin的上述功能，提供Mindin作為藥物靶標(biāo)在篩選治療肝臟缺血再灌注 損傷的藥物中的應(yīng)用。
[0009] 針對(duì)Mindin的上述功能，提供Mindin的抑制劑在制備治療肝臟缺血再灌注損傷 的藥物中的應(yīng)用。
[0010] 一種保護(hù)肝功能的藥物，包含Mindin的抑制劑。
[0011] 一種治療肝臟缺血再灌注損傷的藥物，包含Mindin的抑制劑。
[0012] 所述的Mindin的抑制劑優(yōu)選為Mindin基因的siRNA、Mindin基因的RNA干擾載 體，Mindin的抗體及其他能夠抑制Mindin表達(dá)的抑制劑中的一種。
[0013] 本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果： 1.本發(fā)明發(fā)現(xiàn)Mindin基因的新功能，即Mindin基因能夠惡化肝臟缺血再灌注損傷的 作用。
[0014] 2.基于Mindin在惡化肝臟缺血再灌注損傷中的功能，為肝臟缺血再灌注損傷的 藥物提供靶標(biāo)。
[0015] 3. Mindin的抑制劑可用于制備保護(hù)肝功能和治療肝臟缺血再灌注損傷的藥物。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1肝細(xì)胞特異性Mindin轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建及鑒定結(jié)果圖 A為Mindin載體的構(gòu)建圖； B為肝細(xì)胞特異性Mindin轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定結(jié)果圖。
[0017] 圖2小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)肝臟的壞死情況對(duì)比圖。
[0018] A為WT和Mindin-ΚΟ小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)肝臟HE染色圖及壞死面積統(tǒng)計(jì)柱狀圖； B為NTG和Mindin-TG小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)肝臟HE染色圖及壞死面積統(tǒng)計(jì)柱狀圖。
[0019] 圖3小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)血清中ALT及AST的含量統(tǒng)計(jì)比較圖。
[0020] A為WT和Mindin-ΚΟ小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)肝臟血清中ALT及AST的含量統(tǒng)計(jì)柱狀 圖； B為NTG和Mindin-TG小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)肝臟血清中ALT及AST的含量統(tǒng)計(jì)柱狀圖。
[0021] 圖4小鼠缺血在再灌注12h時(shí)TUNEL細(xì)胞數(shù)的柱狀統(tǒng)計(jì)圖。
[0022] A為WT和Mindin-ΚΟ小鼠在再灌注12h時(shí)TUNEL免疫熒光柱狀統(tǒng)計(jì)圖； B為NTG和Mindin-TG小鼠在再灌注12h時(shí)TUNEL免疫熒光柱狀統(tǒng)計(jì)圖。

【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。
[0024] 實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物及飼養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選用8-10周齡、體重在24g-27g，背景為雄性C57BL/6品系的野生型小 鼠（WT，購(gòu)自北京華阜康生物科技有限公司）、Mindin基因敲除小鼠（Mindin-ΚΟ,由杜克 大學(xué)醫(yī)學(xué)中心免疫學(xué)（Department of Immunology, Duke University Medical Center)何 有文構(gòu)建，并友情贈(zèng)送)。（上述Mindin基因敲除小鼠制造參考以下文獻(xiàn)：You-WenHel et al，The extracellular matrix protein mindin is a pattern-recognition molecule for microbial pathogens. Nature immunology (2004), 5 (1) :88-97) 飼養(yǎng)環(huán)境：所有實(shí)驗(yàn)小鼠均飼養(yǎng)在武漢大學(xué)心血管病研究所SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。小 鼠專用飼料由中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供。飼養(yǎng)條件：室溫在22-24°C之間，濕度在 40-70%之間，明暗交替照明時(shí)間為12h，自由飲水?dāng)z食。
[0025] 【實(shí)施例1】肝細(xì)胞特異性Mindin轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建： 為進(jìn)一步研究Mindin過表達(dá)對(duì)于肝臟缺血再灌注損傷的影響，我們構(gòu)建了幾株肝細(xì) 胞特異性Mindin轉(zhuǎn)基因小鼠（Mindin-TG)。轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建信息：用上游引物，即5'-GAA CTCGAGCCACCATGGAAAACTTGAGTCTTGC-3' ；下游引物，即 5' -GAATGCGGCCGCTTAGACGCAGTTAT CTGGGG-3'，擴(kuò)增小鼠 Mindin 全長(zhǎng)基因（NCBI，GenelD: 100689，匪_133903.3)，把。0嫩插 入白蛋白（Albumin)啟動(dòng)子下游，將構(gòu)建的載體通過顯微注射構(gòu)造成受精胚胎（C57BL/6J 背景），得到肝細(xì)胞特異性Mindin轉(zhuǎn)基因小鼠。
[0026] 通過蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot )實(shí)驗(yàn)鑒定不同轉(zhuǎn)基因鼠肝臟中Mindin蛋白的 表達(dá)量：提取不同轉(zhuǎn)基因鼠肝臟組織蛋白，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)。
[0027] 肝細(xì)胞Mindin的表達(dá)由Albumin (ALB)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)（圖1A)，并通過Western Blot 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Mindin過表達(dá)（圖1B)。為了反映病理生理狀態(tài)下Mindin的改變，我們選擇了 Mindin-TG 4小鼠，Western Blot及定量分析顯示，其肝臟組織中Mindin表達(dá)量約為正常組 織2. 63倍。
[0028] 【實(shí)施例2】小鼠肝缺血再灌注損傷模型（ischemia/reperfusion injury, I/R)獲 得 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：雄性8-10周齡，體重22-27克納入實(shí)驗(yàn) C57BL/6品系野生型小鼠、Mindin基因敲除小鼠及Mindin轉(zhuǎn)基因小鼠和非轉(zhuǎn)基因小 鼠，通過肝臟缺血再灌注建立肝缺血模型（I/R)。隨機(jī)分為8組：C57BL/6J品系野生型小鼠 假手術(shù)組（WT SHAM)及I/R手術(shù)組（WT I/R)、Mindin基因敲除小鼠假手術(shù)組（K0 SHAM)及1/ R手術(shù)組（K0 I/R)、非轉(zhuǎn)基因小鼠假手術(shù)組（NTG SHAM)及I/R手術(shù)組（NTG I/R)、肝細(xì)胞特異 性Mindin轉(zhuǎn)基因小鼠假手術(shù)組（TGSHAM)及I/R手術(shù)組（TG I/R)。
[0029] 2.肝缺血再灌注損傷模型I/R手術(shù)(采用無(wú)創(chuàng)血管夾夾閉中葉和左葉的門靜脈和 肝動(dòng)脈，使約70%的肝臟缺血）模型操作流程 ： 1)手術(shù)前12h給小鼠禁食，可自由飲水。
[0030] 2)手術(shù)前用3%戊巴比妥鈉成功麻醉小鼠后，將其平臥固定肢體，用剃毛器將小鼠 腹部術(shù)區(qū)毛刮凈，用10%碘酒和75%乙醇對(duì)術(shù)區(qū)消毒。
[0031] 3 )取腹正中切口進(jìn)腹，暴露肝臟左、中葉之肝蒂。
[0032] 4)用無(wú)創(chuàng)血管夾夾閉中葉和左葉的門靜脈和肝動(dòng)脈，使約70%的肝臟缺血，以防 止發(fā)生嚴(yán)重腸系膜靜脈淤血。〇.5min后，與非阻斷的右葉相比，可見阻斷葉變白，說明阻斷 成功。此時(shí)，注意記錄缺血開始時(shí)間，維持缺血約60分鐘，期間用濕的鹽水紗布覆蓋切口， 并注意小鼠的保溫（Sham組的小鼠在阻斷成功即刻去除血管夾，恢復(fù)缺血肝血流)。
[0033] 5)缺血60分鐘后去除血管夾，恢復(fù)缺血的肝臟血流，然后關(guān)閉腹腔，分兩層關(guān)腹， 先把內(nèi)層縫好，再縫皮，將手術(shù)后的小鼠置于干凈的籠子中單獨(dú)飼養(yǎng)，觀察。
[0034] 【實(shí)施例3】肝臟壞死面積及肝功能指標(biāo)（AST，ALT )測(cè)定 肝臟缺血再灌注損傷嚴(yán)重程度的評(píng)估指標(biāo)主要包括肝臟壞死面積和肝功能指標(biāo)（AST， ALT)，這些指標(biāo)均與肝臟缺血再灌注損傷嚴(yán)重程度正相關(guān)。
[0035] 1.取材 術(shù)后分別在假手術(shù)組（Sham)，以及缺血再灌注12h，24h，48h時(shí)頸椎脫臼處死 小鼠，立即自下腔靜脈取血lml，分離血清。同時(shí)統(tǒng)一取缺血區(qū)肝左葉組織大小約 1. 5cmX lcmXO. 2cm于10%中性福爾馬林中固定24h后脫水，包埋，進(jìn)行石錯(cuò)切片后進(jìn)行HE 染色。（分離血清：收集血液的EP管于室溫下靜置l-2h使血液自然凝固。4°C，4000rpm/ min，尚心30min，充分分尚血清。用微量移液器分別吸取血清20 μ L，20 μ L，30 μ L，30 μ L置 0. 2mL無(wú)菌ΕΡ管中，對(duì)ΕΡ管進(jìn)行標(biāo)記，隨后保存于-80°C冰箱)。
[0036] 2.制備石蠟標(biāo)本切片 1)主要操作程序包括：包埋框處理一流水沖洗一脫水一透明一浸蠟一包埋一切片一攤 片一晾干或烘烤后備用。
[0037] 2)用石蠟切片機(jī)的標(biāo)準(zhǔn)程序切5 μ m的石蠟切片備用。
[0038] 3. HE 染色 主要步驟為：55 °C烘烤30min -二甲苯5min，3次一100%酒精lmin - 95%酒精 lmin - 70%酒精lmin -雙蒸水lmin -蘇木素溶液5min -水洗lmin - 1%鹽酸酒精l-3s - 水洗lmin - Scott液(碳酸氫鈉0. 35g，硫酸鎂2g，蒸饋水100mL)lmin -水洗lmin -伊紅 溶液3-5min -蒸餾水洗去浮色一70%酒精I(xiàn)s - 95%酒精I(xiàn)s - 100%酒精30s，3次一二甲 苯2min，3次一趁二甲苯未干立即封片一通風(fēng)櫥內(nèi)吹干，顯微鏡拍照。
[0039] 4.小鼠血清ALT、AST含量測(cè)定 ① 從-80°C冰箱中取出血清樣本，迅速置于冰上，在室溫下待樣品融化； ② 在室溫下，4000轉(zhuǎn)/分鐘離心1分鐘，讓EP管壁的血清聚集至管底。
[0040] ③按照操作流程，打開全自動(dòng)生化分析儀（Sysmex，Chemix 180i)，清洗加樣器。
[0041] ④按照全自動(dòng)生化分析儀樣品盤的標(biāo)記順序，逐一放入待測(cè)的ΕΡ管。
[0042] ⑤準(zhǔn)確安裝試劑檢測(cè)盤，開始使用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)ALT、AST水平。
[0043] WT和Mindin-ΚΟ組在肝臟缺血再灌注損傷后的HE染色結(jié)果見圖2A :顯微鏡下可 見Sham組肝組織基本正常，肝組織結(jié)構(gòu)整齊，無(wú)明顯的纖維組織增生。I/R組隨著再灌注的 時(shí)間的延長(zhǎng)，肝組織結(jié)構(gòu)模糊，排列紊亂。其內(nèi)有大小不等、形狀不規(guī)則的壞死灶，壞死灶內(nèi) 肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊，排列紊亂，離斷，與正常肝臟比較，壞死肝臟的肝小葉內(nèi)見大片壞死灶，壞 死組織邊緣可見炎性反應(yīng)帶，肝細(xì)胞核發(fā)生典型的壞死改變，可見核固縮。這種現(xiàn)象在缺血 再灌注后24h達(dá)到高峰。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，給予Mindin-ΚΟ小鼠 I/R后的梗死面積明顯低于 WT組小鼠（圖2A);同樣Mindin-TG小鼠 I/R后的梗死面積明顯大于NTG組小鼠（圖2B)，因 此，Mindin在肝臟缺血再灌注引起的損傷中起到重要作用。
[0044] 血清中ALT及AST的含量統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖3。經(jīng)血清ALT、血清AST檢測(cè)水平表明， 在I/R組各時(shí)間點(diǎn)ALT、AST水平均明顯高于Sham組，在再灌注后12h達(dá)到高峰，隨后下降， Mindin K0小鼠 I/R后的ALT、AST水平明顯低于WT組小鼠（圖3A) ;Mindin TG小鼠 I/R后 的ALT、AST水平顯著高于NTG組小鼠（圖3B)。
[0045] 【實(shí)施例4】缺血再灌注后肝細(xì)胞凋亡情況測(cè)定 用 TUNEL 試劑盒染色檢測(cè)凋亡。（TUNEL 試劑盒：ApopTag? Plus In Situ Apoptosis Fluorescein Detection Kit (S7111, Chemicon)): 1) 將石蠟切片置于烤箱中，60°C烤片30分鐘； 2) 二甲苯，5分鐘X3次； 3) 100%乙醇，5分鐘X 2次；95%乙醇，5分鐘；70%乙醇，5分鐘； 4) ddH20漂洗，5分鐘X2次； 5) 蛋白酶K37°C孵育15分鐘； 6) PBS 漂洗 5minX2 次； 7) 直接滴加 Equilibration Buffer于組織上（13 μ L/cm2)，室溫孵育至少10s ; 8) 棄去 Equilibration Buffer,滴力P TdT Enzyme 工作液（77ulReaction Buffer +33ulTdT Enzyme)于組織上（11 μ L /cm2)，置濕盒于 37°C孵育 lh ; 9) 將切片置于盛有 Stop/Wash Buffer 工作液（lmlLStop/Wash Buffer +34mlLddH20)的染色缸中振蕩15s后室溫孵育lOmin (等待過程中，將適當(dāng)量的 Anti-Digoxigenin Conjugate吸出，至于EP管中，避光放置在室溫下，使其平衡至室溫）； l〇)PBS 漂洗 lminX3 次； 11) 輕輕甩去組織多余殘留的液體，將組織周圍液體吸3滴加 Anti-Digoxigenin Fluorescein 工作液（53%Blocking Solution+ 47%Anti_Digoxigenin Conjugate)于組織上 (13 μ L/cm2)，置濕盒中室溫避光孵育30min ; 12) PBS漂洗2minX4次（每次換新的PBS); 13) SlowFade Gold antifade reagent with DAPI (Invitrogen，S36939)封片；突光鏡 下觀察，拍照。若需保存，于暗濕盒中4°C保存。
[0046] 肝組織細(xì)胞凋亡情況測(cè)定結(jié)果見圖4所示，檢測(cè)了 Mindin-ΚΟ小鼠和野生型小鼠 I/R術(shù)后12小時(shí)肝細(xì)胞凋亡情況。TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)顯示，Mindin-ΚΟ小鼠肝細(xì)胞凋亡 數(shù)量明顯比野生型小鼠降低，Mindin-TG小鼠肝細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯比非轉(zhuǎn)基因小鼠增加，這 表明Mindin與肝細(xì)胞缺血再灌注時(shí)凋亡相關(guān)。這些結(jié)果表明，抑制Mindin表達(dá)可以改善 肝組織缺血再灌注損傷，且可能與肝細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。
[0047] 研究成果表明，Mindin基因敲除小鼠在肝臟缺血再灌注引起的損傷中，小鼠肝臟 壞死面積顯著減少，肝功能明顯改善，肝細(xì)胞凋亡數(shù)量也明顯減少。證明Mindin基因在肝 臟缺血疾病模型中有著重要的惡化作用。
[〇〇48] 上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。 SEQUENCE LISTING 〈110>武漢大學(xué) 〈120〉Mindin基因在肝臟缺血再灌注損傷中的應(yīng)用 <160> 2 <170> Patentln version 3. 3 <210> 1 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial 〈223>上游引物 <400> 1 gaactcgagc caccatggaa aacttgagtc ttgc 34 <210> 2 〈211〉 32 〈212〉 DNA 〈213〉A(chǔ)rtificial 〈223>下游引物 〈400> 2 gaatgcggcc gcttagacgc agttatctgg gg 32
【權(quán)利要求】
1. Mindin作為藥物靶標(biāo)在篩選保護(hù)肝臟功能的藥物中的應(yīng)用。 2. Mindin作為藥物靶標(biāo)在篩選治療肝臟缺血再灌注損傷的藥物中 的應(yīng)用。 3. Mindin的抑制劑在制備保護(hù)肝臟功能的藥物中的應(yīng)用。
4. 一種保護(hù)肝臟功能的藥物，其特征在于：包含Mindin的抑制劑。 5. Mindin的抑制劑在制備治療肝臟缺血再灌注損傷的藥物中的應(yīng)用。
6. -種治療肝臟缺血疾病的藥物，其特征在于：包含Mindin的抑制劑。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3或5所述的應(yīng)用，其特征在于：所述的Mindin的抑制劑優(yōu)選為 Mindin基因的siRNA、Mindin基因的RNA干擾載體或Mindin的抗體及其他能夠抑制Mindin 表達(dá)的抑制劑中的一種。
8. 根據(jù)權(quán)利要求4或6所述的藥物，其特征在于：所述的Mindin的抑制劑優(yōu)選為 Mindin基因的siRNA、Mindin基因的RNA干擾載體或Mindin的抗體及其他能夠抑制Mindin 表達(dá)的抑制劑中的一種。
【文檔編號(hào)】A61K48/00GK104056282SQ201410260263
【公開日】2014年9月24日 申請(qǐng)日期:2014年6月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月11日
【發(fā)明者】李紅良, 王丕曉, 朱麗華 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)