專利名稱：Pkc活化劑單用或與pkc抑制劑聯(lián)用來增強(qiáng)長期記憶的制作方法
PKC活化劑單用或與PKC抑制劑聯(lián)用來增強(qiáng)長期記憶本發(fā)明的優(yōu)先權(quán)本申請(qǐng)要求2005年7月29日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/703,501和2005年10 月21日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/728,753的優(yōu)先權(quán)。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及可用于增強(qiáng)記憶和治療細(xì)胞增生性疾病的上調(diào)和下調(diào)蛋白激酶C的 方法。發(fā)明背景存在各種影響認(rèn)知的病癥和疾病。認(rèn)知過程大致可以被描述成至少包括3個(gè)不 同部分:注意、學(xué)習(xí)和記憶。每個(gè)部分和它們各自的水平均影響對(duì)象認(rèn)知能力的總體 水平。例如，盡管阿耳茨海默病患者會(huì)遭受總體認(rèn)知的喪失，和由此帶來的這些特 征的全部衰退，然而與該疾病最常相關(guān)的卻是喪失記憶。其它疾病的患者則遭受與 其它認(rèn)知特征更顯著相關(guān)的認(rèn)知損傷。例如，注意缺陷型多動(dòng)癥(ADHD)，關(guān)注個(gè)體 保持注意力集中狀態(tài)的能力。其它疾病包括與其它神經(jīng)疾病、衰老和可以對(duì)心智能 力帶來有害影響的必^條件例如癌癥必^^、中風(fēng)/缺血和智力低下有關(guān)的普通癡呆。歷經(jīng)數(shù)十年對(duì)各種記憶案例進(jìn)行研究終于證明了長期記憶需要蛋白質(zhì)的合成。 Agranoff等(1967) Sc,e"ce 158:1600- 1601; Bergold等(1990) Proc.A^L4cac/.S"' 87:3788-3791; Cavallaro等(2002) Prac.AtoL4cW.Sc/. 99:13279-16284; Crow等(1990) iVoc.Ato/Jcac/.Sc/ 87:44卯-4494; Crow等(1999) JA^wra; /z;w.0/. 82:495-500; Epstein 等 (2003) iVewra6/o/.Zeam.Mem. 79:127-131 ; Ezzeddine 等 (2003) Jlewmsd.23:9585-9594; Farley等(1991)/Voc.A^/JcadS".. 88:2016- 2020; Flexner 等(1996) /VocAto/.^cfldSd. 55:369-374 ; Hyden等(1970)尸rac.A^/Jcad&丄 65:898-904; Nelson等(1990)尸rac.A^"o^.Sc/. 87:269- 273; Quattrone等(2001) 尸rac.A^L4o^.&Z. 98:11668-11673; Zhao等(1999)J所o/.C7zem.274:34893隱34902; Zhao 等(2000) FAS￡5 /14:290-300。 Flexner首先揭示了藥物誘導(dǎo)抑制蛋白質(zhì)的合成(如， 用5-丙基尿嘧啶或茴香霉素)，當(dāng)該抑制發(fā)生于訓(xùn)練案例之后的臨界時(shí)間間隔時(shí)，能 阻斷長期記憶。Flexner等(1996)尸roc.Ato/Jc^/.5W. 55:369-374。如果在該臨界時(shí)間窗前或該窗后的任何時(shí)間抑制蛋白質(zhì)的合成，則對(duì)長期記憶沒有影響。然而鞏固記 憶的必需蛋白質(zhì)、它們的調(diào)控機(jī)制和它們對(duì)鞏固長期記憶的作用仍然還是個(gè)謎。已經(jīng)揭示許多物種的長時(shí)相關(guān)記憶的形成依賴于蛋白激酶C(PKC)同工酶易位 和活化到神經(jīng)元膜上。首先，當(dāng)這些PKC同工酶被鈣和輔因子如二酰甘油組合活化 時(shí)，可以使外部神經(jīng)元膜的內(nèi)表面和內(nèi)部細(xì)胞器如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜之間產(chǎn)生穩(wěn)定的聯(lián)系。 采用包括基于巴夫洛夫(Pavlovian)條件反射的家兔瞬膜條件反射(Bank等(1988) /Voc.A^L4cfld.Sc/. 85:1988-1992; Olds等(1989) Sc/ewce 245:866-869)、大鼠的空間迷 宮學(xué)習(xí)(01ds等(1990) JA^mscU0:3707-3713)和大鼠的嗅覺辨別學(xué)習(xí)在內(nèi)的各種哺 乳動(dòng)物相關(guān)學(xué)習(xí)方法揭示了在woZ/z^tZ/ww/M^c/a的單一識(shí)別B類細(xì)胞中發(fā)生PKC 活化(McPhie等(1993) JA^/racAem.60:646-651)。而且，在巴夫洛夫條件反射依賴性 方式中，克萊斯汀(calexcitin)(Nelson等(1990) Sc/e"ce 247:1479-1483)， 一種對(duì)PKC 的a同工酶具有高親和力的物質(zhì)，在單一識(shí)別B類細(xì)胞中的數(shù)量增加和發(fā)生磷酸化 (Kuzirian等(2001) JA^wracj;to/.30:993-1008)。更多證據(jù)表明個(gè)體的PCK同工酶在生物進(jìn)程中起著不同的，有些時(shí)候是相反的 作用，這為藥物開發(fā)提供了兩個(gè)方向。一個(gè)是設(shè)計(jì)PCK的特異性(優(yōu)選同工酶特異性) 抑制劑。由于事實(shí)上催化域并不是主要負(fù)責(zé)PKC同種型特異性的功能域，因此該方 法較為復(fù)雜。另一種方法是開發(fā)具有同工酶選擇性的耙向調(diào)控位點(diǎn)的PKC活化劑。 這樣可以無需考慮具有相反的生物學(xué)作用的其它信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。或者，通過 在劇烈活化后誘導(dǎo)PKC下調(diào)，可以使PKC活化劑產(chǎn)生長時(shí)拮抗作用。進(jìn)行了相關(guān)記憶方法之后，與特異性腦區(qū)中膜部分有關(guān)的PKC的增加會(huì)持續(xù)許 多天(01ds等(1989) ScfMce 245:866- 869)。與這些發(fā)現(xiàn)一致，施用有效的PKC活化劑， 苔蘚抑素，能增強(qiáng)大鼠的空間迷宮學(xué)習(xí)(Sun等(2005)5w^尸/2wwaco/.512: 45-51)。而 且，用PKC活化劑，苔蘚抑素，進(jìn)行的臨床試驗(yàn)表明(Marshall等(2002) Omcer所o/ogy c& 7T^rap;; l:409-416)通過間歇安排藥物遞送可能可以增強(qiáng)PKC的活性作用。一種 PKC活化劑，苔蘚抑素，它是一種大環(huán)內(nèi)酯，能夠活化亞毫微摩爾濃度的PKC(Talk 等(l999) A^"ra6fo/丄eflm.Mem.72:95- 117)。像佛波酯(phorbol esters)和內(nèi)源性活化劑 DAG—樣，苔蘚抑素可以結(jié)合到PKC的C1域，使它易位到膜上，然后被下調(diào)。為了以已知能使PKC最初活化然后下調(diào)延長的劑量(25-120^ig/m"來必，癥已 經(jīng)在人體內(nèi)對(duì)非致瘤性PKC活化劑，苔蘚抑素，進(jìn)行了廣泛的試驗(yàn)(Prevostel等(2000) ■7ow"a/o/Ce〃&〖ewe 113:2575-2584; Lu等(1998) Mo/.5fo/.Ce〃. 8:839-845; Leontieva 等(2004) /5/o/.C/zem.279:5788-5801)。近來還顯示PKC活化劑苔蘚抑素能夠活化切7割淀粉樣前蛋白(APP)的a分泌酶，而在人成纖維細(xì)內(nèi)產(chǎn)生無毒可溶性前蛋白部分 (sAPP)(Etcheberrigaray等(2004) /Voc.Ato/. Jcad&U01:11141- 11146)。苔蘚抑素還能 增強(qiáng)大鼠對(duì)空間迷宮任務(wù)的學(xué)習(xí)和記憶能力(Sun等(2005) ￡w"/Vzarmaco/.512:45-51)，家兔瞬膜案例中的學(xué)習(xí)能力(Schreurs和Alkon，未發(fā)表) 和初步研究報(bào)告中的海蛞蝓(//enm;we"c/a)條件反射(Scioletti等(2004) 萬/0/.&//.207:159)。因此，PKC的最佳活化在正常和疾病狀態(tài)下對(duì)影響認(rèn)知的許多分 子機(jī)制而言是重要的。因?yàn)闆]有下調(diào)難以獲得PKC的上調(diào)，反之亦然，于是需要能夠上調(diào)PKC而使 下調(diào)最小化的方法來增強(qiáng)所觀察到的與PKC活化有關(guān)的認(rèn)知效果。本發(fā)明的方法和 組合物可以滿足這些需要，它會(huì)大大改善對(duì)于阿耳茨海默病和其它神經(jīng)退化疾病的 臨床必^^果，以及預(yù)防性地提供了改善的認(rèn)知增強(qiáng)作用。還提供了通過調(diào)節(jié)a分 泌酶來必激W或增強(qiáng)認(rèn)知狀況的方法和組合物。發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種方法，它用蛋白激酶C(PKC)活化劑接觸蛋白激酶C來刺激鞏固 長期記憶所需的蛋白質(zhì)的合成。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述PKC活化劑是大環(huán)內(nèi)酯。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述 PKC活化劑是苯并內(nèi)酰胺(benzolactam)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述PKC活化劑是吡 咯垸酮(pyrrolidinone)。在優(yōu)選實(shí)施方式中，所述大環(huán)內(nèi)酯是苔蘚抑素。在更優(yōu)選實(shí) 施方式中，所述苔蘚抑素是苔蘚抑素-1、 -2、 -3、 -4、 -5、 -6、 -7、 -8、 -9、 -10、 -11、 -12、 -13、 -14、 -15、 -16、 -17或-18。在最優(yōu)選實(shí)施方式中，所述苔蘚抑素是苔蘚抑 素-1。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述大環(huán)內(nèi)酯是納瑞絲特汀(neristatin)。在優(yōu)選實(shí)施方式中， 所述納瑞絲特汀是納瑞絲特汀-1 。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述接觸活化PKC。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述接觸使PKC 數(shù)量增加。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述接觸使PKC合成增加。在一個(gè)實(shí)施方式中，所 述接觸使克萊斯汀(calexcitin)的數(shù)量增加。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述接觸基本上不會(huì) 引起PKC異常(deregulation)。在一個(gè)實(shí)施方式中，重復(fù)所述接觸。在另一實(shí)施方式中，規(guī)律地、間歇性地重 復(fù)所述接觸。在另一實(shí)施方式中，間歇間隔為1周-1個(gè)月、1天-1周、或少于1-24 小時(shí)。在另一實(shí)施方式中，所述間隔為1周-1個(gè)月。在另一實(shí)施方式中，所述間隔 為1天-1周。在另一實(shí)施方式中，所述間隔為少于1-24小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方式中，在一固定期間內(nèi)維持所述接觸。在另一實(shí)施方式中，所述固定期間為少于24小時(shí)。在另一實(shí)施方式中，所述固定期間為少于12小時(shí)。在另 一實(shí)施方式中，所述固定期間為少于6小時(shí)。在另一實(shí)施方式中，所述固定期間為 少于6小時(shí)。在另一實(shí)施方式中，所述固定期間為少于4小時(shí)。在另一實(shí)施方式中， 所述固定期間為少于2小時(shí)。在優(yōu)選實(shí)施方式中，所述固定期間約為l-12小時(shí)。在 更優(yōu)選實(shí)施方式中，所述固定期間約為2-6小時(shí)。在最優(yōu)選實(shí)施方式中，所述固定期 間約為4小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方式中，在一段多于1天的期間內(nèi)重復(fù)所述接觸。在另一實(shí)施方式 中，在1天-1個(gè)月的期間內(nèi)重復(fù)所述接觸。在另一實(shí)施方式中，在1天-1周的期間 內(nèi)重復(fù)所述接觸。在另一實(shí)施方式中，在1周-1個(gè)月的期間內(nèi)重復(fù)所述接觸。在另 一實(shí)施方式中，在l-6個(gè)月的期間內(nèi)重復(fù)所述接觸。在另一實(shí)施方式中，在l個(gè)月的 期間內(nèi)重復(fù)所述接觸。在另一實(shí)施方式中，在多于l個(gè)月的期間內(nèi)重復(fù)所述接觸。 本發(fā)明涉及一種用蛋白激酶C接觸PKC活化劑來下調(diào)PKC的方法。 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述PKC活化劑是大環(huán)內(nèi)酯。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述 PKC活化劑是苯并內(nèi)酰胺(benzolactam)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述PKC活化劑是吡 咯烷酮(pyrrolidinone)。在優(yōu)選實(shí)施方式中，所述大環(huán)內(nèi)酯是苔蘚抑素。在更優(yōu)選實(shí) 施方式中，所述苔蘚抑素是苔蘚抑素-1、 -2、 -3、 -4、 -5、 -6、 -7、 -8、 -9、 -10、 -11、 -12、 -13、 -14、 -15、 -16、 -17或-18。在最優(yōu)選實(shí)施方式中，所述苔蘚抑素是苔蘚抑 素-1。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述大環(huán)內(nèi)酯是納瑞絲特汀。在優(yōu)選實(shí)施方式中，所述納 瑞絲特汀是納瑞絲特汀-1。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述接觸不會(huì)刺激PKC合成。在另一實(shí)施方式中，所述接 觸基本上不會(huì)刺激PKC合成。在另一實(shí)施方式中，所述接觸使PKC數(shù)量減少。在另 一實(shí)施方式中，所述接觸使PKC數(shù)量大幅減少。在另一實(shí)施方式中，所述接觸不會(huì) 刺激克萊斯汀的合成。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述接觸持續(xù)一段期間。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述持續(xù)期 間為少于1小時(shí)至24小時(shí)。在另一實(shí)施方式中，所述持續(xù)期間為1天-1周。在另一 實(shí)施方式中，所述持續(xù)期間為1周-1個(gè)月。在另一實(shí)施方式中，所述持續(xù)時(shí)間為少 于1小時(shí)至12小時(shí)。在另一實(shí)施方式中，所述持續(xù)期間為少于1小時(shí)至8小時(shí)。在 另一實(shí)施方式中，所述持續(xù)期間為少于1小時(shí)至4小時(shí)。在優(yōu)選實(shí)施方式中，所述 持續(xù)時(shí)間約為4小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述接觸能引起PKC的持續(xù)下調(diào)。本發(fā)明涉及一種用蛋白激酶C(PKC)活化劑接觸蛋白激酶C來刺激鞏固長期記 憶所需蛋白質(zhì)合成的方法，還包括抑制PKC降解的步驟。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述降解是通過泛素化作用發(fā)生的。在另一實(shí)施方式中， 用乳胱素抑制所述降解。在另一實(shí)施方式中，所述PKC來自人。本發(fā)明涉及一種用蛋白激酶C接觸PKC活化劑以刺激鞏固長期記憶所需蛋白質(zhì) 合成的方法，其中提供了含有PKC活化劑和藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體的藥物組合物形 式的PKC活化劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述藥物組合物還含有PKC抑制劑。在另一實(shí)施方式中， 所述PKC抑制劑是在外周組織中抑制PKC的化合物。本文所用的"外周組織"是指 除腦以外的組織。在另一實(shí)施方式中，所述PKC抑制劑是偏性于外周組織中抑制PKC 的化合物。在另一實(shí)施方式中，所述PKC抑制劑是一種能夠緩解PKC活化劑給藥相 關(guān)肌痛的化合物。在另一實(shí)施方式中，所述PKC抑制劑是一種能夠在PKC活化劑受 治個(gè)體中緩解肌痛的化合物。在另一實(shí)施方式中，所述PKC抑制劑是一種能夠提高 PKC活化劑耐受劑量的化合物。具體而言，PKC抑制劑包括，例如，但不限于維 生素E、維生素E類似物，以及它們的鹽；鈣感光蛋白C;噻唑烷二酮類；羅伯斯特 瑞(mboxistaurin)，及它們的組合。本文所用的"維生素E"是指a-生育酚(5、 7、 8-三甲基生育酚)；P-生育酚(5、 8-二甲基生育酚；s-生育酚(8-甲基生育酚)；和y-生育 酚(7,8-二甲基生育酚)，以及它們的鹽和類似物。附圖簡要說明

圖1描述了苔蘚抑素對(duì)獲得長期記憶的影響，該圖顯示，經(jīng)亞優(yōu)訓(xùn)練的動(dòng)物在 接受苔蘚抑素后均表現(xiàn)為獲得了長期記憶。圖2描述了苔蘚抑素對(duì)獲得長期記憶的影響，該圖顯示，用或不用苔蘚抑素， 隨機(jī)進(jìn)行光照和旋轉(zhuǎn)未產(chǎn)生條件反應(yīng)。圖3描述了苔蘚抑素對(duì)獲得長期記憶的影響，該圖顯示，使動(dòng)物連續(xù)兩天接觸 苔蘚抑素4小時(shí)，然后在第3天進(jìn)行2次訓(xùn)練(TE)，動(dòng)物表現(xiàn)出獲得了至少6天的長 期記憶。圖4描述了苔蘚抑素對(duì)獲得長期記憶的影響，該圖顯示，使動(dòng)物連續(xù)三天接觸 苔蘚抑素4小時(shí)，然后在第4天進(jìn)行2次訓(xùn)練(TE)，動(dòng)物表現(xiàn)出獲得了至少96天的 長期記憶。圖5描述了苔蘚抑素對(duì)獲得長期記憶的影響，該圖顯示，接觸苔蘚抑素8-20小時(shí)，然后進(jìn)行2次TE不足以獲得與接觸苔蘚抑素4小時(shí)所得相當(dāng)?shù)挠洃?。圖6描述了苔蘚抑素對(duì)獲得長期記憶的影響，該圖顯示，接觸濃度超過1.0ng/ml 的苔蘚抑素抑制長期記憶的獲得。圖7描述了苔蘚抑素和茴香霉素對(duì)獲得長期記憶的影響，該圖顯示，單次接觸 苔蘚抑素4小時(shí)，加上2次TE能產(chǎn)生持續(xù)數(shù)小時(shí)的長期記憶，而在接觸苔蘚抑素時(shí) 存在茴香霉素則會(huì)完全消除這種記憶。圖8描述了苔蘚抑素和乳胱素的影響，該圖顯示，乳胱素將單次接觸苔蘚抑素(接 著進(jìn)行2次TE)所產(chǎn)生的短時(shí)記憶轉(zhuǎn)變?yōu)槌掷m(xù)許多天的長期記憶。圖9描述了 PKC活化對(duì)克萊斯汀的影響。圖10a描述了苔蘚抑素和訓(xùn)練對(duì)克萊斯汀免疫染色的影響。本圖顯示，在B細(xì) 胞中，克萊斯汀隨著訓(xùn)練數(shù)的增加而增加。圖10b通過免疫染色顯示苔蘚抑素單獨(dú)對(duì)克萊斯汀的影響。圖lla顯示了連續(xù)兩天接觸苔蘚抑素4小時(shí)并在24小時(shí)候后進(jìn)行2次訓(xùn)練對(duì)克 萊斯汀強(qiáng)度的影響。該圖顯示，連續(xù)兩天接觸苔蘚抑素4小時(shí)并在24小時(shí)候后進(jìn)行 2次訓(xùn)練才能將克萊斯汀水平提高到鞏固長期記憶所需的量。圖lib描述了接觸苔蘚抑素后加入茴香霉素對(duì)克萊斯汀的影響。本圖顯示了在2 TE加3天4小時(shí)接觸苔蘚抑素后加入茴香霉素未減少克萊斯汀的免疫染色。圖12顯示據(jù)細(xì)胞質(zhì)中組蛋白磷酸化檢測(cè)，重復(fù)的4小時(shí)苔蘚抑素接觸對(duì)PKC 活性的影響。本圖顯示，連續(xù)兩天接觸苔蘚抑素使PKC活性顯著高于對(duì)照或基線水 平。圖13顯示據(jù)細(xì)胞膜中組蛋白磷酸化檢測(cè)，重復(fù)的4小時(shí)苔蘚抑素接觸對(duì)PKC 活性的影響。本圖顯示連續(xù)兩天接觸苔蘚抑素使PKC活性顯著高于對(duì)照或基線水平。圖14描述了茴香霉素對(duì)PKC活性的影響。本圖顯示，連續(xù)三天接觸苔蘚抑素 的過程中每天存在茴香霉素降低細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中的PKC活性。圖15描述了苔蘚抑素對(duì)海馬神經(jīng)元中的膜-結(jié)合PKC的影響。本圖顯示，使培 育的海馬神經(jīng)元接觸單劑活化劑量的苔蘚抑素(0.28艦)30分鐘導(dǎo)致短期的PKC從胞 液質(zhì)易位到顆粒部分(約60%),及此后長期的下調(diào)。第一次接觸后再次接觸長達(dá)4小 時(shí)使單次接觸苔蘚抑素4小時(shí)后發(fā)生的下調(diào)顯著減弱。圖16描述了重復(fù)接觸苔蘚抑素對(duì)PKC活性的影響。本圖顯示，延遲2-4小時(shí) 后進(jìn)行第二次接觸消除了單次接觸苔蘚抑素30分鐘所產(chǎn)生的顯著下調(diào)，如果第一次 接觸后延遲4小時(shí)再進(jìn)行第二次，則活性增加到基線之上，并顯著高于2小時(shí)或更短時(shí)間之后進(jìn)行第二次接觸所得水平。圖17描述了苔蘚抑素對(duì)蛋白質(zhì)合成的作用。使大鼠IGF-IR細(xì)胞接觸0.28nM苔 蘚抑素30分鐘，培育l-79小時(shí)。然后將["S]甲硫氨酸(9.1pCi)加入培養(yǎng)液，然后分 析放射標(biāo)記物。據(jù)收集神經(jīng)元前最后半小時(shí)內(nèi)的"S-甲硫氨酸摻入檢測(cè)，單次接觸 0.28nM苔蘚抑素30分鐘，在接觸后24小時(shí)內(nèi)總體蛋白質(zhì)合成提高了了 20%， 79小 時(shí)內(nèi)提高了60%，但當(dāng)同時(shí)存在PKC抑制劑Ro-32時(shí)，提高幅度顯著降低。發(fā)明詳述l.定義本文所用的"上調(diào)"是指通過各種機(jī)制(包括但不限于增加轉(zhuǎn)錄、翻譯和/或提 高轉(zhuǎn)錄物或蛋白質(zhì)產(chǎn)物的穩(wěn)定性)而相比于基線狀態(tài)增加某種物質(zhì)如PKC蛋白或轉(zhuǎn) 錄物的數(shù)量或提高其活性。本文所用的"下調(diào)"是指通過各種機(jī)制(包括但不限于減少轉(zhuǎn)錄、翻譯和/或降 低轉(zhuǎn)錄物或蛋白質(zhì)產(chǎn)物的穩(wěn)定性)而相比于基線狀態(tài)減少某種物質(zhì)如PKC蛋白或轉(zhuǎn) 錄物的數(shù)量或降低其活性。本文采用的術(shù)語"藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體"是指活性成分可與之組合，且組合 后可用來將活性成分施用到個(gè)體的化學(xué)組合物、化合物或溶劑。本文所用的"藥學(xué) 上可接受的運(yùn)載體"包括但不限于一種或多種以下物質(zhì)賦形劑；表面活性劑；分 散劑；惰性稀釋劑；?；瘎┖捅澜鈩?；結(jié)合劑；潤滑劑；防腐劑；可生理降解的組 合物如明膠；水性載體和水性溶劑；油性載體和油性溶劑；懸浮劑；分散劑或濕潤 劑；乳化劑，緩和劑(demulcent);緩沖液；鹽類；增稠劑；填充劑；抗氧化劑；穩(wěn)定 劑；和藥學(xué)上可接受的多聚或疏水材料和本領(lǐng)域已知的和有記載的其它成分，例如 全文納入本文做參考的Genaro編(1985)的國賓夕法尼亞州伊斯頓市的馬克出版公司 (Mack Publishing Co.)出版的《雷明頓藥物科學(xué)(i em/wgtow's P/z"mjacew"cfl/Sc/ewces」》 中記載的那些?？梢杂盟幬飳W(xué)領(lǐng)域各種已知的或今后的方法制備本文所述藥物組合物制劑。通常，這種制備方法包括將活性成分與運(yùn)載體或一種或多種其它助劑組合的步驟，然 后，如果必須或需要，將該產(chǎn)物成形或包裝成所需的單劑單位或多劑單位。盡管本文所述的藥物組合物主要是指適于人用的藥物組合物，技術(shù)人員應(yīng)該理 解這種組合物一般說來適用于各種動(dòng)物。如何使所述組合物適用于各種動(dòng)物而對(duì)適 于人用的藥物組合物作出改變是本領(lǐng)域所熟知的，普通獸藥學(xué)家即使需要也僅需要 進(jìn)行普通實(shí)驗(yàn)就可以設(shè)計(jì)和完成這類改變。據(jù)信，可以施用本發(fā)明藥物組合物的個(gè)體包括但不限于人及其它靈長類和其它哺乳動(dòng)物。2.阿耳茨海默病阿耳茨海默病與腦中的特異性神經(jīng)元亞群大量損傷有關(guān)的，其普遍癥狀為喪失 記憶。(Katzman(1986)A^wi:"g/a^/Jow77o/o/Me&c/"e 314:964)。阿耳茨海默病的特 點(diǎn)是神經(jīng)病理性改變。然而，已報(bào)道的外周組織異常支持了這樣一種可能性，就是 阿耳茨海默病是一種最顯著表現(xiàn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變的全身性疾病。(Connolly(1998) 一祭遂，77/^Co/.19:171-77)。將阿耳茨海默病與遺傳起源和染色體1、 14和21相聯(lián)系 的論述參見St.George-Hyslop等(1987)Sc/e"ce 235:885; Tanzi等^"述，A^wo6/o/ogv q/Xfoeaw 3:159-168; Hardy(1996)^"aiVewra/&""^譜/^ 165:13-17。對(duì)個(gè)體患上阿耳茨海默病的定義是進(jìn)行性記憶損傷，失語和視覺空間技能和行 為不足(McKhann等(1986)7Vewo/ogy 34:939-944)?；加邪⒍暮Ｄ〉膫€(gè)體的認(rèn)知受 損是由位于大腦皮層、海馬、基底前腦和其它腦區(qū)的神經(jīng)元細(xì)胞退化所造成的。對(duì)尸體解剖獲得的阿耳茨海默病患者大腦進(jìn)行的組織學(xué)分析證明了在退化神經(jīng)元的核 周體和軸突中、胞外神經(jīng)炎性(老年性)斑和受影響腦區(qū)的一些血管內(nèi)壁和周圍的淀粉樣斑中均存在神經(jīng)元纖維纏結(jié)(NFT)。神經(jīng)元纖維纏結(jié)是含有以螺旋型配對(duì)的纖維(直 徑約10nm)的異常纖維樣結(jié)構(gòu)，因此也稱為成對(duì)螺旋纖維。神經(jīng)炎性斑位于退化的神 經(jīng)末梢(包括軸突和樹突)，含有淀粉樣蛋白纖維的主要化合物?？傊?，阿耳茨海默病 的特點(diǎn)是具有某些神經(jīng)病理特征，包括胞內(nèi)神經(jīng)元纖維纏結(jié)，主要由細(xì)胞骨架蛋白 和胞外薄壁組織和腦血管淀粉樣蛋白組成。此外，本領(lǐng)域目前已經(jīng)有辦法區(qū)分阿耳 茨海默病患者、正常的老年人和其它神經(jīng)退化疾病如帕金森癥、亨廷頓氏舞蹈病、 韋尼克-科爾薩科夫綜合征(Wemicke-Korsakoff)或精神分裂癥的患者，在美國專利 5,580,748和美國專利6,080,582中有進(jìn)一步的舉例描述。盡管引起神經(jīng)元損傷的細(xì)胞改變和疾病的根本病因仍在研究中，但已確證了 APP代謝具有重要性。在阿耳茨海默病患者的腦中被始終確定為對(duì)腦生理學(xué)或病理 生理學(xué)有作用的兩種蛋白質(zhì)是p-淀粉樣蛋白和t。(參見Selkoe(2001)尸/〖戸/o/og/ca/ i^Wev^.81:2)。有關(guān)P-淀粉樣蛋白代謝缺陷和異常鈣穩(wěn)態(tài)和/或鈣活化激酶的論述。 (Etcheberrigaray等^/z/ze^eA及eporfe第3、 5禾Q 6巻第305-312頁；Webb等(2000) Br他/z Jowtuj/ o/P/zflT-maco/ogy 130:1433-52)。阿耳茨海默病(AD)是一種腦病，其特點(diǎn)為蛋白質(zhì)分解代謝發(fā)生變化。蛋白質(zhì)磷 酸化改變與阿耳茨海默病患者中發(fā)現(xiàn)的胞內(nèi)形成神經(jīng)元纖維纏結(jié)有關(guān)。淀粉樣前體 蛋白質(zhì)(APP)的加工處理產(chǎn)生的片段，之后聚集形成作為阿耳茨海默病(AD)特征的淀粉樣沉淀片段，稱為老年斑或AD斑。阿耳茨海默病的主要病理特征是斑塊內(nèi)有淀 粉樣蛋白質(zhì)沉淀。因此，APP加工處理是AD的早期和關(guān)鍵的病理生理學(xué)事件。已確定存在3種APP加工處理途徑。前文術(shù)語"正常"加工處理包括在AP序 列的Lysl6殘基位點(diǎn)(或在Lysl6和Leul7之間；APP770命名法)處切割A(yù)PP的酶的參 與，得到非促淀粉樣變片段大的N-末端外功能區(qū)和小的9kDa膜結(jié)合片段。所述 酶，尚有待完卻確定，稱為a-分泌酶。還有另外兩種分泌酶可以參與APP的加工處 理。 一種或選途徑包括在AP功能域外的Met671和Asp672位點(diǎn)之間切割A(yù)PP(用(3-分泌酶)和內(nèi)體-溶酶體(endosomal-lysomal)系統(tǒng)的參與。另一個(gè)切割位點(diǎn)發(fā)生在A(3 段的羧基末端，質(zhì)膜內(nèi)A(3肽的第39位氨基酸之后。該分泌酶(力的作用產(chǎn)生了含有 A(3全序列和6kDa細(xì)胞關(guān)聯(lián)片段的胞外氨基酸末端。因此，經(jīng)過p和Y分泌酶的加 工處理，產(chǎn)生了因?yàn)楹蠥P全序列而成為的潛能促淀粉樣變片段。多條證據(jù)鏈顯示 所有或選途徑均可發(fā)生于同一個(gè)給定系統(tǒng)，可溶性A(3可以是"正常產(chǎn)物"。然而， 仍然有證據(jù)表明CSF和血漿中的循環(huán)A|3的數(shù)量在帶有"瑞典人(Swedish)"突變的 患者中升高了。而且，用該突變或APP717突變轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)細(xì)胞分泌更多的A(3。最 近，揭示了其它APP突變和PS1和PS2突變的攜帶者可以分泌出更多的特定形式的 長(42-43氨基酸)片段AP。因此，盡管在正常情況下所有或選途徑均可能發(fā)生，在家族性和可能的散發(fā)性 AD中出現(xiàn)了促進(jìn)促淀粉樣變加工的失衡。這些增強(qiáng)的促淀粉樣變途徑最終導(dǎo)致AD 患者腦中形成纖維和斑塊。因此，促進(jìn)非促淀粉樣變、(X-分泌酶途徑的干預(yù)能夠有效 地將APP加工平衡轉(zhuǎn)向據(jù)信為非致病性的、增加APP比之可能有毒的AP肽的相對(duì) 數(shù)量的加工。所述PKC同工酶提供了一種關(guān)鍵的、特異的限速分子靶點(diǎn)，由此可以闡明生物 化學(xué)、生物物理學(xué)和行為效力之間的獨(dú)特關(guān)聯(lián)并應(yīng)用這種關(guān)聯(lián)來改善認(rèn)知能力。此外，就正常和異常記憶而言，已經(jīng)證明K+和Ca^通道均對(duì)記憶儲(chǔ)存和記憶復(fù) 蘇起著關(guān)鍵的作用。例如，已發(fā)現(xiàn)在記憶儲(chǔ)存過程中鉀通道會(huì)變化。(Etcheberrigaray 等(1992) iVoc.A^/. Jcaaf.Sc/. 89:7184; Sanchez-Andres等(1991) Jowma/ 。/Wewo6/ofogy 65:796; Collin等(1988) 5/op/z;w." Jowr"a/ 55:955; Alkon等(1985) 5e/zav/ora/ cmd Wewra/說'o/ogy 44:278; Alkon(1984) 5"c/ewce 226:1037)。該觀察結(jié)果，結(jié)合阿耳茨海 默病患者中幾乎都會(huì)發(fā)生的失憶癥狀，使我們開始對(duì)可能是阿耳茨海默病一病理位 點(diǎn)的鉀通道功能和PKC調(diào)控對(duì)認(rèn)知的影響展開研究。3.蛋白激酶C和阿耳茨海默病已經(jīng)確定，PKC是最大的非受體絲氨酸-蘇氨酸蛋白質(zhì)激酶基因家族之一。自從Nishizuka和同事們?cè)诎耸甏缙谟嘘P(guān)PKC的發(fā)現(xiàn)(Kikkawa等(1982) J5/o/.C/2em. 257:13341)和將它確定為佛波酯的主要受體(Ashendel等(1983) Omc^7 仏，43:4333) 以來，已經(jīng)有了許多關(guān)于該酶的生理學(xué)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制的描述。人們對(duì)PKC的如此強(qiáng) 烈的興趣源于其可以被鈣和二酰甘油(和它的佛波酯模仿物)體外活化這一獨(dú)特能力， 二酰甘油是一種效應(yīng)物，它的形成與生長因子和分化因子作用下的磷脂轉(zhuǎn)變相偶聯(lián)。 目前，所述PKC基因家族由11種基因組成，將它們分成4個(gè)亞組l)典型性 PKCa、 ^、 P2(卩i和(32是同一種基因的不同拼接形式)和Y， 2)新型PKCS、 s、 n和9， 3)非典型性PKC;、 x、 t！禾n t禾n 4)PKQi。 PKCp類似于新型PKC同工型，差別在于 它具有假定的跨膜區(qū)(綜述參見Blohe等(1994) Ca"cer MetoW./ ev.l3:411;Hug等(1993) 291 :329; Kikkawa等(1989)」"".i ev.及oc/2em. 58:31)。 a、 p。 p2和y同工 型是Ca2、磷脂和二酰甘油依賴型，代表了典型的PKC同工型，而其它同工型均受 磷脂和二酰甘油的活化卻不依賴于CA^。所有同工型均包含5個(gè)可變(V1-V5)區(qū)，a、 |3、 y同工型含有4個(gè)(Cl-C4)高度保守的結(jié)構(gòu)域。除PKCa、 P和y以外的所有同工 型均缺乏C2區(qū)，x、 t!和同工型還缺乏C1內(nèi)結(jié)合二酰甘油的兩個(gè)富含半胱氨酸的鋅 指區(qū)中的九個(gè)。Cl區(qū)還含有在所有同工型中均高度保守的偽底物序列，其通過阻斷 底物結(jié)合位點(diǎn)產(chǎn)生無活性的酶構(gòu)象而起著自身調(diào)節(jié)功能(House等，(1987) Sc/ence 238:1726)。因?yàn)榫哂羞@些結(jié)構(gòu)特征，不同的PKC同工型在應(yīng)答生理學(xué)刺激的信號(hào)傳導(dǎo) (Nishizuka (1989) Ca"cw 10:1892)，以及在致瘤性轉(zhuǎn)化和分化中(Glazer (1994)《蛋白 激酶C(/Voto'"ii:/"aye C)》J.F.Kuo編，牛津大學(xué)出版社(1994)第171-198頁)具有高度 特異性的作用。關(guān)于已知的PKC調(diào)節(jié)劑的討論參見PCT/US97/08141、美國專利號(hào) 5,652,232; 6，043,270; 6,080,784; 5,891,906; 5,962,498; 5，955，501; 5,891,870禾口 5,962,504。鑒于PKC在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著主要作用，據(jù)證明PKC是調(diào)控APP加工的激活靶 點(diǎn)。已經(jīng)確證PKC參與APP加工。已經(jīng)揭示，例如佛波酯能顯著增加通過PKC活 化分泌的非促淀粉樣變可溶性APP(sAPP)的相對(duì)量。然而，用佛波酯活化PKC看起 來無法使APP分子直接磷酸化。不考慮作用的精確位點(diǎn)，佛波醇誘導(dǎo)的PKC活化能 增強(qiáng)或促進(jìn)a-分泌酶，非促淀粉樣變途徑。因此，PKC活化有望作為影響無害sAPP 的產(chǎn)生，甚至產(chǎn)生有益sAPP且同時(shí)減少Ap肽相對(duì)量的方法。然而，由于佛波酯具 有腫瘤促進(jìn)活性，因而不是最終進(jìn)行藥物研發(fā)的合適化合物。(Ibarreta等(1999)A^wrai e; oW第10巻，第5和6號(hào)，第1034-40頁)。本發(fā)明人還觀察到蛋白激酶C的活化促進(jìn)阿耳茨海默病(AD)患者淀粉樣進(jìn)行前 體蛋白質(zhì)(APP)的a-分泌酶加工，由此產(chǎn)生非促淀粉樣變可溶性APP(sAPP)。結(jié)果減 少促淀粉樣變AM。和Am2(3)的相対分泌量。這一點(diǎn)尤其重要，因?yàn)槌衫w維細(xì)胞和其 它表達(dá)APP和早老素AD突變的細(xì)胞的總A)3分泌量和/或Am2(3)/Al40的比值增加。 有趣的是，在AD患者腦中(a和|3同工型)和AD患者的成纖維細(xì)胞中(a-同工型)均發(fā) 現(xiàn)PKC缺乏。研究表明對(duì)a、 |3和Y同工型選擇性增強(qiáng)的其它PKC活化劑(即苯并內(nèi)酰胺)能增 強(qiáng)sAPP分泌使之超過基線水平。經(jīng)苯并內(nèi)酰胺處理的AD細(xì)胞的sAPP分泌也略高 于經(jīng)苯并內(nèi)酰胺處理的成纖維細(xì)胞對(duì)照，僅在用10)iMBL處理后才出現(xiàn)顯著的sAPP 分泌增加。據(jù)進(jìn)一步報(bào)道，十字孢堿(一種PKC抑制劑)能夠消除苯并內(nèi)酰胺對(duì)對(duì)照 和AD成纖維細(xì)胞的影響，而相關(guān)化合物還在PC12細(xì)胞中引起~3-倍的sAPP分泌。 本發(fā)明發(fā)明人發(fā)現(xiàn)用苔蘚抑素作為PKC活化劑來促進(jìn)非促淀粉樣變APP加工沒有腫 瘤促進(jìn)作用且已在II期臨床試驗(yàn)階段，因而極具治療價(jià)值。阿耳茨海默病(AD)患者的成纖維細(xì)胞中的變化包括PKC的變化，以及鈣調(diào)和鉀 (K+)通道的變化。據(jù)檢測(cè)TEA-誘導(dǎo)的[Ca^]增加顯示，已經(jīng)表明PKC活化能夠恢復(fù) 正常的K+通道功能。進(jìn)一步的膜片鉗數(shù)據(jù)證實(shí)了 PKC活化劑對(duì)113psK+通道活性恢 復(fù)的作用。因此，基于PKC活化劑來恢復(fù)K+通道已被確立為研究AD病理生理學(xué)的 方法之一，它為AD治療提供了有價(jià)值的模型。(參見，審理中的美國申請(qǐng)序列號(hào) 09/652,656，以其全文納入本文作為參考。)特別有意義的是刺激PKC的大環(huán)內(nèi)酯類(即苔蘚抑素類和納瑞絲特汀類)。在苔 蘚抑素類化合物中，已經(jīng)顯示苔蘚抑素-1能活化PKC，而且被證明沒有促腫瘤活性。 苔蘚抑素-1，作為一種PKC活化劑，還由于其具有雙相的劑量反應(yīng)曲線而特別有用。 此外，還證實(shí)苔蘚抑素-l能夠差異調(diào)控PKC同工型，包括PKCa、 PKC5和PKCs。 已經(jīng)在動(dòng)物和人身上對(duì)苔蘚抑素-1進(jìn)行了毒性和安全性的研究，并且正作為抗癌藥 被廣泛研究。用苔蘚抑素-l進(jìn)行的研究確定，其對(duì)人的主要副作用是肌痛，因此最大 劑量限制在40mg/m、本發(fā)明釆用濃度為O.lnM的苔蘚抑素-1大大增加了 sAPP的分 泌。將苔蘚抑素-1與單獨(dú)載體和另一種PKC活化劑苯并內(nèi)酰胺(BL)(高10,000倍的 濃度)進(jìn)行了比較。目前正在對(duì)苔蘚抑素作為抗癌藥進(jìn)行臨床試驗(yàn)。已知苔蘚抑素會(huì) 結(jié)合PKC的調(diào)控區(qū)并活化該酶。苔蘚抑素是PKC的同工型選擇性活化劑之一。已經(jīng) 發(fā)現(xiàn)除了苔蘚抑素以外還有其它化合物能調(diào)控PKC。(參見例如，W097/43268;以其全文納入本文作參考)。大環(huán)內(nèi)酯類，尤其是苔蘚抑素-1可參見美國專利4,560,774 (以其全文納入本文 作為參考)。大環(huán)內(nèi)酯類和它們的衍生物在本領(lǐng)域的其它地方有所描述，例如美國專 利6,187,568、美國專利6,043,270、美國專利5,393,897、美國專利5,072,004、美國 專利5,196,447、美國專利4,833,257和美國專利4，611,066(均以其全文納入本文作參 考)。上述專利描述了大環(huán)內(nèi)酯類的各種化合物和各種用途，包括它們的消炎用途或 作為抗腫瘤藥的用途。關(guān)于苔蘚抑素類化合物的其它討論參見Szallasi等(1994)在 NIH 3T3成纖維細(xì)胞中苔蘚抑素1和佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-醋酸鹽對(duì)蛋白激酶C 同工型的差異調(diào)控(Differential Regulation of Protein Kinase C Isozymes by Bryostatin 1 and Phorbol 12-Myristate 13-Acetate in NIH 3T3 Fibroblasts), Jowrwa/ o/ C/2em/^7 269(3):2118-24; Zhang等(1996)蛋白激酶C的活化劑，天然產(chǎn)物抗癌藥苔 蘚抑素1的臨床前藥理學(xué)(Preclinical Pharmacology of the Natural Product Anticancer Agent Bryostatin 1， an Activator of Protein Kinase C)， C朋cer i e"arcA 56:802-808; Hennings等(1987)蛋白激酶C的活化劑，苔蘚抑素1，抑制佛波酯對(duì)SENCAR小鼠 皮膚腫瘤的促進(jìn)作用(Bryostatin 1， an Activator of Protein Kinase C， inhibits tumor promotion by phorbol esters in SENCAR mouse skin)， Ga7r/"oge"e57S 8(9): 1343-46; Varterasian等(2000)苔蘚抑素1對(duì)復(fù)發(fā)的低度非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴細(xì)胞性白 血病患者的II期試驗(yàn)(Phase II Trial of Bryostatin 1 in Patients with Relapse Low隱Grade Non-Hodgkin，s Lymphoma and Chronic Lymphocytic Leukemia) ， C7/"/ca/ Cawcer ^searc/z 6:825-28;和Mutter等(2000)綜述文章苔蘚抑素的化學(xué)和臨床生物學(xué) (Review Article:Chemistry and Clinical Biology of the Bryostatins)， 說oorg顯'c cS: MeAc/^z/ CTz^n/W^ 8:1841-1860 (均以其全文納入本文作參考)。肌痛是限制PKC活化劑的耐受劑量的主要副作用。例如，在使用苔蘚抑素-1的 II期臨床試驗(yàn)中，據(jù)報(bào)道，10-87。/。的患者發(fā)生肌痛。(Clamp等(2002;M油'-Owc" 1>"^ 13:673-683)。每周一次，每次20嗎/m2，持續(xù)3周的劑量耐受良好，未見肌痛或其它 副作用。(Weitman等(1999) C7/m'ca/ Ca"cer i ewarc/z 5:2344-2348)。另一項(xiàng)臨床研究 中，每周一次施用25|Lig/m2的苔蘚抑素-1 ，持續(xù)8周是最高的耐受劑量。(Jayson等(1995) 5nY/W J o/Cawcw 72(2):461-468)。另一項(xiàng)研究報(bào)道，50jig/m2(每兩周靜脈輸注1小 時(shí)來給藥，持續(xù)6周)是最高的耐受劑量。(Prendville等(1993) 5Wfe/z J o/Omcer 68(2):418-424)。報(bào)道的肌痛隨著苔蘚抑素-1的重復(fù)給藥而加劇，并開始于初次注射 后的數(shù)天。肌痛對(duì)患者生活質(zhì)量的不良影響是苔蘚抑素-1治療中斷的原因之一。苔蘚抑素誘發(fā)肌痛的病因尚未確定。(美國)國立癌癥研究所建立了分級(jí)肌痛的通用毒性標(biāo)準(zhǔn)。具體地說，該標(biāo)準(zhǔn)分成 5類或5個(gè)等級(jí)。0級(jí)表示無肌痛。1級(jí)肌痛的特點(diǎn)是無需止痛藥的緩和短暫疼痛。1級(jí)肌痛時(shí)，患者行動(dòng)自如。2級(jí)肌痛的特點(diǎn)是中等疼痛，該疼痛或所需的止痛藥會(huì)干 擾一些功能但不會(huì)干擾日常生活的活動(dòng)。3級(jí)肌痛是劇烈疼痛，該疼痛或必需的止痛 藥會(huì)嚴(yán)重干擾日常生活的活動(dòng)。4級(jí)肌痛使人喪失活動(dòng)能力。本發(fā)明組合物通過在外周組織中降低PKC活化提高了 PKC活化劑的用與患者 的耐受劑量并且/或者減少或降低了與PKC活化有關(guān)的副作用。具體地說，PKC抑 制劑能在外周組織中抑制PKC或偏性地在外周組織中抑制PCK。例如維生素E，實(shí) 驗(yàn)顯示，它能夠在糖尿病大鼠大動(dòng)脈和接觸高葡萄糖水平的詞養(yǎng)大鼠平滑肌細(xì)胞中 使二酰甘油-蛋白激酶C活化恢復(fù)正常。(Kunisald等(1994) Z)/Wefey 43(11):1372-1377)。在中度阿耳茨海默病患者中進(jìn)行的用維生素E(2000IU/天)雙盲試 驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，維生素E降低了死亡率和發(fā)病率，但無法增強(qiáng)認(rèn)知能力。(Burke等(1999) 尸oW Grac/w她MWc/"e 106(5):85-96)。大環(huán)內(nèi)酯類，包括苔蘚抑素類，最初來源于萬/g"/a"eW"7^丄。盡管已經(jīng)知道大 環(huán)內(nèi)酯類，尤其是苔蘚抑素類，具有多重用途，卻仍然還不知道大環(huán)內(nèi)酯類和認(rèn)知 增強(qiáng)之間的聯(lián)系。可用于本發(fā)明的化合物的例子包括大環(huán)內(nèi)酯類(即苔蘚抑素類和納瑞絲特汀類 化合物)。盡管實(shí)施例和具體描述中描述了這些化合物的具體實(shí)施方式
，但應(yīng)該理解， 參考文獻(xiàn)中公開的化合物及其衍生物也可用于本發(fā)明的組合物和方法。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)該理解，大環(huán)內(nèi)酯化合物及其衍生物，尤其是苔蘚抑素 類，可以通過組合合成技術(shù)進(jìn)行制備，因此可以建立化合物文庫來優(yōu)化包括但不限 于組合物的效力和安全性在內(nèi)的藥理學(xué)參數(shù)。此外，還可以用這些文庫試驗(yàn)確定那 些更適宜調(diào)控a-分泌酶和/或PKC的成員。本發(fā)明還包括采用苔蘚抑素的合成類似物。具體地說，據(jù)與苔蘚抑素的NMR 分光鏡比較，這些類似物保留了 Cl-、 C 19-、 C26-氧識(shí)別區(qū)的取向以及不同程度的 PKC結(jié)合親和力。美國專利號(hào)6,624,189(以其全文納入本文作參考)所公開和描述的 所述苔蘚抑素類似物也可用于本發(fā)明的方法中。具體地說，美國專利號(hào)6,624,189的 式l類化合物(第3欄，第35-66行)和美國專利號(hào)6,624,189的式n-VII和1998a禾卩1998b 化合物(第8欄，第28-60行)所表示的苔蘚抑素類似物是適用于本發(fā)明方法的PKC 活化劑。仍然需要通過認(rèn)知能力的具體特征或者通過普遍認(rèn)知來發(fā)展能夠改善總體認(rèn)知 的必理方法。還仍然需要發(fā)展能夠增強(qiáng)認(rèn)知的方法，而不論它是否與具體疾病狀況 或認(rèn)知紊亂有關(guān)。本發(fā)明的方法和組合物滿足了這些需要，能夠大大改善臨床上對(duì) 阿耳茨海默病和其它神經(jīng)退化性疾病的必^^果，同時(shí)，能夠增強(qiáng)認(rèn)知能力。還提供了通過調(diào)節(jié)a分泌酶來必邀口/或增強(qiáng)認(rèn)知狀況的方法和組合物。實(shí)施例實(shí)施例l:行為藥理學(xué):^#^#^^素一開始實(shí)驗(yàn)前，將海蛞蝓(Z/enm'we"^ Cra^/cwm'力樣本置于穿孔 的50-ml錐形離心管中在15。的人造海水(ASW)中養(yǎng)3天。將從海生苔蘚動(dòng)物^Mgw/fl "en'^a中純化得到的苔蘚抑素溶解于EtOH，并在ASW中稀釋至所需的終濃度。使 該動(dòng)物與苔蘚抑素一起在ASW中培養(yǎng)4小時(shí)，然后用標(biāo)準(zhǔn)ASW漂洗。針對(duì)所選實(shí) 驗(yàn)往ASW中加入乳胱素(KVM)或茴香霉素。通過往每個(gè)動(dòng)物所居住的8cm長，直徑為lcm的試驗(yàn)管內(nèi)的培養(yǎng)浴液中加入藥 物來產(chǎn)生苔蘚抑素對(duì)//emz^e"^的行為及其生物化學(xué)屬性的影響。實(shí)施例2:免疫染色方法實(shí)驗(yàn)性必運(yùn)和試驗(yàn)之后，將動(dòng)物快速去頭，取出中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)后在含有 4y。低聚甲醛的20mMTris-緩沖(pH8)的天然海水(NSW; 0.2pm微孔過濾)中固定。然 后將CNS包埋入聚酯蠟(20)，切片(6nm)，用偶聯(lián)到結(jié)合抗生素蛋白的微過氧化物酶 上的生物素化二抗免疫染色(ABC方法，載體)，用氨基乙基咔唑(AEC)作為發(fā)色團(tuán)。 在家兔中由提取自烏賊眼葉的全長克萊斯汀蛋白培養(yǎng)多克隆一抗(命名為25U2)。根 據(jù)B-感光細(xì)胞劃定區(qū)域減去相同背景區(qū)(未染色髓質(zhì))的數(shù)碼顯微照片來檢測(cè)灰度強(qiáng) 度。實(shí)施例3:蛋白激酶C試驗(yàn)在含有l(wèi)mM EGTA、 lmM PMSF和50mM NaF的lOOpl 10mM Tris-HCL pH7.4 緩沖液中，用超聲處理(5秒，25W)使細(xì)胞勻衆(zhòng)化。將勻漿轉(zhuǎn)移到異質(zhì)同晶聚合物離 心管，4°和100，000xg離心IO分鐘。分出上清液，立即置于干冰上冷凍。將顆粒部 分在10(^1上述緩沖液中通過超聲處理使其再次懸浮，-80°保存。為了測(cè)定PKC，將 10nl胞液質(zhì)或顆粒部分在含有K)nM組蛋白、4.89mMCaCl2、 1.2pg4il磷脂酰-L-絲氨 酸、0.18嗎/jxl 1.2-二辛?；?錫-甘油、10mMMgCl2、 20mM HEPES(pH7.4)、 0-8mM EDTA、 4mMEGTA、 4%甘油、8嗎/ml抑肽酶、8pg/ml亮抑肽酶和2mM芐脒的條件 下37°培育15分鐘。加入0.5piCi[y32-P]ATP，如前所述通過吸附到磷酸纖維素上來檢測(cè)"P-磷蛋白的形成(25)。稍稍調(diào)整該試驗(yàn)方法使其分別適用于海蛞蝓神經(jīng)系統(tǒng)均漿 或培育的哺乳動(dòng)物神經(jīng)元?jiǎng)驖{。 實(shí)施例4:細(xì)胞培養(yǎng)物將大鼠的海馬細(xì)胞H19-7/IGF-IR(ATCC)置于涂有多聚-L-賴氨酸的平板上，使它 們?cè)贒MEM/10%FCS中于35。生長數(shù)天直到覆蓋度達(dá)到約50%。然后用含有10ng/ml 堿性成纖維細(xì)胞生長因子的5ml N2培養(yǎng)液換下原培養(yǎng)液誘導(dǎo)細(xì)胞分化成神經(jīng)元表 型，在T-25燒瓶中于39'C進(jìn)行培養(yǎng)(26)。然后往lOpl水溶液中加入各種濃度的苔蘚 抑素(0.01-1.0nM)。 一定間隔后，去除培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞，輕刮取下細(xì)胞， 1000rpm離心5分鐘收集細(xì)胞。實(shí)施例5:行為的條件反射對(duì)海蛞蝓進(jìn)行巴夫洛夫條件反射訓(xùn)練包括重復(fù)成對(duì)的神經(jīng)刺激，即光，和無條 件刺激，即環(huán)軌搖晃。(參見Lederhendler等(24)和Epstein等(6))。旋轉(zhuǎn)/搖晃刺激能 使平衡囊毛細(xì)胞興奮，從而誘發(fā)無條件反應(yīng)稱為"足"的肌肉性下表面迅速收縮， 與此同時(shí)，附著或"粘著"到支撐足部的表面。條件反射訓(xùn)練之前，光誘發(fā)弱陽性 趨光性，與此同時(shí)，足部伸長。足夠次數(shù)的光-旋轉(zhuǎn)成對(duì)刺激后，光不再誘發(fā)趨光性， 轉(zhuǎn)而誘發(fā)新的反應(yīng)(24):先前只有通過無條件刺激才能誘發(fā)的"粘著"和足縮短(圖 1)。因此，無條件刺激即旋轉(zhuǎn)或環(huán)軌搖動(dòng)的意義轉(zhuǎn)移到條件刺激，表現(xiàn)為光誘發(fā)的足 收縮一一種足長度的負(fù)改變。對(duì)光的這種條件反應(yīng)可持續(xù)數(shù)周，它并不能由隨機(jī)的 光和旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生，而是刺激特異性的，具有哺乳動(dòng)物巴夫洛夫條件反射的其它特征。實(shí)施例6:苔蘚抑素誘使聯(lián)想記憶延長對(duì)海蛞蝓的巴夫洛夫條件反射訓(xùn)練很好地定義了能使逐步延長習(xí)得條件反應(yīng)保持時(shí)間的訓(xùn)練參數(shù)。例如，兩次(2TE)光和定軌搖動(dòng)成對(duì)訓(xùn)練(參見"方法")能誘導(dǎo) 習(xí)得條件反應(yīng)(光誘發(fā)的足收縮或縮短)，不用藥時(shí)該反應(yīng)保留約7分鐘的。4-6次訓(xùn) 練(4-6TE)誘發(fā)了保留長達(dá)數(shù)小時(shí)的條件反應(yīng)，但在訓(xùn)練結(jié)束約1天后消失。9次TE 能產(chǎn)生持續(xù)許多天，通常高達(dá)2周的長時(shí)聯(lián)想記憶。采用4-和6-次成對(duì)CS/US訓(xùn)練(TE)的亞優(yōu)選方案訓(xùn)練動(dòng)物，在訓(xùn)練前的暗適應(yīng) 期間(IO分鐘)加用苔蘚抑素(0.25ng/ml)，持續(xù)4小時(shí)，或者不加苔蘚抑素(NSW對(duì)照)； 9-次成對(duì)刺激TE和NSW作為陽性對(duì)照。在第4小時(shí)和此后每隔24小時(shí)，所有動(dòng)物 接受純CS測(cè)試。用苔蘚抑素處理過的經(jīng)亞優(yōu)方案訓(xùn)練的動(dòng)物全部表現(xiàn)為保有長期記 憶(11=8-16動(dòng)物/條件/實(shí)驗(yàn)；ANOVA， pO.Ol)。2次TE加苔蘚抑素能使記憶保持?jǐn)?shù)小時(shí)(相比之下，不用苔蘚抑素時(shí)只有數(shù)分鐘)，4次TE加苔蘚抑素使保持時(shí)間延長到超過24小時(shí)(圖l)和6次TE加苔蘚抑素 能使保持時(shí)間達(dá)1周或更長。在第4小時(shí)進(jìn)行測(cè)試時(shí)，不用苔蘚抑素(NSW)，隨機(jī)刺激和成對(duì)的CS/US訓(xùn)練 (TE)沒有產(chǎn)生LTM或誘發(fā)CR。進(jìn)行6-TE條件反射訓(xùn)練前(IO分鐘的暗適應(yīng)期間)施 用苔蘚抑素(0.25ng/ml NSW)并在此后持續(xù)4小時(shí)產(chǎn)生正的CR(足收縮；長度的負(fù)改 變)，由此表明建立了 LTM。拮抗劑Ro-32，當(dāng)在訓(xùn)練前(暗適應(yīng)期間)施用時(shí)，會(huì)阻 斷6TE加苔蘚抑素的作用，即動(dòng)物會(huì)伸長(正的長度改變)和正常的趨光性(11=4-8動(dòng)物 /條件/實(shí)驗(yàn)；ANOVA差，pO.Ol)。隨機(jī)給予光和旋轉(zhuǎn)，不論用或不用苔蘚抑素，都 不會(huì)產(chǎn)生條件反應(yīng)(圖2)， g卩，光誘發(fā)的足收縮。因此，在亞優(yōu)選訓(xùn)練試驗(yàn)中，在訓(xùn) 練期間并緊隨其后使用苔蘚抑素可以延長記憶的保留時(shí)間。實(shí)施例7:培養(yǎng)前幾天預(yù)接觸苔蘚抑素能增強(qiáng)記憶獲得之前的檢測(cè)(15、 17)表明學(xué)習(xí)可以誘導(dǎo)的PKC結(jié)合神經(jīng)元膜(即，易位)可以是 持續(xù)性的。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，家兔瞬膜條件反射、大鼠空間迷宮學(xué)習(xí)、迷宮學(xué)習(xí)和大鼠嗅 覺辨別學(xué)習(xí)均伴有訓(xùn)練后持續(xù)數(shù)天的PKC易位。海蛞蝓條件反射伴有訓(xùn)練后持續(xù)至 少1天的可見于唯一性可識(shí)別B類細(xì)胞中的PKC易位(15)。如上所述，訓(xùn)練期間和之后接觸苔蘚抑素4小時(shí)將2TE誘發(fā)的記憶保留時(shí)間從 6-8分鐘延長到數(shù)小時(shí)。然而，在訓(xùn)練前一天以及2TE當(dāng)日接觸苔蘚抑素4小時(shí)可以 使訓(xùn)練后的記憶保留時(shí)間延長到1天以上。僅采用CS進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)的CR(身體長度收 縮)證明了 ，當(dāng)，使動(dòng)物連續(xù)2天接觸苔蘚抑素(0.25ng/m1)4小時(shí)和進(jìn)行2次成對(duì)CS/US 訓(xùn)練能產(chǎn)生至少6天的長期記憶(11=16動(dòng)物/條件；ANOVA， pO.01)(圖3)。使動(dòng)物連續(xù)3天接觸苔蘚抑素(0.25ng/ml)4小時(shí)，1天之后進(jìn)行2-TE，表現(xiàn)出可 在訓(xùn)練后96小時(shí)以上測(cè)得的長期記憶(LTR)。未接觸苔蘚抑素的動(dòng)物(同圖3所示) 未表現(xiàn)出任何行為改變(CS檢測(cè)無CR)。訓(xùn)練后立即給予經(jīng)3天苔蘚抑素處理的動(dòng)物 茴香霉素(ANI)(lpg/ml)，持續(xù)4小時(shí)，不能阻止長期記憶形成。因此，3天的苔蘚抑 素處理可以消除對(duì)產(chǎn)生LTR所必需的蛋白質(zhì)合成的依賴性，所述蛋白質(zhì)合成通常受 訓(xùn)練后加入的ANI所阻斷(rv^l6動(dòng)物/條件；ANOVA， p<0.01)。第三天的一次4小時(shí) 苔蘚抑素引起了類似的巴夫洛夫條件反應(yīng)記憶保留延長(圖4)。以上結(jié)果支持這樣的 觀點(diǎn)，即連續(xù)2次間隔開的接觸苔蘚抑素能活化PKC，還可能激活長期記憶關(guān)鍵蛋 白質(zhì)的合成，同時(shí)盡可能避免了同時(shí)發(fā)生和后續(xù)發(fā)生的PKC下調(diào)。2次TE之前延 長苔蘚抑素接觸時(shí)間(即8-20小時(shí))(圖5)本身不足以產(chǎn)生與訓(xùn)練前連續(xù)2天接觸4小 時(shí)所得結(jié)果相當(dāng)?shù)拈L期記憶，這一觀察結(jié)果進(jìn)一步支持了上述觀點(diǎn)。這些實(shí)驗(yàn)中，觀察了在訓(xùn)練時(shí)接觸苔蘚抑素(0.25ng/m1)20小時(shí)的作用。采用亞優(yōu)化的2-成對(duì)TE條 件反射訓(xùn)練方案時(shí)，48小時(shí)后記憶喪失。而采用預(yù)接觸苔蘚抑素20小時(shí)的4-成對(duì) TE條件反射訓(xùn)練所得的長期記憶則得以保銜11=8動(dòng)物/條件;第48小時(shí)的ANOVA， p< 0.01)。已知，在其它細(xì)胞系統(tǒng)中，充分延長苔蘚抑素接觸時(shí)間(如，8-12小時(shí))能 引起持續(xù)的PKC下調(diào)，從而抵消PKC活化和促進(jìn)PKC合成。類似地，充分提高的苔蘚抑素濃度最終會(huì)抑制記憶保持(圖6)，據(jù)推測(cè)可能也是 因?yàn)镻KC的下調(diào)。亞優(yōu)化(4TE)訓(xùn)練條件下，苔蘚抑素濃度〈.50ng/ml能增加記憶的 獲得和保持。那些濃度對(duì)9-成對(duì)TE所得的記憶保持沒有明顯作用。然而，在所有檢 測(cè)的訓(xùn)練條件下，濃度a.0ng/ml均抑制習(xí)得和行為的保持(n46動(dòng)物/條件)，據(jù)推測(cè) 可能是由于PKC下調(diào)。實(shí)施例8:預(yù)接觸苔蘚抑素能消除對(duì)訓(xùn)練期間蛋白質(zhì)合成的依賴性對(duì)動(dòng)物進(jìn)行2-成對(duì)訓(xùn)練(TE)， 4小時(shí)后檢測(cè)其記憶保持。在訓(xùn)練前的10分鐘暗 適應(yīng)期間和此后4小時(shí)將苔蘚抑素(0.25 ng/ml)加入NSW給予動(dòng)物，結(jié)果表現(xiàn)出行為 條件反射保持(足收縮(CR)和體長縮短)。NSW對(duì)照動(dòng)物和那些訓(xùn)練前接受苔蘚抑素 處理并在訓(xùn)練后立即接受茴香霉素(1.0pg/ml)處理的動(dòng)物均未發(fā)生CR，其足部伸長并 表現(xiàn)出正常的正趨光性(11=12動(dòng)物/條件/實(shí)驗(yàn)，雙向ANOVA統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，pO.Ol)。 單次4小時(shí)接觸苔蘚抑素加上2次TE能產(chǎn)生持續(xù)數(shù)小時(shí)的長期記憶，當(dāng)茴香霉素與 苔蘚抑素同時(shí)存在時(shí)，這種記憶保持完全喪失(圖7)。 6TE加苔蘚抑素實(shí)驗(yàn)中也觀察 到類似的茴香霉素阻斷作用。然而，重復(fù)多次短暫接觸苔蘚抑素能提高PKC、克萊 斯汀和其它記憶蛋白的凈合成，這樣，如果PKC下調(diào)被充分抑制，則不再需要巴夫 洛夫條件反射訓(xùn)練期間和之后的新增合成。對(duì)訓(xùn)練前3天每天接觸苔蘚抑素4小時(shí) 的動(dòng)物進(jìn)行2次TE后立即施用茴香霉素進(jìn)行4小時(shí)的蛋白質(zhì)合成抑制。這種情況下， 茴香霉素誘發(fā)的蛋白質(zhì)合成抑制并未阻礙記憶的保持，記憶仍然持續(xù)了許多天(圖4)。 相反，同樣的茴香霉素處理4小時(shí)完全消除了 9次TE(—種通常會(huì)產(chǎn)生1-2周記憶保 持的訓(xùn)練方案(27))所產(chǎn)生的記憶保持。最后，如果連續(xù)3天接觸苔蘚抑素4小時(shí)， 每次均聯(lián)用茴香霉素，1天后進(jìn)行2次TE，長期記憶消失。實(shí)施例9:預(yù)先接受蛋白酶體抑制能增強(qiáng)苔蘚抑素對(duì)記憶的影響增強(qiáng)和延長PKC和其它記憶相關(guān)蛋白質(zhì)重新合成的另一種方法是阻斷蛋白質(zhì)降 解通路。其中之一的泛素-蛋白酶體通路(28-30)，被認(rèn)為是PKC的a-同工酶降解的主 要途徑。如前所述，20一-5QpM的蛋白酶體抑制劑，乳胱素可以很大程度地阻止 PKC-a降解。將動(dòng)物與苔蘚抑素(0.25ng/ml)和乳胱素(10MyM)同時(shí)培養(yǎng)4小時(shí)，然后，24小時(shí) 之后采用2-次CS/US成對(duì)訓(xùn)練(TE)誘導(dǎo)條件反射。接著在訓(xùn)練后第4小時(shí)，然每隔 24小時(shí)單用CS測(cè)試動(dòng)物。聯(lián)用苔蘚抑素/乳胱素進(jìn)行處理的動(dòng)物具有持久保持的條 件反射行為；單用苔蘚抑素處理的動(dòng)物其行為保持在24小時(shí)后消失。單用乳胱素處 理的動(dòng)物未表現(xiàn)出行為訓(xùn)練的習(xí)得或保持(數(shù)據(jù)未作圖)。(n=28動(dòng)物，聯(lián)用苔蘚抑素 /乳胱素；n=20，單用苔蘚抑素；n=16，單用乳胱素)。此例中，乳胱素將單獨(dú)接觸苔 蘚抑素(然后進(jìn)行2次TE)所產(chǎn)生的短時(shí)記憶轉(zhuǎn)換成了持續(xù)數(shù)天的長期記憶(圖8)。實(shí)施例10:基于PKC活性的克萊斯汀-免疫染色最近我們揭示了在海蛞蝓條件反射的習(xí)得和保持期間，唯一性已確定B類細(xì)胞 中免疫染色標(biāo)記物克萊斯汀增加(20)。之前的許多發(fā)現(xiàn)提示，低分子量鈣-結(jié)合和0丁 -結(jié)合蛋白，克萊斯汀，在海蛞蝓條件反射訓(xùn)練期間是PKC同工酶的底物(19)。目前 已經(jīng)測(cè)出了一些物種的克萊斯汀的全序列，它看起來與在其它物種中的相似蛋白具 有顯著的同源性(31)，在海蛞蝓巴夫洛夫條件反射訓(xùn)練期間和之后經(jīng)歷了磷酸化的改 變。它同時(shí)還是PKC的a同工酶的高親和力底物和p和Y同工酶的低親和力底物(19)。顯微照片(A、 B)描繪了具代表性的經(jīng)克萊斯汀多抗25U2免疫染色的海蛞蝓眼 組織切片。陽性克萊斯汀染色發(fā)生于有或沒有預(yù)先施用苔蘚抑素的經(jīng)歷過成對(duì) CS/UCS聯(lián)想條件反射訓(xùn)練的動(dòng)物的B細(xì)胞感光細(xì)胞。B-Cell)中(B)。隨機(jī)給予這兩 種刺激(訓(xùn)練，TE)未引起行為改變，也沒有使克萊斯汀高于正常的背景水平(A);用 脊椎動(dòng)物多抗對(duì)基底膜和晶狀體進(jìn)行人工染色。檢測(cè)染色強(qiáng)度的差異，將其記錄為 灰度強(qiáng)度(0-256; B-細(xì)胞胞質(zhì)減掉組織背景)。圖(C)顯示了9次隨機(jī)TE(左欄)的海蛞 蝓的測(cè)得強(qiáng)度和連續(xù)兩天接觸PKC激動(dòng)劑苔蘚抑素(0.25 ng/ml)然后進(jìn)行2次成對(duì)TE 進(jìn)行聯(lián)想條件反射訓(xùn)練的動(dòng)物的的測(cè)得強(qiáng)度。兩次接觸苔蘚抑素加上2次TE增強(qiáng)產(chǎn) 生的PKC活化將克萊斯汀的水平顯著提高，達(dá)到與9-次成對(duì)TE和鞏固(長時(shí))記憶 相關(guān)的水平(11=4-8動(dòng)物/條件/重復(fù)；f檢驗(yàn)比較，pO.Ol)?？巳R斯汀免疫染色的靈敏度足以分辨感光-前庭軸突聯(lián)合區(qū)內(nèi)的結(jié)節(jié)(D)。箭頭代 表中間神經(jīng)元(a)、對(duì)側(cè)神經(jīng)元軸突(b)和推定感光細(xì)胞的軸突末端結(jié)節(jié)(c)間的枝狀區(qū)。 刻度條=10^1!11; CPG，腦側(cè)神經(jīng)節(jié)(圖9、 10)。由于免疫染色抗體與蛋白質(zhì)的磷酸化和無磷酸化形式都反應(yīng)，因此，該條件誘 發(fā)的克萊斯汀標(biāo)記物增加反映實(shí)際蛋白質(zhì)數(shù)量增加。由于特異性PKC-阻斷劑，Ro-32， 能阻止學(xué)習(xí)和B類細(xì)胞中學(xué)習(xí)特異性的克萊斯汀增加(如上所述)，因此之前發(fā)現(xiàn)在所 述各個(gè)B類細(xì)胞內(nèi)發(fā)生易位的PKC看起來引起了條件誘發(fā)的克萊斯汀標(biāo)記物增加。無訓(xùn)練和/或隨機(jī)化的對(duì)照訓(xùn)練方法產(chǎn)生的克萊斯汀(CE)免疫染色只相對(duì)于訓(xùn)練誘發(fā)染色程度一個(gè)很小的分?jǐn)?shù)(Fig 9)。沒有苔蘚抑素的隨機(jī)訓(xùn)練(4-TE)得到略高于背景的測(cè)得強(qiáng)度。施用苔蘚抑素可以 增加這兩種訓(xùn)練例的克萊斯汀水平。隨機(jī)訓(xùn)練情況下，當(dāng)偶爾發(fā)生CS和US的重疊 (配對(duì))時(shí)，就如此處所述，CE有可能增加(增加2.0)。然而，成對(duì)訓(xùn)練時(shí)，克萊斯汀 水平的增加會(huì)超過4.3倍(平均數(shù)± SE， N=5動(dòng)物/處理。4RTE-隨機(jī)對(duì)照，4次隨機(jī) 光和旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)；6PTE:成對(duì)試驗(yàn)，6次成對(duì)光和旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)。6PTE-0Bry比6PTE-0.25Bry; pO.001; 4RTE-0.25Bry比6PTE-0.25Bry; p<0.001(/檢驗(yàn))。當(dāng)采用亞優(yōu)化訓(xùn)練(4-6TE) 時(shí)，CE免疫染色(圖IOA)有中度升高。這些亞優(yōu)選方案不足以產(chǎn)生持續(xù)超過24小時(shí) 的記憶保持。如上所述，進(jìn)行6TE訓(xùn)練期間施用苔蘚抑素能引發(fā)長期記憶保持(>1 周)。而且，苔蘚抑素加6TE誘導(dǎo)的CE免疫染色堪比9TE所得。低劑量(0.1-0.25ng/ml)苔蘚抑素顯著增強(qiáng)2、 4或6次訓(xùn)練試驗(yàn)后的記憶。施用 苔蘚抑素時(shí)，6TE的巴夫洛夫條件反射訓(xùn)練能產(chǎn)生持續(xù)許多天的記憶，不用苔蘚抑 素則僅持續(xù)數(shù)小時(shí)。茴香霉素或PKC抑制劑Ro-32能夠抑制上述記憶增強(qiáng)。重要的 是，9次TE之后24小時(shí)，CE免疫染色大大衰減，盡管記憶仍能在此后持續(xù)超過1 周。然而，最少訓(xùn)練(2TE)之前重復(fù)接觸苔蘚抑素?cái)?shù)天獲得了更持久的CE免疫染色。1、 2和3天每天單獨(dú)施用苔蘚抑素(不同時(shí)進(jìn)行條件反射)4小時(shí)，每次接觸苔蘚 抑素后24小時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)海蛞蝓的B感光細(xì)胞中的克萊斯汀水平逐漸增強(qiáng)。 接觸苔蘚抑素4小時(shí)1次后24小時(shí)，CE免疫染色沒有增強(qiáng)(圖IOB)。兩次接觸苔蘚 抑素后24小時(shí)(連續(xù)兩天，每天l次)，CE免疫染色殘留增多。接觸苔蘚抑素3次， 然后只進(jìn)行2對(duì)訓(xùn)練(成對(duì)的光和環(huán)軌搖動(dòng))，克萊斯汀水平進(jìn)一步升高，同時(shí)，聯(lián)想 性條件反射誘發(fā)的行為改變保持天數(shù)顯著延長(11=16動(dòng)物/條件ANOVA， pO.Ol)。 3次接觸后第一天進(jìn)行2次TE, 24小時(shí)后CE免疫染色的水平接近之前9次TE后 立即觀察到的水平(圖10B)。因此，3天每天接觸苔蘚抑素4小時(shí)后進(jìn)行最少訓(xùn)練(2TE) 后的CE免疫染色表現(xiàn)為比單獨(dú)訓(xùn)練試驗(yàn)所得更持久。這種新合成克萊斯汀的持久性 與表明苔蘚抑素誘導(dǎo)蛋白合成增強(qiáng)的生物化學(xué)觀察結(jié)果相一致。連續(xù)兩天每天接觸苔蘚抑素4小時(shí)，24小時(shí)后進(jìn)行2次訓(xùn)練(2TE)才能將克萊 ,斯汀水平提高到與鞏固的長期記憶相關(guān)的水平。 一般而言，2-TE配合以2次接觸苔 蘚抑素能產(chǎn)生超過1周的記憶保持(11=16動(dòng)物/條件；f檢驗(yàn)，p<0.01)。先進(jìn)行連續(xù)3 天每天接觸苔蘚抑素4小時(shí)能使克萊斯汀水平達(dá)到獲得鞏固記憶所需水平。2次訓(xùn)練 后立即加入茴香霉素不會(huì)減少上述克萊斯汀水平，并且，鞏固記憶可以持續(xù)許多天(N-8動(dòng)物/條件；f檢驗(yàn)，p>0.05，不顯著)。(圖11A、 B)。值得注意的是苔蘚抑素加訓(xùn)練后立即施用PKC抑制劑Ro-32沒能阻止長期記憶 的產(chǎn)生，而在訓(xùn)練加苔蘚抑素的過程中進(jìn)行抑制確能阻止記憶的鞏固。相反，有和 沒有苔蘚抑素的訓(xùn)練期間加入茴香霉素未能阻止長期記憶，而有和沒有苔蘚抑素的 訓(xùn)練后加入茴香霉素則能完全抑制記憶形成。因此，訓(xùn)練期間PKC活化之后是記憶 所需蛋白質(zhì)的合成。因此， 一旦PKC活化被誘導(dǎo)到足夠的水平，就不可避免的會(huì)發(fā) 生必需的蛋白質(zhì)合成。所以，訓(xùn)練前數(shù)天的苔蘚抑素誘導(dǎo)PKC活化，配合以最少訓(xùn) 練，足以產(chǎn)生長期記憶。而且，后一種情況下的長期記憶無需訓(xùn)練(和訓(xùn)練前PKC活 化)后的蛋白合成。再次重申，預(yù)先的PKC活化足以導(dǎo)致后來形成長期記憶所需的蛋 白質(zhì)合成。其合成受苔蘚抑素誘導(dǎo)的PKC活化以及條件反射試驗(yàn)所誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)之 一是克萊斯汀一如免疫染色標(biāo)記所證明的那樣。另一種是PKC本身。實(shí)施例ll:苔蘚抑素對(duì)PKC活動(dòng)的影響已知苔蘚抑素通過增加PKC與細(xì)胞膜部分的結(jié)合而瞬時(shí)活化PKC。已有許多聯(lián) 想記憶范例被證明增強(qiáng)PKC與神經(jīng)元膜的結(jié)合。因此，我們對(duì)使海蛞蝓重復(fù)接觸苔 蘚抑素(即，精確按照訓(xùn)練方法接觸4小時(shí))也會(huì)誘導(dǎo)持久的PKC活化這一假設(shè)進(jìn)行 了試驗(yàn)。連續(xù)數(shù)天將完整的海蛞蝓在所述條件下("行為藥理學(xué)")間歇性的4小時(shí)苔蘚抑 素(0.28nM)接觸。然后檢測(cè)分離的食管外周神經(jīng)系統(tǒng)中胞液質(zhì)中的組蛋白磷酸化(參 見"方法")。2次接觸苔蘚抑素的第二次后10分鐘和24小時(shí)檢測(cè)到的PKC活性顯 著高于基線水平(每次檢測(cè)的N二6)。(圖12、 13)。因此，兩部分中的PKC數(shù)量看來 都增加了，但胞膜內(nèi)PKC與胞液質(zhì)中PKC之比沒有增加。這些結(jié)果表明，與學(xué)習(xí)本 身相比，預(yù)接觸苔蘚抑素對(duì)PKC產(chǎn)生的某些不同的作用。最初活化后(通過易位)， 苔蘚抑素的該作用極有可能是由于PKC的合成增加，這與苔蘚抑素引起克萊斯汀水 平一致，但與重復(fù)接觸苔蘚抑素不直接相關(guān)。但如圖12、 13所述，每次接觸苔蘚抑素(0.25ng/ml)同時(shí)加入茴香霉素(1.0ng/ml)。 注意，連續(xù)三天接觸苔蘚抑素后，茴香霉素顯著減少海蛞蝓食管周圍神經(jīng)系統(tǒng)的胞 液質(zhì)部分和胞膜部分的PKC活性(每次檢測(cè)的N-3， p〈.01)(圖14)。為了進(jìn)一步檢測(cè)重復(fù)接觸苔蘚抑素的生物化學(xué)效應(yīng)，對(duì)經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)溫 度敏感型tsA5CSV40大T抗原而無限繁殖化的大鼠海馬神經(jīng)元進(jìn)行研究(25)。這些 神經(jīng)元在N2培養(yǎng)液中經(jīng)堿性成纖維細(xì)胞生長因子誘導(dǎo)后分化出神經(jīng)元表型(26)，并 表達(dá)出包括PKC在內(nèi)的全部常規(guī)神經(jīng)元蛋白質(zhì)。使培育的海馬神經(jīng)元接觸單劑活性劑量的苔蘚抑素(0.28nM)30分鐘引起了 PKC 從胞液質(zhì)向顆粒部分的迅速易位(約60%)，此后是持續(xù)的下調(diào)(圖15)。最初的PKC 活化和后來的下調(diào)均已在先前描述過，并經(jīng)測(cè)定膜和胞液質(zhì)中的PKC活性得以確定。 使培育的海馬神經(jīng)元接觸苔蘚抑素30分鐘，然后間隔30分鐘-8小時(shí)后再次接觸30 分鐘，使膜結(jié)合的PKC更快地恢復(fù)(rebound)。因此，延遲2-4小時(shí)后再次接觸消除 了單次接觸苔蘚抑素導(dǎo)致的顯著下調(diào)(圖16)。接觸苔蘚抑素后最初的4個(gè)小時(shí)內(nèi)在 胞質(zhì)部分未檢測(cè)到PKC活性的顯著變化。相反，如果使細(xì)胞在2小時(shí)內(nèi)兩次接觸苔 蘚抑素，第二次接觸后的PKC活性顯著降低。然而，如果第二次接觸比首次接觸晚 4小時(shí)，則活性提高到基線之上，顯著高于2小時(shí)后或2小時(shí)之內(nèi)進(jìn)行第二次接觸所 誘導(dǎo)的水平(圖16)。這些結(jié)果符合以下解釋苔蘚抑素先活化PKC后PKC又下調(diào)(28-30)導(dǎo)致PKC 同工酶(以及上述克萊斯汀)合成增加(通過蛋白質(zhì)重新合成)。實(shí)際上，我們通過收集 神經(jīng)元前最后半小時(shí)內(nèi)的"S-甲硫氨酸摻入檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，單次接觸0.28nM苔蘚抑素30 分鐘能在接觸苔蘚抑素后24小時(shí)內(nèi)使得總蛋白質(zhì)合成增加了 20%， 79小時(shí)內(nèi)增加 60%(圖17)。當(dāng)同時(shí)存在PKC抑制劑Ro-32時(shí)，苔蘚抑素所引起的這種持久而復(fù)雜 的蛋白質(zhì)合成增加被部分抑制(圖17)。許多觀察結(jié)果表明足以引起PKC活化的苔蘚抑素不可避免地也會(huì)使PKC逐漸 失活，然后下調(diào)。實(shí)際上，足夠劑量的苔蘚抑素(超過1.0ng/ml)抑制巴夫洛夫條件反 射。這極有可能是由PKC下調(diào)所引起的，而PKC下調(diào)正是高濃度苔蘚抑素所致行為 結(jié)果的特征之一。已經(jīng)知道，有兩條直接途徑可以下調(diào)苔蘚抑素誘發(fā)的PKC活化。 一條途徑也受佛波酯誘導(dǎo)，包括泛素化，接著經(jīng)由蛋白酶體路徑蛋白水解。第二種 下調(diào)機(jī)制不由佛波酯誘導(dǎo)，包括通過胞膜窖區(qū)室(caveolar compartment)移動(dòng)和磷酸酶 PP1和PP2A介導(dǎo)的降解。PKC活化劑的濃度足夠高和/或持續(xù)時(shí)間足夠久，PKC降 解途徑使PKC不足從而刺激重新合成PKC， PKC的合成不能補(bǔ)償其失活和下調(diào)，由 此造成可用PKC減少95%或更多。
權(quán)利要求
1.一種方法，該方法包括使蛋白激酶C(PKC)接觸PKC活化劑來刺激足以鞏固長期記憶的蛋白質(zhì)合成的步驟。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述PKC活化劑是大環(huán)內(nèi)酯。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述PKC活化劑是苯并內(nèi)酰胺。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述PKC活化劑是吡咯烷酮。
5. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述大環(huán)內(nèi)酯是苔蘚抑素。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述苔蘚抑素是苔蘚抑素-1、 -2、 -3、 _4、 -5、 -6、 -7、 -8、 -9、 -10、 -11、 -12、 -13、 -14、 -15、 -16、 -17或-18。
7. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述苔蘚抑素是苔蘚抑素-1。
8. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述大環(huán)內(nèi)酯是納瑞絲特汀。
9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述納瑞絲特汀是納瑞絲特汀-1。
10. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述接觸活化PKC。
11. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述接觸使PKC數(shù)量增加。
12. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述接觸使PKC合成增加。
13. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述接觸使克萊斯汀的數(shù)量增加。
14. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述接觸基本上不引起隨后的PKC 下調(diào)。
15. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，重復(fù)PKC接觸PKC活化劑的步驟。
16. 如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，規(guī)律地、間歇性地重復(fù)PKC接觸 PKC活化劑的步驟。
17. 如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，間歇的間隔為1周至1個(gè)月、1天 至1周、或少于1小時(shí)至24小時(shí)。
18. 如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述間隔為1周至1個(gè)月。
19. 如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述間隔為1天至1周。
20. 如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述間隔為少于1至24小時(shí)。
21.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在一固定期間內(nèi)保持PKC與PKC活化劑的接觸。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述固定期間為少于24小時(shí)。
23. 如權(quán)利要求21所述的方法，
24. 如權(quán)利要求21所述的方法，
25. 如權(quán)利要求21所述的方法，
26. 如權(quán)利要求21所述的方法，
27. 如權(quán)利要求21所述的方法，
28. 如權(quán)利要求21所述的方法，
29. 如權(quán)利要求21所述的方法，
30. 如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于， 其特征在于， 其特征在于， 其特征在于， 其特征在于， 其特征在于， 其特征在于， 其特征在于，所述固定期間為少于12小時(shí)。 所述固定期間為少于6小時(shí)。 所述固定期間為少于4小時(shí)。 所述固定期間為少于2小時(shí)。 所述固定期間約為2-6小時(shí)。 所述固定期間約為4小時(shí)。 所述固定期間約為1-12小時(shí)。 在多于1天的期間內(nèi)重復(fù)所述接觸(
31. 如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，在1天至1個(gè)月的期間內(nèi)重復(fù)所 述接觸。
32. 如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，在1天至1周的期間內(nèi)重復(fù)所述 接觸。
33. 如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，在1周至1個(gè)月的期間內(nèi)重復(fù)所 述接觸。
34. 如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，在l-6個(gè)月的期間內(nèi)重復(fù)所述接觸。
35. 如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，在l個(gè)月的期間內(nèi)重復(fù)所述接觸。
36. 如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，在多于1個(gè)月的期間內(nèi)重復(fù)所述 接觸。
37. —種方法，包括用蛋白激酶C(PKC)接觸PKC活化劑來下調(diào)PKC。
38. 如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，所述PKC活化劑是大環(huán)內(nèi)酯。
39. 如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，所述PKC活化劑是苯并內(nèi)酰胺。
40. 如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，所述PKC活化劑是吡咯垸酮。
41. 如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述大環(huán)內(nèi)酯是苔蘚抑素。
42. 如權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于，所述苔蘚抑素是苔蘚抑素-1、 -2、 -3、 -4、國5、 -6、 -7、 -8、 -9、 -10、 -11、 -12、 -13、 -14、 -15、 -16、 -17或-18。
43. 如權(quán)利要求42所述的方法，其特征在于，所述苔蘚抑素是苔蘚抑素-1。
44. 如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述大環(huán)內(nèi)酯是納瑞絲特汀。
45. 如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述納瑞絲特汀是納瑞絲特汀-1。
46. 如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，所述接觸能下調(diào)PKC。
47. 如權(quán)利要求46所述的方法，其特征在于，所述接觸顯著下調(diào)PKC。
48. 如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，所述接觸不刺激PKC合成。
49. 如權(quán)利要求48所述的方法，其特征在于，所述接觸基本上不刺激PKC合成。
50. 如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，所述接觸使PKC數(shù)量減少。
51. 如權(quán)利要求50所述的方法，
52. 如權(quán)利要求37所述的方法，
53. 如權(quán)利要求50所述的方法，
54. 如權(quán)利要求37所述的方法， 段時(shí)間。
55. 如權(quán)利要求54所述的方法，
56. 如權(quán)利要求54所述的方法，
57. 如權(quán)利要求54所述的方法，
58. 如權(quán)利要求54所述的方法，
59. 如權(quán)利要求54所述的方法，
60. 如權(quán)利要求54所述的方法，
61. 如權(quán)利要求54所述的方法，其特征在于，所述接觸顯著減少PKC。 其特征在于，所述接觸不刺激克萊斯汀的合成。 其特征在于，所述接觸不刺激克萊斯汀的合成。 其特征在于，PKC與PKC活化劑的接觸持續(xù)一其特征在于，持續(xù)期間為少于l-24小時(shí)。 其特征在于，持續(xù)期間為1天至1周。 其特征在于，持續(xù)期間為l周至l個(gè)月。 其特征在于，持續(xù)時(shí)間為少于1-12小時(shí)。 其特征在于，持續(xù)期間為少于1-8小時(shí)。 其特征在于，持續(xù)期間為少于l-4小時(shí)。 其特征在于，持續(xù)時(shí)間約為4小時(shí)。 其特征在于，所述接觸導(dǎo)致PKC持續(xù)下調(diào)。還包括抑制蛋白激酶C(PKC)降解所述降解通過泛素化作用進(jìn)行。 所述降解受乳胱素的抑制。
62. 如權(quán)利要求37所述的方法，
63. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于， 的步驟。
64. 如權(quán)利要求63所述的方法，其特征在于，
65. 如權(quán)利要求64所述的方法，其特征在于，
66. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述PKC來自人。
67. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，以含有PKC活化劑和藥學(xué)上可接受 的運(yùn)載體的藥物組合物形式提供所述PKC活化劑。
68. 如權(quán)利要求67所述的方法，其特征在于，所述藥物組合物還含有PKC抑制劑。
69. 如權(quán)利要求68所述的方法，其特征在于，所述PKC抑制劑能在外周組織中 抑制PKC。
70. 如權(quán)利要求68所述的方法，其特征在于，所述PKC抑制劑選擇性地在外周 組織中抑制PKC。
71. 如權(quán)利要求68所述的方法，其特征在于，所述PKC抑制劑是一種能夠緩解 給予個(gè)體PKC活化劑相關(guān)肌痛的化合物。
72. 如權(quán)利要求68所述的方法，其特征在于，所述PKC抑制劑是一種能夠增加 PKC活化劑耐受劑量的化合物。
73. 如權(quán)利要求68所述的方法，其特征在于，所述PKC抑制劑為維生素E、維 生素E類似物、維生素E鹽、鈣感光蛋白C、噻唑烷二酮、羅伯斯特瑞或其組合。
全文摘要
本發(fā)明公開了用蛋白激酶C(PKC)活化劑接觸PKC活化劑以至刺激蛋白質(zhì)的合成從而滿足鞏固長期記憶所需的方法。本發(fā)明還公開了用蛋白激酶C(PKC)活化劑接觸PKC活化劑來下調(diào)PKC的方法。
文檔編號(hào)A61K31/4015GK101277691SQ200680032173
公開日2008年10月1日 申請(qǐng)日期2006年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月29日
發(fā)明者D·L·阿爾康 申請(qǐng)人:布朗歇特洛克菲勒神經(jīng)科學(xué)研究所