專利名稱：制備和分離磷脂的方法
制備和分離磷脂的方法
發(fā)明目的
本發(fā)明涉及制備和純化磷脂酰絲氨酸(PS)的方法以及借助二價金屬氧 化物(BMO)獲得高產(chǎn)率的終產(chǎn)物。 發(fā)明領(lǐng)域
大腦老齡化的生理過程中發(fā)生的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的功能衰退經(jīng)常 導(dǎo)致老年人的認知功能退化，這種退化依次導(dǎo)致行為障礙以及短暫和空間 i己憶的改變。
CNS活性的功能衰退與神經(jīng)膜的脂類組分的生物化學(xué)和結(jié)構(gòu)變化的 開始有關(guān)并且與大腦酶的活性降低有關(guān)，而這種活性降低可能減少神經(jīng)元 突觸。
磷脂酰絲氨酸(PS)是腦中主要的酸性磷脂。因此一段時間以來科學(xué)研 究集中在發(fā)現(xiàn)用于年齡相關(guān)的認知障礙的藥理學(xué)治療方法，這種方法A^ 于能阻止(和/或部分重建)老齡化的神經(jīng)元膜的結(jié)構(gòu)和功能缺陷的磷脂。
人體的臨床前和臨床研究表明口服施用PS(特別是在老年人中)在學(xué)習(xí) 能力以及短暫和空間記憶方面，甚至是特別的失能病理學(xué)(例如阿爾茨海默 病)的情況下確定顯著增加(Cenacchi T.等人；Aging Clin Exp Res; 1993; 5: 123-133; Nunzi MG等人；Adv Exp Med Biol; 1992; 318:393-8)。
另外，研究表明磷脂酰絲氨酸能對抗遭受身體緊張的個體的激素皮質(zhì) 醇的增加(Monteleone P.等人；Neuroendocrinology; 1990; 52(3):243-8)，從 而減少葡萄糖的代謝并且在劇烈的身體努力后獲得更大的功能恢復(fù)。
述年齡相關(guān)病理學(xué)的藥物(和/或食品補充劑)中和在制備適用于劇烈身體緊 張的所有情況的食品補充劑中，以及在制備用于美容領(lǐng)域和/或作為它們包 含的藥物的控釋系統(tǒng)的脂質(zhì)體中的用途。
科學(xué)文獻和專利中已知的制備和純化PS的方法描述了將磷脂酰M
(PC)向PS的酶轉(zhuǎn)化，該轉(zhuǎn)化是通過酶磷脂酶D(PLD)催化的轉(zhuǎn)磷脂?；?應(yīng)，主要通過有機溶劑對PS的萃取進行隨后的純化。
近年來，多種方法經(jīng)完善后用于合成PS，這些方法是通過在7jC/有機 溶劑的兩相體系或在含水介質(zhì)中的酶轉(zhuǎn)化實現(xiàn)的。
EP 0776976描述了在包含水/曱苯的體系中酶制備PS的方法，其中有 機相包含形成PS的起始磷脂，7JC相包含羥基接受體并且合成反應(yīng)在粗制 磷脂酶D的存在下發(fā)生在7jC/溶劑界面，所述的粗制磷脂酶D是從產(chǎn)生PLD 的微生物菌林的發(fā)酵培養(yǎng)液中獲得的。
1990年，研究者首次嘗試避開兩相體系，因為兩相體系需要大量溶劑， 而這些溶劑難以除去，因此導(dǎo)致制備和純化PS的高成本(Comfurius P.等 人，Journal of Lipid Research 1990， 31: 1719-1721)。
因此，用能將起始磷脂以膠束形式分散的洗滌劑/表面活性劑替代有機 溶劑，以便在含水介質(zhì)中引發(fā)獨特的合成的酶反應(yīng)。
事實上，EP 1048738涉及在給定濃度的特別的洗滌劑和鈣鹽的存在下 在含水介質(zhì)中酶合成PS的方法，其中該含水介質(zhì)通過有機溶劑使其完全 沒有任何污染。
DE 19917249描述了在除了加入氯化鉤鹽(CaCl2)不使用表面活性劑的 含水介質(zhì)中酶制備PS的方法，然而，不能確定酶轉(zhuǎn)化百分數(shù)以及獲得的 PS的純度。
EP 1310563 7>開了在不使用洗滌劑和/或鈣鹽的7&相中制備PS的方 法，該方法是基于在水中將包含磷脂、羥基接受體和PLD的起始混合物勻 漿，得到與雙層磷脂膜結(jié)構(gòu)相似的最終勻漿，其中轉(zhuǎn)磷脂?；磻?yīng)可以隨 后發(fā)生。
EP 1427839描述了在不包含洗滌劑但存在金屬離子的水中酶合成磷 月旨(包括PS),所述的金屬離子是由配制/溶解在水中的相應(yīng)鹽釋放獲得。所 述的方法發(fā)生在兩個不同相中，其中從磷脂混合物開始，第一個酶水解反 應(yīng)由PLD催化，產(chǎn)生磷脂酸，隨后是第二個轉(zhuǎn)磷脂酰化反應(yīng)，其中在過量 絲氨酸的存在下形成PS。
最后，EP 12312134要求了在水中酶合成PS的方法，該方法^吏用由 ^r印tovC/"7/ZM附AacA!;/^附e菌林產(chǎn)生并且純化得到的酶PLD的級分， 在最終制備PS中獲得更高產(chǎn)率。
關(guān)于PS(通過在含水介質(zhì)/有機溶劑或含水介質(zhì)中的轉(zhuǎn)磷脂酰化獲得) 的純化，EP 1213294要求了純化方法，該方法是基于使用包含7JC/極性溶劑 (例如異丙醇)的混合物，以從包含上述磷脂的溶液中萃取磷脂，該溶液依 次用烴溶劑(例如曱苯)表示，而EP 0922707涉及使用有機溶劑二相體系(例 如庚烷和甲醇)從磷脂混合物中萃取/純化PS的方法。
本發(fā)明涉及制備和純化磷脂酰絲氨酸(PS)的方法，由于通過二價金屬 氧化物(BMO)的特別作用將PC有效轉(zhuǎn)化為PS,這些方法獲得了非常高產(chǎn) 率的終產(chǎn)物。
另外，酶PLD催化的轉(zhuǎn)磷脂酰化方法使得高百分數(shù)的PC轉(zhuǎn)化為PS， 而且該方法與酶反應(yīng)發(fā)生的介質(zhì)無關(guān)。
因此，本發(fā)明涉及由PLD和BMO催化制備PS的方法，該方法的特 征在于其是
在包含7jc/脂族醇的含水醇介質(zhì)中，或 在包含水/極性非質(zhì)子溶劑的非質(zhì)子介質(zhì)中，或 在包含7jC/有機溶劑的兩相體系中進行。 發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及制備PS(式I)的方法，其中轉(zhuǎn)磷脂?；窃贐MO的存在 下由酶PLD催化進行的，從而實現(xiàn)磷脂?；糠钟闪字Ｄ憠A(PC)(式II) 轉(zhuǎn)移到絲氨酸上(在這種情況下表示羥基接受體)；該酶反應(yīng)提供了在很高 程度上將PC轉(zhuǎn)化為PS，而且這與酶反應(yīng)發(fā)生的介質(zhì)無關(guān)。因此所述的反 應(yīng)可以
在包含水/脂族醇但不形成兩相體系的含水醇介質(zhì)中，或 在包含水/極性非質(zhì)子溶劑但不形成兩相體系的非質(zhì)子介質(zhì)中，或 在包含7K/有機溶劑的兩相體系中進行。 式I<formula>formula see original document page 9</formula>
其中R1和W獨立地表示飽和的、單不飽和的和/或多不飽和的?；?C10-C30, X-OH或OM，其中M-堿或堿土金屬、銨、烷基銨(包括內(nèi)鹽)。
式n
<formula>formula see original document page 9</formula>
其中R1和R2以及X具有上述定義的含義，并且R3=CH2-CH2-NH2 或CH2CH2-N(CH3)3。
令人驚訝地發(fā)現(xiàn)BMO劇烈地改變由起始磷脂酰膽堿表示的反應(yīng)底 物，測定這種變化以便酶PLD作用顯著地增加了 PS的最終產(chǎn)率，因此使 工業(yè)規(guī)模制備PS具有很大優(yōu)勢。這種基本改變發(fā)生在底物本身結(jié)構(gòu)中， 而與酶反應(yīng)發(fā)生的介質(zhì)無關(guān)。事實上，BMO能使PC小泡裂開從而使得酶 在其中穿透，因此通過穿透進入小泡確定PC轉(zhuǎn)化為PS的百分數(shù)的增加， PLD酶還可以作用于先前親水溶液(例如包含酶本身的溶液)無法穿透的小 泡內(nèi)的脂質(zhì)層。
根據(jù)本發(fā)明，在含水醇和非質(zhì)子介質(zhì)中以及在兩相體系中試驗了多種 二價金屬氧化物，例如氧化鈣(CaO)、氧化鎂(MgO)和氧化鋅(ZnO)，相比 使用相同方法但在氯化鈣(CaCl2)的存在下的方法獲得的結(jié)果，它們?nèi)缦旅?實施例顯示的那樣給出了很好的結(jié)果。
事實上，已知鈣鹽、并且特別是CaCl2作為釣離子的來源加入到轉(zhuǎn)磷 脂?；磻?yīng)發(fā)生的介質(zhì)中(Comfurius P.等人，Journal of Lipid Research 1990， 31: 1719-1721; Comfurius P.等人，Biochim Biophys Acta, 1977， 488: 36-42)，促進PLD酵的催化活性并且因此增加了磷脂酰膽堿轉(zhuǎn)化為 PS(Okawa Y,等人；JBiochem.; 1975; 78: 363-372)。
為了區(qū)別和闡明BMO是完全不同于金屬鹽并且演示它們在新制* 系中的效率(這是本發(fā)明的目的)，申請人已經(jīng)進行了將在鈣鹽的存在下和 在BMO的存在下由PC轉(zhuǎn)化為PS所獲得的不同產(chǎn)率進行比較的試驗。
如從獲得的結(jié)果中看到，磷脂酰膽堿轉(zhuǎn)化為PS的產(chǎn)率一致證明不僅 完全不一樣，而且顯然且顯著高于由CaCl2獲得的產(chǎn)率。
除了上述的氧化物，在制備PS的新方法中可以使用多種不同BMO， 例如元素表中的氧化錳、二價鐵氧化物、氧化鈷、氧化銅和其它二價金屬 氧化物。
本發(fā)明方法可以在其中進行的溶劑的實例是脂族醇，例如甲醇、乙醇、 正丙醇、異丙醇；非質(zhì)子極性溶劑，例如二曱亞砜(DMSO)、 二甲基甲酰 胺、乙腈、N-曱基-吡咯烷酮；以及有機溶劑，例如正己烷、甲苯、正丁醇、 苯。
優(yōu)選的醇是異丙醇，優(yōu)選非質(zhì)子溶劑是DMSO并且優(yōu)選的有機溶劑是己坑。
實施例1描述了在包含乙酸鹽緩沖液的起始溶液(其中溶解了 CaO(或 MgO或ZnO))中加入包含給定百分數(shù)的異丙醇的含水醇介質(zhì)開始，將PC 轉(zhuǎn)化為PS，將該方法與在相同含水醇介質(zhì)中但在CaCl2鹽的存在下進行的 PS制備方法相比較。
可用于本方法的醇(特別是異丙醇)的百分數(shù)(以占起始緩沖液體積的％ 體積表示)可以從0.1至50%不同，優(yōu)選從1.25%至20%，并且最優(yōu)選10%, 在包含一定濃度BMO(特別是CaO)的含水醇介質(zhì)中其濃度在0.1至1 M之 間不同，優(yōu)選在0.3至0.6 M之間并且最優(yōu)選等于0.54 M。
PC轉(zhuǎn)化為PS的最高產(chǎn)率是卯％，這遠高于在相同的制備方法中但在 CaCl2的存在下獲得的產(chǎn)率。
另 一方面，實施例2演示了通過在包含給定摩爾濃度的CaO(或MgO 或ZnO)的起始緩沖液中加入給定量的DMSO(以占所用緩沖液體積的％體 積表示)獲得PC/PS轉(zhuǎn)化的產(chǎn)率高于80%是可能的，并且上述的PS產(chǎn)率是 非常不同于在相同制備方法中但在CaCl2的存在下獲得的產(chǎn)率。
所用的非質(zhì)子溶劑(特別是DMSO)的百分數(shù)可以從0.1至50%不同，
優(yōu)選從1.25至10%,并且最優(yōu)選1.25%，在包含一定濃度BMO(特別是 CaO)的非質(zhì)子介質(zhì)中其濃度在0.1至l M之間不同，優(yōu)選在0.3至0.6 M 之間并且更優(yōu)選等于0.33 M。
轉(zhuǎn)磷脂酰化的酶反應(yīng)甚至是在包含水/有機溶劑的兩相體系中能獲得 很高的PC/PS轉(zhuǎn)化產(chǎn)率。
實施例3描述了在包含7JC/己烷的兩相體系中并且再次在CaO、 MgO 和ZnO的存在下PS的制備。在新方法中所用溶劑的量(這是本發(fā)明的目的) 是很少的(如下文所演示的)，如此少量以至于制備成本有限并且從終產(chǎn)物 中除去溶劑并不困難。
在所述方法中使用的溶劑的濃度可以從0.1至40% v/v(以占起始緩沖 液體積的％體積表示)不同，優(yōu)選從l至5。/。v/v，并且最優(yōu)選1.25% v/v和 2.5% v/v，在一定濃度BMO(特別是CaO)的存在下其濃度在0.1至1 M之 間不同，優(yōu)選在0.3至0.6 M之間并且最優(yōu)選等于0.54 M。
在這種情況下PC轉(zhuǎn)化為PS的最高產(chǎn)率也高于80%，并且非常不同 于在相同方法中但在CaCl2的存在下獲得的產(chǎn)率。
轉(zhuǎn)磷脂?；磻?yīng)可以在不同溫度下進行，溫度范圍在20至70。C之間， 優(yōu)選45或55'C。
起始磷脂底物是由純化形式或作為原料存在的動物和/或植物源的天 然的或合成的磷脂酰膽堿表示，磷脂酰膽堿的起始濃度范圍在10至500 mg/mL之間，優(yōu)選在200至300 mg/mL之間。
與醇、非質(zhì)子溶劑或有機溶劑混合/聯(lián)合以獲得含水醇、非質(zhì)子或兩相
最終介質(zhì)的起始含水介質(zhì)由水或未緩沖的鹽水溶液或例如由乙酸鈉三7jC合
物和乙酸在濃度0.02至0.2 M之間形成的緩沖g示。
羥基接受體由絲氨g示，其可以以D、 L或外消旋形式存在。絲氨 酸的最佳濃度(優(yōu)選以L形式表示)可以在1 g/g(gg)起始磷脂至至多5 gg不 同，優(yōu)選在2 gg至3 gg(起始磷脂)。
緩沖液的最佳pH可以在4至9之間不同，因為這取決于所用PLD的 來源，但優(yōu)選在5至6之間，并且如果使用從微生物5^印似veW,W/""附 /iflc/^Mw^發(fā)酵得到的PLD,最優(yōu)選pH等于5.6。
所述的酶可以以純化的或部分純化的形式使用，或者以從其培養(yǎng)液中 簡單過濾;微生物之后的非純化的形式使用。
實施例4(和圖l)描述了用于部分純化PLD以^得酶的新體系，該酶 基本上沒有被可能千擾PLD催化活性的不同性質(zhì)的蛋白污染，描述了沒有 涉及太多步驟的方法，因為冗長的方法會導(dǎo)致過度的工業(yè)成本從而缺乏工 業(yè)規(guī)4莫制備的可4亍性。
實施例4描述的部分純化的酶用實施例3描述的制備方法試驗，與非 純化形式(簡單除去產(chǎn)酶微生物之后)的酶和高純化的酶制備(使用離子交換 色譜樹脂和直接識別PLD酶的單/多克隆抗體獲得的，但是還可以使用本 領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的所有純化方法)相比較對于所有試驗的酶制備(純化 的、部分純化的和非純化的)，PC/PS轉(zhuǎn)化百分數(shù)是相等的。
為了確保PC轉(zhuǎn)化為PS高于80%， PLD的最佳量范圍在1至100單 位/g起始磷脂，因為這取決于所用PLD的來源。例如，當使用 5^印toveW/"7/Z"附/rflc/^V eww的PLD時，最4圭濃度范圍在1至10單位/g 磷脂之間不同。
本發(fā)明的另外的目的是從轉(zhuǎn)磷脂酰化反應(yīng)發(fā)生的介質(zhì)中殘留的絲氨 酸、PC和PLD(這些表示雜質(zhì))中分離和純化PS。 為了分離和純化PS，開發(fā)了下面方法。
1.在轉(zhuǎn)磷脂?；磻?yīng)后，通過向反應(yīng)介質(zhì)(其中存在新產(chǎn)生的磷脂)中 加入濃度2至6%(優(yōu)選5%)的氯化鈉溶液來分離PS:因此獲得兩相，因為 PS在該溶液中不溶而殘留組分(大部分是可溶的)主要留在下層清液中。然 后通過分離并且除去下層清液來獲得沉積于反應(yīng)介質(zhì)上層部分的PS。
或者，啟動新的PS分離和純化方法是可能的(本發(fā)明目的)，該方法是 通過過濾反應(yīng)介質(zhì)中的PS包涵體以立即除去所有殘留組分。然后加入 NaCl溶液。形成兩相并且除去上層清液，因為PS存在于下層清液中。NaCl 洗滌可以重復(fù)兩次或多次，如果需要調(diào)節(jié)鹽濃度。如實施例5演示的，這 些洗滌^作能完全除去該方法中使用的醇類、非質(zhì)子和有機溶劑，以制備 上述的PS。隨后在用螯合劑處理反應(yīng)介質(zhì)中存在的離子，用乙醇溶液(百 分數(shù)50至100%,優(yōu)選95%)或用在水中的酮溶劑(例如丙酮)混合物(百分
數(shù)50至95%)沉淀/洗滌產(chǎn)物；乙醇洗滌可以重復(fù)數(shù)次(如果需要調(diào)節(jié)乙醇 的百分數(shù))。最后，用卯至100。/。的乙醇進行最后的洗滌，之后終產(chǎn)物可以 或不可以千燥。
2.在轉(zhuǎn)磷脂?；磻?yīng)后，通過^f吏用孔徑例如能透過小分子同時能截留 大分子的多孔膜的超濾法實現(xiàn)PS的分離和純化?；谶@個原因，優(yōu)選4吏 用孔徑小至足以截留分子量為100,000/300,000道爾頓或更大的分子的濾 膜。
用于PS的分離和純化的所述的方法能除去酶反應(yīng)后留下的并且起初 包含在轉(zhuǎn)磷脂酰化介質(zhì)中的底物殘留物，例如絲氨酸、PC、無機鹽、PC
釋放的膽堿、PA、鹽/氧化物，總之所述的方法能從PLD酶中完全純化PS, 正如實施例5演示的沒有殘留痕量PLD酶。因此獲得最終PS具有4艮高的 純度。
一些抗氧化劑(例如抗壞血酸和/或維生素E)可以包括在制備和純化PS 的方法中。
下列實施例更詳細地7>開了本發(fā)明。 實施例1
在包含0.54 M CaO、 MgO和ZnO或0.54 M CaCl2的含水醇介質(zhì)(在 異丙醇的存在下)中從植物PC制備PS
制備兩種不同的含水醇溶液，該溶液是通過在包含0.54 M CaO(或 MgO或ZnO)的乙酸鹽緩沖液中加入兩種濃度的異丙醇(等于起始緩沖液 體積的1.25和10%)形成的，與通it^目同方法但在0.54 M CaCl2鹽的存在 下制備PS相比較。
將試驗氧化物和氯化鉤溶于40 mL 0.2 M乙酸鹽緩沖液(pH 5.6)中，然 后加入0.5 mL異丙醇以達到1.25% v/v(僅對于CaO)，或者加入4 mL異 丙醇以達到10% v/v(醇也可以在絲氨酸溶解后加入到包含BMO的緩沖液中)。
將產(chǎn)生的溶液在裝有冷凝器的夾套反應(yīng)器中攪拌約10分鐘，然后在溫 度為55C下加入20 g L-絲氨酸，攪拌直至完全溶解。隨后，加入10 g大 豆磷脂酰膽堿并且攪拌10分鐘。然后按每gg PC加入5.5 U PLD酶并且將混合物在55'C下攪拌24-48小時。
最后，取出每個產(chǎn)物的樣品并且通過薄層色譜法(TLC)試驗PC成功轉(zhuǎn) 化為PS。
PC轉(zhuǎn)化為PS的產(chǎn)率
反應(yīng)后存在的產(chǎn)物分布，以在轉(zhuǎn)磷脂酰化方法后獲得的PA(PC釋放出 的磷脂酸，作為PLD作用的結(jié)果)和PS的百分數(shù)表示。PA和PC被認為 M應(yīng)的殘留物。
用1.25% v/v異丙醇，在CaO的存在下獲得的PC轉(zhuǎn)化為PS的產(chǎn)率 PA 8.0% PS 85.5% PC 6.5%
用10% v/v異丙醇，在CaO的存在下獲得的PC轉(zhuǎn)化為PS的產(chǎn)率 PE-OH 4.0% PA 3.5% PS 89.5% PC 3.0%
用10% v/v異丙醇，在CaCl2的存在下獲得的PC轉(zhuǎn)化為PS的產(chǎn)率 PE-OH 15.8% PA 10.7% PS 70.1% PC 3.4%
用10% v/v異丙醇，在MgO的存在下獲得的PC轉(zhuǎn)化為PS的產(chǎn)率 PE-OH 9.0% PA 4.5% PS 84.0% PC 2.5%
用10% v/v異丙醇，在ZnO的存在下獲得的PC轉(zhuǎn)化為PS的產(chǎn)率 PE-OH 10,0% PA 8.0% PS 80.0% PC 2.0%(在轉(zhuǎn)磷脂?；磻?yīng)過程中產(chǎn)物定義為PE-OH，因為反應(yīng)是在醇的存 在下發(fā)生的)。 實施例2
在包含0.33 M CaO、 MgO和ZnO或0.33 M CaCl2的非質(zhì)子介質(zhì)(在 DMSO的存在下)中從植物PC制備PS
使用濃度占起始緩沖液體積的1.25至10%之間不同的DMSO，在所 有情況下在0.33 M CaO(或MgO或ZnO)的存在下，與通過相同方法但在 CaCl2鹽的存在下制備PS相比較。
將試驗的氧化釣和氯化4丐溶于40 mL 0.2 M, pH 5.6乙酸鹽緩沖液中。 將獲得的溶液在裝有冷凝器的夾套反應(yīng)器中攪拌。約10分鐘攪拌后，在溫 度為45°C時加入20 g L-絲氨酸并且繼續(xù)攪拌直至完全溶解。
隨后，加入10 g大豆PC和0.5 mL DMSO(相應(yīng)于1.25% v/v)或4 mL DMSO(相應(yīng)于10% v/v)并且攪拌混合物(如先前實施例，可以在方法起始 階段并且在BMO溶解后加入DMSO)。 10分鐘后掩爭gg PC加入5.5 U PLD酶并且將混合物在45C下攪拌24-48小時。
隨后，在反應(yīng)完成后取出獲得的各自產(chǎn)物的樣品并且試驗PC成功轉(zhuǎn) 化為PS。
PC轉(zhuǎn)化為PS的產(chǎn)率
用1.25% v/v DMSO,在CaO的存在下獲得的PC轉(zhuǎn)化為PS的產(chǎn)率 PA 7.1% PS 86.3% PC 6.6%
用1.25% v/v DMSO，在CaCl2的存在下獲得的PC轉(zhuǎn)化為PS的產(chǎn)率 PA 8.1% PS 66.7% PC 25.2%
用10% v/v DMSO，在CaCl2的存在下獲得的PC轉(zhuǎn)化為PS的產(chǎn)率 PA 6% PS 69% PC 25%用10% v/v DMSO，在CaO的存在下獲得的PC轉(zhuǎn)化為PS的產(chǎn)率 PA 7.5% PS 72.5% PC 20%
用10% v/v DMSO，在MgO的存在下獲得的PC轉(zhuǎn)化為PS的產(chǎn)率 PA 9.0% PS 71.0% PC 20%
用10% v/v DMSO，在ZnO的存在下獲得的PC轉(zhuǎn)化為PS的產(chǎn)率 PA 8.5% PS 71.5% PC 20% 實施例3a
在包含0.54 M CaO、 MgO和ZnO或0.54 M CaCl2的兩相體系(在有 機溶劑、己烷的存在下)中從植物PC制備PS
制備包含0.54 M CaO(或MgO或ZnO)的乙酸鹽緩沖液的兩相體系， 然后加入等于緩沖^始體積1.25%量的己烷，與如果相同制備方法但在 0.54 M CaCl2的存在下制備PS相比較。
然后將試驗的氧化物和氯化鈣溶于40 mL 0.2 M乙酸鹽緩沖液(pH 5.6) 中，然后加入0.5mL己烷以達到1.25% v/v(選擇的有機溶劑可以在絲氨酸 溶解前或后加入到包含BMO的緩沖液中)。
將獲得的溶液在裝有冷凝器的夾套反應(yīng)器中攪拌。
然后按實施例1描述的繼續(xù)操作。
最后，取出獲得的每個產(chǎn)物的樣品并且試驗PC成功轉(zhuǎn)化為PS。 PC轉(zhuǎn)化為PS的產(chǎn)率
用1.25% v/v己烷，在CaO的存在下獲得的PC轉(zhuǎn)化為PS的產(chǎn)率 PA 7.5% PS 87.0% PC 5.5%
用1.25% v/v己烷，在CaCl2的存在下獲得的PC轉(zhuǎn)化為PS的產(chǎn)率PA 8.1% PS 68.4% PC 23.5%
用1.25% v/v己烷，在MgO的存在下獲得的PC轉(zhuǎn)化為PS的產(chǎn)率 PA 8.5% PS 82.5% PC 9.0%
用1.25% v/v己烷，在ZnO的存在下獲得的PC轉(zhuǎn)化為PS的產(chǎn)率 PA 11.0% PS 80.0o/o PC 9.0% 實施例3b
在包含0.54 M CaO或0.54 M CaCl2的兩相體系(在有機溶劑、己烷的 存在下)中從植物PC制備PS
制備包含0.54 M CaO乙酸鹽緩沖液的兩相體系，然后加入等于緩沖 ^^始體積2.5%量的己烷，與通過相同制備方法但在0.54 M CaCh的存 在下制備PS相比較。從這點開始，操作與實施例3a相同。
PC轉(zhuǎn)化為PS的產(chǎn)率
用2.5% v/v己烷，在CaO的存在下獲得的PC轉(zhuǎn)化為PS的產(chǎn)率 PA 7.5% PS 86.0% PC 6.5%
用2.5% v/v己烷，在CaCl2的存在下獲得的PC轉(zhuǎn)化為PS的產(chǎn)率 PA 10.0% PS 65.0% PC 25,0% 實施例4
PLD酶的部分純化
在新的制備方法中使用的PLD酶可以通過下面步驟部分純化 通過切向流;微過濾穿過孔徑為0.2 nm的濾膜(優(yōu)選聚醚砜膜PES) 除去產(chǎn)生的試劑；
切向流超濾穿過分子截留為10，000D的濾膜(優(yōu)選PES);
切向流超濾穿過分子截留為30，000D的濾膜(優(yōu)選PES);
最終切向流超濾穿過分子截留為10,000 D的濾膜(優(yōu)選PES)以再濃 縮酶并且用50 mM pH=8的TRIS-HCL緩沖液透析。


圖1顯示的是上述部分純化的酶PLD的色語分析的發(fā)現(xiàn)，與從產(chǎn)生酶 本身的試劑中單獨純化的發(fā)酵培養(yǎng)液的分析相比(圖2)。
實施例5a
根據(jù)方法1的PS的分離和純化
向已完成制備PS的反應(yīng)介質(zhì)中補充1.5體積(占起始反應(yīng)體積)的5% NaCl溶液，并且將混合物在溫度為30X:下攪拌至少30分鐘。然后通過分 離和除去下層清液來分離沉積于反應(yīng)介質(zhì)上層部分的PS。向上清液(PS)中 補充4體積的3o/。NaCI溶液，并且在30士10X:下攪拌至少30分鐘。隨后， 分離并且除去上清液(該步驟重復(fù)2次)，同時向下層清液(由PS表示)中力口 入2體積的在0.1 M pH 7.5的乙酸鹽緩沖液中制備的EDTA(乙二胺四乙酸) 溶液(濃度為40 gg/升)。
進一步攪拌混合(在25士10。C下至少1小時)后，獲得混合物，將pH調(diào) 至7/7.5并且加入2體積(占EDTA的體積)的95%乙醇，在25士10。C下將混 合物攪拌至少1小時。
在PS沉淀一段時間后，收集PS并且除去上清液(包含在水中的乙醇 的相)，因為PS不溶于含水醇相。用乙醇/水(乙醇百分比為70-95%)反復(fù)洗 滌，然后用100%乙醇進行最后洗滌，并且作為最后一步，可以干燥PS。
終產(chǎn)物:方法1分離的脂類部分的分布，并且如實施例3描述的用0.54 M CaO制備PS。
PA 5.8%
PS 94,2%
實施例5b
根據(jù)方法1的PS的分離和純化
向已完成制備PS的反應(yīng)介質(zhì)中補充1.5體積(占起始反應(yīng)體積)的5% NaCl溶液，并且將混合物在溫度為20。C下攪拌至少30分鐘。然后通過分
離和除去下層清液來分離沉積于反應(yīng)介質(zhì)上層部分的PS。向上清液(PS)中 補充3體積的3% NaCl溶液，并且在20士10'C下攪拌至少30分鐘。隨后， 分離并且除去(該步驟重復(fù)3次)上清液，同時向下層清液(由PS表示)中加 入3體積的在0.1 M pH 7.0的乙酸鹽緩沖液中制備的EDTA溶液(濃度為 鄧gg/升)。
進一步攪拌混合(在20士10X:下至少1小時)后，獲得混合物，將pH調(diào) 至7/7.5并且加入2體積(占EDTA的體積)的100%乙醇，在20土10t:下將 混合物攪拌至少1小時。
在PS沉淀一段時間后，收集PS并且除去上清液(包含在水中的乙醇 的相)。用乙醇/水(乙醇百分比為70%)反復(fù)洗滌，然后用100%乙醇進行最 后洗滌，并且作為最后一步，可以干燥PS。
終產(chǎn)物:方法1分離的脂類部分的分布，并且如實施例3描述的用0.54 MCaO制備PS。
PA 6.8%
PS 93.2%
實施例5c
根據(jù)方法1的PS的分離和純化
在加入NaCl溶液前，將PS過濾以立即除去反應(yīng)介質(zhì)的所有殘留組分。 然后加入NaCl并且如實施例5a描述的繼續(xù)分離和純化方法。
終產(chǎn)物:方法1分離的脂類部分的分布，并且如實施例3描述的用0.54 MCaO制備PS。
PA 5.0%
PS 95.0%
在轉(zhuǎn)磷脂?；磻?yīng)后，獲得的產(chǎn)物的TLC分析(Vitello F.等人；J Chromatog; 1978; 166(2):637-40)顯示殘留絲氨酸的濃度為2%。
在該相中PLD的量通過描述的技術(shù)方法(Aurich I.等人；Anal Biochem; 1999; 268:337-342)確定并且顯示為2 U/g。
絲氨酸濃度在先前描述的PS純化方法完成后再次測定并且顯示為低 于/等于0.2%。
PLD酶的殘留活性也再次測定并且顯示為低于該方法的檢測限。
為了證明完全不存在甚至最小痕量的有機溶劑(在制備PS方法中(實施 例3描述的)使用該溶劑)，因此采用新穎的并且創(chuàng)造的本發(fā)明步驟，申請 人在鄰近加入醇溶液之前的時期分析實施例5描述的部分純化的PS。
如歐洲藥典5.0，第2.4.24部分殘留溶劑的鑒定與控制中描述的通過 已知的"靜止頂空注射氣相色鐠"技術(shù)進行該分析。
校正色譜圖(圖3)是通過使用包含乙酸乙酯和正己烷(每個相應(yīng)于1000 ppm，相當于100 mg試驗產(chǎn)物)的標準樣品獲得的。
圖4顯示方法1純化的PS中完全不存在正己烷。
實施例6
根據(jù)方法2的PS的分離和純化
向已完成制備PS的反應(yīng)介質(zhì)中補充1.5體積(占起始反應(yīng)體積)的5% NaCl溶液，并且將整體在45"C下攪拌至少30分鐘，然后PS的分離持續(xù) 至少1小時。
兩相的形成將其分離并且丟棄下層清液，同時向上清液中補充2.5 倍體積的在水中制備的EDTA溶液(濃度為22 gg/L)。 一旦溫度達到28"C ， 進行超濾。優(yōu)選^f吏用孔徑能截留分子量為100，000/300，000道爾頓的分子的濾膜。
然后可以冷凍干燥終產(chǎn)物。
終產(chǎn)物:方法2分離的脂類部分的分布，并且例如實施例l描述的用 0.54MCaO制備PS。 PA 6.0% PS 94,0%
絲氨酸濃度在先前描述的PS純化方法完成后測定并且顯示為低于/等 于0.2%,同時進一步測定PLD酶的殘留活性并且顯示為低于該方法的檢 測限。
權(quán)利要求
1.制備下式磷脂酰絲氨酸的方法id="icf0001" file="S2006800186998C00011.gif" wi="73" he="30" top="5" left = "5" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>其中R1和R2獨立地表示飽和的、單不飽和的或多不飽和的?；鵆10-C30，X＝OH或OM，其中M＝堿或堿土金屬、銨、烷基銨(包括內(nèi)鹽)，該方法包括以下通式的磷脂酰膽堿與D、L或外消旋形式的絲氨酸之間的轉(zhuǎn)磷脂?；磻?yīng)id="icf0002" file="S2006800186998C00012.gif" wi="35" he="29" top="5" left = "5" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>其中R1和R2以及X具有上述特別的含義，并且R3＝CH2-CH2-NH2或CH2-CH2-N+(CH3)3，該反應(yīng)是通過磷脂酶D酶(PLD)催化的，其特征在于所述的反應(yīng)是在包含脂族醇的含水醇介質(zhì)中并且在二價金屬氧化物的存在下進行的。
2. 權(quán)利要求l的方法，其特征在于所述的反應(yīng)是在包含非質(zhì)子極性溶 劑的介質(zhì)中并且在二價金屬氧化物的存在下進行的。
3. 權(quán)利要求l的方法，其特征在于所述的反應(yīng)是在包含水/有機溶劑形 成的兩相體系的介質(zhì)中并且在二價金屬氧化物的存在下進行的。
4. 權(quán)利要求l的方法，其中脂族醇選自甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇。
5. 權(quán)利要求4的方法，其中脂族醇是異丙醇，其濃度在0.1至50%之 間，以占起始緩沖液體積的％體積表示。
6. 權(quán)利要求5的方法，其中異丙醇的濃度是10%。
7. 權(quán)利要求2的方法，其中非質(zhì)子極性溶劑選自二甲亞砜、乙腈、二 甲基甲酰胺和N-甲基-吡咯烷酮。
8. 權(quán)利要求7的方法，其中非質(zhì)子極性溶劑是二甲亞砜，其濃度在0.1 至50%之間，以占起始緩沖液體積的％體積表示。
9. 權(quán)利要求8的方法，其中二甲亞砜的濃度是1.25%。
10. 權(quán)利要求3的方法，其中有機溶劑選自正己烷、甲苯、苯和正丁醇。
11. 權(quán)利要求10的方法，其中有機溶劑是正己烷，其濃度在0.1至40%之間，以占起始緩沖液體積的。/o體積表示。
12. 權(quán)利要求ll的方法，其中正己烷的濃度是1.25%或2.5%。
13. 前述權(quán)利要求的方法，其中二價金屬氧化物是鈞或鎂或鋅的氧化 物，其濃度在0.1至1M之間。
14. 權(quán)利要求13的方法，其中所選的氧化物的濃度是0.33或0.54 M。
15. 權(quán)利要求l-3的方法，其中絲氨酸的濃度范圍在l至5gg/gg磷脂 酰膽堿之間。
16. 權(quán)利要求15的方法，其中絲氨酸的濃度范圍在2至3 gg/gg磷脂 酰膽堿之間。
17. 權(quán)利要求1-3的方法，其中磷脂酰膽堿是以純化形式或作為原料存 在的動物和/或植物來源的天然的或合成的，其起始濃度在10至500 mg/mL 之間，優(yōu)選在200至300mg/mL之間。
18. 所有前述權(quán)利要求的方法，其中轉(zhuǎn)磷脂?；磻?yīng)是在溫度為20°C 至60。C之間并且優(yōu)選在45。C下發(fā)生的。
19. 所有上述權(quán)利要求的方法，其中轉(zhuǎn)磷脂?；磻?yīng)是在溫度為20°C 至60 °C之間并且優(yōu)選在55°C下發(fā)生的。
20. 所有前述權(quán)利要求的方法，其中酶PLD是衍生自微生物&"/7toveW/d///MW/^"c/^》e"Se的發(fā)酵來源的酶，該酶以純化的、部分純化 的或未純化的形式使用。
21. 權(quán)利要求20的方法，其中所用的PLD的濃度在1至100單位/g 磷脂酰膽堿之間不同。
22. 權(quán)利要求21的方法，其中所用的PLD的濃度在1至10單位/g磷 脂酰膽堿之間不同。
23. 純化根據(jù)所有前述權(quán)利要求制備的磷脂酰絲氨酸(PS)的方法，并且 該方法涉及下面步驟I) 在包含已完成制備的PS的反應(yīng)介質(zhì)中加入氯化鈉鹽水溶液， 混合并且分離PS;II) 收集并且除去下層清液；III) 可以重復(fù)步驟I和II，改變氯化鈉溶液的起始濃度并且除去上清液；IV) 加入EDTA溶液以螯合溶液中存在的離子，并且隨后混合；V) 加入包含乙醇百分數(shù)為50至100%的乙醇溶液或包含丙酮百分數(shù) 為50至95%的丙酮/水的混合物，混合并且沉淀PS;VI) 可以重復(fù)步驟V，改變乙醇的百分數(shù)；VII) 加入包含乙醇百分數(shù)為90至100%的乙醇溶液；VIII) 收集并且除去上清液；IX) 干燥獲得的終產(chǎn)物。
24. 純化根據(jù)權(quán)利要求1-22制備的磷脂酰絲氨酸(PS)的方法，并且該 方法涉及下面步驟I) 在先前已過濾的PS中加入氯化鈉鹽水溶液，隨后混合并且分離PS;II) 收集并且除去上清液；III) 可以重復(fù)步驟I和II，改變氯化鈉溶液的起始濃度并且除去上清液；IV) 加入EDTA溶液以螯合溶液中存在的離子，并且隨后混合；V) 加入包含乙醇百分數(shù)為50至100%的乙醇溶液或包含丙酮百分數(shù) 為50至95%的丙酮/水的混合物，隨后混合并且沉淀PS;VI) 可以重復(fù)步驟V，改變乙醇的百分數(shù)；VII) 加入包含乙醇百分數(shù)在卯至100%的乙醇溶液；VIII) 收集并且除去上清液；IX) 干燥獲得的終產(chǎn)物。
25. 純化根據(jù)權(quán)利要求1-22制備的磷脂酰絲氨酸(PS)的方法，該方法 涉及下面步驟 I) 在包含已完成制備的PS的反應(yīng)介質(zhì)中加入氯化鈉鹽水溶液， 混合并且分離PS;II) 收集并且除去下層清液；III) 加入氯化鈉鹽水溶液并且通過多孔膜進行超濾；IV) 干燥終產(chǎn)物。
26. 藥物組合物，該藥物組合物包含如所有前述權(quán)利要求描述制備和 純化的磷脂酰絲氨酸。
27. 如所有前述權(quán)利要求描述制備和純化的磷脂酰絲氨酸在制備用于 預(yù)防和治療與大腦老齡化相關(guān)的病理學(xué)的藥物中的用途。
28. 如所有前述權(quán)利要求描述制備和純化的磷脂酰絲氨酸在制備食物 補充劑中的用途。
29. 如所有前述權(quán)利要求描述制備和純化的磷脂酰絲氨酸在制備用于 美容領(lǐng)域以及作為藥物控釋系統(tǒng)的脂質(zhì)體中的用途。
30. 權(quán)利要求20的方法，其中衍生自孩i生物5^印toveW/"7/Z"附的酶PLD的純化涉及下面步驟I) 通過孔徑為0.2 nm的微過濾除去產(chǎn)生的試劑；II) 用分子截留為IO，OOOD的濾膜超濾；III) 用分子截留為300,000 D的濾膜超濾；IV) 用分子截留為10,000 D的濾膜超濾以再濃縮酶并且用酸性緩沖液 透析。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備式CH₂OR¹ CHOR²CH₂O-P(＝O)-OCH₂-CH(NH₂)-COOHX的磷脂酰絲氨酸的方法，其中R¹和R²獨立地表示飽和的、單不飽和的和/或多不飽和的酰基C₁₀-C₃₀，X＝OH或OM，其中M＝堿或堿土金屬、銨、烷基銨(包括內(nèi)鹽)，該方法包括通式CH₂OR¹CHOR²CH₂O-P(＝O)-OR³X的磷脂酰膽堿(其中R¹和R²以及X具有上述特別的含義，R³＝CH₂-CH₂-NH₂或CH₂-CH₂-N⁺(CH₃)₃)與D、L或外消旋形式的絲氨酸之間的轉(zhuǎn)磷脂?；磻?yīng)，該反應(yīng)是通過磷脂酶D酶(PLD)催化的，其特征在于所述的反應(yīng)是在包含脂族醇的含水醇介質(zhì)中并且在二價金屬氧化物的存在下進行的。
文檔編號A61K31/685GK101184494SQ200680018699
公開日2008年5月21日 申請日期2006年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月30日
發(fā)明者A·M·贊納拉托, A·甘比拉拉, M·皮塔雷洛, S·瓦卡羅 申請人:菲迪雅制藥股份公司