專(zhuān)利名稱(chēng)：抗滑膜素抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗滑膜素抗體。更詳細(xì)地講，本發(fā)明涉及能抑制滑膜素自身泛素化的抗體，含有該抗體的醫(yī)藥組合物，應(yīng)用上述抗體檢測(cè)表達(dá)滑膜素的細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種關(guān)節(jié)的滑膜組織異常增殖的全身性炎癥性疾病?；ぜ?xì)胞(synovial cells)是一種成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，在關(guān)節(jié)的滑膜內(nèi)形成1～6層上皮樣細(xì)胞層，提供滑液中的蛋白聚糖和透明質(zhì)酸?？梢杂^察到RA患者的關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜組織增殖，結(jié)果引起多層結(jié)構(gòu)，滑膜細(xì)胞浸潤(rùn)到其它組織。此外，RA患者的血清中存在針對(duì)自身免疫球蛋白(IgG)Fc段的自身抗體。這種叫做RA因子的自身抗體很久以來(lái)已用作RA的特征性診斷指標(biāo)。
但是作為自身免疫性疾病的RA的病因尚未明確?；赗A因子檢測(cè)的RA診斷，并未闡明疾病特異性抗體的產(chǎn)生系統(tǒng)，因此，它與病因的關(guān)聯(lián)還不明確。
RA的病態(tài)/病情經(jīng)過(guò)從(a)生物體內(nèi)的多種免疫反應(yīng)，及(b)伴隨骨破壞的關(guān)節(jié)滑膜增殖這2個(gè)方面考慮，與前者免疫反應(yīng)相關(guān)的有許多研究，正在闡明其分子水平的本質(zhì)。但是，與后者關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞相關(guān)的研究，不局限于RA本身，其細(xì)胞生物學(xué)特征尚未明確。
因此為了闡明RA的發(fā)病經(jīng)過(guò)，本發(fā)明者們研究了慢性、難治性疾病的發(fā)病和進(jìn)展背后的分子機(jī)制。首先，以RA患者的人滑膜培養(yǎng)細(xì)胞作為免疫原，獲得抗人滑膜細(xì)胞抗體，與滑膜細(xì)胞的cDNA文庫(kù)進(jìn)行免疫篩選，尋找在RA患者的滑膜組織中表達(dá)的新基因。成功分離出該基因，鑒于表達(dá)其所編碼的蛋白質(zhì)的組織為滑膜細(xì)胞(synovial cell)，故將其命名為滑膜素(synoviolin)，闡明了其生理意義(WO02/052007號(hào)小冊(cè)子)。發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)的滑膜素，與作為RA疾病的主因的滑膜組織的異常增殖密切相關(guān)，期待在診斷中能提供重要信息。此外，通過(guò)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)得知，滑膜素編碼具有環(huán)指功能域(RING finger motif)的E3泛素連接酶。該功能域?qū)Φ鞍踪|(zhì)的泛素化發(fā)揮重要作用。實(shí)際上，證明它具有自身泛素化的活性，所以推測(cè)其對(duì)蛋白質(zhì)功能有調(diào)控作用。
本發(fā)明者們，在進(jìn)行滑膜素與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的研究時(shí)初次發(fā)現(xiàn)，滑膜素具有泛素化連接酶作用，能引起自身泛素化(self-ubiquitination)。
發(fā)明的公開(kāi)如上所述，期望開(kāi)發(fā)出能抑制滑膜素自身泛素化反應(yīng)的抗體、含有該抗體的醫(yī)藥組合物等。
為了解決上述課題，本發(fā)明者們進(jìn)行了廣泛研究，結(jié)果在滑膜素具有泛素化連接酶作用，能引起自身泛素化(self-ubiquitination)的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)了抑制滑膜素自身泛素化的抗體，從而完成了本發(fā)明。
也就是說(shuō)，本發(fā)明如下(1)一種能抑制滑膜素自身泛素化的、針對(duì)滑膜素的抗體或其片段。該抗體或其片段可以不影響滑膜素的底物蛋白質(zhì)的泛素化。此外，該抗體可以是單克隆抗體。
(2)上述能抑制滑膜素自身泛素化的抗體或其片段，是用包含序列號(hào)3～5任一項(xiàng)所示的氨基酸序列的多肽為抗原免疫動(dòng)物，通過(guò)其抗體產(chǎn)生細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞融合獲得的雜交瘤產(chǎn)生的、針對(duì)滑膜素的單克隆抗體或其片段。
(3)一種雜交瘤，是包含序列號(hào)3～5所示任一氨基酸序列的多肽作抗原免疫動(dòng)物，將免疫動(dòng)物的抗體產(chǎn)生細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合獲得的，它產(chǎn)生能抑制滑膜素自身泛素化的單克隆抗體。
(4)一種能抑制滑膜素自身泛素化的、針對(duì)滑膜素的單克隆抗體的制備方法，其特征在于，用包含序列號(hào)3～5所示任一氨基酸序列的多肽作抗原免疫動(dòng)物，培養(yǎng)其抗體產(chǎn)生細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合細(xì)胞，從所得培養(yǎng)物中獲取上述單克隆抗體。
(5)一種含有(1)或(2)中抗體或其片段的醫(yī)藥組合物。該醫(yī)藥組合物可用于治療或預(yù)防，例如細(xì)胞增殖性疾病關(guān)節(jié)炎、癌癥、纖維癥、動(dòng)脈硬化、Castleman病、多發(fā)骨髓瘤、局限性回腸炎、全身性若年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、腦腫瘤、舌癌、咽喉癌、肺癌、乳腺癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、膽道癌、膽囊癌、十二指腸癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、卵巢癌、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、橫紋肌肉瘤、纖維肉瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、皮膚癌、急性骨髓性白血病、急性淋巴性白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病、成人型T細(xì)胞白血病、惡性淋巴瘤。
(6)一種滑膜素自身泛素化的抑制劑，其含有(1)或(2)中的抗體或其片段。
(7)一種含滑膜素的細(xì)胞的檢測(cè)試劑，其含有(1)或(2)中的抗體或其片段。
(8)一種因滑膜素引起的細(xì)胞增殖性疾病的檢測(cè)用試劑，它含有(1)或(2)中的抗體或其片段。細(xì)胞增殖性疾病包括，例如關(guān)節(jié)炎、癌癥、纖維癥、動(dòng)脈硬化、Castleman病、多發(fā)骨髓瘤、局限性回腸炎、全身性若年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、腦腫瘤、舌癌、咽喉癌、肺癌、乳腺癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、膽道癌、膽囊癌、十二指腸癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、卵巢癌、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、橫紋肌肉瘤、纖維肉瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、皮膚癌、急性骨髓性白血病、急性淋巴性白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病、成人型T細(xì)胞白血病、惡性淋巴瘤等。另外，上述細(xì)胞選自滑膜細(xì)胞、破骨細(xì)胞、角化上皮細(xì)胞、血液細(xì)胞、癌細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、真皮細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、色素細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、子宮內(nèi)皮細(xì)胞、肺胞上皮細(xì)胞、未分化間質(zhì)系細(xì)胞、外胚層頂脊。
(9)一種抑制滑膜素自身泛素化的方法，其特征在于使(1)或(2)中的抗體或其片段與滑膜素進(jìn)行反應(yīng)。
(10)一種滑膜素表達(dá)細(xì)胞的檢測(cè)方法，其特征在于使(1)或(2)中的抗體或其片段與生物樣品進(jìn)行反應(yīng)。
(11)一種因滑膜素引起的細(xì)胞增殖性疾病的檢測(cè)方法，其特征在于讓(1)或(2)中的抗體或其片段與從待檢者采集的生物樣品進(jìn)行反應(yīng)。細(xì)胞增殖性疾病及細(xì)胞的種類(lèi)與前面相同。另外，上述細(xì)胞選自滑膜細(xì)胞、破骨細(xì)胞、角化上皮細(xì)胞、血液細(xì)胞、癌細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、真皮細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、色素細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、子宮內(nèi)皮細(xì)胞、肺胞上皮細(xì)胞、未分化間質(zhì)細(xì)胞、外胚層頂脊。
本說(shuō)明書(shū)中所引用的所有技術(shù)文獻(xiàn)均作為參考在此引用。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是用SL-1抗體對(duì)關(guān)節(jié)炎患者(RA2樣本)及變形性關(guān)節(jié)炎患者(OA2樣本)來(lái)源的滑膜細(xì)胞進(jìn)行Western印跡的結(jié)果照片圖。
圖2是用SL-1抗體對(duì)RA患者來(lái)源的滑膜細(xì)胞進(jìn)行熒光免疫染色的結(jié)果照片圖。
圖3是用SL-1抗體對(duì)RA患者來(lái)源的滑膜組織的免疫染色結(jié)果及HE染色圖像。
圖4是通過(guò)Western印跡分析SL-1抗體抑制MBP-dTM Syno-His融合蛋白自身泛素化的照片。
圖5是通過(guò)Western印跡分析SL-1抗體不影響因滑膜素引起的GST-P4HA1融合蛋白的泛素化的照片。
實(shí)施發(fā)明的最佳狀態(tài)以下對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
1.概要本發(fā)明的抗體是針對(duì)滑膜素的抗體，能夠抑制滑膜素的自身泛素化。是用滑膜素的RING finger區(qū)域的部分氨基酸序列構(gòu)成的肽作抗原進(jìn)行免疫而獲得的。
泛素化是在泛素活化酶(E1)、泛素偶聯(lián)酶(E2)、泛素連接酶(E3)等酶的共同作用下，使底物蛋白質(zhì)順次結(jié)合泛素的過(guò)程。泛素化的生理意義，傳統(tǒng)的認(rèn)識(shí)是作為標(biāo)簽修飾，將蛋白質(zhì)輸送到蛋白酶體系統(tǒng)的蛋白質(zhì)降解結(jié)構(gòu)中。通過(guò)后來(lái)的研究，現(xiàn)在的觀點(diǎn)是泛素化的意義在于，將其定位于調(diào)控蛋白質(zhì)功能的可逆性蛋白質(zhì)修飾系統(tǒng)。
本說(shuō)明書(shū)中“自身泛素化(self-ubiquitination，autoubiquitination)”是指由于滑膜素具有泛素連接酶活性，滑膜素自身成為泛素化的底物蛋白，不需其它泛素連接酶自己就能結(jié)合泛素。滑膜素的自身泛素化是由本發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)滑膜素具有連接酶活性而闡明的。也就是說(shuō)，在小鼠中，通過(guò)過(guò)表達(dá)滑膜素可自然發(fā)生伴隨滑膜細(xì)胞增殖的關(guān)節(jié)病(WO02/052007)(Amano T，et al.，Genes Dev.17(19)2436-49，2003)。另一方面，E3泛素連接酶的RING finger結(jié)構(gòu)域是酶的活性中心，即使該結(jié)構(gòu)域中僅1個(gè)氨基酸發(fā)生了置換完全失去酶活性。實(shí)際上，表達(dá)滑膜素的酶活性中心的1個(gè)氨基酸突變體(C307S)的小鼠中完全不出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎(如上，Amano T，等)。這提示自身泛素化對(duì)滑膜素的功能表達(dá)很重要，滑膜素的自身泛素化成為滑膜素的代表性功能。而且，其自身泛素化不僅能觀察到內(nèi)源性的滑膜素的全長(zhǎng)分子，而且還可產(chǎn)生僅滑膜素的胞內(nèi)部分與標(biāo)簽蛋白質(zhì)融合的滑膜素。在以上發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，本發(fā)明者們進(jìn)行廣泛研究，完成了本發(fā)明的抗體。
本發(fā)明中的“抗體”是指所有能與抗原滑膜素或其部分片段結(jié)合的抗體分子(既可以是多克隆抗體也可是單克隆抗體)，此外還包括其片段，即具有抗原抗體反應(yīng)活性的活性片段，具體而言，包括Fab、F(ab′)2、重組體Fv、單鏈Fv。
2.滑膜素(1)滑膜素及其等價(jià)的蛋白質(zhì)為了獲得滑膜素的抗體，除滑膜素之外，可應(yīng)用與之同等或等價(jià)的蛋白質(zhì)、它們的片段或部分肽等作為免疫原。它們中的任何一種均可成為抗滑膜素抗體的抗原。其理由是，與其說(shuō)，通常抗體是通過(guò)識(shí)別抗原蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)整體而誘導(dǎo)產(chǎn)生，倒不如說(shuō)，是通過(guò)識(shí)別作為表位部分的蛋白質(zhì)表面的微小區(qū)域而被誘導(dǎo)的。這些表位部位是由多肽鏈的連續(xù)部分或不連續(xù)部分而形成的。因此，對(duì)于滑膜素的一種類(lèi)型的抗體，作為表位發(fā)揮作用的部位對(duì)應(yīng)滑膜素的固定的肽部位。
本發(fā)明中使用的滑膜素的種類(lèi)，可以是人、小鼠、大鼠等來(lái)源的滑膜素，但并不限定于此。作為滑膜素，可使用例如包含序列號(hào)2中氨基酸序列多肽。
還可應(yīng)用與滑膜素同等或等價(jià)的蛋白質(zhì)作為抗原(如后述)。
(2)從生物樣品進(jìn)行制備可從RA患者的滑膜組織中獲得滑膜素。由于滑膜細(xì)胞可以在體外培養(yǎng)，所以可以從其培養(yǎng)物中回收滑膜素。具體而言，以通過(guò)外科滑膜切除術(shù)(synovectomy)從RA患者切除的滑膜組織等為基礎(chǔ)，從該組織中分離出滑膜細(xì)胞。若培養(yǎng)分離的細(xì)胞，可作為附著性細(xì)胞回收滑膜細(xì)胞。(Nakajima T et.al.，J.Clin.Invest.92186-193，1993)。可聯(lián)合應(yīng)用公知的蛋白質(zhì)純化技術(shù)從回收的細(xì)胞中提取、純化滑膜素。所得滑膜素或其片段可作為獲得抗體的免疫原。
(3)通過(guò)基因工程技術(shù)進(jìn)行制備滑膜素不僅可以從生物樣品獲得，也可將表達(dá)滑膜素的基因重組到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)體系中，作為基因重組體的表達(dá)產(chǎn)物而獲得。
編碼滑膜素的多聚核苷酸的來(lái)源不限。也就是說(shuō)，除基因組DNA、cDNA之外，也可合成。此外，核酸既可以是DNA，也可是RNA。只要是編碼滑膜素，包含基于遺傳密碼子簡(jiǎn)并的具有任意堿基序列的多聚核苷酸，或者含有修飾的核苷酸的序列。
分離編碼滑膜素的多聚核苷酸，可以從上述RA患者的滑膜細(xì)胞提取出的mRNA為基礎(chǔ)獲得cDNA文庫(kù)，進(jìn)行克隆。也就是說(shuō)，通過(guò)PCR等擴(kuò)增cDNA文庫(kù)，篩選雜交的克隆，獲得預(yù)期的多聚核苷酸(ShortJ.M，et.al.，Nucleic Acid Res.167583-7600，1988)。編碼序列號(hào)2中所示多肽的DNA的堿基序列示于序列號(hào)1中。作為將編碼滑膜素的多聚核苷酸重組到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)體系的合適的宿主/載體體系，具體實(shí)例有表達(dá)載體pGEX和大腸桿菌。
除此之外，利用細(xì)菌作宿主時(shí)，有商品化的利用His tag、HA tag、FLAG tag等的融合蛋白質(zhì)的表達(dá)載體。作為宿主/載體體系，利用畢赤酵母(Pichia)屬酵母的表達(dá)體系、或者以昆蟲(chóng)細(xì)胞作宿主的利用桿狀病毒載體的表達(dá)體系，可有效表達(dá)有糖鏈修飾的蛋白質(zhì)。再者，利用哺乳動(dòng)物的細(xì)胞，可進(jìn)行利用巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子、Rous肉瘤病毒(RSV)啟動(dòng)子、或者SV40等的啟動(dòng)子的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
另外，本發(fā)明中也可從上述滑膜素基因或上述載體收集滑膜素。也就是說(shuō)，本發(fā)明中通過(guò)無(wú)活細(xì)胞的無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成體系，可生產(chǎn)滑膜素。
無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成體系是應(yīng)用細(xì)胞提取液在試管等人工容器內(nèi)合成蛋白質(zhì)的體系。本發(fā)明中使用的無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成體系也包含以DNA為模板合成RNA的無(wú)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄體系。
該情況下，與上述宿主對(duì)應(yīng)的生物，相當(dāng)于下面細(xì)胞提取液的來(lái)源生物。此時(shí)，上面的細(xì)胞提取液可使用真核細(xì)胞來(lái)源的或原核細(xì)胞來(lái)源的提取液，例如使用小麥胚芽、兔網(wǎng)織紅細(xì)胞、小鼠L-細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、CHO細(xì)胞、芽殖酵母、大腸桿菌等的提取液。這些細(xì)胞提取液既可是濃縮的也可是未濃縮的。
細(xì)胞提取液可通過(guò)，例如超濾、透析、聚乙二醇(PEG)沉淀等獲得。此外，本發(fā)明中，也可應(yīng)用商品化的試劑盒進(jìn)行無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成。這樣的試劑盒包括，例如PROTEIOSTM(東洋紡)、TNTTMSystem(Promega)、合成裝置PG-MateTM(東洋紡)、RTS(Roche diagnostics)等。
通過(guò)如上細(xì)胞蛋白質(zhì)合成而獲得的滑膜素，可適當(dāng)選擇前述的色譜進(jìn)行純化。
(4)滑膜素具有同等功能的蛋白質(zhì)能成為制備抗滑膜素單克隆抗體的抗原的蛋白質(zhì)，不僅包含從滑膜細(xì)胞提取出的人滑膜素，還包含與滑膜素具有同等功能的各種蛋白質(zhì)。這樣的蛋白質(zhì)可以是人工合成的也可是天然產(chǎn)生的。還包含人滑膜素的氨基酸序列中因1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸發(fā)生置換、缺失、附加和/或插入等而發(fā)生突變的蛋白質(zhì)，或者氨基酸側(cè)鏈等發(fā)生修飾的修飾蛋白質(zhì)、與其它蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)。
這些蛋白質(zhì)中氨基酸的突變或修飾個(gè)數(shù)、或者突變或修飾部位無(wú)特殊限制，只要能保持滑膜素的功能即可。例如可使用序列號(hào)2中所示的氨基酸序列中因1個(gè)或幾個(gè)(例如1個(gè)或數(shù)個(gè))氨基酸發(fā)生置換、缺失、附加和/或插入等而突變的蛋白質(zhì)，或者氨基酸側(cè)鏈等發(fā)生修飾的修飾蛋白質(zhì)。
具體的講，可使用(i)序列號(hào)2中所示的氨基酸序列中1個(gè)或幾個(gè)(例如1個(gè)或數(shù)個(gè))(例如1～10個(gè)，優(yōu)選1～5個(gè))氨基酸缺失了的氨基酸序列；(ii)序列號(hào)2中所示的氨基酸序列中1個(gè)或幾個(gè)(例如1個(gè)或數(shù)個(gè)(例如1～10個(gè)，優(yōu)選1～5個(gè)))氨基酸被其它的氨基酸置換了的氨基酸序列；(iii)序列號(hào)2中所示的氨基酸序列中附加了1個(gè)或幾個(gè)(例如1個(gè)或數(shù)個(gè)(例如1～10個(gè)，優(yōu)選1～5個(gè)))其它氨基酸的氨基酸序列；(iv)包含組合了上述(i)～(iii)的氨基酸序列、且具有與上述滑膜素同樣作用的突變型滑膜素多肽。
另外，本發(fā)明中使用的多肽，只要其具有與滑膜素同等的功能，也可是與上述滑膜素的氨基酸序列具有同源性的多肽。包括與上述滑膜素多肽的氨基酸序列具有約85％以上、優(yōu)選約90％以上、更優(yōu)選約95％以上的同源性的氨基酸序列等。
編碼上述序列號(hào)2中所示氨基酸序列中1個(gè)或幾個(gè)氨基酸發(fā)生缺失、附加或插入的氨基酸序列的多聚核苷酸，可參照「Molecular Cloning，A Laboratory Manual 2nd ed.」(Cold Spring Harbor Press 1989)、「Current Protocols in Molecular Biology」(John Wiley&Sons 1987-1997)、Kunkel T.A，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82488-92，1985等中描述的位點(diǎn)特異性突變誘導(dǎo)方法等方法進(jìn)行制備。
另外，向多聚核苷酸中導(dǎo)入突變時(shí)可按照Kunkel法和Gappedduplex法等公知的技術(shù)方法，應(yīng)用利用了位點(diǎn)特異性突變誘導(dǎo)方法的突變導(dǎo)入試劑盒進(jìn)行，例如應(yīng)用QuikChangeTMSite-DirectedMutagenesis Kit(Stratagene公司)、GeneTailorTMSite-DirectedMutagenesis System(Invitrogen)、TaKaRa Site-Directed MutagenesisSystem(Mutan-K、Mutan-Super Express Km等TaKaRa公司)等。
上述“同等功能的蛋白質(zhì)”是指，第1，與滑膜素在免疫學(xué)上同等的蛋白質(zhì)。也就是說(shuō)，作為與滑膜素同等功能的蛋白質(zhì)，包含滑膜素的功能域，只要其能與特異性識(shí)別滑膜素、存在于RA患者血清中的抗體進(jìn)行反應(yīng)即可。
第2，與滑膜素同等功能的蛋白質(zhì)是根據(jù)與滑膜素結(jié)合的配體蛋白質(zhì)的結(jié)合特性而定義的。例如，HMG-CoA Reductase Degradation 3(Hrd3)、原膠原-脯氨酸、2-酮戊二酸4-過(guò)氧化物酶 (プロリン4ヒドラキシラ一ゼ(hydraxylase))、α多肽I(P4HA1)、Homocysteine-indusible endoplasmic reticulum stress-indusibleubiquitin-like domain member 1(Herp)等(專(zhuān)利2003-295951、專(zhuān)利2004-076931、專(zhuān)利2003-350704)。
第3，與人滑膜素同等功能的蛋白質(zhì)包括具有促進(jìn)滑膜增生活性的蛋白質(zhì)。導(dǎo)入了人滑膜素基因的轉(zhuǎn)基因小鼠中，可觀察到顯著頻率的伴隨關(guān)節(jié)炎的指腫脹，組織學(xué)上可確認(rèn)這些指關(guān)節(jié)中出現(xiàn)伴隨滑膜增生的骨破壞和異常的骨新生。
第4，與人滑膜素同等功能的蛋白質(zhì)包括具有參與正常骨形成或四肢發(fā)育活性的蛋白質(zhì)。在發(fā)育過(guò)程中，滑膜素在頭頂骨、四肢、耳等骨和軟骨形成的部位強(qiáng)表達(dá)，在四肢形成期，可觀察到在ApicalEctodermal Ridge(AER；外胚層頂脊)及軟骨、骨骺部位強(qiáng)表達(dá)。
第5，本發(fā)明中與人滑膜素同等功能的蛋白質(zhì)，也可基于滑膜素具有的生物化學(xué)活性，例如泛素連接酶活性進(jìn)行定義。這些生物化學(xué)活性表現(xiàn)在滑膜素中發(fā)現(xiàn)的各種結(jié)構(gòu)域、實(shí)驗(yàn)結(jié)果等中。
(5)與滑膜素素融合蛋白質(zhì)或修飾蛋白質(zhì)與滑膜素同等功能的蛋白質(zhì)中也包含氨基酸殘基的修飾、保守的置換、缺失、附加或插入、糖鏈等生理的或人為的修飾、熒光和放射性物質(zhì)的標(biāo)記、或與其它蛋白質(zhì)的融合等加入了各種修飾的蛋白質(zhì)。例如，在上述基因重組體中，有可能因表達(dá)的宿主而產(chǎn)生糖鏈修飾的差異。但是，即使其糖鏈修飾不同，但只要其顯示滑膜素同樣的性狀，均作為滑膜素或其同等功能的蛋白質(zhì)。
作為與其它蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)的例子有，附加了FLAG標(biāo)簽、HA標(biāo)簽、或His標(biāo)簽等附加氨基酸序列、至少維持作為上述與滑膜素同等功能的蛋白質(zhì)的至少一種性狀的蛋白質(zhì)?；蛘哌€包括，即使具有不同于滑膜素的活性，但擁有滑膜素?fù)碛械闹辽僖环N功能的融合蛋白質(zhì)。
由于滑膜素即使是其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域也能使自身泛素化，所以，本發(fā)明中應(yīng)用的滑膜素是除去了細(xì)胞膜貫穿部位的滑膜素dTM。例如，本發(fā)明中也可應(yīng)用該dTM與上述標(biāo)簽蛋白質(zhì)融合了的MBP-滑膜素dTM-His。
或者還包括，即使具有不同于滑膜素的活性，但擁有滑膜素?fù)碛械闹辽僖环N功能的融合蛋白質(zhì)。
3.抗原的制備可應(yīng)用上述滑膜素或其同等蛋白質(zhì)作為制備抗滑膜素抗體的抗原。但是抗體的檢測(cè)中不僅可應(yīng)用抗原分子本身(即滑膜素或其等價(jià)蛋白質(zhì))，還可采用應(yīng)用其蛋白質(zhì)片段、片段肽、包含化學(xué)合成的寡肽與適當(dāng)載體的復(fù)合體作抗原的多種方法。其理由是，特別優(yōu)勢(shì)的表位、或者在臨床上較有些意義的表位特異的分析體系，不易受到非特異性反應(yīng)的影響。也就是說(shuō)，由此可有效實(shí)施后述雜交瘤的克隆化和克隆篩選，且能獲得抗體效價(jià)高的抗滑膜素單克隆抗體。與可識(shí)別作為表位部位的抗原蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)中的多數(shù)區(qū)域相比，優(yōu)選雖然特異性稍低但可識(shí)別少數(shù)特定結(jié)構(gòu)低級(jí)結(jié)構(gòu)中也能識(shí)別特定的少數(shù)特定結(jié)構(gòu)。
在獲得針對(duì)滑膜素的特異性及親和性高的單克隆抗體的過(guò)程中，下述的途徑是有效的。具體而言，在后述獲得免疫學(xué)活性的功能域肽的方法的基礎(chǔ)上，能確定出作為表位的功能域。
已知表位至少由3個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成。與其它蛋白質(zhì)間的免疫學(xué)識(shí)別則至少有8個(gè)氨基酸殘基才能實(shí)現(xiàn)。因此，選自滑膜素或其等價(jià)蛋白質(zhì)的氨基酸序列，至少是連續(xù)的8個(gè)氨基酸殘基、通常為9個(gè)氨基酸殘基、優(yōu)選10個(gè)氨基酸殘基、更優(yōu)選11～15個(gè)氨基酸殘基、尤其是與患者血清中的抗體反應(yīng)的片段，可作為本發(fā)明中抗體檢測(cè)用抗原。
再者，針對(duì)構(gòu)成表位的寡肽，通過(guò)加入各種修飾而提高其免疫學(xué)反應(yīng)性的方法是業(yè)內(nèi)人士公知的。例如，添加人血清白蛋白等無(wú)活性蛋白質(zhì)、或者附加了無(wú)義氨基酸序列的修飾可提高其免疫學(xué)反應(yīng)性。
滑膜素的片段，可通過(guò)使用胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶等蛋白酶進(jìn)行消化，或應(yīng)用溴化氫(ブロモシアン)等進(jìn)行化學(xué)切斷，或聯(lián)合應(yīng)用二者進(jìn)行?？衫蒙V、電泳等公知的分離技術(shù)，將目的肽從生成的肽混合物中分離純化出來(lái)。
其它的方法，隨機(jī)切斷編碼滑膜素的DNA，將之插入到噬菌體載體中，制備提呈功能域肽的噬菌體庫(kù)，由此而獲得。用識(shí)別滑膜素的抗體進(jìn)行免疫篩選，可確定出這些文庫(kù)中有免疫學(xué)活性的功能域。
從上述觀點(diǎn)看，通過(guò)檢索滑膜素的親水性譜與其它抗原性指標(biāo)的分析方法，可首先確定出推斷氨基酸殘基數(shù)14個(gè)以上的、較適宜的肽部分。作為候選免疫原的這些肽也可通過(guò)液相法或固相法等肽合成技術(shù)這些公知技術(shù)合成。以Merrifield法為代表的固相合成法簡(jiǎn)便可在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行。
作為α-氨基保護(hù)基可應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的叔丁基氧羰基(Boc)，也可應(yīng)用Sheppard等開(kāi)發(fā)的9-芴甲氧羰基(Fmoc)基(Atherton，E&Sheppard，R.C，J.Chem.Soc.Chem.Comm.165，1985)(參照泉屋信夫、他著「ペプチド合成の基礎(chǔ)と実験」194～233頁(yè)、丸善、1985年)。
本發(fā)明中也可利用基于固相合成法的自動(dòng)化肽合成儀。合成的肽，可在三氟醋酸等從存在下從樹(shù)脂上分離下來(lái)，然后通過(guò)逆相高效色譜進(jìn)行純化。純化的肽其純度在85％以上。
上述候選肽中，通過(guò)從免疫動(dòng)物采集的多克隆抗體與滑膜素進(jìn)行反應(yīng)，酶標(biāo)記抗IgG抗體進(jìn)行檢測(cè)反應(yīng)顯示陽(yáng)性的肽，可作為本發(fā)明的制備抗體用的免疫抗原。
作為免疫原，尤其是有用的滑膜素片段，至少包括一個(gè)包含以下氨基酸序列的肽。
Syno-P3(SLALTGAVVAHAYYC/序列號(hào)3)、Syno-P2(TCRMDVLRASLPAQS/序列號(hào)4)、Syno-P1(GAATTTAAGTSATAC/序列號(hào)5)這些肽與載體蛋白質(zhì)結(jié)合而制備成的免疫原可產(chǎn)生滑膜素特異的、且具有足夠親和性的抗體。作為免疫原有用的滑膜素的上述肽與匙孔戚血藍(lán)蛋白(KLH)載體蛋白結(jié)合，致敏動(dòng)物。
為了獲得免疫原而使用的其它載體物質(zhì)包括結(jié)核菌素純化蛋白衍生物、破傷風(fēng)變性毒素、霍亂毒素及其B亞基、白喉毒素、卵白蛋白、牛血清白蛋白、大豆胰蛋白酶抑制劑、胞壁酰二肽、褐色的脂蛋白等。肽與載體結(jié)合的反應(yīng)、試劑等可參照公知的文獻(xiàn)(例如，大海忍、他著細(xì)胞工學(xué)別冊(cè)実験プロトコ一ルシリ一ズ新版抗ペプチド抗體実験プロトコ一ル「遺伝子産物の同定からタンパク質(zhì)機(jī)能解析まで」秀潤(rùn)社1994年；Coligan J.E et al.，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY，Vol.1，p.9.4.1-9.4.11，1991)。
4.免疫(1)滑膜素多克隆抗體的制備將如上制備的抗原施用給哺乳動(dòng)物。對(duì)哺乳動(dòng)物無(wú)特定限制，例如大鼠、小鼠、兔等，優(yōu)選兔。
每只動(dòng)物抗原的施用量是，不應(yīng)用佐劑時(shí)，兔1～10mg，應(yīng)用佐劑時(shí)0.1～1mg。佐劑包括完全氟氏佐劑(FCA)、不完全氟氏佐劑(FIA)、氧化鋁佐劑等。主要通過(guò)注入到靜脈內(nèi)、皮下、腹腔內(nèi)等進(jìn)行免疫。此外，對(duì)免疫的間隔無(wú)特殊限制，數(shù)日～數(shù)周間隔、優(yōu)選2～5周間隔，免疫1～10次，優(yōu)選2～5次。然后，在最終免疫日6～60天后，用酶免疫測(cè)定法(ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)或EIA(enzyme immunoassay))、放射性免疫測(cè)定法(RIA；radioimmunoassay)等測(cè)定抗體效價(jià)，在小時(shí)最大抗體效價(jià)的時(shí)候采血，獲得抗血清。
其后，用ELISA法等測(cè)定抗血清中多克隆抗體對(duì)這些蛋白質(zhì)的反應(yīng)性。
(1)滑膜素單克隆抗體的制備(i)抗體產(chǎn)生細(xì)胞的采集用能成為免疫抗原的滑膜素或免疫學(xué)上同等的蛋白質(zhì)、或其片段或片段肽作免疫原，單獨(dú)或與載體及稀釋劑一起施用到哺乳動(dòng)物可能產(chǎn)生抗體的部位，以制備單克隆抗體。此時(shí)，為了提高抗體產(chǎn)生能力，優(yōu)選與佐劑等混和施用(Adv.Tubercl.Res.，1130-148，1956)。佐劑包括FCA、FIA、氧化鋁佐劑等。
單克隆抗體的獲得是讓免疫細(xì)胞(具體而言抗體產(chǎn)生細(xì)胞)與骨髓瘤細(xì)胞間形成融合細(xì)胞，使該細(xì)胞克隆化，篩選出產(chǎn)生滑膜素特異的抗體的克隆(Kohler，G.&Milstein，C，Nature 256495-7，1975)。
免疫時(shí)，用包含上述肽的復(fù)合體(或者滑膜素或其免疫學(xué)上同等的蛋白質(zhì)、或其片段)作免疫原，每次，例如20μg～1mg，與適當(dāng)?shù)淖魟┤芙饣蚧旌秃?，給動(dòng)物進(jìn)行免疫。
作為免疫動(dòng)物應(yīng)用的哺乳動(dòng)物包括小鼠、豚鼠、兔、大鼠、綿羊、山羊、猴、狗等，通常從容易操作考慮，特別優(yōu)選小鼠或兔。希望抗體產(chǎn)生細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞來(lái)源于同種類(lèi)型的動(dòng)物。施用，通常3～6個(gè)月，每2～6周施用一次，施用2～10次。
抗體產(chǎn)生細(xì)胞的采集是從抗原致敏的上述動(dòng)物中選擇抗體效價(jià)得到認(rèn)可的個(gè)體，在最終免疫的2～5天后，采集脾臟細(xì)胞、淋巴結(jié)細(xì)胞或B淋巴細(xì)胞。讓其中所含抗體產(chǎn)生細(xì)胞與具有自身增殖能力的骨髓瘤細(xì)胞融合。通過(guò)篩選能產(chǎn)生本發(fā)明的抗滑膜素單克隆抗體的克隆，從所生成的雜交瘤中制備出能產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤。其程序基本上按照Kohler的方法(″Immunological Method″，Academic Press，New York，391，1979)。
(ii)細(xì)胞融合可使用公知的技術(shù)進(jìn)行融合操作，例如上述Kohler和Milstein的方法。骨髓瘤細(xì)胞包括P3U1、NS-1、SP2/0等來(lái)源于小鼠骨髓瘤的細(xì)胞株或其突變株等，但特別優(yōu)選P3U1。作為融合劑包括聚乙二醇(PEG)、仙臺(tái)病毒等，優(yōu)選應(yīng)用PEG。融合時(shí)，將骨髓瘤細(xì)胞懸浮到不含血清的RPMI1640培養(yǎng)基等中，向該懸浮液中加入上面制備的包含脾細(xì)胞等抗體產(chǎn)生細(xì)胞的溶液，靜置?；厥针x心分離的細(xì)胞，加入含PEG的RPMI1640培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)2～4分鐘，完成細(xì)胞融合。
離心，回收雜交瘤，轉(zhuǎn)移到HAT(次黃嘌呤、氨基喋呤及胸腺嘧啶核苷)培養(yǎng)基中，分到96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)規(guī)定的時(shí)間。培養(yǎng)，通常在5％CO2、孵箱中、20～40℃、優(yōu)選34～38℃。通常在1周后觀察到雜交瘤形成的集落。培養(yǎng)的時(shí)間通常是5日～3周，優(yōu)選1～2周。
(iii)抗體篩選及克隆化單克隆抗體的篩選通?？捎锰砑恿薍AT的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行。對(duì)篩選及培養(yǎng)用的培養(yǎng)基無(wú)特殊限制，只要雜交瘤能在其中生長(zhǎng)即可。例如可應(yīng)用雜交瘤培養(yǎng)用無(wú)血清培養(yǎng)基、含胎牛血清(fetal calfserum；FCS)的RPMI培養(yǎng)基、GIT培養(yǎng)基等。
用酶抗體法等測(cè)定觀察到增殖的孔的培養(yǎng)上清中針對(duì)肽的抗體效價(jià)，例如通過(guò)有限稀釋法進(jìn)行雜交瘤的克隆化，可獲得本發(fā)明的雜交瘤的克隆。
對(duì)所形成的本發(fā)明的雜交瘤的篩選操作一般如下。向直接或與載體一起吸附了作為免疫原應(yīng)用的肽的微孔等固相中，添加雜交瘤培養(yǎng)上清，接下來(lái)添加放射性物質(zhì)、用酶等標(biāo)記的抗免疫球蛋白抗體或ProteinA，檢測(cè)結(jié)合到固相上的單克隆抗體，這樣的方法很便利?；蛘呦蛭搅丝姑庖咔虻鞍卓贵w或ProteinA的固相中添加雜交瘤培養(yǎng)上清，接下來(lái)添加標(biāo)記抗原，檢測(cè)結(jié)合到固相上的單克隆抗體。
通過(guò)上述操作篩選出陽(yáng)性孔，數(shù)日后，將一陽(yáng)性株接種到一96孔培養(yǎng)板中，100細(xì)胞/培養(yǎng)板，培養(yǎng)10～14天。確定集落，培養(yǎng)上清同樣適用于上面篩選用的抗原固相化培養(yǎng)板，可同樣進(jìn)行檢測(cè)。篩選的集落，在培養(yǎng)后進(jìn)行再克隆化，培養(yǎng)10～14天，實(shí)施與上面同樣的集落確定和培養(yǎng)上清的鑒定。篩選出親株不同的孔，在24孔培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)，回收上清，進(jìn)行克隆的檢測(cè)，鑒定抗體的亞型及抗體產(chǎn)生。
(iv)單克隆抗體的產(chǎn)生及其分離體外培養(yǎng)如上篩選出的克隆SL-1，能產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體SL-1抗體。其培養(yǎng)，可使用該技術(shù)領(lǐng)域慣用的方法。
用體外培養(yǎng)的培養(yǎng)基培養(yǎng)雜交瘤SL-1時(shí)，可很容易的從其培養(yǎng)物中分離出SL-1抗體。為了提高增殖速度、抗體產(chǎn)生 率，可對(duì)培養(yǎng)基種類(lèi)的選擇與維持、培養(yǎng)條件的管理(例如培養(yǎng)基內(nèi)氧濃度、攪拌速度、污染)進(jìn)行探求。
利用除人之外的溫血?jiǎng)游锟寺∨囵B(yǎng)時(shí)，可從其腹水和/或血液中收集單克隆抗體。例如，將克隆接種到補(bǔ)足了胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基等中，使之達(dá)到規(guī)定的細(xì)胞密度，培養(yǎng)箱中，5％CO2存在下、37℃培養(yǎng)。接下來(lái)，將其培養(yǎng)物接種到預(yù)先施用了降植烷的小鼠腹腔內(nèi)，在預(yù)定的時(shí)間內(nèi)，按常規(guī)方法飼養(yǎng)。通常1～2周后，收集腹水，向其中添加硫酸銨，進(jìn)行鹽析沉淀。利用色譜等從其級(jí)分中分離、純化單克隆抗體。
從培養(yǎng)物或腹水和/或血液分離單克隆抗體的方法，與常規(guī)的多克隆抗體的純化方法相同，就是免疫球蛋白的分離純化法。也就是說(shuō)，可以適當(dāng)?shù)慕M合應(yīng)用鹽析法、透析法、過(guò)濾法、濃縮、乙醇沉淀法，等電點(diǎn)沉淀法、各種電泳法、離子交換(DEAE樹(shù)脂等)吸脫著法、超離心法、凝膠過(guò)濾法、特異的親和純化法等。隨后對(duì)生成的單克隆抗體進(jìn)行濃縮、干燥，按用途制備成液狀或固體狀。
(iv)人源化或人型化抗體本發(fā)明中抗體包括人型化或人源化抗體。
人抗體可與常規(guī)的單克隆抗體同樣制備，只是把免疫體系換成人，免疫哺乳動(dòng)物即可。
人型化抗體是恒定區(qū)域和可變區(qū)域的一部分為人型的抗體，它是一種重組抗體，可變區(qū)域中框架區(qū)域(FR)來(lái)源于人，稱(chēng)為CDR的互補(bǔ)性決定區(qū)域(complementarity determining region)來(lái)源于小鼠。制備人型化抗體時(shí)，CDR從小鼠抗體的可變區(qū)域移到人可變區(qū)域，然后將這些人型化的重構(gòu)人可變區(qū)域連接到人恒定區(qū)域。人型化抗體的制備方法，可按照基因工程學(xué)方法獲得，在該技術(shù)領(lǐng)域已經(jīng)確立(杉村和久「本格化する抗體醫(yī)療！抗體エンジニアリンクと抗體醫(yī)薬のすベて」Bioベンチヤ一Vol.2 No.4羊土社2002年)。
(3)本發(fā)明的抗體的特征(i)能抑制滑膜素的自身泛素化也就是說(shuō)，可用于因滑膜素自身泛素化所導(dǎo)致的疾病的治療。
(ii)不影響滑膜素的底物蛋白P4HA1的泛素化也就是說(shuō)，對(duì)與P4HA1的泛素化相關(guān)的生理功能沒(méi)有影響。
(iii)本發(fā)明抗體的亞類(lèi)是IgG1。
5.本發(fā)明單克隆抗體的用途由于本發(fā)明的抗體(例如SL-1抗體)能特異性識(shí)別滑膜素或其部分肽，所以我們認(rèn)為它有多種多樣的利用形式。以下，以SL-1抗體為例說(shuō)明其幾個(gè)典型的利用方式。
(1)抑制滑膜素自身泛素化反應(yīng)泛素化是在泛素活化酶(E1)、泛素偶聯(lián)酶(E2)、泛素連接酶(E3)等酶的共同作用下，使底物蛋白質(zhì)順次結(jié)合泛素的過(guò)程。如上所述，滑膜素的自身泛素化是指，由于滑膜素具有泛素連接酶的活性，滑膜素自身可成為泛素化的底物蛋白質(zhì)，不需其它泛素連接酶就能自己結(jié)合泛素。
上述泛素活化酶(E1)、泛素偶聯(lián)酶(E2)等酶類(lèi)有商品化的，可適當(dāng)應(yīng)用。其應(yīng)用范圍是，96孔微孔培養(yǎng)板的每孔中，E110～50ng，優(yōu)選20～40ng，E20.1～0.5μg，優(yōu)選0.2～0.3μg。
作為對(duì)泛素化必要的低分子反應(yīng)因子，可適當(dāng)選擇MgCl2、MgSO4等Mg鹽、ATP、EDTA、NAF、DTT(二硫蘇糖醇)、崗田酸(okadaicacid)等。這些化合物均有商品化的產(chǎn)品，很容易獲得。
再者，溶解酶類(lèi)或試劑的緩沖液、洗滌用緩沖液、測(cè)定用緩沖液、反應(yīng)終止緩沖液等，可使用任意的公知的緩沖液(例如、Tris-HCl)，只要其不使酶失活、或者抑制反應(yīng)即可。
應(yīng)用His標(biāo)簽融合蛋白質(zhì)MBP-dTM Syno-His，與如上制備的單克隆抗體、抗FLAG抗體或小鼠IgG混和，4℃1.5小時(shí)，進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)。
其后，進(jìn)行自身泛素化反應(yīng)。通?；に氐淖陨矸核鼗磻?yīng)按以下條件進(jìn)行。向一定量的成為反應(yīng)溶劑的緩沖液(pH6～8)中分別添加上述量的對(duì)滑膜素的自身泛素化必要的反應(yīng)物質(zhì)(滑膜素或其活性衍生物除外)，室溫孵育5～30分鐘。然后添加滑膜素或其活性衍生物，或固化的滑膜素的活性衍生物，開(kāi)始滑膜素的自身泛素化反應(yīng)。室溫～37℃的溫度下，孵育20～120分鐘，加入一定量的終止緩沖液(含有0.2 M硼酸緩沖液、TritonX-100及EDTA)終止反應(yīng)。然后，測(cè)定與滑膜素結(jié)合的泛素或未結(jié)合的泛素的含量，求出自身泛素化的程度。
(2)檢查、診斷、治療效果或藥效判定方面的利用滑膜素在RA患者的滑膜組織中強(qiáng)表達(dá)。此外，在RA患者的血中可高頻度地檢測(cè)出識(shí)別滑膜素的抗體(自身抗體)。另一方面，在健康者的血中，基本上檢測(cè)不出滑膜素的抗體?；に匾种企w外培養(yǎng)的滑膜細(xì)胞的增殖。對(duì)于促進(jìn)滑膜細(xì)胞增殖的配體，認(rèn)為其是與滑膜素相競(jìng)爭(zhēng)的?；谶@些信息，推定如下分子機(jī)制。即，滑膜素在滑膜細(xì)胞的強(qiáng)表達(dá)，促進(jìn)與對(duì)滑膜細(xì)胞具有增殖促作用的滑膜素的配體的結(jié)合，結(jié)果促進(jìn)滑膜細(xì)胞的增殖。因此，滑膜細(xì)胞的異常增殖即導(dǎo)致RA的病癥。
基于這樣的發(fā)現(xiàn)，利用SL-1抗體的免疫學(xué)特性可提供細(xì)胞增殖性疾病的檢測(cè)方法或診斷方法。細(xì)胞增殖性疾病包括，例如關(guān)節(jié)炎、癌癥、纖維癥、動(dòng)脈硬化、Castleman病、多發(fā)骨髓瘤、局限性回腸炎、全身性若年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、腦腫瘤、舌癌、咽喉癌、肺癌、乳腺癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、膽道癌、膽囊癌、十二指腸癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、卵巢癌、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、橫紋肌肉瘤、纖維肉瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、皮膚癌、急性骨髓性白血病、急性淋巴性白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病、成人型T細(xì)胞白血病、惡性淋巴瘤等，但并不限定于此。此外，與癌相關(guān)的不管是原發(fā)性還是轉(zhuǎn)移性。另外，細(xì)胞包括滑膜細(xì)胞、破骨細(xì)胞、角化上皮細(xì)胞、血液細(xì)胞、癌細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、真皮細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、色素細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、子宮內(nèi)皮細(xì)胞、肺胞上皮細(xì)胞、未分化間質(zhì)系細(xì)胞、外胚層頂脊等，但并不限定于此。
這些方法包括(i)待檢者的生物樣品與本發(fā)明的抗體反應(yīng)，檢測(cè)樣品中存在的疾病標(biāo)記物的步驟，及(ii)將步驟(i)中的檢測(cè)結(jié)果與疾病關(guān)聯(lián)的步驟。
上面的標(biāo)記物可應(yīng)用以下(a)～(d)中所示的任一種標(biāo)記物。這些標(biāo)記物的測(cè)定方法后面講述。
(a)滑膜素或與滑膜素同等功能的蛋白質(zhì)；(b)滑膜素或與滑膜素同等功能的肽(c)與滑膜素或與滑膜素同等功能的蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體，及(d)與滑膜素或與滑膜素同等功能的肽結(jié)合的抗體。
例如，若在從待檢者獲得的血液樣品中能檢測(cè)到與滑膜素或與滑膜素同等功能的蛋白質(zhì)或肽反應(yīng)的抗體，則該待檢者為RA的可能性高。
或者，在從患者采集的滑膜組織中發(fā)現(xiàn)滑膜素或與滑膜素同等功能的蛋白質(zhì)的表達(dá)，則提示因RA造成的滑膜組織的增生。蛋白質(zhì)的表達(dá)通常以蛋白質(zhì)自身或攜帶其信息的mRNA的存在為指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)?；に氐臋z測(cè)優(yōu)選應(yīng)用本發(fā)明的SL-1抗體進(jìn)行滑膜素的檢測(cè)?；ぜ?xì)胞、滑膜組織等、或體液中檢測(cè)到滑膜素時(shí)，認(rèn)為RA為進(jìn)行性。
除RA的診斷之外，包含本發(fā)明抗體的免疫學(xué)分析用試劑對(duì)治療效果或藥效的判定有用。用基本上與RA的診斷同樣的方法進(jìn)行RA的治療效果或藥效的判定?；そM織和血液中滑膜素或其抗體的水平，與編碼這些蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)增減相關(guān)，它們的檢測(cè)具有可作為指示癥狀推移、疾病緩解的指標(biāo)的意義。
本發(fā)明的SL-1抗體還可用于表達(dá)滑膜素的細(xì)胞的分離或檢測(cè)。包括滑膜細(xì)胞、破骨細(xì)胞、角化上皮細(xì)胞、血液細(xì)胞、癌細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、真皮細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、色素細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、子宮內(nèi)皮細(xì)胞、肺胞上皮細(xì)胞、未分化間質(zhì)系細(xì)胞、外胚層頂脊等，但并不限定于此。除在發(fā)生過(guò)程中的外胚層頂脊表達(dá)外，滑膜素在風(fēng)濕病滑膜細(xì)胞、滑膜、骨·軟骨及成為肢體原基的未分化間質(zhì)細(xì)胞中強(qiáng)表達(dá)。因此，滑膜素可作為，特別優(yōu)選作為外胚層頂脊、風(fēng)濕病滑膜細(xì)胞及未分化間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物使用。
也就是說(shuō)，以滑膜素的表達(dá)為指標(biāo)，可檢測(cè)或分離滑膜細(xì)胞、破骨細(xì)胞、角化上皮細(xì)胞、血液細(xì)胞、癌細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、真皮細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、色素細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、子宮內(nèi)皮細(xì)胞、肺胞上皮細(xì)胞、未分化間質(zhì)系細(xì)胞、外胚層頂脊，特別是外胚層頂脊、風(fēng)濕病滑膜細(xì)胞及未分化間質(zhì)細(xì)胞。例如，將針對(duì)滑膜素的抗滑膜素單克隆抗體與用適當(dāng)?shù)臒晒獾葮?biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行反應(yīng)，通過(guò)細(xì)胞分選等分離出表達(dá)滑膜素的細(xì)胞。分離出的未分化間質(zhì)細(xì)胞在體外或體內(nèi)對(duì)組織、例如、肌肉、肌腱、脂肪、及骨髓等的基質(zhì)(stroma)、骨·軟骨的形成、或關(guān)節(jié)的再建有用。再建的組織和器官不僅可在基礎(chǔ)研究利用，還可有再生醫(yī)學(xué)的應(yīng)用。
本發(fā)明的抗體也可用于純化滑膜素抗體柱的制備、純化時(shí)各級(jí)分中存在的該蛋白質(zhì)的檢測(cè)。但與本發(fā)明相關(guān)的特異性抗滑膜素單克隆抗體的利用并不僅限定于這些用途。
(3)應(yīng)用免疫學(xué)分析用試劑的分析下面，對(duì)包含SL-1抗體的免疫學(xué)分析用試劑如何在上述用途中使用進(jìn)行具體講述。
針對(duì)樣品中的抗原或抗體的免疫學(xué)分析方法有很多，一般已經(jīng)普及。應(yīng)用針對(duì)滑膜素或其片段等的單克隆抗體的測(cè)定法無(wú)特殊限定。樣本中的抗原量，既可通過(guò)化學(xué)的或物理的手段檢測(cè)與滑膜素的量相對(duì)應(yīng)的抗體或抗原-抗體復(fù)合體的量測(cè)定，也可從應(yīng)用含已知量的抗原的標(biāo)準(zhǔn)溶液制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出其含量的測(cè)定方法。作為抗原-抗體復(fù)合體量的檢測(cè)方法，具體而言，適于應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)法、免疫測(cè)定法、用懸液計(jì)測(cè)量懸液(nephelometry)、三明治法等。從靈敏度和特異性考慮，特別優(yōu)選以下的三明治夾心法。
三明治法(例如ELISA法)是，將待檢樣本(含有定量對(duì)象滑膜素)與固相化的本發(fā)明的SL-1抗體進(jìn)行反應(yīng)(1次反應(yīng))，再與標(biāo)記了的抗滑膜素抗體進(jìn)行反應(yīng)(2次反應(yīng))，通過(guò)測(cè)定固相化載體上標(biāo)識(shí)劑的活性，可對(duì)待檢樣本中滑膜素的量進(jìn)行定量。該情況下，1次反應(yīng)與2次反應(yīng)可逆順序進(jìn)行，也可同時(shí)進(jìn)行，也可錯(cuò)開(kāi)時(shí)間進(jìn)行。2次反應(yīng)中應(yīng)用的抗體，優(yōu)選應(yīng)用其滑膜素結(jié)合部位與本發(fā)明的SL-1抗體不同的抗體。
使用本發(fā)明的單克隆抗體的免疫測(cè)定法是，將待檢樣本中的抗原與固相化抗原對(duì)一定量的標(biāo)記化單克隆抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)后，分離固相與液相?；蛘撸瑢⒋龣z樣本中的抗原與過(guò)量的標(biāo)記化單克隆抗體進(jìn)行反應(yīng)，接著加入固相化抗原，使未反應(yīng)的標(biāo)記化抗體結(jié)合到固相上后，分離固相與液相。接下來(lái)測(cè)定任一相中的標(biāo)記量，對(duì)待檢樣本中的抗原量進(jìn)行定量。
競(jìng)爭(zhēng)法是，將待檢樣本中的抗原與標(biāo)記抗原對(duì)抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)，然后分離(B/F分離)未反應(yīng)的標(biāo)記抗原(F)、與抗體結(jié)合的標(biāo)記抗原(B)，測(cè)定B、F中的標(biāo)記量，對(duì)待檢樣本中的抗原量進(jìn)行定量。作為其它的方法，有應(yīng)用可溶性抗體，使用聚乙二醇進(jìn)行B/F分離、使用針對(duì)上述抗體的第2抗體等的液相法；應(yīng)用固相化抗體作第1抗體，或者第1抗體用可溶性的，用固相化抗體作第2抗體。例如，將固化到載體上的本發(fā)明的抗滑膜素單克隆抗體及標(biāo)記化的抗體與待檢樣本同時(shí)或連續(xù)進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合反應(yīng)，然后測(cè)定固相化載體上的標(biāo)記劑的活性。
Nephelometry法是測(cè)定凝膠內(nèi)或溶液中抗原抗體反應(yīng)結(jié)果產(chǎn)生的不溶性沉淀物含量。因待檢樣本中抗原量少而僅得到微量的沉降物時(shí)，優(yōu)選應(yīng)用利用激光散射的laser Nephelometry。
為了檢測(cè)分析樣品中的抗體，將抗原敏化的板與樣品中的抗體進(jìn)行反應(yīng)，用特異的抗原標(biāo)記抗體檢測(cè)被捕捉到板表面的成為檢測(cè)對(duì)象的抗體的方法是常用的抗體的免疫學(xué)分析方法(Immunochemistry，8871-879，1971)。或者，可使用本發(fā)明的SL-1抗體作為標(biāo)記抗體檢測(cè)板上的未結(jié)合抗原。此外，將吸附了抗原的乳膠顆粒與樣品混和，作為免疫學(xué)的凝集反應(yīng)檢測(cè)抗體的方法也是公知的(Plotz C.M &Singer J.M，Am.J.Med.，21888-892，1956)。免疫學(xué)的粒子凝集反應(yīng)是一種能對(duì)1種試劑進(jìn)行迅速分析的方法，是一種適于大規(guī)模篩選的方法。
本發(fā)明的SL-1抗體作為細(xì)胞分離或檢測(cè)用試劑應(yīng)用時(shí)，抗滑膜素單克隆抗體可與其它溶媒和溶質(zhì)聯(lián)合應(yīng)用形成組合物。例如可與蒸餾水、pH緩沖溶液、鹽、蛋白質(zhì)、表面活性劑等聯(lián)合應(yīng)用。
反應(yīng)試劑有可通過(guò)適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)或物理的檢測(cè)手段進(jìn)行檢測(cè)的標(biāo)記。應(yīng)用這樣的標(biāo)記物的測(cè)定方法中所使用的標(biāo)記劑有，例如熒光物質(zhì)、酶、放射性同位素、發(fā)光物質(zhì)等。用酶進(jìn)行標(biāo)記時(shí)，叫做ELISA法，被廣泛應(yīng)用。
作為熒光物質(zhì)，示例有熒光胺、熒光異硫氰酸鹽等，作為酶有過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、蘋(píng)果酸脫氫酶、α-糖苷酶、α-半乳糖苷酶等，作為放射性同位素有125I、131I、3H、14C等，作為發(fā)光物質(zhì)有蟲(chóng)熒光素、ルシゲニン、魯米諾、魯米諾衍生物等。
本發(fā)明的SL-1抗體或抗原與標(biāo)記劑的結(jié)合也可應(yīng)用生物素-親和素體系?？乖騿慰寺】贵w的固相化中，可應(yīng)用物理吸附，或者應(yīng)用常規(guī)的蛋白質(zhì)或酶等固相化，固化中應(yīng)用的活性結(jié)合的方法。作為載體可應(yīng)用聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、硅膠等合成樹(shù)脂、瓊脂糖、葡聚糖、纖維素等不溶性多糖類(lèi)、或玻璃等。
作為反應(yīng)溶媒，給予最適的反應(yīng)條件，包含對(duì)反應(yīng)生成物的穩(wěn)定有用的緩沖液、反應(yīng)物的穩(wěn)定劑等。
作為檢測(cè)手段，包含分光器、放射線(xiàn)檢測(cè)器、光發(fā)射檢測(cè)器等能檢測(cè)上述標(biāo)記的儀器。
(4)檢查診斷用的試劑盒本發(fā)明的SL-1抗體用于免疫學(xué)測(cè)定方法時(shí)，沒(méi)有特別的條件、操作等的限制。在各種方法中按常規(guī)條件操作進(jìn)行。必要時(shí)可構(gòu)建添加若干修飾的適當(dāng)?shù)臏y(cè)定體系。
為了能更簡(jiǎn)便、有效的進(jìn)行測(cè)定，將上述試劑試劑盒化。通過(guò)試劑盒化，在普通的檢查室或?qū)嶒?yàn)室，無(wú)需特殊的分析儀器、熟練的操作、高難的知識(shí)，即可高效地進(jìn)行定量。對(duì)用于實(shí)施上述各種診斷方法或治療判定方法的檢測(cè)試劑盒的構(gòu)成及形式無(wú)特殊限定，對(duì)其內(nèi)容沒(méi)有限定，只要其能達(dá)成預(yù)期的目的即可。通常由解釋實(shí)行檢測(cè)方法所得結(jié)果的使用說(shuō)明書(shū)、反應(yīng)試劑、進(jìn)行反應(yīng)時(shí)的反應(yīng)介質(zhì)、提供檢驗(yàn)場(chǎng)所的基材等構(gòu)成。此外，期望還包含作為比較基準(zhǔn)的或制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的對(duì)照樣品、檢測(cè)器等。
(5)醫(yī)藥組合物本發(fā)明的抗體作為細(xì)胞增殖性疾病的治療或預(yù)防用醫(yī)藥組合物應(yīng)用。細(xì)胞增殖性疾病包括，例如關(guān)節(jié)炎、癌癥、纖維癥、動(dòng)脈硬化、Castleman病、多發(fā)骨髓瘤、局限性回腸炎、全身性若年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、腦腫瘤、舌癌、咽喉癌、肺癌、乳腺癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、膽道癌、膽囊癌、十二指腸癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、卵巢癌、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、橫紋肌肉瘤、纖維肉瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、皮膚癌、急性骨髓性白血病、急性淋巴性白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病、成人型T細(xì)胞白血病、惡性淋巴瘤等，但并不限定于此。此外，與癌相關(guān)的不管是原發(fā)性還是轉(zhuǎn)移性。
本發(fā)明的醫(yī)藥組合物，包含以本發(fā)明的抗體或其片段作為有效成分。此外優(yōu)選以包含藥學(xué)上允許的載體的醫(yī)藥組合物形式提供。
這里所講“藥學(xué)上許可的載體”包括賦形劑、稀釋劑、增量劑、崩 劑、安定劑、保存劑、緩沖劑、乳化劑、芳香劑、著色劑、甘味劑、粘稠劑、矯味劑、溶解輔助劑或其它的添加劑等。通過(guò)使用一個(gè)以上的載體，可制備成注射劑、液劑、膠囊劑、懸濁劑、乳劑或糖漿等劑型的醫(yī)藥組合物。這些醫(yī)藥組合物可以經(jīng)口施用也可非經(jīng)口施用。作為非經(jīng)口施用的其它形式，包含一個(gè)或一個(gè)以上的活性物質(zhì)，包含按常規(guī)方法處方的注射劑等。
本發(fā)明的藥劑的施用量根據(jù)患者的年齡、性別、體重及癥狀、治療效果、施用方法、處理時(shí)間、或該藥劑中所含活性成分-高親和性抗體的種類(lèi)而不同，通常每個(gè)成人，一次600μg～6000mg，優(yōu)選6～600mg，但并不限定于該范圍。
例如，注射劑時(shí)，可通過(guò)將其溶解或懸浮到，例如生理鹽水或商品化的注射用蒸餾水等藥學(xué)上許可的載體中，使其濃度達(dá)到1mg抗體/ml載體～100mg抗體/ml載體，進(jìn)行制備。這樣制備的注射劑，對(duì)有必要進(jìn)行處置的人患者，一次1kg體重10μg～100mg，優(yōu)選100μg～10mg，1日施用1～數(shù)次。施用方式包括靜脈內(nèi)注射、皮下注射、皮內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射或腹腔內(nèi)注射等，但優(yōu)選靜脈內(nèi)注射。此外，可根據(jù)情況，將注射劑制備成非水性稀釋劑(例如，丙二醇、聚乙二醇、橄欖油等植物油、甲醇等醇類(lèi)等)、懸浮劑或乳濁劑。這些注射劑的無(wú)菌化可通過(guò)用濾器過(guò)濾除菌、配合滅菌劑等進(jìn)行?？蓪⒆⑸鋭┲苽涑捎脮r(shí)制備的形式。也就是說(shuō)，通過(guò)冷凍干燥等制成無(wú)菌的固體組合物，使用前溶解到無(wú)菌的注射用蒸餾水或其它溶劑中使用。
以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明再進(jìn)行具體說(shuō)明。這些實(shí)施例，業(yè)內(nèi)人士可進(jìn)行多種多樣的改變。本發(fā)明不限定于這些實(shí)施例。如果沒(méi)有特殊說(shuō)明，％表示重量％。
〔實(shí)施例1〕本實(shí)施例，其目的是制備抗滑膜素單克隆抗體。
合成以下所示含人滑膜素的部分氨基酸序列的3種肽作為免疫用的肽，用于制備抗滑膜素單克隆抗體。這些氨基酸序列選自推測(cè)其有抗原性的區(qū)域。
Syno-P3(SLALTGAVVAHAYYC)(序列號(hào)3)、
Syno-P2(TCRMDVLRASLPAQS)(序列號(hào)4)、及Syno-P1(GAATTTAGTSATAC)(序列號(hào)5)各合成的肽中，借助氨基酸序列中的Cys，可與匙孔戚血藍(lán)蛋白(KLH)結(jié)合。將結(jié)合了KLH的各合成肽50μg溶解到0.1ml生理鹽水中，添加0.1ml的氟氏完全佐劑(FCA)作為免疫原。將各免疫原分別注射0.2ml到8只小鼠(BALB/c雌性、5周齡)背部皮下，進(jìn)行免疫。每2周免疫1次，共免疫4次，1周后再免疫1次。最終免疫8日后，從心臟取血，獲得血清200μl以上。從通過(guò)ELISA驗(yàn)證抗體效價(jià)升高的個(gè)體中取出脾細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞融合。
對(duì)于各免疫原，通過(guò)ELISA測(cè)定3只小鼠血清中的抗體效價(jià)。無(wú)論應(yīng)用哪種免疫原，均可觀察到其抗體效價(jià)上升的個(gè)體?？梢源_認(rèn)這些免疫原均可作為滑膜素的免疫原應(yīng)用。
將骨髓瘤細(xì)胞株(P3U1)與小鼠脾細(xì)胞以1∶10混和，在50％PEG(和光純藥社PEG1540)存在下進(jìn)行細(xì)胞融合。融合后，將脾細(xì)胞5×105個(gè)/ml接種到96孔培養(yǎng)板中。在HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)10～14天后，確認(rèn)細(xì)胞的增殖，進(jìn)行培養(yǎng)上清的鑒定。
應(yīng)用固化了各合成肽的ELISA板進(jìn)行培養(yǎng)上清的鑒定。鑒定操作如下進(jìn)行。將培養(yǎng)上清與ELISA板進(jìn)行反應(yīng)后，應(yīng)用抗小鼠IgG山羊過(guò)氧化物酶(POX)進(jìn)行陽(yáng)性孔的篩選。篩選出供于克隆化的孔，其它陽(yáng)性孔的細(xì)胞冷凍保存。
數(shù)日后，將一株細(xì)胞接種到一96孔培養(yǎng)板中，100個(gè)細(xì)胞/培養(yǎng)板(20細(xì)胞/ml)，培養(yǎng)10～14天。判定集落，進(jìn)行培養(yǎng)上清的鑒定。培養(yǎng)上清的鑒定是，將上清50μl加到上述篩選用抗原固相化的ELISA培養(yǎng)板中。使用抗小鼠IgG山羊-PoX作為第2抗體。篩選的集落，培養(yǎng)后進(jìn)行亞克隆，培養(yǎng)10～14天，與上面同樣進(jìn)行集落判定和培養(yǎng)上清的鑒定。選擇親株不同孔，在24孔培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)，回收上清，進(jìn)行克隆的驗(yàn)證，鑒定抗體的亞類(lèi)及抗體產(chǎn)生。克隆化的結(jié)果，作為能高效產(chǎn)生針對(duì)滑膜素的、具有極高親和性的單克隆抗體的雜交瘤，篩選出以Syno-P2作免疫原而獲得的克隆SL-1。
〔實(shí)施例2〕本實(shí)施例，其目的是應(yīng)用抗滑膜素單克隆抗體進(jìn)行患者樣品中滑膜素的檢測(cè)。
(1)用抗滑膜素單克隆抗體對(duì)患者來(lái)源的滑膜細(xì)胞進(jìn)行Western印跡應(yīng)用實(shí)施例1中獲得的識(shí)別Syno-P2的SL-1抗體，用SDS-PAGE分離慢性關(guān)節(jié)風(fēng)濕病患者(RA)來(lái)源的滑膜細(xì)胞的蛋白質(zhì)，進(jìn)行Western印跡。Western印跡的操作是，應(yīng)用實(shí)施例1的SL-1抗體作一抗，應(yīng)用抗小鼠IgG綿羊-HRP作為標(biāo)記抗體。
用變形性關(guān)節(jié)病患者(OA)來(lái)源的滑膜細(xì)胞作對(duì)照進(jìn)行分析。結(jié)果，RA患者來(lái)源的滑膜細(xì)胞中可檢測(cè)出特異的信號(hào)(圖1「RA」泳道1、2的85kDa附近的條帶)。可以確認(rèn)實(shí)施例1中所得SL-1抗體特異性識(shí)別滑膜素。
(2)用抗滑膜素單克隆抗體對(duì)RA患者來(lái)源的滑膜細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色應(yīng)用SL-1抗體對(duì)RA患者來(lái)源的滑膜細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光細(xì)胞化學(xué)分析。免疫染色的操作是，除應(yīng)用實(shí)施例1的SL-1抗體作一抗，應(yīng)用抗小鼠IgG綿羊-FITC作為標(biāo)記抗體之外，按照WO02/052007號(hào)的實(shí)施例9中描述的進(jìn)行?？梢詸z測(cè)到滑膜素的信號(hào)在RA患者來(lái)源的滑膜細(xì)胞中很強(qiáng)(圖2上)，但僅用二抗進(jìn)行反應(yīng)作為對(duì)照，未檢測(cè)出信號(hào)(圖2下)。
(3)用抗滑膜素單克隆抗體對(duì)RA患者來(lái)源的滑膜組織進(jìn)行免疫染色應(yīng)用SL-1抗體對(duì)RA患者來(lái)源的滑膜組織切片進(jìn)行免疫染色。免疫染色的操作是，除應(yīng)用實(shí)施例1的SL-1抗體作一抗，應(yīng)用抗小鼠IgG綿羊-HRP作為標(biāo)記抗體之外，按照WO02/052007號(hào)的實(shí)施例9中描述的進(jìn)行?；に卦赗A患者來(lái)源的滑膜組織中強(qiáng)表達(dá)(圖3SL-1抗體部分)。通過(guò)同時(shí)進(jìn)行的HE染色觀察到滑膜細(xì)胞的增殖層，該部分即是單克隆抗體染色的部位。根據(jù)這些結(jié)果可以確認(rèn)本發(fā)明的SL-1抗體特異性識(shí)別RA患者滑膜組織中的滑膜素(圖3HE染色部分)。
如上，通過(guò)應(yīng)用抗滑膜素抗體檢測(cè)患者樣品中的滑膜素，可實(shí)施RA的檢查和診斷。
〔實(shí)施例3〕本實(shí)施例的目的是開(kāi)發(fā)滑膜素檢測(cè)用ELISA法檢測(cè)試劑。
將適量按實(shí)施例1的方法獲得的SL-1抗體溶解到PBS中，使其濃度為20μg/ml。將溶液加到酶免疫測(cè)定(EIA)用96平底微孔板中，100μl/孔，室溫下靜置數(shù)小時(shí)。除去孔中的溶液，用含0.05(V/V)％Tween20的PBS洗滌，加入含1(V/V)％-胎牛白蛋白(BFA)的PBS、100μl/孔，4℃靜置一晚，封閉單克隆抗體后，除去PBS，獲得抗體板。
與此不同的是，按照常規(guī)方法用滑膜素免疫致敏兔，制備多克隆抗體。按過(guò)碘酸氧化法用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記多克隆抗體。應(yīng)用PBS預(yù)平衡過(guò)的Sephacryl S-300HR(Pharmacia社)，通過(guò)凝膠過(guò)濾色譜，獲得純化的標(biāo)記抗體。該二次標(biāo)記抗體作為包含鹽、穩(wěn)定劑、防腐劑等緩沖試劑的組合物。
按照常規(guī)的EIA，將適當(dāng)稀釋的患者的血液、尿等體液或組織等加到上面所得具有固相SL-1抗體的上述96孔微孔板中，室溫作用1小時(shí)。此時(shí)，以只加稀釋液的孔作對(duì)照。用含0.05％Tween20的磷酸緩沖液洗滌后，加入HRP標(biāo)記的抗小鼠IgG兔抗體，室溫反應(yīng)30分鐘。用含0.05％Tween20的磷酸緩沖液洗滌未反應(yīng)的二抗后，向各孔中加入底物緩沖液-含0.015％過(guò)氧化氫的0.1M檸檬酸緩沖液，以及染色劑O-苯二胺檸檬酸緩沖液(10mg/ml)，室溫反應(yīng)30分鐘后，添加2M硫酸終止顯色反應(yīng)。接著用酶標(biāo)儀測(cè)定492nm的吸光度，由此求出待檢樣本中滑膜素的含量。
〔實(shí)施例4〕本實(shí)施例的目的是探討滑膜素的自身泛素化。
滑膜素是具有RING finger功能域的E3泛素-蛋白質(zhì)連接酶，RING finger功能域是E2泛素結(jié)合酶的結(jié)合部位。此外，已知E3泛素-蛋白質(zhì)連接酶能使自身泛素化，因此實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證是否與滑膜素的自身泛素化相關(guān)。
用與滑膜素蛋白質(zhì)的RING finger區(qū)域的328～342位氨基酸對(duì)應(yīng)的肽作抗原，制備小鼠單克隆抗體SL-1(實(shí)施例1)。應(yīng)用His標(biāo)簽融合蛋白質(zhì)MBP-dTM Syno-His、與一定濃度的SL-1抗體、抗FLAG抗體或小鼠IgG混合，4℃1.5小時(shí)，進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)。
其后，應(yīng)用體外泛素化反應(yīng)體系檢測(cè)滑膜素的自身泛素化?；旌虴1(酵母來(lái)源)、E2(UbcH5c)、ATP、GST-HA-泛素、預(yù)先與抗體反應(yīng)的各MBP-dTM Syno-His，37℃、反應(yīng)120分鐘。反應(yīng)后，各樣品中加入4xSDS-PAGE緩沖液，5分鐘沸騰后，在10％SDS-PAGE上展開(kāi)。用Western印跡分析法，用SL-1抗體檢測(cè)滑膜素泛素化的條帶。
結(jié)果，可以觀察到250kDa的條帶以SL-1抗體量依賴(lài)性的方式受到抑制，2μg的SL-1抗體可抑制MBP-dTM Syno-His的自身泛素化。但是，未見(jiàn)到等量的抗FLAG抗體和小鼠IgG對(duì)250 kDa條帶的抑制備用(圖4上)。此外，同樣的實(shí)驗(yàn)中，SL-1抗體量到達(dá)8～44μg/L時(shí)也能抑制250kDa附近的條帶，這提示SL-1抗體可抑制MBP-dTM Syno-His的自身泛素化(圖4下)。由此表明，SL-1抗體特異性抑制MBP-dTM Syno-His的自身泛素化。
〔實(shí)施例5〕本實(shí)施例的目的是探討SL-1抗體是否對(duì)因滑膜素引起的泛素化產(chǎn)生影響。
泛素通過(guò)由活化酶(E1)、結(jié)合酶(E2)、連接酶(E3)構(gòu)成的泛素體系與靶蛋白共價(jià)結(jié)合，該反應(yīng)反復(fù)進(jìn)行形成多聚泛素鏈，成為被蛋白酶體降解的標(biāo)記。人們發(fā)現(xiàn)P4HA1是滑膜素的底物蛋白。P4HA1是脯氨酰羥化酶的α亞單位。脯氨酰羥化酶是膠原產(chǎn)生過(guò)程中必須的、催化膠原的脯氨酸殘基羥化的酶。因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)了SL-1抗體具有抑制滑膜素自身泛素化的作用，所以探討該抗體是否對(duì)因滑膜素引起的P4HA1泛素化產(chǎn)生影響。
首先，將MBP-dTM Syno-His與一定濃度的SL-1抗體、抗FLAG抗體或小鼠IgG混合，4℃1.5小時(shí)，進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)。其后，在體外泛素化反應(yīng)體系中，將2μg的GST融合P4HA1蛋白質(zhì)GST-P4HA1與E1(酵母來(lái)源)、E2(UbcH5c)、ATP、GST-HA-泛素、預(yù)先與抗體反應(yīng)的各MBP-dTM Syno-His混和，37℃、反應(yīng)120分鐘。反應(yīng)后，各樣品中加入4xSDS-PAGE緩沖液，5分鐘沸騰后，在10％SDS-PAGE上展開(kāi)。用Western印跡分析法，用抗GST抗體檢測(cè)P4HA1泛素化的條帶。
結(jié)果表明，4μg的SL-1抗體可顯著抑制MBP-dTM Syno-His的自身泛素化，但8μg的SL-1抗體對(duì)GST-P4HA1的泛素化一點(diǎn)也沒(méi)有抑制(圖5)。圖5中，-E3是不含滑膜素的樣品，α-SL1是添加抗體的樣品，IgG表示陰性對(duì)照，GST-P4HA1-Ubn所示的250kDa附近的條帶表示泛素化的GST-P4HA1。因此可以明確，SL-1抗體可特異性抑制滑膜素的自身泛素化，對(duì)GST-P4HA1的泛素化無(wú)影響。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性本發(fā)明的抗體可調(diào)節(jié)滑膜素的自身泛素化。
另外，由于RA患者的血中發(fā)現(xiàn)識(shí)別滑膜素的自身抗體，所以在RA的診斷上可提供一全新的途徑。因此，含有本發(fā)明抗體的醫(yī)藥組合物對(duì)RA治療方法等的開(kāi)發(fā)也能提供一全新的途徑。
另外，本發(fā)明提供產(chǎn)生上述抗體的細(xì)胞、及利用上述單克隆抗體的滑膜素含有細(xì)胞的檢測(cè)試劑盒。
滑膜的發(fā)育及骨·軟骨、四肢的發(fā)育相關(guān)的滑膜素基因與RA的病態(tài)相關(guān)，RA患者中能產(chǎn)生針對(duì)該基因產(chǎn)物的抗體。本發(fā)明的SL-1抗體可用于成為對(duì)RA診斷有用的標(biāo)記物的滑膜素以及患者血清中高頻度出現(xiàn)的抗體的特異性檢測(cè)、定量，有利于對(duì)RA疾病的診斷和治療效果的判定。
本發(fā)明的SL-1抗體，利用其高特異性，可及滑膜素作為細(xì)胞標(biāo)記物應(yīng)用，可從胚胎細(xì)胞獲得未分化間質(zhì)細(xì)胞，有望在再生醫(yī)學(xué)中應(yīng)用。
序列表<110>Locomogene Inc.
<120>抗滑膜素抗體<130>G06-0076<150>JP2004-197010<151>2004-07-02<160>5<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>3374<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(403)..(2256)<400>1gccctttctt atgagcatgc ctgtgttggg ttgacagtga gggtaataat gacttgttgg 60ttgattgtag atatagggct ctcccttgca aggtaattag gctccttaaa ttacctgtaa120gattttcttg ccacagcatc cattctggtt aggctggtga tcttctgagt agtgatagat180tggttggtgg tgaggtttac aggtgttccc ttctcttact cctggtgttg gctacaatca240ggtggcgtct agagcagcat gggacaggtg ggtaagggga gtcttctcat tatgcagaag300tgatcaactt aaatctctgt cagatctacc tttatgtagc ccggcagtcg cgcggattga360gcgggctcgc ggcgctgggt tcctggtctc cgggccaggg ca atg ttc cgc acg 414Met Phe Arg Thr1gca gtg atg atg gcg gcc agc ctg gcg ctg acc ggg gct gtg gtg gct 462Ala Val Met Met Ala Ala Ser Leu Ala Leu Thr Gly Ala Val Val Ala5 10 15 20cac gcc tac tac ctc aaa cac cag ttc tac ccc act gtg gtg tac ctg 510His Ala Tyr Tyr Leu Lys His Gln Phe Tyr Pro Thr Val Val Tyr Leu25 30 35acc aag tcc agc ccc agc atg gca gtc ctg tac atc cag gcc ttt gtc 558Thr Lys Ser Ser Pro Ser Met Ala Val Leu Tyr Ile Gln Ala Phe Val40 45 50ctt gtc ttc ctt ctg ggc aag gtg atg ggc aag gtg ttc ttt ggg caa 606Leu Val Phe Leu Leu Gly Lys Val Met Gly Lys Val Phe Phe Gly Gln55 6065
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<213>智人<400>3Ser Leu Ala Leu Thr Gly Ala Val Val Ala His Ala Tyr Tyr Cys1 5 10 15<210>4<211>15<212>PRT<213>智人<400>4Thr Cys Arg Met Asp Val Leu Arg Ala Ser Leu Pro Ala Gln Ser1 5 10 15<210>5<211>15<212>PRT<213>智人<400>5Gly Ala Ala Thr Thr Thr Ala Ala Gly Thr Ser Ala Thr Ala Cys1 5 10 1權(quán)利要求
1.一種針對(duì)滑膜素的抗體或其片段，它能抑制滑膜素的自身泛素化。
2.權(quán)利要求1的抗體或其片段，其特征在于，它不影響滑膜素的底物蛋白質(zhì)的泛素化。
3.權(quán)利要求1或2的抗體或其片段，其抗體是單克隆抗體。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的能抑制滑膜素自身泛素化的抗體或其片段，是用包含序列號(hào)3～5所示的任一氨基酸序列的肽作抗原免疫動(dòng)物，通過(guò)其抗體產(chǎn)生細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞融合而獲得的雜交瘤產(chǎn)生的，是針對(duì)滑膜素的單克隆抗體或其片段。
5.一種雜交瘤，是包含序列號(hào)3～5所示任一氨基酸序列的肽作抗原免疫動(dòng)物，將免疫動(dòng)物的抗體產(chǎn)生細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合而獲得的，它產(chǎn)生能抑制滑膜素自身泛素化的單克隆抗體。
6.一種方法，其是能抑制滑膜素自身泛素化的針對(duì)滑膜素的單克隆抗體的制備方法，用包含序列號(hào)3～5所示任一氨基酸序列的肽作抗原免疫動(dòng)物，培養(yǎng)其抗體產(chǎn)生細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合細(xì)胞，從所得培養(yǎng)物中獲取上述單克隆抗體。
7.一種含有權(quán)利要求1～4任一項(xiàng)中抗體或其片段的藥物組合物。
8.權(quán)利要求7的醫(yī)藥組合物，它用于治療或預(yù)防關(guān)節(jié)風(fēng)濕病、癌癥、纖維癥、動(dòng)脈硬化、Castleman病、多發(fā)骨髓瘤、局限性回腸炎、全身性若年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、腦腫瘤、舌癌、咽喉癌、肺癌、乳腺癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、膽道癌、膽囊癌、十二指腸癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、卵巢癌、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、橫紋肌肉瘤、纖維肉瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、皮膚癌、急性骨髓性白血病、急性淋巴性白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病、成人型T細(xì)胞白血病、惡性淋巴瘤。
9.一種滑膜素自身泛素化的抑制劑，它含有權(quán)利要求1～4任一項(xiàng)中的抗體或其片段。
10.一種滑膜素含有細(xì)胞的檢測(cè)試劑，它含有權(quán)利要求1～4任一項(xiàng)中的抗體或其片段。
11.一種因滑膜素引起的細(xì)胞增殖性疾病的檢測(cè)用試劑，它含有權(quán)利要求1～4任一項(xiàng)中中的抗體或其片段。
12.權(quán)利要求11的試劑，其中細(xì)胞增殖性疾病至少選自關(guān)節(jié)風(fēng)濕病、癌癥、纖維癥、動(dòng)脈硬化、Castleman病、多發(fā)骨髓瘤、局限性回腸炎、全身性若年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、腦腫瘤、舌癌、咽喉癌、肺癌、乳腺癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、膽道癌、膽囊癌、十二指腸癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、卵巢癌、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、橫紋肌肉瘤、纖維肉瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、皮膚癌、急性骨髓性白血病、急性淋巴性白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病、成人型T細(xì)胞白血病、惡性淋巴瘤中的一種。
13.權(quán)利要求10～12任一項(xiàng)中的試劑，其中細(xì)胞選自滑膜細(xì)胞、破骨細(xì)胞、角化上皮細(xì)胞、血液細(xì)胞、癌細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、真皮細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、色素細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、子宮內(nèi)皮細(xì)胞、肺胞上皮細(xì)胞、未分化間質(zhì)系細(xì)胞、外胚層頂脊中的任一種。
14.一種抑制滑膜素自身泛素化的方法，其特征在于，使權(quán)利要求1～4任一項(xiàng)中的抗體或其片段與滑膜素進(jìn)行反應(yīng)。
15.一種滑膜素表達(dá)細(xì)胞的檢測(cè)方法，其特征在于，使權(quán)利要求1～4任一項(xiàng)中的抗體或其片段與生物樣品進(jìn)行反應(yīng)。
16.一種因滑膜素引起的細(xì)胞增殖性疾病的檢測(cè)方法，其特征在于，使權(quán)利要求1～4任一項(xiàng)中的抗體或其片段與從待檢者采集的生物樣品進(jìn)行反應(yīng)。
17.權(quán)利要求16的方法，其中細(xì)胞增殖性疾病至少選自關(guān)節(jié)風(fēng)濕病、癌癥、纖維癥、動(dòng)脈硬化、Castleman病、多發(fā)骨髓瘤、局限性回腸炎、全身性若年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、腦腫瘤、舌癌、咽喉癌、肺癌、乳腺癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、膽道癌、膽囊癌、十二指腸癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、卵巢癌、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、橫紋肌肉瘤、纖維肉瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、皮膚癌、急性骨髓性白血病、急性淋巴性白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病、成人型T細(xì)胞白血病、惡性淋巴瘤中的一種。
18.權(quán)利要求15～17任一項(xiàng)中的方法，其中細(xì)胞選自滑膜細(xì)胞、破骨細(xì)胞、角化上皮細(xì)胞、血液細(xì)胞、癌細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、真皮細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、色素細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、子宮內(nèi)皮細(xì)胞、肺胞上皮細(xì)胞、未分化間質(zhì)細(xì)胞、外胚層頂脊中的任一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及針對(duì)滑膜素的抗體或其片段，以提供識(shí)別滑膜素部分的單克隆抗體，該抗體能抑制滑膜素自身泛素化。
文檔編號(hào)A61P29/00GK101018810SQ200580029608
公開(kāi)日2007年8月15日 申請(qǐng)日期2005年7月4日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月2日
發(fā)明者中島利博, 山崎聰士, 張蕾, 天野徹也 申請(qǐng)人:株式會(huì)社洛科摩基因