專利名稱：高功能抗體生物合成的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種制備抗體或其他蛋白質(zhì)分子的方法。
背景技術：
近幾年的研究表明抗體可用作診斷和治療包括癌癥在內(nèi)的各種疾病[1]。通過化學或者生物修飾，抗體還可用作為癌癥的檢測、診斷試劑[1]。作為疾病診斷、治療試劑抗體必需具備下列條件(1)診斷及治療的抗體必須具有高親和力、專一性，無交叉反應；(2)用作治療試劑的抗體不能引起體內(nèi)免疫反應；(3)用作體內(nèi)的診斷及治療抗體必須在37℃的生理條件下不失活、不降解、無沉淀反應[2]。
然而，從動物中獲得抗體很難達到上述標準。通過動物途徑獲得人源抗體則難度更高，過程非常復雜。生物技術通過在體外篩選抗體可避免使用動物，使有效獲得達到上述標準的抗體成為可能。重組DNA技術還可進一步開發(fā)重組序列，從而產(chǎn)生動物所不能產(chǎn)生的高功能高活性分子。由于避免使用動物，人源抗體也可以很容易獲得。此外，生物技術在體外可以設計和控制篩選條件，從而產(chǎn)生所需抗體。例如，可用高溫篩選結構穩(wěn)定的抗體。目前，常用體外生物篩選技術包括噬菌體顯承[3]、細胞表面顯承[4，5]及核糖體顯承[6]。
基因庫的大小是決定能否產(chǎn)生高功能高活性分子的主要因素之一?；驇煸酱?，多樣性越大，則獲得高功能高活性分子的概率也越大[7]。目前的顯承技術通常使用固定的基因庫，即便是無細胞的核糖體顯承技術，其基因庫最大也只能達到1013-14分子。這一基因庫大小只能任意變化10個殘基((32)10＝1014)。使用固定基因庫的另一缺點是如果基因庫不含有高功能高活性分子，無論使用什么樣的顯承技術也很難得到滿意的抗體。改進辦法是模擬自然進化，建立一個動態(tài)基因庫，使有效的連續(xù)變異和功能篩選同時進行。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種制備抗體或其他蛋白質(zhì)分子的方法，包括以下步驟(a)建立DNA文庫；
(b)表達所述DNA文庫為可溶、游離蛋白質(zhì)；(c)基于所述蛋白質(zhì)的功能，篩選具有結合活性的單克隆菌或一小組克隆分子，獲得其編碼功能蛋白質(zhì)的DNA；(d)對上述(c)中獲得的不同的DNA分子序列進行重組、重排和突變以產(chǎn)生新DNA序列；(e)從(d)中新產(chǎn)生的新DNA序列與來自(c)中的不同DNA分子進行混合；重復(b)到(e)，直到獲得理想的活性蛋白質(zhì)。
特別是，本發(fā)明涉及1.使用以下步驟獲得抗體(或其他蛋白質(zhì)分子)a)建立DNA文庫。
b)表達DNA文庫為可溶、游離蛋白質(zhì)。
c)基于蛋白功能，篩選具有結合功能(Binding activity)的單克隆菌或一小組克隆分子，獲得其編碼功能蛋白質(zhì)的DNAd)對上述(c)中獲得的不同的DNA分子序列進行的重組、重排和突變以產(chǎn)生新DNA序列。
e)從(d)中新產(chǎn)生的新DNA序列與來自(c)中的不同DNA分子進行混合。
f)重復(b)到(e)，直到獲得理想(滿意)的活性蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)方面1a(方面1第a項，以下采用相同規(guī)則)，DNA文庫可以是獨立的PCR片斷或插入到表達質(zhì)粒，基因文庫編碼完整蛋白分子或者部分蛋白質(zhì)區(qū)域。
3.根據(jù)方面1a和2，基因文庫的多樣性可以是來源于自然序列、人造序列或者兩者(自然和人造序列)的混合。
4.根據(jù)方面2和3，基因文庫可以是編碼單鏈抗體(scFv)。其多樣性或者來自天然文庫或者來自賦予了免疫性文庫或者是兩者的結合?；驇熨Y源可以是來自任何動物，包括人源或者動物或人與動物的混合。優(yōu)先選擇應是用人源抗體構架與不同來源的CDRs混合而制備的基因庫。
5.根據(jù)方面1b，基因的表達或者在大腸桿菌中進行，或者在無細胞體系中進行。采用無細胞體系進行表達時，DNA(質(zhì)粒或PCR片斷)可以是單一分子也可以是一小組分子，例如50-100不同分子。
6.根據(jù)方面1c，進行功能篩選時，可使用菌落濾膜篩選法(colony filter screening)，或ELISA，或斑點印跡法(dotblotting)，或蛋白芯片(protein array)，或這些方法的聯(lián)合使用。篩選中活性的檢測可在確定的條件下進行，如采用升溫、添加變性劑、改變培養(yǎng)時間、抑制劑等。
7.根據(jù)方面1d，在功能篩選所獲得DNA分子中進行序列的重組(recombination)和重排(shuffling)時，可以通過PCR，或PCR相關技術，或其他分子生物學方法，或這些方法的聯(lián)合使用來完成?；蛲蛔円部梢酝ㄟ^定點突變(site-directed)或者是隨機突變(randommutation)引入。
8.根據(jù)方面1b，供于本文涉及的基因表達體系可以是E.coli，或者是無細胞體系，或者是其他異源宿主。
9.根據(jù)方面1b，表達的蛋白質(zhì)或者是單體，或者是二聚體(包括共價鍵連接或非共價鍵連接的二聚體)。
10.根據(jù)方面1b，蛋白質(zhì)為重組抗體。
11.根據(jù)方面9，表達的蛋白質(zhì)可攜帶供檢測或者純化蛋白的標記。
12.根據(jù)方面11，標記物可以是一種多肽。在表達過程中，標記物可能與蛋白質(zhì)形成融合體。該多肽也可被化學基團標記。
13.根據(jù)方面9，形成二聚體共價聯(lián)接可通過位于蛋白質(zhì)N末端或C末端或內(nèi)部的一個或多個半胱氨酸殘基聯(lián)接。
14.根據(jù)方面9，二聚體形成可以是通過蛋白質(zhì)結構域(domain)或蛋白質(zhì)序列(sequence)的非共價鍵連接形成的。
15.根據(jù)方面9，二聚體形成可以是通過交聯(lián)試劑實現(xiàn)。
16.根據(jù)方面11-12，其多肽標記序列為(H)7LGGC，優(yōu)先選擇連接于蛋白質(zhì)的C末端。
17.抗CEA(carcinoembryonic antigen)的重組抗體，其親和力大于108M-1，含有表1中例舉任何重鏈CDRs和輕鏈CDRs組合。
18.根據(jù)方面17，對CEA具有高親和力，專一性的重組抗體含有表1任何重鏈的CDR1，CDR2，CDR3及輕鏈CDR1，CDR2，CDR3的重新自由組合(random recombination of CDRs)。
19.根據(jù)方面17-18，對CEA具有高親和力，專一性的重組抗體，其構架來源于人源抗體構架。
20.根據(jù)方面17-19，對CEA具有高親和力，專一性的重組抗體僅含有重鏈。
21.根據(jù)方面17-20，對CEA具有高親和力，專一性的重組抗體包括發(fā)生在CDRs區(qū)或者在抗體構架區(qū)的任何突變體。
22.根據(jù)方面17-21，對CEA具有高親和力，專一性的重組抗體的大量制備可通過任何蛋白表達方法。
23.根據(jù)方面17-22，其重組抗體可連接任何抗腫瘤試劑或可檢測的標記試劑(如放射性標記試劑、化學發(fā)光試劑、熒光劑或者酶標試劑等)。
24.根據(jù)方面17-23，其重組抗體可用于診斷體內(nèi)或體外CEA含量試劑中的一種基本成分，檢測的樣品包括人類樣品或腫瘤組織樣品。
25.根據(jù)方面17-24，其重組抗體可作為治療癌癥的藥物。
26.根據(jù)方面24，其重組抗體用于診斷體試劑包括(但不局限于)以下方式ELISA，protein micro-arrays，dot blot，immuno-precipitation和in vivo detection。
27.根據(jù)方面24，其重組抗體用于體內(nèi)診斷體包括(但不局限于)腫瘤組織的定位診斷及用于抗體指導的外科手術。
28.根據(jù)方面24，其重組抗體片斷用于診斷試劑包括(但不局限于)與不同凝集素合用，檢測診斷特定癌癥病人或癌癥手術后病人。
29.根據(jù)方面17-22，抗CEA的重組抗體用于基因診斷及治療。
附圖簡述

圖1是本發(fā)明方法原理基本圖示。
圖2表明了ELISA結果。其顯示不同大腸桿菌菌株表達的抗體對CEA的結合功能。數(shù)字表示不同大腸桿菌菌株。PC表示CEA抗體正對照。
圖3表明了重組抗體717的ELISA結果。
圖4表明了重組抗體636的表達及ELISA分析。(a)Western blot采用辣根過氧化物酶-抗多聚組氨酸酶聯(lián)抗體檢測從大腸桿菌(E.coli)中表達釋放重組抗體636。(b)ELISA表明重組抗體636的專一性。
圖5表明了重組抗體二聚體的形成。聚丙烯銑氨凝膠電泳(SDS-PAGE)及Western印跡分析重組抗體單體或二聚體的生成。(a)細胞間質(zhì)(periplasm)樣品用DTT處理；(b)細胞間質(zhì)(periplasm)樣品沒用DTT處理。箭頭分別為單體和二聚體蛋白帶。
圖6表明了競爭性ELISA分析。虛線表示50％抑制率的CEA濃度范(1ng/ml)。CEA的分子量為180,000Da。
圖7表明了重組抗體96對CEA抗原的靈敏性檢測(ELISA)。(a)抗體96濃度稀釋；(b)CEA抗原稀釋。
發(fā)明詳述本發(fā)明基于動態(tài)基因庫及連續(xù)功能篩選原理，描述了一新的篩選高親和力、專一性抗體的方法。該方法重復進行“基因庫序列不斷多樣化γ蛋白表達γ功能篩選”，直到獲得滿意的抗體。具體描述如下。
第一周期循環(huán)的抗體基因庫(G1)，可將自然抗體或人工合成的CDRs區(qū)域庫源組建在一個或者多個固定的抗體框架上。然后表達基因庫。最后使用特定抗原篩選出有活性的抗體分子。第二周期循環(huán)抗體基因庫(G2)，將由第一周期循環(huán)所獲得DNA(編碼具有結合抗原的抗體分子)來組成，通過PCR將其CDRs區(qū)域進行重新組合產(chǎn)生新的重新組合的分子。重新組合的分子然后再與沒有組合的分子以一定比例組合(例如1∶1)，形成第二循環(huán)的抗體基因庫(G2)?；驇?G2)又經(jīng)過基因表達，使用同樣的抗原進行功能篩選，獲得具有活性的抗體分子，用于第三周期循環(huán)。周期循環(huán)將繼續(xù)重復，直到獲得具有滿意功能的抗體分子為止(見圖1)。
我們使用抗原CEA，已獲得了一些高活性抗CEA的重組抗體，證明了上述途徑的可行性及有效性(見下)。
本發(fā)明與現(xiàn)有的顯承技術有明顯的不同之處第一，沒有使用固定的基因庫。每一循環(huán)基因庫里都含有重新組合的分子，而且重新組合的分子來源于具有特定抗原結合功能的特定序列。換句話說，基因序列重組在每一循環(huán)均有發(fā)生，產(chǎn)生重組的基因序列源來自于上一循環(huán)中所篩選的具有活性的分子。第二，在進行功能篩選時，產(chǎn)生的抗體是可溶、自由的，沒有以任何形式與其他載體結合。而現(xiàn)有的顯承技術，抗體必須和其他載體直接連接在一起。
建立起始基因庫(G1)首選的途徑之一是使用人源抗體框架[9]，在該框架上建立CDRs庫。該CDRs庫可以是人源，也可以是其他動物或者人源與其他動物的混合物。CDRs庫也可以是來源于免疫后的動物(包括人源)?？贵w表達一般使用大腸桿菌，也可使用無細胞蛋白表達體系。如果使用大腸桿菌表達抗體，其功能篩選使用膜濾菌落篩選方法(見材料與方法)。如果使用無細胞表達體系，則首先篩選小群體分子(例如，50-100基因分子)，然后，有活性的群體繼續(xù)分離(10-20分子)，直到獲得單一分子。
最后篩選獲得的分子可在其C端連接一多肽序列HHHHHHHLGGC。通過C端的半胱氨酸殘基，可以讓單鏈抗體分子形成二聚體。二聚體的形成可增加抗體接合抗原的能力，也可以使單一的H7-tag變成雙倍的H7-tag(即HHHHHHHLGGC-CGGLHHHHHHH)，從而增加檢測靈敏性。另外，C端的半胱氨酸也可用作抗體標記，使抗體成為體內(nèi)、體外診斷試劑(同位素自顯影)包括用于抗體指導的外科手術，或成為抗體藥物試劑。
我們采用本發(fā)明獲得了一些抗CEA的單鏈抗體。其中一抗體可直接發(fā)展為診斷、治療試劑。這些抗體將提供有用的CDRs庫，通過序列重組產(chǎn)生所需的高活性抗CEA抗體。
CEA系Carcinoembryonic antigen(癌胎抗原)的縮寫，該抗原已被學術界確認為一種與腫瘤相關的生物標記，可作為腫瘤診斷及治療的相關抗原[10-15]。最初學術界認為該抗原是一種表達僅存在于胎盤組織中的蛋白，但是現(xiàn)在研究已經(jīng)證實CEA能在幾種正常成人表皮組織中表達，包括結腸、胃、舌、食道、子宮、汗腺和前列腺等器官。但在正常的表皮組織中，CEA僅出現(xiàn)在細胞的前表面，且極少進入血液循環(huán)。例如，健康成人的糞便中每日CEA排泄量為50-70mg，而血液中CEA含量小于10ng/ml。相反，在腫瘤細胞中，CEA可存在于整個腫瘤細胞中，并參與血液循環(huán)。所以，檢測血液中CEA含量可作為癌癥病人診斷指標。
具體實施例方式
材料與方法PCR引物設計與mRNA制備擴增人源抗體可變區(qū)所需的PCR引物，見[9]；制備擴增山羊抗體可變區(qū)所需PCR引物，見[16]；制備擴增大鼠抗體可變區(qū)所需的PCR引物，見[17]。人源抗體的基本庫取材于美國Clontech公司的mRNA文庫，人源CDRs(互補決定域)通過RT-PCR(逆轉錄酶PCR)技術從Clontech的mRNA文庫中擴增獲得。山羊的CDRs通過RT-PCR技術從一癌胚抗原(CEA)免疫的山羊的mRNA文庫中獲得。大鼠的CDRs通過RT-PCR技術從CEA免疫的大鼠的mRNA文庫中獲得。CEA抗原從美國Scripps實驗室購得。
PCR和PCR Shuffling應用上述PCR引物并通過標準的PCR和RT-PCR技術可實現(xiàn)抗體序列的擴增，PCR Shuffling依照一種改進的“DNA片段引物”方法進行，見[18]。簡言之，編碼CDR1、CDR2、CDR3多樣性的PCR片斷均可作為與寡核苷酸一端連接的引物使用。經(jīng)30輪PCR后，通過瓊脂糖電泳分析PCR產(chǎn)品，對目標PCR凝膠帶進行切割和洗脫。
膜濾菌落篩選[19]將PCR片斷與表達型載體連接并轉入大腸桿菌細胞中。接種后，瓊脂平板在37℃下過夜培養(yǎng)。然后將親水性的第一張PVDF膜輕放于長有細菌菌落的平板表面，使細菌菌落轉移到PVDF膜(微孔型GVWP，孔徑0.22um)上。然后將第二張疏水性PVDF轉移膜(Immobilion P，Milli-pore Corp)先用3ug/ml捕獲抗原溶液包被，再用含3％BSA的PBS溶液封阻后浸入2xTY液體培養(yǎng)基中(該培養(yǎng)基含有1mM IPTG和50-100ug/ml氨卞青酶素)。等將第二張潤濕后的膜放置于含有1mMIPTG和100ug/ml的氨卞青酶素的新鮮瓊脂平板表面后，再將第一張含有細菌菌落的PVDF膜放置于第二張膜的表面，使菌落面向上。這疊膜在環(huán)境溫度為25-30攝氏度條件下過夜培養(yǎng)。培養(yǎng)后，帶有菌落的第一張膜被移至新鮮瓊脂平板培養(yǎng)基上，放置于4攝氏度儲存，作為備用細菌。將第二張膜從瓊脂平板表面移出，立即用含0.1％吐溫20的PBS緩沖液洗滌3次(每次10分鐘)，然后用酶聯(lián)抗體檢測法檢測重組抗體。即用該膜與辣根過氧化物酶(酶聯(lián))抗多聚組氨酸抗體(HRP-coupled anti-(His)6 tag antibody，Sigma，英國)。使用時，先用含有1％BSA的PBS溶液以1∶2500稀釋，溫育1小時。經(jīng)3次清洗后，該膜通過一種化學發(fā)光試劑(Piece，英國)進行檢測。
ELISA用100ul CEA抗原包被ELISA微量滴定板孔，除特殊情況，CEA濃度一般為0.5ug/ml。將滴定板放置于4攝氏度過夜包被后，用1％BSA的PBS溶液封阻。加入從大腸桿菌周質(zhì)中提取并經(jīng)Ni+柱層析(Qiagen，英國)純化制得的抗CEA的抗體(scFv)，在室溫或在37℃下培養(yǎng)1小時后，用含0.05％Tween20的PBS洗滌液洗板3次，將1∶2500稀釋后的辣根過氧化物酶-抗多聚組氨酸酶聯(lián)抗體(Sigma，英國)加入滴定板孔中，室溫1小時后，加入100ul的ELISA顯色劑(Sigma，英國)。在450nm發(fā)射濾光器下讀數(shù)。進行競爭性ELISA反應時，以不同濃度游離的CEA作為抑制劑，抑制重組抗體和與微量板上包埋的CEA抗原進行的結合反應。
實施例實施例1 抗CEA的重組抗體的篩選采用由3條人源重鏈(VH1、VH3、VH5)和一條山羊重鏈VH組成的基本構架來構建重組抗體可變區(qū)的最初PCR基因文庫(G1)，這些重鏈構架再與人的輕鏈V3連接作為結合單元。不同動物源的CDRs庫則是通過PCR shuffling技術引入。該PCR基因庫被克隆到攜帶有一個PelB前導序列和自行設計的多聚組氨酸標記的表達載體中。然后將該載體轉入大腸桿菌E.coli中并置于瓊脂平板上生長，然后將E.coli菌落轉移到PVDF濾膜上。使用膜濾菌落篩選方法，檢測從大腸桿菌E.coli中釋放的重組抗體。挑選陽性菌落，提取其DNA作為下一步PCR擴增制備CDRs庫。三輪循環(huán)后，以奶粉為對照，采用CEA抗原結合的ELISA方法分析陽性。圖2表明一些重組抗體與CEA有特異性結合。所有與CEA結合的克隆菌被測序。CDRs序例結果見表1。其中幾個重組抗體的抗原結性質(zhì)也進行了ELISA分析，確定其CEA抗原的專一結合，結果見圖3和圖4。
實施例2 重組抗體二聚體(scFv)2的形成為了方便于大腸桿菌周質(zhì)中重組抗體二聚體(scFv)2的形成，我們在抗體C末端引入半胱氨酸殘基。同時，為了方便于檢測重組抗體的生成，多聚組氨酸(His)6也被引入。我們用western blotting法來檢測所重組抗體在E.coli的表達及生成形式(即單體或二聚體)。重組抗體(96scFv)在大腸桿菌中表達后，提取其細胞間質(zhì)(periplasm)，然后用含有或不含二硫蘇糖醇(DTT)的點樣緩沖液(loading buffer)分別處理周質(zhì)提取物。樣品經(jīng)聚丙烯銑氨凝膠(SDS-PAGE)電泳后轉移到PVDF膜(Immobilion P)上，接著采用辣根過氧化物酶-抗多聚組氨酸酶聯(lián)抗體檢測。分析表明，當樣品用DTT處理后，只顯示一條預期單體帶，而沒有被DTT處理的樣品則產(chǎn)生兩條蛋白質(zhì)帶，分別為單體和二聚體蛋白帶(見圖5)。這一結果表明重組抗體scFv通過C-端的半胱氨酸殘基形成共價二硫健，產(chǎn)生抗體二聚體(scFv)2。
實施例3 重組抗體親和力、特異性和穩(wěn)定性的測定來自E.coli細胞間質(zhì)的重組抗體96經(jīng)Ni+親和層析法純化后，以游離CEA抗原為抑制劑，采用競爭性ELISA分析方法檢測此抗體對CEA抗原的親和力。如果以50％抑制率的CEA濃度表示抗體親和力高低，該抑制曲線表明重組抗體96具有小于0.001nM濃度的表觀親和力(10-12M)(圖6)。我們也通過蛋白質(zhì)印跡(western blotting)方法測定了已知含量的96scFv抗體與CEA抗原的結合曲線(見圖7a)。該結果也表明重組抗體96與CEA抗原的親和力小于0.01nM。重組抗體96的特異性也通過檢測抗體96與一系列不同的普通蛋白質(zhì)的結合情況來確定，如與BSA、奶粉、KLH等的蛋白作為對照。結果顯示抗體96與上述對照蛋白質(zhì)均無交叉反應。抗體96的穩(wěn)定性實驗是采用在提高溫度條件下的ELISA方法來測定的，結果表明該抗體在37℃條件下至少3小時內(nèi)沒有明顯結合力下降。再則，我們也觀察到當用PBS溶液適當對尿素可溶但無活性抗體(inclusion bodies)進行稀釋，可觀察到抗體96很快恢復或折疊成具有結合CEA活性的抗體。這一容易復性事實也證明了該抗體的穩(wěn)定性。
實施例4 重組抗體96對CEA抗原的靈敏性檢測采用ELISA方法測定不同濃度的CEA(50ng、25ng、12.5ng、6ng、3ng)與96ScFv抗體的親和力，檢測表明96scFv抗體識別含量低于3ngCEA抗原(見圖7b)。表明該抗體對CEA的濃度檢測非常靈敏。
表1.不同區(qū)域CDRs序列重鏈(VH)

輕鏈(VL)

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1.一種制備抗體或其他蛋白質(zhì)分子的方法，包括以下步驟(a)建立DNA文庫；(b)表達所述DNA文庫為可溶、游離蛋白質(zhì)；(c)基于所述蛋白質(zhì)的功能，篩選具有結合活性的單克隆菌或一小組克隆分子，獲得其編碼功能蛋白質(zhì)的DNA；(d)對上述(c)中獲得的不同的DNA分子序列進行重組、重排和突變以產(chǎn)生新DNA序列；(e)從(d)中新產(chǎn)生的新DNA序列與來自(c)中的不同DNA分子進行混合；重復(b)到(e)，直到獲得理想的活性蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權利要求1的方法，其中所述DNA文庫是獨立的PCR片斷。
3.根據(jù)權利要求1的方法，其中所述DNA文庫是插入到表達質(zhì)粒中的PCR片斷。
4.根據(jù)權利要求2的方法，其中所述DNA文庫編碼完整蛋白分子。
5.根據(jù)權利要求2的方法，其中所述DNA文庫編碼部分蛋白質(zhì)區(qū)域。
6.根據(jù)權利要求1-5任一項的方法，其中DNA文庫的多樣性是來源于自然序列、人造序列或者兩者的組合。
7.根據(jù)權利要求1-5任一項的方法，其中DNA文庫編碼單鏈抗體(scFv)。
8.根據(jù)權利要求1-5任一項的方法，其中DNA文庫的多樣性來自天然文庫。
9.根據(jù)權利要求1-5任一項的方法，其中DNA文庫的多樣性來自賦予了免疫性文庫。
10.根據(jù)權利要求1-5任一項的方法，其中DNA文庫的多樣性來自天然文庫和賦予了免疫性文庫的結合。
11.根據(jù)權利要求1-5任一項的方法，其中DNA文庫來自人。
12.根據(jù)權利要求1-5任一項的方法，其中DNA文庫來自動物。
13.根據(jù)權利要求1-5任一項的方法，其中DNA文庫來自人與動物的混合。
14.根據(jù)權利要求1-5任一項的方法，其中基因庫資源是用人源抗體構架與不同來源的CDRs混合而制備的基因庫。
15.根據(jù)權利要求1的方法，其中基因的表達或者在大腸桿菌中進行，或者在無細胞體系中進行。
16.根據(jù)權利要求1的方法，其中在進行功能篩選時，使用菌落濾膜篩選法，或ELISA，或斑點印跡法，或蛋白芯片，或這些方法的聯(lián)合使用。
17.根據(jù)權利要求1的方法，其中在功能篩選所獲得DNA分子中進行序列的重組和重排時，可以通過PCR，或PCR相關技術，或其他分子生物學方法，或這些方法的聯(lián)合使用來完成。
18.根據(jù)權利要求1的方法，其中所述基因表達體系是大腸桿菌，或者是無細胞體系，或者是其他異源宿主。
19.根據(jù)權利要求1的發(fā)，其中表達的蛋白質(zhì)或者是單體，或者是二聚體。
20.根據(jù)權利要求1的方法，其中蛋白質(zhì)為重組抗體。
21.根據(jù)權利要求9的方法，其中表達的蛋白質(zhì)可攜帶供檢測或者純化蛋白的標記。
22.根據(jù)權利要求21的方法，其中標記物可以是一種多肽。
23.根據(jù)權利要求19的方法，其中形成二聚體共價聯(lián)接是通過位于蛋白質(zhì)N末端或C末端或內(nèi)部的一個或多個半胱氨酸殘基聯(lián)接的。
24.根據(jù)權利要求19的方法，其中二聚體形成是通過蛋白質(zhì)結構域或蛋白質(zhì)序列的非共價鍵連接形成的。
25.根據(jù)權利要求19的方法，其中二聚體形成是通過交聯(lián)試劑實現(xiàn)的。
26.根據(jù)權利要求21-22任一項的方法，其多肽標記序列為(H)7LGGC。
27.抗CEA的重組抗體，其親和力高于10-8M，并且含有以下任何重鏈CDRs和輕鏈CDRs組合重鏈CDR1 CDR2 CDR3TFTGYYWINPNSGGTNYAQKFQGSVNGDSVPYTFTGYYWINPNSGGTNYAQKFQGGLWDYYYTFTGYYWINPNSGGTNYAQKFQGDLNNWNYYYYYTFTGHYGGVSSGALTAYNTALQSSFITIFGVVIIHYYYTFTGYYWINPNSGGRNYAQKFQGDLNNWNYYYYYFSLTKYWINPNSGGTNYAQKFQGDLNNWNYYYYAFSTYGVIWYDGSNKYYADSVKGEIAGSFTTSWIIYPGDSDTRYSPSFQGQSSGWYSFTTSWIIYPGDSDTRYSPSFQGQSSGWYYSFTSYIIYPGDSDTQY QAGMLSP輕鏈CDR1 CDR2 CDR3GGNNIGSKSVH DDSDRPSQVWDSSSDGGNNIGSKSVH DDSDRPSQPFDSSLNGGGNNIGSKSVH DDSDRPQKVWDSSSDGGHDIGSKSVH GDSDRPSASYQSTYSGGGNNIGSKSVH ATTDRASQVWDSSSDTGSSSNIGAGHDVH GNSNRPSQSYDSSLSGSGSSSNIGGNAYVG GDSDRPSAAWDDTLHGTGSSSNIGAGHDVH GNSNRPSQSYDSSLSGTGSSSDVGAGHDVH GNSNRPSQPFDSSLNGTGSSSTTGAGYDVH GNNNRPSQSYDNTLSG
28.根據(jù)權利要求27的抗體，所述抗體對CEA具有高親和力，并且含有含有任何重鏈CDR1、CDR2、CDR3及輕鏈CDR1、CDR2、CDR3的重新自由組合。
29.根據(jù)權利要求27或28的抗體，所述抗體對CEA具有高親和力，專一性的重組抗體，其構架來源于人源抗體構架。
30.根據(jù)權利要求27-29任一項的抗體，所述抗體對CEA具有高親和力，專一性的重組抗體僅含有重鏈。
31.根據(jù)權利要求27-30任一項的抗體，所述抗體對CEA具有高親和力，專一性的重組抗體包括發(fā)生在CDRs區(qū)或者在抗體構架區(qū)的任何突變體。
32.根據(jù)權利要求27-31任一項的抗體，所述抗體對CEA具有高親和力，專一性的重組抗體的大量制備是通過任何蛋白表達方法進行的。
33.根據(jù)權利要求27-32任一項的抗體，其中重組抗體可連接任何抗腫瘤試劑或可檢測的標記試劑。
34.根據(jù)權利要求27-33任一項的抗體，其中重組抗體可用于診斷體內(nèi)或體外CEA含量試劑中的一種基本成分，檢測的樣品包括人類樣品或腫瘤組織樣品。
35.根據(jù)權利要求27-34任一項的抗體，其中重組抗體可作為治療癌癥的藥物。
36.根據(jù)權利要求34的抗體，其中重組抗體用于ELISA、斑點印跡法、蛋白芯片、免疫沉淀和體內(nèi)檢測。
37.根據(jù)權利要求34的抗體，其中重組抗體用于腫瘤組織的定位診斷及用于抗體指導的外科手術。
38.根據(jù)權利要求34的抗體，其中重組抗體片斷用于與不同凝集素合用，檢測診斷特定癌癥病人或癌癥手術后病人。
39.根據(jù)權利要求27-32任一項的抗體，其中抗CEA的重組抗體用于基因診斷及治療。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種篩選重組抗體的新方法。該方法運用一反復循環(huán)過程“基因庫多樣化γ蛋白表達γ功能篩選”，直至獲得滿意的抗體為止。在進行抗體表達時，一多用途的多肽序列(Tag)連接在抗體的C端。該多肽序列可將單鏈抗體(scFv)形成二聚體(scFv)
文檔編號C12N15/13GK1948476SQ200510113739
公開日2007年4月18日 申請日期2005年10月14日 優(yōu)先權日2005年10月14日
發(fā)明者柳紅 申請人:英國希爾思生物分子有限責任公司