專利名稱：：抗人cd146的單克隆抗體，包含其的組合物，檢測(cè)可溶性cd146的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。具體地說(shuō)本發(fā)明涉及一組抗人CD146的鼠單克隆抗體，這組抗體能夠在生化、細(xì)胞和組織水平特異性識(shí)別人源CD146蛋白。本發(fā)明還涉及一種夾心ELISA檢測(cè)可溶性CD146的方法，在這種檢測(cè)方法中捕獲抗體是本發(fā)明中涉及的鼠單克隆抗體，檢測(cè)抗體是用生物素標(biāo)記的發(fā)明專利ZL991075862中涉及的鼠單克隆抗體AA98。
背景技術(shù)：
：CD146，又名MUC18，Mel-CAM/MCAM，是一種屬于免疫球蛋白超家族的細(xì)胞黏附分子。CD146胞外有五個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域(V-V-C2-C2-C2)(HolnessandSimmons1994)，并被高度糖基化，介導(dǎo)鈣離子非依賴的細(xì)胞間相互黏附。CD146最早發(fā)現(xiàn)是黑色素瘤的標(biāo)志分子，參與黑色素瘤的轉(zhuǎn)移及惡化(Lehmann,Riethmulleretal.1989;Sers,Kirschetal.1993)。CD146在黑色素腫瘤中的異常高表達(dá)增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞之間的黏附，并對(duì)于腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移非常重要(Johnson,Rothbacheretal.1993)。研究表明，CD146的表達(dá)與黑色素瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力直接相關(guān)，而在不表達(dá)CD146的黑色素瘤細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)CD146可以顯著增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力(Bani,Raketal.1996;Shih,Speicheretal.1997;Xie，Lucaetal.1997)。此外，CD146也表達(dá)在少量的正常組織中，比如平滑肌，血管內(nèi)皮和滋養(yǎng)層等(Shih1999)。同時(shí)，CD146也被廣泛認(rèn)為是血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性標(biāo)志分子(Bardin,Francesetal.1996;Bardin，Anfossoetal.2001)。在之前的研究中，抗人CD146抗體被應(yīng)用檢測(cè)血液中的循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞(George,Ponceletetal.1991;Bardin,Georgeetal.1996;Solovey,Guietal.2001)。由于這一特征，在伴有內(nèi)皮損傷、脫落現(xiàn)象的某些疾病中，CD146可作為疾病進(jìn)程的參考指標(biāo)。另有研究表明CD146分子還表達(dá)于單核細(xì)胞，有報(bào)道在激活的T淋巴細(xì)胞上也有高表達(dá)(Pickl,Majdicetal.1997)。像其它很多黏附分子一樣，體內(nèi)CD146分子以細(xì)胞膜和可溶形式(solubleCD146,sCD146)存在(Neidhart:Wehrlietal.1999;Bardin，Moaletal.2003)。研究表明sCD146在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑液以及慢性腎衰竭患者的血清中的表達(dá)水平明顯高于正常人?？谷薈D146抗體在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中體現(xiàn)出了很強(qiáng)的抑制腫瘤生長(zhǎng)的治療效果。Mills等開(kāi)發(fā)的抗CD146全人抗體，ABX-MA1在裸鼠模型中顯著地抑制黑色素腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲以及向肺部的轉(zhuǎn)移(Mills,Tellezetal.2002)。發(fā)明專利ZL991075862中所述，開(kāi)發(fā)的抗CD146鼠單克隆抗體AA98具有抑制腫瘤血管生成的作用，并在多種裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)中明顯抑制腫瘤(例如肝癌、胰腺癌等)的生長(zhǎng)(Yan,Linetal.2003)。進(jìn)一步的研究還揭示了AA98的抑制腫瘤血管生成的機(jī)制是通過(guò)抑制MAPK磷酸化以及NFkB活化實(shí)現(xiàn)的(Bu,Gaoetal.2006)。雖然抗人源CD146的抗體已有一些報(bào)道，但是這些抗體對(duì)不同的血管內(nèi)皮組織卻有著不同的結(jié)合活性。例如S-endol能夠結(jié)合各種類型的血管的內(nèi)皮細(xì)胞，包括動(dòng)脈、細(xì)動(dòng)脈、靜脈、小靜脈、毛細(xì)血管、高內(nèi)皮微靜脈和淋巴血管系統(tǒng)等(George,Ponceletetal.1991)。而另一株抗CD146抗體MUC18只結(jié)合毛細(xì)血管和高內(nèi)皮微靜脈(Kuzu,Bicknelletal.1993)。S-endol結(jié)合臍帶靜脈內(nèi)皮組織而MUC18不結(jié)合(Bardin,Francesetal.1996)。此外，P1H12能夠同時(shí)結(jié)合腫瘤和正常組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞(StCroix,Ragoetal.2000)，而AA98卻特異性的結(jié)合腫瘤組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞(Yan,Linetal.2003)。這些證據(jù)表明，很可能不同的抗體結(jié)合表位在不同的組織和微環(huán)境中的暴露情況有所差異。因此，針對(duì)CD146蛋白上不同表位開(kāi)發(fā)抗體，并研究其對(duì)于不同組織的結(jié)合能力，對(duì)于闡明CD146在血管內(nèi)皮細(xì)胞上的功能非常必要。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明利用天然純化的CD146蛋白免疫小鼠，獲得雜交瘤細(xì)胞。用ELISA的方法篩選與重組表達(dá)的CD146蛋白胞外區(qū)有強(qiáng)結(jié)合能力的抗體，獲得六株抗體，分別命名為AA1、AA2、AA3、AA4、AA5禾QAA7，同時(shí)獲得分泌這些抗體的雜交瘤細(xì)胞，依次是8E8、8F4、A5、GIO、H5①和H5②。這六株抗體均屬I(mǎi)gGl，K亞型。ELISA和免疫印跡的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這些抗體和CD146分子的特異性結(jié)合。利用重組表達(dá)的CD146蛋白胞外不同的結(jié)構(gòu)域以及免疫印跡的方法，證實(shí)AA1和AA2識(shí)別表位(序列為SEQIDNO:l的人CD146序列中的位置24-128)位于第一個(gè)IgV結(jié)構(gòu)域，而AA3、AA4、AA5禾口AA7識(shí)另lj表位(序列為SEQIDNO:l的人CD146序列中的位置335-400)位于第二個(gè)lgC2結(jié)構(gòu)域。因此，這六株抗體依照不同的抗原表位分成兩類VI類(包括AA1和AA2)和C2-2類(包括AA3、AA4、AA5和AA7)。細(xì)胞免疫熒光，免疫沉淀及免疫組化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)VI類抗體能夠在分子、細(xì)胞及組織水平同時(shí)識(shí)別天然構(gòu)象和變性的CD146蛋白質(zhì)，而C2-2類抗體只識(shí)別變性的CD146蛋白質(zhì)。這證實(shí)了不同的抗原表位在不同情況下的暴露有所不同。本發(fā)明同時(shí)利用VI類抗體，如AA1和生物素標(biāo)記的發(fā)明專利ZL991075862中涉及的鼠單克隆抗體AA98，開(kāi)發(fā)了一套夾心ELISA的方法，用于檢測(cè)溶液和體液中可溶性CD146分子。相比之前提供的商業(yè)化檢測(cè)方法報(bào)道(CyQuantELISAassaykit,Bioxytex,Marseille,France)的雙抗夾心ELISA(靈敏度為10ng/ml)，本發(fā)明的夾心ELISA方法靈敏度提高了一個(gè)數(shù)量級(jí)，達(dá)到lng/ml。此方法能夠用于人血液及腦脊液中可溶性CD146的檢測(cè)，并在CD146表達(dá)異常的病癥中具有臨床診斷應(yīng)用價(jià)值。運(yùn)用本發(fā)明中的方法，發(fā)現(xiàn)在系統(tǒng)性血管炎等自身免疫病中，病人血清中的CD146分子含量顯著升高，對(duì)于臨床診斷具有指導(dǎo)意義和應(yīng)用價(jià)值。具體地，本發(fā)明涉及一種人CD146抗原表位，其氨基酸序列為SEQIDNO:24或SEQIDNO:25所示。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種抗人CD146抗體，其特征在于其能夠特異性識(shí)別上述人CD146抗原表位。優(yōu)選地，所述抗人CD146抗體特征在于包括抗體重鏈和抗體輕鏈，其中所述抗體重鏈包括作為CDR的由SEQIDNO:26的氨基酸序列組成的CDR1，由SEQIDNO:27的氨基酸序列組成的CDR2和由SEQIDNO:28的氨基酸序列組成的CDR3組成，所述抗體輕鏈包括作為CDR的由SEQIDNO:29的氨基酸序列組成的CDRl，由SEQIDNO:30的氨基酸序列組成的CDR2和由SEQIDNO:31的氨基酸序列組成的CDR3組成。更優(yōu)選地，所述抗體的重鏈由SEQIDNO:32的氨基酸序列組成，輕鏈由SEQIDNO:33的氨基酸序列組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種抗人CD146抗體，特征在于包括抗體重鏈和抗體輕鏈，其中所述抗體重鏈包括作為CDR的由SEQIDNO:34的氨基酸序列組成的CDRl，由SEQIDNO:35的氨基酸序列組成的CDR2和由SEQIDNO:36的氨基酸序列組成的CDR3組成，所述抗體輕鏈包括作為CDR的由SEQIDNO:37的氨基酸序列組成的CDRl，由SEQIDNO:38的氨基酸序列組成的CDR2和由SEQIDNO:39的氨基酸序列組成的CDR3組成。優(yōu)選地，所述抗體的重鏈由SEQIDNO:40的氨基酸序列組成，輕鏈由SEQIDNO:41的氨基酸序列組成。在本發(fā)明的另一方面，還涉及上述抗人CD146的抗體在制備用于治療腫瘤的藥物組合物中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述腫瘤是黑色素瘤、肝癌，胰腺癌。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，還涉及上述抗人CD146的抗體在制備用于靶向CD146的人體腫瘤的成像定位診斷的診斷劑中的應(yīng)用。在另一個(gè)方面，本發(fā)明還涉及一種組合物，例如用于治療腫瘤的藥物組合物，其包含上述任一方面的抗人CD146抗體，和藥用載體。用于本文時(shí)，"藥用載體"包括生理適合的任何和所有的溶劑、分散介質(zhì)、包衣劑、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲和吸收延緩試劑等。優(yōu)選地，所述載體適合于靜脈內(nèi)的、肌內(nèi)的、皮下的、腸胃外的、脊柱的或表皮的施用(例如，通過(guò)注射或灌輸)。通過(guò)許多本領(lǐng)域已知的方法可以施用本發(fā)明的組合物。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，施用路徑和/或模式將取決于所需結(jié)果而變化。為了通過(guò)某些施用路徑來(lái)施用本發(fā)明化合物，用一種材料來(lái)包被化合物，或與一種材料共同施用化合物以預(yù)防其失活可能是必需的。例如，可以以適當(dāng)載體，例如脂質(zhì)體或稀釋劑來(lái)給受試者施用所述化合物。藥用稀釋劑包括鹽水和水性緩沖溶液。藥用載體包括用于即時(shí)制備滅菌的可注射溶液或分散體的滅菌水溶液或分散體和滅菌粉末。將這些介質(zhì)和試劑用于藥用活性物質(zhì)的應(yīng)用為本領(lǐng)域所知。在用于本文時(shí)，短語(yǔ)"腸胃外的施用"和"經(jīng)腸胃外施用"表示除腸內(nèi)的和局部施用以外的通常通過(guò)注射的施用模式，包括但不局限于，靜脈內(nèi)的、肌內(nèi)的、動(dòng)脈內(nèi)的、鞘內(nèi)的、囊內(nèi)的、眶內(nèi)的、心內(nèi)的、皮內(nèi)的、腹膜內(nèi)的、經(jīng)氣管的、皮下的、表皮下的、關(guān)節(jié)內(nèi)的、囊下的、蛛網(wǎng)膜下的、脊柱內(nèi)的、硬膜外的、胸骨內(nèi)的注射和灌輸。無(wú)論選擇何種施用路徑，通過(guò)為本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的常規(guī)方法，將可以以適合的水合形式和/或本發(fā)明的藥物組合物形式使用的本發(fā)明的化合物配制成可藥用劑型。對(duì)于特定患者、組合物和施用方式，本發(fā)明藥物組合物的活性成分的實(shí)際劑量水平可以變化以獲得有效實(shí)現(xiàn)理想的治療反應(yīng)而不會(huì)對(duì)患者具有毒性的活性成分的量。選定的劑量水平將取決于許多藥物動(dòng)力學(xué)因素，其包括所用的本發(fā)明特定組合物的活性，施用的路徑，施用的時(shí)間，所用的特定化合物的排泄率，治療的持續(xù)時(shí)間，與所用的特定化合物結(jié)合使用的其它藥物、化合物和/或物質(zhì)，待治療的患者的年齡、性別、體重、疾病狀況、一般健康和以前的疾病史和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域眾所周知的類似因素。所述組合物必須是無(wú)菌且流體的，以到達(dá)組合物可以通過(guò)注射器進(jìn)行傳遞的程度。除了水之外，載體優(yōu)選是等滲緩沖鹽溶液。在另一個(gè)方面，本發(fā)明還涉及分泌抗人CD146抗體的雜交瘤細(xì)胞株，保藏號(hào)分別為CGMCCNO:2310和CGMCCNO:2311。在另一個(gè)方面，本發(fā)明還涉及編碼能與下面定義的各個(gè)另外抗體鏈一起裝配的多肽的核酸，其中所述多肽是下述多肽的任一種a)抗體重鏈，其為上述所定義的抗體重鏈之一；b)抗體輕鏈，其為上述所定義的抗體輕鏈之一。同時(shí)，本發(fā)明還涉及包括按照權(quán)利要求11的核酸的表達(dá)載體，其能夠在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)所述核酸。以及包括所述表達(dá)載體的原核或真核宿主細(xì)胞。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，還涉及一種制備結(jié)合人CD146的抗體的方法，其特征在于在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)上述編碼抗體重鏈的核酸和編碼抗體輕鏈的核酸，并且從所述細(xì)胞中回收所述多肽。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，涉及一種檢測(cè)人CD146的方法，其利用上述的抗人CD146抗體，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行。優(yōu)選地，所述酶聯(lián)免疫吸附法是夾心酶聯(lián)免疫吸附法，其中將上述的抗人CD146抗體的一種或多種作為捕獲抗體，將中國(guó)專利ZL991075862中的鼠單克隆抗體AA98作為檢測(cè)抗體。更優(yōu)選地，所述人CD146存在于體液中。甚至更優(yōu)選地，所述體液是組織液，血清，淋巴液或腦脊液。所述體液可采自系統(tǒng)性血管炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥以及格林巴利綜合癥等自身免疫性疾病病人或/和慢性腎衰等病癥的病人。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，還涉及所述抗人CD146的抗體的衍生物，其中所述衍生物為所述抗體與生物標(biāo)記物(如生物素、HRP、堿性磷酸酶、FITC、PE、Cy3、Cy5等常規(guī)熒光染料、納米磁珠等納米材料)、抗腫瘤藥物(如現(xiàn)有技術(shù)已知的卡鉑、順鉑、五氟尿嘧啶等)、毒素(如蓖麻毒素、淋巴毒素等)、放射活性劑(如131碘、9()釔、放射性銅等)結(jié)合的產(chǎn)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員基于說(shuō)明書(shū)關(guān)于抗人CD146抗體的教導(dǎo)，結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)的知識(shí)，完全可以毫無(wú)困難地獲得上述衍生物，進(jìn)而確定衍生物的效果。本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)在于(1)研制了一組針對(duì)人CD146蛋白的鼠單克隆抗體；(2)揭示了這組抗CD146抗體識(shí)別的抗原表位，并證實(shí)了識(shí)別不同表位的抗體，在分子、細(xì)胞及組織水平上對(duì)于CD146蛋白的結(jié)合有顯著差別；(3)開(kāi)發(fā)了一種高靈敏度的夾心ELISA方法用于可溶性CD146分子的檢測(cè)。圖1:AA1-AA7特異識(shí)別重組人源CD146分子胞外區(qū)段蛋白。圖2:各種CD146胞外重組蛋白示意圖。圖3:AA1-AA5和AA7的抗原表位鑒定。上圖是Dl-D5的蛋白電泳圖。下圖是分別利用AA1-AA5和AA7進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其與Dl-D5的結(jié)合能力。圖4:AA1-AA5和AA7在免疫印跡中識(shí)別還原和非還原CD146蛋白。泳道1-6是非還原的A375細(xì)胞裂解液，泳道7-12是還原的A375細(xì)胞裂解液。圖5:AA1-AA5和AA7用于流式細(xì)胞術(shù)的CD146分子檢測(cè)。圖中mlgG作為陰性對(duì)照。只有AA1和AA2識(shí)別活細(xì)胞中的CD146分子。圖6:AA1-AA5和AA7用于細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞膜上CD146。AA98作為實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照，mlgG作為實(shí)驗(yàn)的陰性對(duì)照。只有AA1和AA2以及AA98能夠結(jié)合細(xì)胞膜上CD146，箭頭僅示其中之一。圖7:AA1-AA5和AA7用于免疫沉淀實(shí)驗(yàn)捕獲細(xì)胞裂解液中的CD146。泳道1-7是分別用mlgG，AA1-5及AA7進(jìn)行免疫沉淀捕獲的蛋白復(fù)合物，泳道8是細(xì)胞裂解上清，作為陽(yáng)性對(duì)照，用AA98進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)。圖8:AA1-AA5和AA7進(jìn)行冰凍切片免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)組織水平的CD146分子。AA98作為實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照，CD31用于標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞(如箭頭所示)。如箭頭所示，只有AA1和AA2能夠結(jié)合冰凍切片上組織水平的CD146分子。圖9:夾心ELISA檢測(cè)5ng/ml-320ng/ml標(biāo)準(zhǔn)樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖10:夾心ELISA檢測(cè)5ng/ml-80ng/ml標(biāo)準(zhǔn)樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，及擬合方程。圖ll:HMV6g載體的圖譜，其含有MBP-His標(biāo)簽。雜交瘤細(xì)胞株8E8和G10(其分別分泌抗體AA1和AA4)于2008年1月24日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC，中國(guó)，北京，海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號(hào))，保藏號(hào)分別為CGMCCNo.2310和CGMCCNo.2311。具體實(shí)施方式下面通過(guò)實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解，下述實(shí)施例僅是用于舉例說(shuō)明的目的。本發(fā)明的精神和范圍由后附的權(quán)利要求所限定。實(shí)施例1:單克隆抗體AA1-AA5和AA7的制備及鑒定。應(yīng)用雜交瘤技術(shù)(KohlerandMilstein1975;Yeh,Hellstrometal.1979;Yeh,Hellstrometal.1982)產(chǎn)生并篩選獲得抗體AA1-AA6和AA7。簡(jiǎn)述如下從人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中分離天然CD146蛋白(其氨基酸序列如SEQIDNO:l所示，核苷酸序列如SEQIDNO:2所示)，按照(Yan，Linetal.2003)描述的單克隆抗體AA98抗原純化方法純化，將其作為免疫原對(duì)BALB/C小鼠(北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)進(jìn)行免疫接種，每次腹膜內(nèi)注射100嗎蛋白/鼠，每?jī)尚瞧谝淮?，共三次。取脾?xì)胞之前加強(qiáng)免疫一次，M膜內(nèi)注射lOOpg蛋白/鼠。加強(qiáng)免疫之后三天，取脾臟，并將脾細(xì)胞懸浮于RPMI培養(yǎng)基中。在聚乙二醇(PEG)存在下，將脾細(xì)胞和SP2/0-Ag14鼠骨髓瘤細(xì)胞(ATCC)進(jìn)行融合，并用HAT選擇性培養(yǎng)基對(duì)雜交瘤進(jìn)行篩選。運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)的方法篩選能夠大量產(chǎn)生高親和力的抗人CD146抗體的雜交瘤細(xì)胞克隆。使用重組表達(dá)的CD146分子胞外區(qū)蛋白，rhCD146(序列為SEQIDNO:l的人CD146序列中的位置氨基酸24-552)作為包被抗原，檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清。具體的做法是，首先在ELISA板上過(guò)夜包被50i^lpg/mlrhCD146蛋白，用PBS洗三遍。加入2%牛血清白蛋白(Ameresco)封閉1小時(shí)。然后先后加入分泌抗體的雜交瘤培養(yǎng)上清、酶標(biāo)抗體(1:5000稀釋的羊抗鼠HRP，SantaCruz)和底物(200ng/mlTMB(Ameresco)，0.03%H2O2(北京化學(xué)試劑公司)，pH4.5)，進(jìn)行ELISA篩選。通過(guò)三輪篩選獲得了六個(gè)分泌高親和力抗體的雜交瘤細(xì)胞株8E8、8F4、A5、G10、H5①和H5②，其分泌的抗體分別對(duì)應(yīng)命名為AA1、AA2、AA3、AA4、AA5禾口AA7。將雜交瘤細(xì)胞株8E8和G10(其分別分泌抗體AA1和AA4)于2008年1月24日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC，中國(guó)，北京，海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號(hào))，保藏號(hào)分別為CGMCCNo.2310和CGMCCNo.2311。而雜交瘤細(xì)胞株AA6是ELISA篩選時(shí)的陰性雜交瘤克隆，與CD146結(jié)合能力很弱。分別大量培養(yǎng)擴(kuò)增雜交瘤細(xì)胞8E8、8F4、A5、GIO、H5①和H5②，分別收集含有AA1、AA2、AA3、AA4、AA5和AA7抗體的培養(yǎng)上清用于抗體功能鑒定。另外分別將雜交瘤細(xì)胞8E8、8F4、A5、GIO、H5①和H5②用無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，用于制備抗體腹水。腹水的制備方法簡(jiǎn)述如下六周齡BALB/C小鼠腹腔注射降植垸(Sigma)0.5ml/只。IO天后，將雜交瘤細(xì)胞懸液lxl(^個(gè)/ml接種于BALB/C小鼠腹腔，0.5ml/只，約十天后，收集腹水，離心取上清。通過(guò)蛋白A親和層析，從培養(yǎng)上清或腹水中純化單克隆抗體AA1、AA2、AA3、AA4、AA5禾QAA7。將純化單克隆抗體無(wú)菌過(guò)濾，并冷藏或冷凍保存。應(yīng)用BDPharmingen公司鼠抗體亞型鑒定試劑盒(目錄號(hào)550487)，將發(fā)明專利ZL991075862中所述AA98(下同)作為實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照，ELISA方法鑒定出抗體AA1、AA2、AA3、AA4、AA5和AA7均屬于IgGl亞型，如表1所示。表1抗體AA1、AA2、AA3、AA4、AA5、AA7和AA98抗體分型<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>ELISA方法用于鑒定純化的AA1-AA5和AA7六種抗體對(duì)于CD146蛋白的結(jié)合特異性。原核表達(dá)的6xHis-tag融合的His-rhCD146(由6xHis-tag和序列為SEQIDNO:l的人CD146序列中的位置24-552的氨基酸組成)以及真核表達(dá)的堿性磷酸酶(AlkalinePhosphatase,簡(jiǎn)稱AP，其序列如SEQIDNO:3所示)融合的sCD146-AP(由序列為SEQIDNO:l的人CD146序列中的位置24-559的氨基酸和序列為SEQIDN0:3的AP以及序列為SEQIDNO:42的連接區(qū)組成)分別在實(shí)驗(yàn)中被用作包被抗原(它們的結(jié)構(gòu)示意圖參見(jiàn)圖2)。其中，His-rhCD146制備方法簡(jiǎn)要介紹如下將人CD146的cDNA序列(SEQIDNO:2)中位置70-1656的核苷酸克隆至pET28b(Novagen)載體上，利用限制性內(nèi)切酶Ndel和Notl(NEB提供)及引物5，-AACATA辺GTGCCCGGAGAGGCTGAGCAG-3，(SEQIDNO:4)禾卩5'-AAGCGGCCGCCAGCTTTCTCTCTGTGGAG-3，(SEQIDNO:5)。在E.ColiBL21DE3(Invitrogen)菌株中表達(dá)，以包含體形式存在，洗滌及復(fù)性后獲得所需抗原。蛋白表達(dá)及包涵體洗滌方法見(jiàn)下述D1，D2及D4蛋白表達(dá)及包涵體洗滌方法。包涵體復(fù)性步驟如下1.將溶解的包涵體蛋白調(diào)濃度至lmg/ml，共lml裝入透析袋中，外液以140ml6M脲素，200mM精氨酸，25mMTris(pH8.0)，150mMNaCl，2mM還原型谷胱甘肽(GSH)，lmM氧化型谷胱甘肽(GSSG)4。C靜置透析過(guò)夜。2.倒出上述50ml透析外液，補(bǔ)入50ml稀釋液600mM精氨酸，25mMTris(pH8.0),150mMNaCl，2mMGSH,lmMGSSG,。此時(shí)外液的的尿素濃度為4M。4。C透析6小時(shí)。3.倒出75ml透析外液，補(bǔ)入75ml稀釋液，尿素終濃度為2M。4°C透析6小時(shí)。4.配200ml400mM精氨酸，25mMTris，150mMNaCl，2mMGSH，lmMGSSG，透析過(guò)夜。尿素濃度為OM，精氨酸濃度為400mM。5.倒出100ml透析外液，補(bǔ)入100ml25mMTris，150mMNaCl。終溶液為200mM精氨酸，25mMTris，150mMNaCl，lmMGSH，0.5mMGSSG。4匸透析6小時(shí)。6.重復(fù)步驟5.7.以900ml25mMTris150mMNaCl透析過(guò)夜。8.換新鮮1L25mMTris150mMNaCl透析6小時(shí)。9.測(cè)定蛋白含量，SDS-PAGE法檢測(cè)。濃度可達(dá)500pg/ml以上。可通過(guò)超濾或Ni—NTA親和層析進(jìn)一步濃縮。透析用化學(xué)試劑均由Sigma公司提供。)sCD146-AP的制備過(guò)程簡(jiǎn)單如下融合蛋白的編碼核苷酸序列(SEQIDNO:6)用Xbal禾BEcoRI(NEB)克隆在pCMV-SPORTS6載體(OpenBiosystems提供)上，含有插入片段的質(zhì)粒利用Fugene6(Roche)轉(zhuǎn)染試劑瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞(ATCC)中，細(xì)胞培養(yǎng)上清按照(Yan,Linetal.2003)描述的單克隆抗體AA98抗原純化方法純化，獲得sCD146-AP融合蛋白。利用ELISA檢測(cè)抗體與重組蛋白的結(jié)合，簡(jiǎn)單的方法如下。1)制備Trx-His(其氨基酸序列如SEQIDNO:7所示)按照實(shí)施例2中關(guān)于表達(dá)D3和D5蛋白的方法，即將pET32a(Novagen)轉(zhuǎn)化B121(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)Ni柱純化。用Thrombin蛋白酶(15U酶/mg蛋白，Sigma提供)4。C酶解過(guò)夜，之后再用Ni-NTA純化帶著6xHis標(biāo)簽的Trx-His，方法與實(shí)施例2中純化D3和D5蛋白類似。2)制備MBP-His(其氨基酸序列如SEQIDNO:8所示)按照實(shí)施例2中關(guān)于表達(dá)D3和D5蛋白的方法，即將HMV6g載體(載體圖譜如圖11所示)轉(zhuǎn)化B121(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)Ni柱純化。用Tev蛋白酶(l嗎酶/mg蛋白，Iiwitrogen提供)4°C酶解過(guò)夜，之后再用Ni-NTA純化帶著6xHis標(biāo)簽的MBP-His，方法與實(shí)施例2純化D3和D5蛋白類似。3)在ELISA板上不同孔上分別包被lpg/ml抗原(His-rhCD146,sCD146-AP,Trx-His和MBP-His)，50^1/孔，4。C包被過(guò)夜；用2%BSA/PBS(Ameresco)室溫封閉2小時(shí)，之后用1:2000稀釋的抗體(制備的腹水AAl-5和AA7)50nl/孔室溫在板上孵育2小時(shí)，接著用PBST洗5遍，PBS洗1遍。二抗用l:5000稀釋的HRP偶聯(lián)羊抗鼠IgG(SantaCruz)室溫孵育1小時(shí)，PBST洗5遍，PBS洗1遍。用TMB底物(200ng/mlTMB(Ameresco)，0.03%H2O2(北京化學(xué)試劑公司)，pH4.5)100^1/孔顯色，硫酸終止。結(jié)果如圖1所示，AA1-AA5及AA7都能很強(qiáng)的結(jié)合重組表達(dá)的CD146蛋白胞外區(qū)His-rhCD146和sCD146-AP，然而卻不結(jié)合6xHis-tag融合的硫氧還蛋白(Trx-His)和6xHis-tag融合的甘露糖結(jié)合蛋白(MBP-His)。這證實(shí)了這六株抗體均特異性識(shí)別CD146蛋白而不是His-tag。其中使用的AA6作為實(shí)驗(yàn)的陰性對(duì)照。實(shí)施例2:單克隆抗體AA1-AA5和AA7的抗原表位鑒定。運(yùn)用分別重組表達(dá)的人源CD146胞外區(qū)五個(gè)結(jié)構(gòu)域蛋白以及免疫印跡的方法，鑒定了本發(fā)明中所述的六株抗體的抗原表位。如圖2所示，結(jié)構(gòu)域1-5分別表示CD146從胞外到跨膜區(qū)的V-V-C2-C2-C2五個(gè)結(jié)構(gòu)域。重疊的序列被設(shè)計(jì)來(lái)防止可能的表位丟失。結(jié)構(gòu)域1(序列為SEQIDNO:l的人CD146序列中的位置24-145的氨基酸，如SEQIDNO:9所示)克隆在pET30a(Novagen)上，表達(dá)出來(lái)的是His6-Stag融合His6-S-Dl蛋白。結(jié)構(gòu)域2(序列為SEQIDNO:l的人CD146序列中的位置128-248的氨基酸，如SEQIDNO:10所示)、結(jié)構(gòu)域3(序列為SEQIDNO:l的人CD146序列中的位置233-335的氮基酸，如SEQIDNO:ll所示)、結(jié)構(gòu)域4(序列為SEQIDNO:l的人CD146序列中的位置313-442的氨基酸，如SEQIDNO:12所示)以及結(jié)構(gòu)域5(序列為SEQIDNO:l的人CD146序列中的位置400-560的氨基酸，如SEQIDNO:13所示)分別克隆在pET32a(Novagen)上，表達(dá)出來(lái)的分別是Trx-His6-Stag融合的Trx-His6-S-D2，Trx-His6-S-D3,Trx-His6-S-D4和Trx-His6-S-D5?？寺∵^(guò)程簡(jiǎn)述如下用相應(yīng)的一對(duì)引物D1S和D1A(用于結(jié)構(gòu)域1)，D2S和D2A(用于結(jié)構(gòu)域2)，D3S和D3A(用于結(jié)構(gòu)域3)，D4S禾BD4A(用于結(jié)構(gòu)域4)，D5S和D5A(用于結(jié)構(gòu)域5)，及模板pcDNA3.1(-)b-CD146(通過(guò)將序列如SEQIDNO:2所示來(lái)源于Johnson,J.P.實(shí)驗(yàn)室的CD146cDNA利用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI(NEB)克隆至pcDNA3.1(-)b載體(Invitrogen)而獲得)作PCR反應(yīng)，條件為95°C5分鐘；95°C45秒，56°C40秒，72°C50秒，30個(gè)循環(huán)；72°C5分鐘。分別擴(kuò)增出編碼結(jié)構(gòu)域1-5的核苷酸序列。引物列表如下，正義鏈引物帶有NcoI酶切位點(diǎn)(如下劃線所示)，反義鏈引物帶有HindIII酶切位點(diǎn)(如下劃線所示)引物名稱引物序列5'至3'D1S5，cateCCATGGTGCCCGGAGAGGCTGAG3'(SEOID<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠(BiowestAgarose)分離，用Tiangen公司提供的瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(產(chǎn)品編號(hào)DP209-03)回收PCR產(chǎn)物，然后用Takara公司提供的pMD18T-simplekit將片段連接到T載體(試劑盒內(nèi)提供了載體和酶)上，并轉(zhuǎn)化ToplO感受態(tài)細(xì)胞(Tiangen提供)。加有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)板上長(zhǎng)出來(lái)的單克隆Dl-T(插入了結(jié)構(gòu)域1的核苷酸序列)，D2-T(插入了結(jié)構(gòu)域2的核苷酸序列)，D3-T(插入了結(jié)構(gòu)域3的核苷酸序列)，D4-T(插入了結(jié)構(gòu)域4的核苷酸序列)和D5-T(插入了結(jié)構(gòu)域5的核苷酸序列)，用帶有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)37°C過(guò)夜，并用Tiangen提供的質(zhì)粒小提試劑盒(產(chǎn)品編號(hào)DP103-03)抽提質(zhì)粒，用NcoI和HindIII(NEB)雙酶切pET30a、pET32a、提取的質(zhì)粒(即分別插入了結(jié)構(gòu)域1-5的核苷酸序列的T載體)。之后用2%瓊脂糖凝膠(BiowestAgarose)分離，用Tiangen公司提供的瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(產(chǎn)品編號(hào)DP209-03)回收T載體的酶切小片段(即結(jié)構(gòu)域l-5的核苷酸序列)及pET30a和pET32a酶切開(kāi)的質(zhì)粒片段。Dl-T的酶切小片段與pET30a酶切開(kāi)的質(zhì)粒片段連接，D2-T，D3-T，D4-T及D5-T的酶切小片段與pET32a酶切開(kāi)的質(zhì)粒片段連接，用NEB公司提供的T4DNA連接酶建立連接反應(yīng)，16。C連接過(guò)夜。轉(zhuǎn)化ToplO感受態(tài)細(xì)胞(Tiangen)，pET30a-Dl用含卡那霉素(50ng/ml)的半固體LB培養(yǎng)板篩選，pET32a-D2，pET32a-D3，pET32a-D4，禾BpET32a-D5用含氨節(jié)霉素(100ng/ml)的半固體LB培養(yǎng)板篩選。過(guò)夜培養(yǎng)獲得的單克隆分別用含有抗生素的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，并抽提質(zhì)粒，獲得的質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化B121(DE3)感受態(tài)細(xì)胞(Tiangen)。重組蛋白His6-S-Dl，Trx-His6-S-D2，Trx-His6-S-D3，Trx-His6-S-D4和Trx-His6-S-D5的誘導(dǎo)表達(dá)轉(zhuǎn)化了pET30a-Dl，pET32a-D2，pET32a-D3，pET32a-D4，和pET32a-D5的B121(DE3)單克隆，在含有相應(yīng)抗生素的5mlLB培養(yǎng)液中37t:培養(yǎng)過(guò)夜。過(guò)夜菌1:100接種至相應(yīng)新鮮的培養(yǎng)基中37。C培養(yǎng)，待細(xì)菌生長(zhǎng)至OD600為0.6時(shí)，加入lmMIPTG(Ameresco)37"C誘導(dǎo)表達(dá)6小時(shí)或者0.2mMIPTG16。C誘導(dǎo)過(guò)夜。Dl，D2和D4由IPTG誘導(dǎo)表達(dá)之后，呈現(xiàn)包涵體狀態(tài)，不可溶。包涵體純化和洗滌方法如下菌體重懸于25mMTris-HCl(pH7.4)，300W超聲2x99個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)超聲4秒，暫停8秒，共12秒。4'C12000g離心30分鐘。包涵體沉淀重懸于溶液1(2.5MNaCl)中，4'C攪拌30分鐘，4。C12000g離心30分鐘。包涵體沉淀重懸于溶液2(0.5%TritonX-100,10mMEDTA，pH8.0)中，4"C攪拌30分鐘，4°C12000g離心30分鐘。包涵體沉淀重懸于溶液3(2MUrea,50mMTris，lmMEDTA,pH8.0)中，4。C攪拌30分鐘，4°C12000g離心30分鐘。隨后，包涵體溶解在溶液4(8MUrea,25mMTris，150mMNaCl,25mMDTT,pH8.0)中。D3和D5由IPTG誘導(dǎo)表達(dá)之后，呈現(xiàn)可溶狀態(tài)，用Ni柱純化。具體方法如下菌體重懸于25mMTris-HCl(pH7.4)，300W超聲2x99個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)超聲4秒，暫停8秒，共12秒。4。C12000g離心30分鐘，收集上清，過(guò)0.45mm濾膜去除雜質(zhì)。Ni-NTAsepharose6FastFlow(GEHealthCare)填柱，用超純水洗滌后，在50mMTris-HCl(pH7.4),150mMNaCl的平衡溶液中平衡。然后將含有His6-tag的蛋白的離心可溶上清上樣掛柱，用洗滌溶液(50mMTris-HCl,pH7.4,150mMNaCl,50mM咪唑)洗柱。最后洗脫溶液(50mMTris-HCl,pH7.4,150mMNaCl,300mM咪唑)洗脫柱上的蛋白。利用免疫印跡實(shí)驗(yàn)鑒定AA1-AA5及AA7所識(shí)別的抗原表位。簡(jiǎn)單過(guò)程如下用15%SDS-PAGE分離原核表達(dá)純化的Dl-D5蛋白，然后用Bio-rad半干轉(zhuǎn)印儀將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用溶解在PBST中的5%脫脂牛奶室溫封閉2小時(shí)，然后用上述5y。脫脂牛奶/PBST稀釋(1:2000)的一抗溶液(AA1-AA5及AA7)4。C孵育過(guò)夜。接著PBST洗5遍，用上述5。/。脫脂牛奶/PBST稀釋(1:2000)的二抗(辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的羊抗鼠IgG抗體，Pierce)溶液室溫孵育1小時(shí)。PBST洗5遍之后，用Pierce公司的顯色底物(產(chǎn)品編號(hào)34076，400)ul3%H2O2+400plLuminol溶液/miniblot)顯色。實(shí)驗(yàn)中，分別利用AA1,AA2,AA3,AA4,AA5和AA7作為一抗，辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的羊抗鼠IgG(Pierce)作為二抗，檢測(cè)不同抗體與重組表達(dá)的CD146胞外區(qū)五個(gè)結(jié)構(gòu)域Dl-5的結(jié)合活性。如圖3所示，AA1和AA2只結(jié)合Dl，不結(jié)合相鄰的D2，證實(shí)了其抗原表位處于序列為SEQIDNO:l的人CD146序列中的位置24-128之間，具體序列如SEQIDNO:24所示。AA3-5和AA7只結(jié)合D4，不結(jié)合相鄰的D3和D5，證實(shí)了其抗原表位處于序列為SEQIDNO:l的人CD146序列中的位置335-400之間，具體序列如SEQIDNO:25所示。基于不同的抗原表位把這六株抗體分成兩類，Vl類和C2-2類。因?yàn)锳A1和AA2的抗原表位位于第一個(gè)IgV樣結(jié)構(gòu)域，歸為V1類，而AA3，AA4，AA5和AA7的抗原表位位于第二個(gè)IgC2樣結(jié)構(gòu)域，所以歸為C2-2實(shí)施例3:利用單克隆抗體AA1-AA5和AA7檢測(cè)人CD146本發(fā)明所述抗人CD146鼠單克隆抗體可以在分子、細(xì)胞以及組織水平檢測(cè)人CD146蛋白。在全細(xì)胞蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)中，AA1-AA5和AA7均能夠識(shí)別還原和非還原兩種狀態(tài)的CD146蛋白。具體的實(shí)驗(yàn)方法如下收集高表達(dá)CD146的人源黑色素瘤細(xì)胞A375(ATCC)，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩遍，4°C800rpm離心5分鐘，細(xì)胞沉淀用裂解液(Tris-HCl50mMpH8.0,NaCl150mM,EDTAlmM,NP-401%,Glycerol10%,PMSF100嗎/ml)裂解細(xì)胞，4。C12000g離心15分鐘，收集上清，分別加入含有DTT(終濃度100mM)(二硫蘇糖醇)和不含有DTT的上樣緩沖液(5x上樣緩沖液0.313MTris-HCl,pH6.8,10%SDS,0.05%溴酚藍(lán)，50%甘油)，100。C煮樣。10%SDS-PAGE分離全細(xì)胞蛋白，之后半干電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。5%脫脂牛奶封閉后，分別用AA1-AA5和AA7作為一抗(1:10000用封閉液5%脫脂牛奶/TBST稀釋)4'C孵育膜過(guò)夜，然后用辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的羊抗鼠IgG二抗(Pierce,1:2000封閉液5。/。脫脂牛奶/TBST稀釋)室溫孵育1小時(shí)，用Pierce公司提供的顯色底物(產(chǎn)品編號(hào)34076，400^13%H2O2+400)ilLuminol溶液/miniblot)檢測(cè)。如圖4所示，AA1-AA5禾口AA7能夠在分子水平結(jié)合A375表達(dá)的CD146蛋白分子。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)手段，證實(shí)VI類抗體能夠識(shí)別活細(xì)胞水平中細(xì)胞膜表面的CD146蛋白，C2-2類抗體不能識(shí)別。具體的實(shí)驗(yàn)方法如下收集高表達(dá)CD146的人源黑色素瘤細(xì)胞A375(同上)，用預(yù)冷的含有0.3%BSA的PBS洗滌細(xì)胞兩遍，每遍洗滌之后4'C800rpm離心5分鐘。用羊血清稀釋液(l:20用PBS稀釋)封閉細(xì)胞，之后力口入AA1-AA5禾BAA7，以及陽(yáng)性對(duì)照AA98作為一抗(1:2000PBS稀釋)，冰上孵育40分鐘。用預(yù)冷的含有0.3%BSA的PBS洗滌細(xì)胞兩遍，加入FITC偶聯(lián)的羊抗鼠IgG作為二抗(Sigma，1:300PBS稀釋)，室溫孵育20分鐘，用BDFACSCaliburflowcytometry系統(tǒng)檢測(cè)(BDBioscience)。結(jié)果如圖5所示，AA1和AA2即VI類抗體能夠結(jié)合A375表達(dá)的CD146分子，與陰性對(duì)照mlgG(用小鼠IgG作為一抗使用，Sigma提供)有明顯區(qū)別。而AA3-5禾BAA7即C2-2類抗體，不能結(jié)合活細(xì)胞A375膜上的天然狀態(tài)的CD146分子，可能的原因是C2-2類識(shí)別的抗原表位在天然狀態(tài)下并不暴露在CD146蛋白分子的表面。同樣，利用免疫熒光技術(shù)實(shí)驗(yàn)，也只有VI類抗體能夠識(shí)別細(xì)胞水平的CD146分子，而C2-2類抗體不能，AA98作為實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照，mlgG作為陰性對(duì)照，如圖6所示。實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了CD146分子主要分布在細(xì)胞膜表面。實(shí)驗(yàn)過(guò)程簡(jiǎn)述如下用預(yù)冷h1丙酮/甲醇固定長(zhǎng)于24孔板的A375細(xì)胞1分鐘，之后PBS洗滌兩次。用2%羊血清(北京中杉金橋)于37。C封閉細(xì)胞30分鐘，PBS洗兩遍。然后加入100(ill:2000PBS稀釋的一抗(AA1-AA5及AA7，AA98和mlgG)，37。C孵育2小時(shí)。PBS洗滌之后，用l:300PBS稀釋的FITC偶聯(lián)的羊抗鼠IgG(Sigma)作為二抗和細(xì)胞37"C孵育1小時(shí)。PBS洗，鏡檢。VI類抗體可以用于富集溶液中的天然CD146分子。利用免疫沉淀的技術(shù)，V1類抗體可以結(jié)合并富集細(xì)胞裂解液中的CD146蛋白。具體的方法如下lxl07A375(同上)細(xì)胞在0.6mL冰預(yù)冷的上述裂解液中裂解30分鐘，4。C12000g離心15分鐘，收集上清。先加入20(^150%slurry(50%與PBS或TE混合)的proteinA-Agarose(SantaCruz)，進(jìn)行預(yù)清除。然后分別加入2嗎AA1-AA5和AA7，4"C孵育過(guò)夜。之后加入20)_il50%slurry的proteinA-Agarose捕獲抗原-抗體復(fù)合物，用PBS洗滌沉淀三次，加入40|illx上樣緩沖液(將上述5x上樣緩沖液稀釋5倍)，IO(TC加熱煮樣10分鐘。蛋白沉淀用免疫印跡的方法檢測(cè)(實(shí)驗(yàn)方法同上所述)，AA98作為檢測(cè)一抗。如圖7所示，AA1和AA2能夠沉淀富集A375裂解液中的CD146蛋白，而C2-2類抗體不能。利用免疫組織化學(xué)技術(shù)，VI類抗體可以檢測(cè)組織水平的CD146蛋白分子。具體做法如下人臍帶組織用OCT(冰凍組織包埋液，Sakura提供)包埋，進(jìn)行冰凍切片。切片在預(yù)冷的丙酮里固定5分鐘，然后在含有0.3%H202的甲醇中室溫閉光孵育30分鐘去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的干擾。PBS洗滌三次之后，用5%馬血清(北京中杉金橋，PBS稀釋馬血清)封閉切片，然后分別在含有AA1-AA5，AA7，AA98以及抗CD31抗體(SantaCruz)的一抗稀釋液(1:2000封閉液稀釋)中4。C孵育過(guò)夜。之后用生物素標(biāo)記的二抗(生物素偶聯(lián)的羊抗鼠IgG，Vector公司，1:1000封閉液稀釋)和辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的鏈霉抗生物素蛋白作為三抗(Vector,1:1000PBS稀釋)，37。C孵育組織切片，最后用新鮮配置的DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋，產(chǎn)品編號(hào)ZLI-9033)顯色。顯色完畢之后用蘇木素復(fù)染細(xì)胞核。如圖8所示，抗CD31抗體標(biāo)記了血管內(nèi)皮細(xì)胞(如箭頭所示)，AA1和AA2能夠在組織水平識(shí)別臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞以及血管平滑肌細(xì)胞分布的CD146分子(如箭頭所示)，而C2-2類抗體不能。AA98作為實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照(如箭頭所示)。實(shí)施例4:高靈敏度雙抗夾心ELISA檢測(cè)人可溶性CD146方法利用本發(fā)明中所述抗人CD146抗體AA1以及發(fā)明專利ZL991075862中所述AA98，本發(fā)明開(kāi)發(fā)出了一種高靈敏度的雙抗夾心ELISA方法，檢測(cè)血清中的可溶性CD146。主要方法是用AA1(關(guān)于AA2的實(shí)驗(yàn)相同，故省略)作為捕獲抗原，生物素(Biotin)標(biāo)記的AA98作為檢測(cè)抗原，真核表達(dá)的sCD146-AP作為標(biāo)準(zhǔn)品，檢測(cè)正常人和自身免疫病患者血清中的可溶性CD146蛋白。實(shí)驗(yàn)證實(shí)了，本發(fā)明開(kāi)發(fā)的夾心ELISA具有較高的靈敏度和較寬的線性范圍。利用此方法還證實(shí)了，自身免疫病如系統(tǒng)性血管炎患者血清中的CD146蛋白含量，較健康志愿者有顯著升高。具體實(shí)驗(yàn)方法如下1.樣品來(lái)源及臨床資料健康志愿者血漿來(lái)自北京紅十字血液中心，血管炎患者血漿來(lái)自安貞醫(yī)院。2.具體步驟1)ELISA板包被抗體將抗體AA1以0.02MPB(pH7.25)稀釋至l嗎/ml，50pl/孔4。C包被過(guò)夜。2)封閉非特異結(jié)合位點(diǎn)200)^1/孔2。/。BSA/PBS，室溫孵育2小時(shí)。3)樣品孵育將已知濃度的sCD146-AP梯度以封閉液(2%BSA/PBS)稀釋用來(lái)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，稀釋后的濃度分別為5、10、20、40、80、160、320ng/ml。待測(cè)血清稀釋20倍，上樣量50pl，封閉液取代樣品作為陰性對(duì)照。每個(gè)樣品設(shè)兩次重復(fù)。室溫孵育2小時(shí)。4)PBST5次，PBS1次洗去非特異性結(jié)合。5)檢測(cè)抗體孵育檢測(cè)抗體AA98-生物素(用于標(biāo)記AA98的生物素由Pierce公司提供)以2%BSA/PB稀釋至0.5嗎/ml，50^/孔室溫孵育2小時(shí)。'6)PBST5次，PBS1次洗去非特異性結(jié)合。7)酶標(biāo)二抗放大信號(hào)加入合適濃度的鏈霉抗生物素蛋白-辣根過(guò)氧化物酶(Vector,h3000)，50(al/孔，室溫孵育1小時(shí)。8)PBST5次，PBS1次洗去非特異性結(jié)合。9)顏色反應(yīng)加入底物(200ng/mlTMB(Ameresco)，0.03%H2O2(北京化學(xué)試劑公司)，pH4.5)顯色，100|_11/孔，37t:i5分鐘，加入50^1/孔2MH2S04終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀450nm讀數(shù)。10)軟件統(tǒng)計(jì)結(jié)果軟件分析吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)sCD146-AP濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。11)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)樣品的濃度。3.結(jié)果分析1)利用已知sCD146-AP的濃度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。稀釋后sCD146-AP的濃度為5320ng/ml，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖9示。經(jīng)計(jì)算得出該方法檢測(cè)范圍在580ng/ml內(nèi)符合線性。取sCD146-AP濃度580ng/ml作圖所得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線(R2=0.9981)，如圖10所示。2)分析健康志愿者及系統(tǒng)性血管炎患者血漿中sCD146含量。健康志愿者血漿中sCD146含量為154.7ng/ml，而血管炎患者血漿sCD146含量達(dá)到383.9ng/ml，二者差異明顯，如表2所示。表2:利用夾心ELISA檢測(cè)的健康志愿者和系統(tǒng)性血管炎患者血清中可溶性CD146含量。檢測(cè)樣品OD450稀釋液sCD146濃度(ng/ml)原液sCD146濃度(ng/ml)健康志愿者0.1337.73191154,7系統(tǒng)性血管炎患者0.317519.1925383.9參考文獻(xiàn)Bani，M.R.,J.Rak,etal.(1996)."Multiplefeature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tgaacaagaccaagatccacagcgsgtc1440C"Cg3gC3CCCtgaatgtcctcgtga.ccccgg3gCtgUggagacaggtgttgaatgcacg1500gCCtCC33Cgacctgggcaaaaac8CC3gc3"tCC"tcttCCtggagctggtcaatttaacc15603CCCtC3C3Ccagactccaacacaaccactggcctcagcacttccactgccagtcctcat1620accagagccaacagcacctccacagagaga83gCtgCCggagccgg,gccggggcggc1680ggCggC3gCggCggCggC3gcggcggcggcSgCgtg333Caa^gcact己ttgC3CtggC31740CtCtt3CCgttactgtttscccctgtgaca&33gCCCgg3caccagaaatgcctgttctg1800ga33acc.gggCtgCtC3gggcgatattactgcacccggcggtgctcgccgttt38Cgggt1860gatcagactgccgctctgcgtg3ttctcttagcgat犯a.cctgcaa&aaa"tsttattttg1920ctgattggcgstgggatgggggactcggaaattsctgccgcacgtaattatgccg犯ggt1980gcgggcggctt3t3g3tgCCttaccgcttaccgggcaatacactcactat2040gcgctgaat3aaaassccggcaaaccggactacgtcaccg3CtCggCtgCatcagcaacc2100gcctggtcaaccggtgtcaaaacctataacggcgcgctgg2160gstcaccc33cgsttctggaaatggcaaaa,gccgcaggtctggCg3CCggt33Cgtt"tct22203ccgcagagttgcsggstgcC3CgCCCgCtgcgctggtggcscatgtgacctcgcgcaas2280tgCt3CggtCcgagcgcg3ccagtgaaaaa.tgtcc.gggt3acgctctggaaaaaggcgg32340333gg3tCg3ttaCCg33C3gctgct.taacgctcgtgccgscgttacgcttggcggcggc2400gcaaaaacctUgctgaaacggcaaccgctggtg33tggC3ggg&aa33CgCtgCgtg332460C3ggC3C3ggcgcgtggttatcagttggtgagcgatgctgcctcactgaaUcggtgacg2520g33gcgaatcagca333acccctgcttggcctgtUgctgacggcaatatgccsgtgcgc2580tggctaggaccgaaagcaacgtaccatggca.atatcgataagcccgcagtC3CCtgt3Cg2640ccaastccgcaacgta.atgacagtgtaccaaccctggcgcagatgaccgacaaagccatt2700gaattgttgagtS3333tg3g雄ggctttttcctgcaagUgEl3ggtgCgtcaatcgat27603a3C3gg3tCatgctgcgaatccttgtgggcaaattggcgagacggtcgatctcgatga32820gccgtacaa.cgggcgctggaattcgctaaaaaggagggtaacacgctggtcatagtcacc2880gCtg3tC3CgcccacgccagCC3g3ttgttgcgccggataCC333gCtCCgggcctcacc2940caggcgctaatggCgC3gtgatggtgatgagttscgggaactccgaagag3000gattcaca.agaacataccggcagtcagttgcgtsUgcggCg"t3tggCCCgC3tgCCgCC3060aatgttgttggactgaccgaccagaccgatctcttctacaccatgaaagccgctctgggg3120Ctg333t333129<210〉7<211〉129<212>PRT<213〉人工序列〈400〉7MetSerAspLyslielieHisLeuThrAspAspSerPheAspThrAsp151015ValLeuLysAlaAspGlyAlalieLeuValAspPheTrpAlaGluTrp202530CysGlyProCysLysMetlieAlaProlieLeuAspGlulieAlaAsp'354045GluTyrGinGlyLysLeuThrValAlaLysLeuAsnlieAspGinAsn505560ProGlyThrAlaProLysTyrGlylieArgGlylieProThrLeuLeu65707580LeuPheLysAsnGlyGluValAla,AlaThrUsValGlyAlaLeuSer859095LvsGlyGinLeuLysGluPheLeuAspAlaAsnLeuAlaGlySerGly100105110SerGlyHisMetHisHisHisHisHisHisSerSerGlyLeuValPro115120125<210〉8<211〉386PRT〈213〉人工序列〈■〉8MetGlySer1SerHisHisHisHisHisHisGlyThrLysThrGluGlu51015GlyLysLeuVallieTrplieAsnGlyAspLysGlyTyrAsnGlyLeu202530八laGluValGlyLysLysPheGluLysAspThrGlylieLysValThr354045ValGluHisProAspLysLeuGluGluLysPheProGinValAlaAla505560ThrGlyAspGlyProAsplieliePheTrpAlaHisAspArgPheGly65707580GlyTyrA]aGinSerGlvLeuLeuAlaGlulieThrProAspLysAla859095PheGinAspLysLeuTyrProPheThrTrpAspAlaValArgTyrAsn100105110GlyLysUulieAlaTyrProlieAlaValGluAlaLeuSerLeulie115120125TyrAsnLysAspLeuLeuProAsnProProLysThrTrpGluGlulie130135140ProAlaLeuAspLysGluLeuLysAlaLysGlyLysSerAlaLeuMet145150155160GluAsnLeuGinGluProTyrPheThrTrpProLeulieAlaAlaAsp165170175GlyGlyTyrAlaPheLysTyrGluAsnGlyLysTyrAsplieLysAsp180185190ValGlyValAspAsnAlaGlyAlaLysAlaGlyLeuThrPheLeuVal195200205AspLeulieLysAsnLysHisMetAsnAlaAspThrAspTyrSerlie210215220AlaGluAlaAlaPheAsnLysGlyGluThrAlaMetThrlieAsnGly225230235240ProTrpAlaTrpSerAsnlieAspThrSerLysValAsnTyrGlyVal245250255ThrValLeuProThrPheLysGlyGinProSerLysProPheValGly260265270ValUuSerAlaGlylieAsnAlaAlaSerProAsnLysGluL_euAla275280285LysGluPheLeuGluAsnTyrLeuLeuThrAspGluGlyLeuGluAla290295300ValAsnLysAspLysProLeuGlyAlaValAlaLeuLysSerTyrGlu305310315320GluGluLeuAlaLysAspProArglieAlaAlaThrMetGluAsnAla325330335GinLysGlyGlulieMetProAsnlieProGinMetSerAlaPheTrp340345350TyrAlaValArgThrAlaVallieAsnAlaAlaSerGlyArgGinThr35536036^ValAspGluAlaLeuLysAspAlaGinThrGlyThrAspTyrAsplie370375380ProThr385〈210〉〈211><212><213〉9122PRT人<400>9ValProGlvGluAlaGluGinProAlaProGluLeuValGluValGlu1.51015ValGlySerThrAlaLeuLeuLysCysGlyLeuSerGinSerGinGly202530AsnLeuSerHisValAspTrpPheSerValHisLysGluLysArgThr354045LeuliePheArgValArgGinGlyGinGlyGinSerGluProGlvGlu505560TyrGluGinArgLeuSerLeuGinAspArgGlyAlaThrLeuAlaLeu65707580ThrGinValThrProGinAspGluArgliePheLeuCysGinGlyLys859095ArgProArgSerGinGluTyrArglieGinLeuArgValTyrLysAla100105110ProGluGluProAsnlieGinValAsnPro115120<210>10<211〉121<212>PRT<213>人〈400〉10lie1GinLeuArgVal5丁yrLysAlaProGlu10GluProAsnlieGin15ValAsnProLeuGlylieProValAsnSerLysGluProGluGluValAla202530ThrCysValGlyArgAsnGlyTyrProlieProGinVallieTrpTyr354b45LysAsnGlyArgProLeuLysGluGluLysAsnArgValHislieGin505^60SerSerGinThrValGluSerSerGlyLeuTyrThrLeuGinSerlie65707580LeuLvsAlaGinLeuValLysGluAspLysAspAlaGinPheTyrCys859095G]uLeuAsnTyrArgLeuProSerGlyAsnHisMetLysGluSerArg100105110GluValThrValProValPheTyrPro115l50<210>11〈211〉103<212〉PRT<213>人<400〉11Asn1HisMetLysGlu5SerArgGluValThrValProValPheTyrPro1015ThrGluLysValTrpLeuGluValGluProValGlyMetLeuLysGlu202530GlvAspArgValGlulieArgCysLeuAlaAspGlyAsnProProPro354045HisPheSerlieSerUsGinAsnProSerThrArgGluAlaGluGlu505560GluThrThrAsnAspAsnGlyValLeuValLeuGluProAlaArgLys65707580GluHisSerGlyArgTyrGluCysGinGlyLeuAspLeuAspThrMet859095lieSerLeuLeuSerGluPro100<210〉12<211>130<212〉PRT人〈400〉12GluHisSerGlyArgTyrGluCysGinGlyLeuAspLeuAspThrMet151015lieSerLeuLeuSerGluProGinGluLeuLeuValAsnTyrValSer202530AspValArgValSerProAlaAlaProGluArgGinGluGlySerSer354045LeuThrLeuThrCysGluAlaGluSerSerGinAspLeuGluPheGin505560TrpLeuArgGluGluThrGlyGinValLeuGluArgGlyProValLeu65707580GinLeuHisAspLeuLysArgGluAlaGlyGlyGlyTyrArgCysVal859095AlaSerValProSerlieProGlyLeuAsnArgThrGinLeuValAsn100105110ValAlaliePheGlyProProTrpMetAla.PheUsGluArgLysVal115120125TrpVal130〈210〉<211〉〈212>〈213〉13161PRT人〈400〉13GluAlaGlvGlyGlyTyrArgCysValAlaSerValProSerliePro151015GlvLeuAsnArgThrGinLeuValAsnValAlaliePheGlyProPro202530TrpMetAlaPheLysGluArgLysValTrpValLysGluAsnMetVal354045LeuAsnLeuSerCvsGluAlaSerGlyHisProArgProThrlieSer505560TrpAsnValAsnGlyThrAlaSerGluGinAspGinAspProGinArg65707580ValLeuSerThrUuAsnValLeuValThrProGluLeuUuGluThr859095GlyValGluCysThrAlaSerAsnAspLeuGlyLysAsnSerlieLeuli)O105110PheLeuGluLeuValAsnLeuThrThrLeuThrProAspSerAsnThr115120125ThrThrGlyLeuSerThrSerThrAlaSerProHisThrArgAlaAsn130135140SerThrSerThrGluArgLysLeuProGluProGluSerArgGlyVal145150155160Val<210〉14<211〉27<212〉醒<213>人工序列<400>14catgccstggtgcccggagaggctgsg27<210〉〈211〉〈212〉<213〉1531DNA人工序列<400〉15aagcttUaggggttgacctggatgtttgg31〈210>〈211〉〈212〉<213>1630腿人工序列〈400〉16ccatgggtatccagctccgcgtctacaaag30<210>17<211>31<212〉DNA<213〉人工序列<400>17aagcttttacgggtagaaa.acagggacggtg31<210>18〈211〉33〈212〉DNA<213〉人工序列<400,18ccat.gggtaaccacatgaaggagtccagggaag33<210>19〈211〉34<212〉DNA<213〉人工序列<400>19aagctntatggttcactcagcagcgatatcatg34〈210〉20〈211〉28<212〉隨<213〉人工序列<400〉20ccatgga.aca.ca.gtgggcgctatgaatg28<210>21<211〉31〈212>DNA<213〉人工序列<400〉21aagcttttacacccacaccttcctctccttg31<210〉22<211〉25<212〉隱<213〉人工序列<400>22ccatggaggcaggaggcggctatcg25〈210〉23<211〉27〈212>DNA<213〉人工序列〈400〉23aagcttttaga.ccacgccccggctctc27<210〉24<211〉105〈212>PRT<213〉人〈400>24ValProGlyGluAlaGluGinProAlaProGluLeuValGluValGlu151015ValGlySerThrAlaLeuLeuLysCysGlyLeuSerGinSerGinGly202^30AsnLeuSerHisValAspTrpPheSerValHisLysGluLysArgThr354045LeuliePheArgValArgGinGlyGinGlyGinSerGluProGlyGlu505560TyrGluGinArgLeuSerLeuGinAspArgGlyAlaThrLeuAlaLeu65707580ThrGinValThrProGinAspGluArgliePheLeuCysGinGlyLys859095ArgProArgSerGinGluTyrArglie100105〈210〉25〈211〉66<212〉PRT〈213〉人〈400〉25ProGinGluUuLeuValAsnTyrValSerAspValArgValSerPro151015AlaAlaProGluArgGinGluGlySerSerLeuThrLeuThrCysGlu202530AlaGluSerSerGinAspLeuGluPheGinTrpLeuArgGluGluThr354045GlyGinValLeuGluArgGlyProValLeuGinLeuHisAspLeuLys'505560ArgGlu65<210>26<211〉8〈212〉PRT〈213〉人工序列<400>26GlyLeuThrPheThrGluTyrThr15<210〉27〈211>8<212〉PRT<213>人工序列〈400〉27lieAsnProAsnAsnGlyGlyPro15<210〉28<211〉9<212〉PRT〈213〉人工序列〈400>28AlaArgAsnGlyGlyAspPheAlaTvr15〈210〉29〈211>12<212>PRT〈213〉人工序列<400〉29GinSerLeuLeuTyrSerSerAsnGinGluAsnTyr1510<210>30<211>3<212〉PRT<213〉人工序列〈400>30TrpAlaSer1<210>31〈211〉9<212>PRT〈213〉人工序列<400〉31GinGinTyrTyrSerTvrProLeuThr15〈210〉32〈211>116<212>PRT〈213〉人工序列<柳〉32GluValGinLeuGinGinSerGly15SerValLyslieSerCysLysThr20ThrlieHisTrpValLysGinSer3540GlyThrlieAsnProAsnAsnGly5055LvsGlvLvsAlaThrLeuThrVal6570MetGluLeuArgSerLeuThrSer85ProGluLeuValLysProGlyAla1015SerGlyLeuThrPheThrGluTyr2530HisGlyLysSerLeuGluTrplie45GlyProSerTyrAsnGinLysPhe60AspLysSerSerSerThrAla丁vr7580GluAspSerAlalieTyrTyrCys9095AlaArgAsnGlyGlyAspPheAlaTyrTrpGlyGinGlyThrLeuVal100105110ThrValSerAla115<210>33〈211〉113〈212〉PRT〈213〉人工序列〈400〉33ThrLeuValLeuThrGinSerProSerSerLeuAlaValSerValGly151015GluLysValThrMetSerCysLysSerSerGinSerLeuLeuTyrSer202530SerAsnGinGluAsnTyrLeuAlaTrpTyrGinGinLysProGlyGin354045SerProLysLeuLeulieTyrTrpAlaSerThrArgGluSerGlyVal505560ProAspArgPheThrGlySerGlySerGlyThrAspPheAlaLeuThr65707580'lieSerThrValLysAlaGluAspLeuAlaValTyrTyrCysGinGin859095TyrTyrSerTyrProUuThrPheGlyAlaGlyThrGluLeuGluLeu100105110Lys<210〉34<211〉8<212〉PRT<213>人工序列<400>34GlyPheThrPheSerThrTyrAla15〈210>35<2ii:〉7〈212〉PRT<213>人工序列<400〉35lieSerSerGlySerArgThr15<210>36<211〉8〈212〉PR丁<213〉人工序列<400>36ValArgGlyProAlaPheAla.His15<210>37<211>11<212〉PRT〈213〉人工序列〈400〉37GinSerLeuLeuAspSerAspGlyLvsThrTyr1510<210〉38<211〉3<212>PRT〈213〉人工序列<400〉38LeuValSer1<210〉39<211〉8〈212>PRT<213〉人工序列<400>39CysGinGlyThrHisPheSerThr15<210〉40<211>114<212〉PRT<213>人工序列<400>40GluValLysLeuGluGluSerGlyGluGlyLeuValLysProGlyGly151015SerLeuUsUuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerThr丁yr202530AlaMetSerTrpValArgGinThrProAspLysArgLeuGluTrpVal354045AlaSerlieSerSerGlySerArgThrTyrTyrSerAspSerValLys505560GlyArgSerThrlieSerArgAspAsnAlaArgAsnAsnLeuTyrLeu65707580GinMetAsnSerLeuArgSerGluAspThrAlaMetTyrTyrCysVal859095ArgGlyProAlaPheAla.HisTrpGlyGinGlyThrLeuValThrVal100SerAla<210>41<211>111<212>PRT<213>人工序列<400〉41AsplieValMetThrGinSerProLeuThrLeu1510105110SerValThrlieGly15GinProAlaSerlieSerCysLysSerSerGinSerLeuLeuAspSer202530AspGlyLysThrTyrLeuAsnTrpPheLeuGinArgProGlyGinSer354045ProLvsArgLeulieTyrLeuValSerThrLeuAspSerGlyValPro505560AspArgPheThrGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuLyslie65707580SerArgValGluAlaGluAspLeuGlyValTyrTyrCysCysGinGly859095ThrHisPheSerThrPheGlyAlaGlyThrL、'sLeuGluLeuLys100105110<210>42<211〉12<212>PRT<213〉人工序列〈400〉42GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySer1510權(quán)利要求1.一種人CD146抗原表位，其氨基酸序列為SEQIDNO24或SEQIDNO25所示。2.—種抗人CD146抗體，其特征在于其能夠特異性識(shí)別權(quán)利要求1的人CD146抗原表位。3.權(quán)利要求2的抗人CD146抗體，其特征在于所述抗體包括抗體重鏈和抗體輕鏈，其中所述抗體重鏈包括作為CDR的由SEQIDNO:26的氨基酸序列組成的CDRl，由SEQIDNO:27的氨基酸序列組成的CDR2和由SEQIDNO:28的氨基酸序列組成的CDR3組成，所述抗體輕鏈包括作為CDR的由SEQIDNO:29的氨基酸序列組成的CDRl，由SEQIDNO:30的氨基酸序列組成的CDR2和由SEQIDNO:31的氨基酸序列組成的CDR3組成。4.權(quán)利要求3的抗人CD146抗體，其特征在于所述抗體的重鏈由SEQIDNO:32的氨基酸序列組成，輕鏈由SEQIDNO:33的氨基酸序列組成。5.權(quán)利要求2的抗人CD146抗體，其特征在于所述抗體包括抗體重鏈和抗體輕鏈，其中所述抗體重鏈包括作為CDR的由SEQIDNO:34的氨基酸序列組成的CDRl，由SEQIDNO:35的氨基酸序列組成的CDR2和由SEQIDNO:36的氨基酸序列組成的CDR3組成，所述抗體輕鏈包括作為CDR的由SEQIDNO:37的氨基酸序列組成的CDRl，由SEQIDNO:38的氨基酸序列組成的CDR2和由SEQIDNO:39的氨基酸序列組成的CDR3組成。6.權(quán)利要求5的抗人CD146抗體，其特征在于所述抗體的重鏈由SEQIDNO:40的氨基酸序列組成，輕鏈由SEQIDNO:41的氨基酸序列組成。7.權(quán)利要求2—6任一項(xiàng)的抗人CD146的抗體在制備用于治療腫瘤的藥物組合物中的應(yīng)用。8.權(quán)利要求7的應(yīng)用，其中所述腫瘤是黑色素瘤、肝癌，胰腺癌。9.權(quán)利要求2—6任一項(xiàng)的抗人CD146的抗體在制備用于靶向CD146的人體腫瘤的成像定位診斷的診斷劑中的應(yīng)用。10.—種用于治療腫瘤的藥物組合物，其包含權(quán)利要求2—6任一項(xiàng)的抗人CD146抗體和藥用載體。11.分泌抗人CD146抗體的雜交瘤細(xì)胞株，保藏號(hào)分別為CGMCCNO:2310和CGMCCNO:2311。12.—種編碼能與下面定義的,各個(gè)另外抗體鏈一起裝配的多肽的核酸，其中所述多肽是下述多肽的任一種a)抗體重鏈，其選自權(quán)利要求3或5所定義的抗體重鏈；b)抗體輕鏈，其選自權(quán)利要求3或5所定義的抗體輕鏈。13.—種包括按照權(quán)利要求12的核酸的表達(dá)載體，其能夠在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)所述核酸。14.一種原核或真核宿主細(xì)胞，其包括按照權(quán)利要求13的載體。15.—種制備結(jié)合人CD146的抗體的方法，其特征在于在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)按照權(quán)利要求12的編碼抗體重鏈的核酸和編碼抗體輕鏈的核酸，并且從所述細(xì)胞中回收所述多肽。16.—種檢測(cè)人CD146的方法，其利用權(quán)利要求2-6任一項(xiàng)的抗人CD146抗體，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行。17.權(quán)利要求16的方法，其中所述酶聯(lián)免疫吸附法是夾心酶聯(lián)免疫吸附法，其中將權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)的抗人CD146抗體的一種或多種作為捕獲抗體，將中國(guó)專利ZL991075862中的鼠單克隆抗體AA98作為檢測(cè)抗體。18.權(quán)利要求16或17的方法，其中所述人CD146存在于人體液中。19.權(quán)利要求17的方法，其中所述體液是組織液，血清，淋巴液或腦脊液。20.權(quán)利要求2—6任一項(xiàng)的抗人CD146的抗體的衍生物，其中所述衍生物為所述抗體與生物標(biāo)記物、抗腫瘤藥物、毒素、放射活性劑結(jié)合的產(chǎn)物。全文摘要本發(fā)明是利用生物技術(shù)研制出的一組抗人CD146分子及建立的高靈敏度夾心ELISA檢測(cè)可溶性CD146的方法。本發(fā)明包括抗人CD146鼠單克隆抗體AA1、AA2、AA3、AA4、AA5和AA7，利用抗體組合及夾心ELISA特異性檢測(cè)可溶性CD146的方法。這組抗體能夠在分子、細(xì)胞和組織水平特異性識(shí)別人源CD146，并基于其識(shí)別不同表位而分成兩類。由抗體AA1與另一株抗人CD146鼠單抗AA98組合的夾心ELISA方法能夠檢測(cè)到每毫升鈉克量級(jí)可溶性CD146。這些抗體及此種檢測(cè)手段將成為基礎(chǔ)研究或臨床應(yīng)用中有效的檢測(cè)或診斷的工具及方法，同時(shí)也將為與CD146相關(guān)疾病的靶向治療提供良好載體。文檔編號(hào)C07K14/705GK101245101SQ200810057260公開(kāi)日2008年8月20日申請(qǐng)日期2008年1月31日優(yōu)先權(quán)日2008年1月31日發(fā)明者靜馮,迪盧,瑩張,楊東玲,鄭超固,閻錫蘊(yùn)申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所