專利名稱：：用于引發(fā)腫瘤細胞致死的核酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于寡核苷酸/DNA片段在生物學和治療學應(yīng)用中的用途領(lǐng)域，更具體的是屬于核酸干擾DNA損傷信號傳導和修復途徑，特別是雙鏈斷裂(DSB)修復的非同源性末端連接(NHEJ)途徑的領(lǐng)域。本發(fā)明涉及用作引發(fā)接受抗癌治療的腫瘤的細胞致死的工具的核酸。單獨的放療、化療，或者結(jié)合手術(shù)是對抗人類癌癥的主要治療手段。電離輻射直接或間接地引起雙鏈DNA斷裂(DSBs)，并引發(fā)細胞/組織死亡(壞死或凋亡)。電離輻射的細胞毒性效應(yīng)形成了廣泛應(yīng)用于人類癌癥治療的放療的基礎(chǔ)。某些腫瘤(例如，惡性膠質(zhì)瘤)的輻射抗性和輻射對附近正常組織的副作用(例如，在乳腺癌和子宮頸癌的治療中)目前限制了放療的功效。在過去幾年中，很多研究集中與電離輻射應(yīng)答有關(guān)的生物學機制，是為了洞察腫瘤細胞的放射敏感性或放射抗性現(xiàn)象之下的復雜性。對于精細調(diào)節(jié)對電離輻射的應(yīng)答的不同途徑的理解是邁向鑒定新的藥物和療法的分子靶的重要一步，所述新的藥物和療法與放療結(jié)合，可以提高從對輻射具有高度抗性的腫瘤例如腦或頭和頸部腫瘤痊愈的機會?；熕巹┑氖褂每梢餌NA損傷，包括直接或間接的DSBs。最廣泛使用的化療藥劑(化學細胞毒素)家族的實例為拓撲異構(gòu)酶I或II的抑制劑(喜樹堿/拓撲替康，表柔比星/依托泊苷)(camptothecin/topotecan，epirubicin/etoposide)，DNA交聯(lián)劑(順鉑/卡鉑/奧沙利鉑)(cisplatin/carboplatin/oxaliplatin)，DNA烷基化試劑(卡莫司汀/卡達巴嗪)(carmustine/dacarbazine)或抗新陳代謝的試劑(5-氟尿嘧啶/吉西它濱/卡培它濱)(5-fluorouracil/gemcitabine/capecitabine)，以及有絲分裂紡錘體的抑制劑(紫杉醇/多西它賽/長春瑞濱)(paclitaxel/docetaxel/vinorelbine)。生物細胞毒素(單克隆抗體，細胞因子/激酶抑制劑，免疫治療劑/疫苗)開發(fā)的新近進展證明了它們對一部分腫瘤具有有效性和特異性。但是它們經(jīng)常與化學細胞毒素結(jié)合使用。盡管在新的細胞毒素藥物開發(fā)上有很多進展，對化療的耐藥性仍然是在癌癥治療中主要的臨床憂慮。對涉及藥物吸收/流出、代謝降解、靶的突變、增強的修復、細胞死亡(細胞凋亡和壞死)的信號傳導的耐藥機制的理解對于保證化療的功效是非常重要的并提高了治療指數(shù)，尤其是抗性腫瘤的治療?；熍c放療相結(jié)合被廣泛應(yīng)用于癌癥的治療。雖然仍未完全闡明，細胞毒素作用的生物學基礎(chǔ)依賴于細胞機制，例如細胞周期或者DNA損傷，它們在射線誘導的細胞死亡中也是重要的因素，在癌癥治療中，通過組合不同的治療方法，引起加和的或者甚至更好的協(xié)同效益。在過去十年中，在本領(lǐng)域展開了許多研究。有人開始對輻射應(yīng)答的信號轉(zhuǎn)導的復雜性進行描述。電離輻射靶向的特別重要的基因是那些參與調(diào)節(jié)輻射誘導的致死機制，如細胞凋亡或DNA修復的基因。電離輻射誘導的細胞死亡主要依賴于DSBs的修復。有兩個機制參與這些損害的修復非同源性末端連接(NHEJ，不依賴序列的途徑)和同源重組(HR，依賴序列的途徑)(Jackson的綜述，2002)。靶向參與這兩種主要的DSB修復途徑的基因?qū)е律僭S或者中等的輻射敏感度，這依賴于使用的方法和癌癥細胞系(Belenkov等，2002；Marangoni等，2000；Ohnishi等，1998)。Ku70和Ku80，DNA-PKsc蛋白在輻射或化學誘導的DNA損傷的修復中起重要作用。如果損傷不能被及時修復，則細胞死亡。因此，它們是使靶細胞和組織對放療和化療敏感的令人感興趣的分子靶。已經(jīng)設(shè)想并實施了很多方法用于抑制這些參與NHEJ途徑的關(guān)鍵蛋白(Ku70/Ku80，DNA-PKsc等)，而NHEJ途徑被認為在哺乳動物細胞中占主導地位的1)PI3K的抑制劑(磷脂酰肌醇-3-激酶)(即DNA-PKsc，PARP-1，ATM，ATR)(Boulton等，2000；Durant&Karran，2003；Willmore等，2004；Vauger等，2004)2)負顯性(Negativedominant)和肽(KU80的C-末端)(Marangoni等，2000；Kim等，2002)3)單鏈抗體可變片段(scFv)(DNA-PKsc)(Li等，2003)4)RNA適體(SELEXRNA結(jié)合Ku)(Yoo&Dynan，1998)5)反義(Antisense)(Ku70，Ku80，DNA-PKsc)(Li等，2003b；Marangoni等，2000；Sak等，2002)6)siRNA(DNA-PKsc)(Peng等，2000).盡管付出了這些極大的努力，DNA修復基因靶向與癌癥治療的結(jié)合迄今為止仍處于早期實驗階段，尚未有臨床研究顯示任何被證實效益。值得注意的是，以上描述的方法具有共同的特征它們靶向參與可能具有旁路的復雜級聯(lián)途徑(例如NHEJ)的單一的效應(yīng)器(蛋白)。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過使用化學修飾的或者非雙鏈的核酸分子，充當斷裂的DNA片段的模擬物并被識別為DNA損傷治療誘導的DSB位點，可以提高腫瘤針對直接的或間接的DNA損傷抗癌治療的敏感度。經(jīng)上述修飾的分子應(yīng)該有非復制結(jié)構(gòu)。因而本發(fā)明的一個目的是為了提供這樣的雙鏈核酸片段，下面也稱“DNA修復誘導的致死”(簡稱DRIL)分子，可以增強治療抗性的腫瘤對放療和化療的應(yīng)答。更具體的是，本發(fā)明旨在提供與能引起DNA的直接或者間接DSBs的物理和化學藥劑組合應(yīng)用的新的DRIL分子，并提供一種治療癌癥的方法，將上述DRIL分子的應(yīng)用與直接或間接引起DNA損傷的抗癌療法結(jié)合使用。本發(fā)明的另一個目的涉及DRIL分子在制備用于提高癌癥療效，尤其是用于對放療和/或化療具有高度抗性的腫瘤的抗腫瘤治療佐劑中的應(yīng)用。本發(fā)明的DRIL分子是參與NHEJ途徑(不依賴序列的途徑)的蛋白，尤其是Ku蛋白的底物，包括一個至少4-10000個堿基對(bp)，尤其是4-1000bp的不依賴序列的主鏈。它們具有如下的特性-當與藥物載體一起使用時，雙鏈DRIL分子可以被細胞/組織體吸收到細胞核中；-DRIL分子的游離末端可被參與雙鏈斷裂修復和損傷信號傳導的DNA結(jié)合蛋白所識別；-DRIL分子的游離末端可被上述的酶整合到腫瘤細胞的基因組DNA中。根據(jù)DRIL分子通過NHEJ途徑起作用的機制，除應(yīng)用上的考慮以外，它們的長度本身沒有限制，但必須包括至少4bp，更優(yōu)選至少8bp。因而，本發(fā)明的DRIL分子優(yōu)選8-500bp，最優(yōu)選16-200bp。特別優(yōu)選的DRIL分子包括16-100bp，更優(yōu)選24-100bp。本發(fā)明的DRIL分子，有一個天然的磷酸二酯主鏈，或者一個化學修飾的磷酸二酯主鏈，或者帶有化學基團或化學基團混合物的另一主鏈，只要所述修飾的寡聚物保持了作為參與NHEJ途徑的蛋白，尤其是Ku蛋白，和涉及DSB損傷信號傳導途徑的蛋白的底物。優(yōu)選地，化學修飾的目的在于，在如果發(fā)生了基因組整合后，給DRIL分子賦予穩(wěn)定性和/或阻止它們的進一步的復制(誘變效應(yīng)的可能原因)。也可以用糖模擬物如′-O-烷基核糖、2′-O-烷基-C4′支鏈核糖、環(huán)己基或者其他的碳環(huán)或己糖醇來取代戊糖呋喃糖基。它們可以被制備成線性的或者發(fā)夾雙鏈核酸，其中的環(huán)可以是核酸，或者是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其他化學基團，優(yōu)選連接物，諸如六甘醇或者四脫氧胸苷酸(T4)。本發(fā)明的DRIL分子可由至少一個游離的dsDNA末端制成；上述的游離末端可以是平末端或者5′-/3’-突出的末端，并包括修飾的核酸主鏈或者本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的其他的化學基團或化學基團的混合物。優(yōu)選的片段在每條鏈的末端包括一個或者幾個化學基團。優(yōu)選的化學基團包括硫代磷酸酯。或者，優(yōu)選的片段具有3′-3′核苷酸鍵。本發(fā)明的其他修飾主鏈包括甲基磷酸酯、氨基磷酸酯、嗎啉代核酸、2′-O，4′-C亞甲基/亞乙基橋連的鎖核酸，肽核酸(PNA)，和短鏈烷基，或環(huán)烷基糖間鍵合(cycloalkylintersugarlinkages)或短鏈雜原子或長度可變的雜環(huán)糖內(nèi)鍵合(intrasugarlinkages)，或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何修飾的核苷酸。美國專利5,677,437描述了雜芳香(heteroaromatic)的寡核苷鍵合(linkages)。氮連接物或含氮基團也可用于制備寡核苷酸模擬物(美國專利5,792,844和5,783,682)。美國專利5,637,684描述了氨基磷酸酯和硫代磷酸酰胺寡聚化合物。還預見了具有嗎啉代主鏈結(jié)構(gòu)的寡核苷酸(美國專利5,034,506)。在其他的實施方案中，諸如肽核酸(PNA)主鏈，寡核苷酸的磷酸二酯主鏈可以被聚酰胺主鏈取代，堿基直接或間接地結(jié)合到聚酰胺主鏈的氮雜氮原子上。其他人工合成的寡核苷酸可包含取代的糖部分，該糖部分在2′位置上包括下述的其中一個基團OH，SH，OCH3，SCH3，F(xiàn)，OCN，OCH2CH2OCH3，O(CH2)nNH2或O(CH2)nCH3，其中n代表1到約10；C1到C10的低級烷基、取代的低級烷基、烷芳基或者芳烷基；Cl；Br；CN；CF3；OCF3；O-；S-；或N-烷基；O-，S-，或N-鏈烯基；SOCH3；SO2CH3；ONO2；NO2；N3；NH2；雜環(huán)烷基；雜環(huán)烷芳基；氨基烷基氨基；聚烷基氨基(polyalkylyamino)；取代的甲硅烷基；或者能提高寡核苷酸的藥代動力學和/或藥物動力學性質(zhì)的基團，和其他的具有類似性質(zhì)的取代基。DRIL分子本質(zhì)上是基于天然核苷酸，2′-脫氧核苷酸或2′-核糖核酸，并且任選包括一個或者幾個修飾的核苷酸和/或除腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶之外的核堿基。除常見堿基外，合適的核堿基有例如C5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶、假異胞嘧啶、C5-丙炔基尿嘧啶、N7-脫氮鳥嘌呤、N7-糖基化鳥嘌呤，或α端基異構(gòu)體，或其他修飾的核堿基或堿性殘基。當被輻射或被化療處理時，將存在于組織或身體的細胞中的化學修飾的DRIL分子將會在DSB位點整合到基因組DNA中，或者通過細胞的DNA修復機制如NHEJ，被識別為由電離輻射誘導的DSB位點。因而，他們將被DSB修復蛋白結(jié)合，整合到斷裂的染色體中，或者使修復系統(tǒng)飽和。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，上述的DRIL分子此外包括至少一個插入元件，其阻礙DNA復制、DNA修復、或損傷信號傳導過程。所述的非復制元件可以整合到雙鏈片段的內(nèi)部位置或者末端。它(它們)可包括a)不能作為DNA復制模板的單元，例如聚乙二醇鏈，優(yōu)選六乙二醇鏈，或任何碳氫鏈，最終被一個或多個雜原子所阻斷和/或取代，例如氧、硫、氮、或包括一個或多個雜原子的雜原子或雜環(huán)基團；b)作為阻滯元件的單元，不受DNA聚合酶或核酸外切酶的影響，諸如任何3′-修飾的核苷酸，或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其他核苷酸；c)天然的寡核苷酸，例如Tn，當用于發(fā)夾片段的環(huán)中時，優(yōu)選四脫氧胸苷酸(T4)。上述的鏈通過化學合成、半生物合成或者生物合成、一些擴增的方法，然后用一些提取和制備方法，并進行一些化學修飾來進行制備。對培養(yǎng)的細胞、裸鼠的異種移植腫瘤和遺傳改良的小鼠進行的實驗顯示上述的DRIL分子引發(fā)接受放療和/或化療的腫瘤的細胞/組織致死。因此本發(fā)明也涉及與DNA阻斷治療結(jié)合使用的佐劑成分，所述成分包括如上定義的DRIL分子，連同藥物載體，以有效量導入腫瘤細胞的細胞核中。本發(fā)明也涉及提高腫瘤對抗癌癥療法的敏感度的方法，它包括，聯(lián)合，-將如上定義的DRIL分子導入癌癥細胞/組織，以及-在細胞中誘導，通過DNA損傷方法使DNA斷裂。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，在上述的導入步驟中使用了轉(zhuǎn)染劑?；隗w內(nèi)研究中使用的方案，本發(fā)明提供了合理的方法，以建立DRIL分子與放療或化療結(jié)合使用的臨床方案。任何一種方案下的合理性在于當發(fā)生DNA損傷事件時，DRIL分子應(yīng)該被遞送到細胞核中。因此，DRIL分子必須先于放療幾個小時施用，然而，它們可以隨同化療藥劑一起施用，這依賴于施用模式和每種成分的藥代動力學。對于小鼠的方案包括，輻射之前幾小時施用DRIL分子，例如5小時，且每周3次，超過6周治療的輻射總劑量相當于30Gy。分成幾部分進行輻射尤其有效。優(yōu)選地，所述方法包括將用DRIL分子治療與雙倍的化療結(jié)合。例如5-FU和CPT11一起被注射3次，連續(xù)三天，休息的間隔為一整周。或者用DRIL分子的治療與放療結(jié)合。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易將其適用于人類，特別是取決于病人的體重。在一個優(yōu)選的實施方案中，DRIL分子是化學修飾的DRIL分子，如上述定義及人類治療中其他實踐的DRIL分子。在另一個實施方案中，DRIL分子不是化學修飾的，并與天然的核酸片段對應(yīng)，但是顯示化學修飾片段的特征，尤其是具有所述化學修飾的DRIL分子的堿基對的數(shù)目和性質(zhì)。更具體的是，通過電離輻射(放療)或化學反應(yīng)(化療)實現(xiàn)了DNA鏈的斷裂。這樣的方法是一種新的治療佐劑與DNA損傷療法結(jié)合的針對腫瘤的方法。本發(fā)明也涉及所述非化學修飾的DRIL分子在制備用于治療腫瘤，尤其是對放療和/或化療高度抗性的腫瘤的抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，，所述藥物與DNA阻斷治療尤其是放療或化療結(jié)合使用。體內(nèi)，化學修飾或非修飾的DRIL分子同適當?shù)妮d體一起，通過適當?shù)耐緩浇o藥，例如口服、靜脈內(nèi)、或腫瘤內(nèi)給藥、或皮下注射、或其他途徑。本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點將在如下的實施例中給出，參考圖1到5及表1和2，上述的圖分別代表圖1.1在Hep2細胞的不同量的核提取物存在下，對不同的32p放射-標記的DRIL分子上進行的條帶遷移分析；圖1.2在含有Hep2細胞核提取物中的蛋白不同的32p放射-標記的DRIL分子的延滯條帶中鑒定Ku蛋白的存在；圖2.1在用γ-射線對DRIL分子進行輻射后，Hela細胞的克隆發(fā)生存活率分析；圖2.2攜帶新霉素抗性編碼基因的線性質(zhì)粒片段(2μg)被DRIL32-PEG分子抑制其輻射增強的不合理整合；圖2.3Hela細胞在輻射后被帶熒光的DRIL32-FITC分子轉(zhuǎn)染；圖3.1未處理的GMA32細胞，被脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺單獨轉(zhuǎn)染，或被不同的DRIL分子通過脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺轉(zhuǎn)染，但未經(jīng)進一步的輻射或有絲分裂抑制劑處理的細胞的FACS分析；圖3.2在未處理的GMA32細胞，被脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺單獨轉(zhuǎn)染，或被不同的DRIL分子通過脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺轉(zhuǎn)染的細胞中，通過γ-H2AX標記免疫檢測DNA修復灶；圖3.3未處理的GMA32細胞，被脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺單獨轉(zhuǎn)染，或被不同的DRIL分子通過脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺轉(zhuǎn)染，但未經(jīng)進一步的輻射或有絲分裂抑制劑處理的細胞的p53的15位絲氨酸殘基的磷酸化狀態(tài)的Western印跡分析；圖3.4未處理的和經(jīng)過輻射或不同的有絲分裂抑制劑處理的GMA32細胞的克隆發(fā)生存活率；圖4異種移植的人喉腫瘤在小鼠中的生長，監(jiān)控接受治療或不接受治療的腫瘤在時間t時的體積與最初體積的比值(Vt/Vi)；圖5.1在K-RasV12G×Apc1638N轉(zhuǎn)基因小鼠中誘導的消化道腫瘤治療的化學致敏作用；和圖5.2通過肉眼觀察或組織學檢查的每個動物的消化道腫瘤的平均數(shù)。圖5.3A組方案圖解(i.p.腹膜內(nèi)注射；o.口服給藥)。B組5μm切片上的DRIL32-FITC的熒光(左)和免疫熒光標記的γ-H2AX(右)的熒光，所述切片來自根據(jù)A組的方案處理過的動物的腫瘤組織。下面部分顯示了(使用63×鏡頭)上面部分(使用1O×鏡頭，白色框)指定區(qū)域的放大圖。發(fā)熒光的DRIL32-FITC和標記的γ-H2AX的colocalization在DAPI復染的細胞核中以亮點出現(xiàn)。一經(jīng)請求將提供彩圖。對裸鼠異種移植的人放射線抗性腫瘤(頭和頸，惡性膠質(zhì)瘤)和轉(zhuǎn)基因小鼠的RasV12G×Apc1638N雙突變在消化道中誘導的腫瘤進行分子和細胞學研究，目的是i)評價DRIL分子的生物學活性；ii)通過使用DRIL分子使抗癌療法敏感而使DNA誘餌法有效；iii)闡明觀察到的DRIL作用效果下的分子和細胞機制。這些研究的結(jié)果在以下部分被描述和總結(jié)(實施例)實施例1DRIL分子的設(shè)計、合成和制備設(shè)計了兩種類型的DRIL分子線性或發(fā)夾dsDNA片段。對于發(fā)夾DRIL分子而言，一個六乙二醇連接物(縮寫為PEG)或一個四脫氧胸苷酸(縮寫為T4)被用作環(huán)。dsDNA莖的末端通過整合硫代磷酸酯，或3′-3′核苷酸鍵可以保護其不被3′-核酸外切酶化學降解。原則上，可使用其他化學修飾，條件是能Ku70/Ku80-DNAPKsc結(jié)合相匹配(Martensson&Hammarten，2002)。使用不同莖長的DRIL分子，為8bp(DRIL8-PEG)、16bp(DRIL16-PEG)、24bp(DRIL24-PEG)和32bp(DRIL32-PEG)，也使用不同的莖序列。也設(shè)計了一個啞鈴形的dsDNA片段(DRIL32-2×PEG)作為對照，其兩個末端被兩個PEG環(huán)密封。一些DRIL分子由一個用熒光素(DRIL32-FITC)、花菁3(DRIL32-Cy3)、或生物素(DRIL32-Bt)標記的T而被標記。表1.1和1.2總結(jié)了本研究中使用的DRIL分子的序列和化學結(jié)構(gòu)。DRIL分子序列和化學結(jié)構(gòu)DRIL325′ACGCACGGGTGTTGGGTCGTTTGTTCGGATCT3′3′TGCGTGCCCACAACCCAGCAAACAAGCCTAGA5′DRIL32po-PEGDRIL32-PEGDRIL24-PEGDRIL16-PEGDRIL8-PEGDRIL32ss5′ACGCACGGGTGTTGGGTCGTTTGTTCGGATCT-3′DRIL32-T4DRIL32-2×PEGDRIL32s33-PEGDRIL32-NH25′ACGCACGGGTGTTGGGTCGTTTGTTCGGATCT3′-NH23′TGCGTGCCCACAACCCAGCAAACAAGCCTAGA5′-NH2DRIL32-FITCDRIL32-Cy3DRIL32-Btt＝熒光素(FITC)，花菁3(Cy3)或生物素(Bt)-標記的T表1.1DRIL分子的序列和化學結(jié)構(gòu)。粗體字母是具有硫代磷酸酯主鏈的核苷酸。實線代表六乙二醇連接物(PEG)。DRIL32-T4含有T4作為連接物，替代PEG連接物。DRIL32-2×PEG是一個啞鈴形(閉合)分子。DRIL32s33-PEG含有一個倒置序列(堿基組成相同但順序不同)和一個3′-3′鍵。DRIL分子序列和化學結(jié)構(gòu)DRIL645′ACGCACGGGTGTTGGGTCGTTTGTTCGGATCTACGCACGGTCGTTTGTTCGGTGTTGGCGATCT3′3′TGCGTGCCCACAACCCAGCAAACAAGCCTAGATGCGTGCCAGCAAACAAGCCACAACCGCTAGA5′DRIL64-PEG5′ACACGGGTGTTGGCTGTCGTTTGTTCGGATCT-ACGCACGGTCGTTTGTTCGGTGTTGGCGTACT3′3′TGCGTGCCCACAACCCAGCAAACAAGCCTAGA-TGCGTGCCAGCAAACAAGCCACAACCGCTAGA5′表1.264-bpDRIL分子的序列和化學結(jié)構(gòu)。粗體字母是具有硫代磷酸酯主鏈的核苷酸。實線代表六乙二醇連接物(PEG)。所有的DRIL分子通過自動化的固相寡核苷酸合成來制備(Eurogentec，Belgium)。通過變性的反相HPLC純化。變性毛細管凝膠電泳和MALDT-TOF/LC-MS被用于做質(zhì)量控制。超過90％的寡核苷酸是全長的。在運輸之前所有的樣品都被凍干。一經(jīng)接收，將所有的樣品都溶解于雙蒸水中。未標記的DRIL分子的濃度在變性條件下(60℃-90℃取決于DRIL分子的熱穩(wěn)定性)通過分光光度法測定(Cantor&Warshaw，1970)。將帶有PEG環(huán)和3′突出及互補末端的兩半發(fā)夾退火，并通過DNAT4連接酶(BioLabs)連接，制備啞鈴形dsDNA片段(DRIL32-2×PEG)。基于對熱力學和動力學的考慮，根據(jù)它們的分子量，用如下方案制備DRIL分子的樣品-對于雙分子的DRIL分子(DRIL32、DRIL64和DRIL64-PEG)溶于雙蒸水的每股鏈的1∶1母液(可能是最高濃度)的混合物必須在90℃加熱5分鐘，使每股鏈完全變性。溫和地恢復至室溫進行退火(樣品一般置于水浴中)，并將產(chǎn)生的雙鏈分子等分量貯存于-20℃。-對于單分子DRIL分子(發(fā)夾)而言溶于雙蒸水的含有200μM發(fā)夾DRIL分子的溶液必須在90℃加熱5分鐘以完全變性。必須通過將樣品置于冰水浴(0℃)驟冷卻進行退火。等分量貯存于-20℃。實施例2DRIL分子的生物化學分析作為剖析DRIL分子作用機制的第一步，根據(jù)標準方案，在Hep2細胞核蛋白提取物的存在下，用不同的32p放射-標記的DRIL分子進行一系列條帶遷移分析。一般地，10nM32p放射-標記的DRIL分子在不同濃度的核蛋白(0，10，20，40，80，160和320ng/μl)存在下于30℃溫育在TBE緩沖液中10分鐘。然后將樣品上樣到5％丙烯酰胺非變性凝膠上。在95V、4℃電泳2小時。將凝膠干燥，并用磷光成像器掃描(MolecularDynamics)。圖1.1顯示，除8-bpDRIL8-PEG分子(最短的DRIL分子)外，觀察到具有共同的條帶(條帶1)的較長DRIL分子的高達3條延滯條帶。在長DRIL分子存在時出現(xiàn)其他條帶。用32-bp長DRIL分子(DRIL32-PEG，DRIL32po-PEG和DRIL32)滴定的Hep2核蛋白提取物的延滯條帶譜更加復雜。隨著蛋白濃度增加，延滯條帶1的強度增加并隨后降低。延滯條帶2和3的強度作為蛋白濃度的函數(shù)增加，直至達到穩(wěn)定值。用小鼠單克隆抗-Ku70抗體進行結(jié)合相互作用和條帶遷移分析(SantaCruzBiotechnology)，結(jié)果顯示，延滯條帶1和2包含Ku復合體(圖1.2在向膠上上樣之前，向結(jié)合反應(yīng)中加入(+)或不加(-)抗-Ku抗體時，線α-Ku顯示了Ku復合體。條帶以1、2和3編號，在條帶的數(shù)字上加上星號，代表抗Ku結(jié)合之后的遷移)。在加入抗-Ku70抗體后，條帶1和2被超遷移至條帶1*和2*。很可能是條帶1有1個結(jié)合至DRIL的Ku70/80復合體，條帶2有兩個結(jié)合至DRIL的Ku70/80復合體。以純的Ku蛋白進行的對照實驗證明了這種解釋。注意到加入抗-Ku70抗體后，條帶3消失(用DRIL24-PEG和DRIL32po-PEG清晰可見)，表明條帶3也含有Ku復合體。Ku蛋白的鑒定明確地顯示了DRIL分子與NHEJ機制相互作用。實施例3DRIL分子的體外活性對來自女性子宮頸癌(HeLa)和喉癌(Hep2)的兩個放射-抗性的人類癌癥細胞系，通過克隆發(fā)生存活率分析結(jié)合電離輻射，對培養(yǎng)的細胞中DRIL分子的活性進行了研究。3.1)誘導的細胞致死對HeLa細胞轉(zhuǎn)染DRIL分子8小時并以源自137Ce的□-射線進行四次輻射，每間隔2小時輻射一次，每次輻射劑量為0.5Gy(4×0.5Gy)，可以觀察到，與非轉(zhuǎn)染的細胞相比，轉(zhuǎn)染細胞克隆發(fā)生存活率的顯著減少。結(jié)果見圖2.1，其中的A組給出在DRIL32和DRIL32-PEG存在時，標準化存活克隆數(shù)的劑量依賴關(guān)系，而B組給出當存在不同的DRIL分子，濃度為83nM時(培養(yǎng)基中的濃度)的標準化存活克隆數(shù)。在劑量依賴方式中，實驗效果取決于DRIL分子的化學性質(zhì)。在本分析中，發(fā)夾DRIL分子(DRIL32-PEG，DRIL32-T4和DRIL24-PEG)和線性雙鏈DRIL分子(DRIL64-PEG和DRIL64)大大降低了克隆發(fā)生存活率。值得注意的是，缺乏游離dsDNA末端(由六乙二醇連接物在兩末端加帽)的啞鈴形DRIL分子(DRIL32-2×PEG)不顯示任何效果。環(huán)的化學性質(zhì)不重要(例如，DRIL32-PEG與DRIL32-T4相比)。這些觀察結(jié)果表明，一些DRIL分子可以使細胞對電離輻射敏感化。用添加10％血清的MEM進行細胞培養(yǎng)。根據(jù)廠商的說明書用Superfect(Qiagene)作為轉(zhuǎn)染劑。以處理過的細胞形成的克隆數(shù)量與未處理的細胞形成的克隆數(shù)量的比值來評價克隆發(fā)生存活率。3.2)DRIL分子對外源DNA的不合理整合的抑制眾所周知，電離輻射可促進外源DNA的轉(zhuǎn)染，該過程被稱為輻射增強的整合。Hela細胞物被用于本分析。在8小時期間，用2μg的線性質(zhì)粒(攜帶新霉素抗性編碼基因)以三種不同比值的DNA/superfect(1∶2，1∶5，1∶10)轉(zhuǎn)染細胞。在轉(zhuǎn)染期間，細胞被暴露于不同的輻射方案無輻射，1Gy和2Gy的單一輻射，以及2Gy分為每間隔2小時輻射0.5Gy劑量的電離輻射(4×0.5Gy)。通過對生長在含0.6mg/mlG418的培養(yǎng)基中的NeoR細胞的選擇，來檢測質(zhì)粒的整合。分開的輻射方案大大增加了質(zhì)粒的整合。當將2μg的DRIL32-PEG分子被加到轉(zhuǎn)染混合物中時，可完全破壞輻射增強的整合(圖2.2)。本實驗表明，需要Ku、DNA-PK和ATM蛋白(Nimura等，2002)的外源DNA的輻射增強的不合理整合如所預期被DRIL分子抑制，其作用機制與DRIL32-PEG分子一樣，通過捕獲涉及NHEJ途徑的蛋白起作用。3.3)DSBs修復的誘導抑制細胞核中DSB損傷可以通過使用標記DNA斷裂的γ-H2AX抗體進行免疫檢測。大部分的H2AX灶在輻射后迅速出現(xiàn)，并隨著DSBs修復過程的推進而消失。在非轉(zhuǎn)染細胞中，在輻射后兩小時幾乎檢測不到H2AX灶。圖2.3給出2Gy輻射2小時后Hela細胞被熒光DRIL32-FITC分子轉(zhuǎn)染的結(jié)果。左側(cè)實驗組由細胞核中γ-H2AX抗體的熒光免疫檢測的DRIL32-FITC的熒光(亮點和斑點)和DNA修復病灶的熒光；右側(cè)實驗組由γ-H2AX抗體的熒光免疫和DAPI復染檢測的DNA修復灶的細胞核的同一圖像。左下角的箭頭顯示細胞核中DRIL32-FITC和γ-H2AX信號的缺乏。右上角的箭頭顯示共同定位的DRIL32-FITC和γ-H2AX信號。如圖2.3所示，被DRIL32-FITC分子轉(zhuǎn)染的Hela細胞中，在輻射(2Gy)2小時后，未修復的DSB斷裂持久存在，如DRIL32-FITC及γ-H2AX抗體的加倍的熒光標記所示。值得注意的是，同一培養(yǎng)物中，在未有效轉(zhuǎn)染DRIL32-FITC的細胞中幾乎檢測不到DSB修復灶，表明這些細胞中完成了DNA修復。轉(zhuǎn)染和輻射方案與上述描述的相似。對于免疫檢測，細胞在直徑為5cm培養(yǎng)皿內(nèi)的蓋玻片表面生長，以2μgFITC標記的DRIL32-FITC分子用Superfect(Qiagene)根據(jù)廠商的說明書進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染開始后四小時，輻射細胞(2Gy)，然后在培養(yǎng)基中于37℃靜置2小時。洗滌3次后，用2％PFA固定細胞10分鐘。再洗滌1次后，用在1×PBS、1％BSA中1/100稀釋的兔抗-□-H2AX抗體(4411-PC，Trevigen)檢測□-H2AX的存在。以1×PBS、0.5％TritonX-100將細胞洗滌3次，然后用在1×PBS、1％BSA中1/100稀釋的若丹明結(jié)合的山羊抗-兔抗體，在室溫溫育1小時。通過表面熒光顯微術(shù)觀察細胞。實施例4GMA32細胞系中DRIL分子及它們與輻射或有絲分裂抑制劑結(jié)合使用的效果將允許DNA斷裂的GMA32中國倉鼠成纖維細胞培養(yǎng)于添加1mM丙酮酸鈉、2mM谷酰胺、1×MEM非必需氨基酸、1×青霉素/鏈霉素和10％馬血清的MEM培養(yǎng)基(Gibco)中中。一般，在根據(jù)廠商的說明書用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺2000(LifeTechnologies)作為轉(zhuǎn)染劑(比值為1∶3)轉(zhuǎn)染不同的DRIL分子(4.5μg)之前24小時，將2×105到4×105的細胞接種到直徑為5cm的培養(yǎng)皿中不含抗生素的培養(yǎng)基上。轉(zhuǎn)染結(jié)束時，輻射細胞(4Gy)或者以以下有絲分裂抑制劑處理諾考達唑(nocodazole)(200nM)，長春瑞濱(navelbine)(100nM)或紫杉醇(taxol)(200nM)。約16小時后，移去藥物，再生細胞。以源自137Ce的γ-射線進行細胞輻射。再生24小時后，收集細胞，用于FACS、western印跡分析或測定克隆發(fā)生率(存活率)或每個處理的效果。圖3.1顯示了未處理的GMA32細胞，由脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺單獨轉(zhuǎn)染的細胞，或由脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺轉(zhuǎn)染不同的DRIL分子，但未經(jīng)進一步的輻射或有絲分裂抑制劑處理的細胞的FACS分析。M1期代表在顯示細胞死亡的亞-G1期細胞的百分比。只有當雙鏈DRIL32分子和發(fā)夾DRIL32-PEG分子存在時，才可觀察到大量細胞的死亡，而發(fā)夾DRIL16-PEG和單鏈DRIL32ss分別誘導中度的和中等的細胞死亡。與對照(被脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺單獨轉(zhuǎn)染的細胞)相比，最短的發(fā)夾DRIL8-PEG不能引發(fā)細胞死亡。本實驗用FACScalibur流動細胞計數(shù)器來完成(BectonDickinson)。收集細胞，懸浮在1ml預冷的GM緩沖液(6.5mM葡萄糖，137mMNaCl，5.4mMKCl，2mMNa2HPO4，1mMKHPO4，0.5mMEDTA)中，加入3ml預冷的100％乙醇后，貯存于4℃至少2小時。在那個步驟，最后以1×PBS洗滌細胞，然后在PI溶液(50μg/ml碘化丙錠，溶于1×PBS緩沖液的25μg/mlRNaseA)中，在室溫下染色30分鐘。以Cellquest軟件分析了10000個結(jié)果，并對細胞集合進行了門控。記錄了含有DNA的亞-G1內(nèi)容物的細胞的百分比。在同樣的條件下，在未處理的GMA32細胞，脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺單獨轉(zhuǎn)染的細胞，或被不同的DRIL分子通過脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺轉(zhuǎn)染的細胞中，由γ-H2AX標記(細胞核中的亮點或斑點)對139位絲氨酸上被磷酸化的H2AX的DNA修復灶的免疫檢測。以FITC-DiOC6和DAPI對細胞膜和細胞核進行復染。觀察到了DRIL分子的類似效果(圖3.2)。本實驗表明，雙鏈DRIL32和發(fā)夾DRIL32-PEGc均可有效地引發(fā)相似的細胞應(yīng)答，好象細胞核中發(fā)生了DNA損傷一樣。這為這些DRIL分子可被用于捕獲參與通過NHEJ途徑的DSB修復的蛋白提供了直觀的證據(jù)。在用不同的DRIL分子轉(zhuǎn)染之前24小時，使細胞在直徑為5cm培養(yǎng)皿的蓋玻片上生長，用于免疫檢測。轉(zhuǎn)染后一天，在培養(yǎng)基中加入FITC-DiOC6(分子探針)，在37℃保持5分鐘(對膜進行復染)。洗滌3次之后，以4％PFA固定細胞20分鐘。再洗滌后，用以1/100稀釋在1×PBS、1％BSA中的兔抗γ-H2AX抗體(4411-PC，Trevigen)檢測139位絲氨酸上磷酸化的H2AX(γ-H2AX)。用1×PBS、0.5％TritonX-100洗滌細胞3次，然后用以1/100稀釋在1×PBS、1％BSA中的山羊抗-兔抗體Alexa594(分子探針)在室溫溫育1小時。通過表面熒光顯微鏡術(shù)觀察細胞。為尋找DNA損傷信號傳導的證據(jù)，進行了進一步的實驗。蛋白p53是一種已知的通過改變其磷酸化狀態(tài)，介導DNA損傷的信號傳導和調(diào)整適當?shù)膽?yīng)答(DNA修復、細胞凋亡等)的主要蛋白。尤其是，15位絲氨酸殘基的磷酸化參與它與起反饋控制作用的MDM2蛋白的相互作用。因此，通過Western印跡來評價p53的15位絲氨酸的磷酸化狀態(tài)。圖3.3顯示，當細胞被雙鏈DRIL32或發(fā)夾DRIL32-PEG分子轉(zhuǎn)染時，p53的15位絲氨酸被高度磷酸化，然而，較短的發(fā)夾DRIL16-PEG誘導中等的磷酸化。最短的DRIL8-PEG和單鏈DRIL32ss分子均不能誘導p53蛋白的15位絲氨酸的顯著磷酸化。本實驗提供了額外的證據(jù)，證明雙鏈DRIL32和發(fā)夾DRIL32-PEG在GMA32細胞中的存在，被檢測作為DNA損傷，并給轉(zhuǎn)導蛋白應(yīng)答誘導信號，如p53蛋白磷酸化，這很可能通過ATM激活途徑進行。使細胞溶解在Laemmli緩沖液中，用于Western印跡分析。將等量的溶解產(chǎn)物溶解在12％的聚丙烯酰胺凝膠中。將蛋白轉(zhuǎn)化到硝化纖維膜上，在用含5％非脫脂牛奶的TBST緩沖液(10mMTris-HCl，pH7.5，150mMNaCl，0.1％Tween20)稀釋500倍的抗-p53Ser15的抗體(9284，細胞信號傳導)溫育過夜前，以5％脫脂牛奶封閉(1小時)。然后用在TBST中以1/5000稀釋的辣根過氧化物酶-結(jié)合的山羊抗-兔IgG次級抗體(PO448，Dako)溫育印跡。用增強的化學熒光(RPN2106ECL，Amersham)來檢測蛋白-抗體復合物。通過克隆發(fā)生率(克隆存活率)分析來評價DRIL分子在GMA32細胞中的放射致敏化作用和化學致敏化作用的效果。圖3.4顯示，在以雙鏈DRIL32或發(fā)夾DRIL32-PEG分子轉(zhuǎn)染的GMA32細胞中，觀察到了對4Gy輻射的放射致敏化作用。另外，在以雙鏈DRIL32或發(fā)夾DRIL32-PEG分子轉(zhuǎn)染的GMA32細胞中，當它們被有絲分裂抑制劑(200nM諾考達唑(nocodazole)，100nM長春瑞濱(navelbine(vinorelbine))或200nM紫杉醇(taxol(paclitaxel)))處理時，也能觀察到化學致敏化作用。這些藥物阻斷了微管的聚合作用或解聚作用，也可間接誘導DNA斷裂。對細胞進行計數(shù)之后，制備一系列稀釋物，將不同數(shù)量的細胞接種到直徑為5cm培養(yǎng)皿中，用于克隆發(fā)生率分析。細胞數(shù)在100-200(對照細胞)到3000(被轉(zhuǎn)染的或/和已處理過的細胞)間波動。10天以后，用4％多聚甲醛固定(20分鐘)細胞(形成克隆)，然后用亞甲基藍染色(15分鐘)，對每個平皿上(三個重復)的克隆進行計數(shù)。實施例5裸鼠中異種移植的人腫瘤的治療的放射致敏化作用通過使用由皮下注射放射抗性的細胞系(來自喉癌的Hep2)或腫瘤片段(先前通過皮下注射來自惡性膠質(zhì)瘤的U87細胞系而得到的)而異種移植有人類腫瘤的裸鼠，與放療相結(jié)合來評價DRIL分子的體內(nèi)活性。為了建立體內(nèi)原理的證據(jù)，主要對異種移植了放射抗性的人喉腫瘤的小鼠進行了研究。用源自137Ce的γ-射線進行輻射，為了實行對腫瘤的局部輻射，對小鼠采取適當?shù)谋Ｗo。典型的分析條件包括，在輻射之前5小時，根據(jù)廠商的說明書，腫瘤內(nèi)注射適量的1nmoleDRIL分子與轉(zhuǎn)染劑(陽離子樹枝狀聚合物(dendrimer(Superefct，Qiagene))，雙十八烷基氨基甘氨?；?DOGS，Polyplustransfection)，聚乙烯亞胺(polyethyleneimine(PEI，PolyplusTransfection)))。在4-5周內(nèi)，輻射的總劑量為30Gyi)3×2Gy/周(大約每兩天一次)；ii)5Gy/周；iii)15Gy/2周。每周測量腫瘤的大小2-3次。輻射和腫瘤內(nèi)注射MEN培養(yǎng)基(DRIL稀釋緩沖液)的處理，被用于作為無DRIL(MEM)的輻射處理的對照。計算腫瘤體積(V＝(a+b2)/2，其中a＝長度，b＝寬度)。以時間t測量的體積與最初體積的比值(Vt/Vi)作為腫瘤發(fā)展的指標。跟蹤小鼠直至100天。至少測試了4個獨立的系列，每個系列有6只動物。結(jié)果見圖4(A組未處理組(n＝38)；B組對照組，20μ1培養(yǎng)基(MEM)+3×2Gy/周的輻射(n＝30)；C組1nmole(20μg)DRIL32-PEG+3×2Gy/周的輻射(n＝35)。MEM或DRIL32-PEG在輻射之前5小時通過腫瘤內(nèi)注射提供。每兩天提供一次分開的輻射劑量(2Gy)，每周3次。處理持續(xù)5周，總輻射劑量為30Gy。圓點代表每只小鼠的腫瘤體積的時間進程。實線是最好的多項式擬合。D組顯示腫瘤體積(Vt/Vi)＜5)增大的所有小鼠的Kaplan-Meyer圖。對于3×2Gy/周輻射(C組，n＝5)的DRIL32-PEG組積累了大量的數(shù)據(jù)，與對照組未處理的(A組，n＝38)，MEM+3×2Gy(B組，n＝30)相比清楚地顯示了放射致敏化作用。DRIL32-PEG+3×2Gy對MEM+3×2Gy組的Man和Whitney統(tǒng)計檢驗得出p值＝0.00067。在腫瘤體積(Vt/Vi＜5)比最初的體積小5倍(D組)的小鼠的Kaplan-Meyer圖上觀察到了同樣的趨勢。為了闡釋DRIL分子的分子特征和體內(nèi)活性的最佳方案，隨后對異種移植了人喉腫瘤的小鼠進行了進一步的研究。從研究的組中得到的數(shù)據(jù)與生物化學和體外研究中(比較實施例2，3和4)觀察到的DRIL分子的分子特征一致。另外，還表明1)回顧人類的臨床方案，把輻射分成幾部分，每周3×2Gy，產(chǎn)生最好的放射致敏化作用；2)放射致敏化作用是劑量依賴性的1nmole(20μg)DRIL32-PEG＞0.3nmole(6μg)DRIL32-PEG，0.1nmole(2μg)DRIL32-PEG時無效；3)放射致敏化作用依賴于腫瘤內(nèi)注射DRIL32-PEG和電離輻射之間的停留時間5小時＞＞1小時；4)根據(jù)廠商的說明書DRIL分子必須與轉(zhuǎn)染劑(superfect，DOGS或PEI)一起使用。腫瘤橫切片的組織染色和磁共振成象顯示，在DRIL分子與放療的結(jié)合治療后，出現(xiàn)了壞死。在異種移植了人類惡性膠質(zhì)腫瘤的小鼠中也能觀察到放射致敏化作用。惡性膠質(zhì)是最高級別的腦瘤，其特征為發(fā)展異常迅速，很快導致死亡，對放射和化療具有抗性。衍生自人類惡性膠質(zhì)瘤的2-3百萬的U87細胞首先通過皮下注射到裸鼠中。然后取出移植的腫瘤，隨后通過皮下移植大約8mm3惡性膠質(zhì)腫瘤用于接種其他裸鼠。表2顯示了異種移植了人類惡性膠質(zhì)腫瘤的裸鼠的實驗系列的數(shù)據(jù)。通過腫瘤內(nèi)注射接受了DRIL32-PEG(1nmole)和輻射(1×15Gy/周或3×5Gy/周，隨后休息一周，然后進行第二個治療周期，電離輻射的總劑量為30Gy)的小鼠中，在治療開始后25天，50％小鼠的腫瘤體積＜4cm3，然而，100％對照組(不治療或輻射并注射鹽溶液(PBS))小鼠的腫瘤體積大大超過4cm3，在處理結(jié)束之前，根據(jù)目前的動物倫理規(guī)則，在本分析結(jié)束時將他們處死。分析組在第25天腫瘤體積＜4cm3的(異種移植的惡性膠質(zhì)瘤)小鼠的數(shù)量(每組6只小鼠)未處理的0/6PBS+1×15Gy/周0/6DRIL32-PEG+1×15Gy/周3/6PBS+3×5Gy/周0/6DRIL32-PEG+3×5Gy/周3/6表2由DRIL32-PEG(1nmole/腫瘤內(nèi)注射)分析裸鼠異種移植的人惡性膠質(zhì)瘤的放射致敏化作用。使用了兩種輻射方案1×15Gy/周，或3×5Gy/周，隨后休息一周，再進行第二個輻射周期?？傒椛鋭┝繛?0Gy。對照組為未處理的或接受鹽溶液(PBS)注射的組?？傊?，異種移植到裸鼠的兩種人類放射抗性腫瘤(喉和惡性膠質(zhì)瘤)的發(fā)展速度可以大大降低，這提供了證據(jù)證明，DRIL分子可以有效地使這些迅速擴散的放射抗性腫瘤對放療的作用變得敏感。因此，在體內(nèi)得到了DNA誘餌方法的原理的證據(jù)。實施例6K-RasV12G×Apc1638N轉(zhuǎn)基因小鼠誘導的消化道腫瘤治療的化學致敏化作用選擇了一種內(nèi)源性的小鼠腫瘤模型來評價DRIL分子使抗癌化療致敏化的能力。為此目的，使用了攜帶K-RasV12G和Apc1638N突變的轉(zhuǎn)基因小鼠。通過兩只轉(zhuǎn)基因小鼠的繁殖得到一只攜帶由小鼠絨毛蛋白啟動子(pVill/K-RasV12G)控制的K-RasV12G突變(Janssen等，2002)，另一只含有在一個等位基因中的Apc1638N突變(Fodde等，1994)。具有pVill/K-RasV12G×Apc1638N突變的轉(zhuǎn)基因小鼠在大約5月齡時，在消化道中生成了自發(fā)的腫瘤，并且迅速死亡。在它們的平均12周齡時，根據(jù)圖5.1A組所示的方案，接受化療(5FU+CPT11)與DRIL32-PEG相結(jié)合的治療，與單獨的化療相比較。本方案包括3個治療周期。每個周期包括在腹膜內(nèi)注射0.6mg5FU和0.6mg的CPT11，連同口服施用0.1mg的DRIL32-PEG，每周3次，隨后休息一周。5FU(5-氟尿嘧啶，Teva)以濃度為50mg/ml配置在0.9％NaCl溶液中。CPT11/Irinotecan(Campto，Aventis)以濃度為20mg/ml配置在0.9％NaCl溶液中。跟蹤小鼠的健康狀態(tài)和存活情況直至其死亡。沒有觀察到由于DRIL分子而產(chǎn)生了額外的毒性效應(yīng)的臨床跡象。結(jié)果見圖5.1。A組在平均12周齡時，對三組的K-RasV12G×Apc1638N轉(zhuǎn)基因小鼠實施的治療方案對照組(未處理的)，以5FU+CPT11處理的組，以5FU+CPT11和DRIL32-PEG.處理的組。進行三個周期的治療。每個周期包括在腹膜內(nèi)注射0.6mg5FU和0.6mgCPT11，連同口服施用0.1mgDRIL32-PEG，每周3次，隨后休息一周。每組小鼠的數(shù)量顯示在括號中。終點是存活的時間；B組三組的存活曲線的Kaplan-Meyer圖；C組B組中所示的三組的存活時間的中值。盡管是簡化的組，與單獨接受化療(存活中值＝173天)和對照組(存活中值＝175天)(B和C組)相比，在接受化療(5FU+11CPT)與DRIL32-PEG相結(jié)合的治療組中可以觀察到存活時間的顯著提高(存活中值＝226天，p值＝0.2)。為了提高統(tǒng)計顯著性，目前正在進行補充分析以增加5FU+CPT11+DRIL32-PEG和5FU+CPT11組的數(shù)目。為了估計每只動物腫瘤的平均數(shù)，在治療結(jié)束后兩周(平均18周齡)，處死一系列的小鼠。通過肉眼觀察和組織學檢查的檢查腸(用Hematoxyline-Eosine-Safran進行標準染色)。結(jié)果見圖5.2。每組動物的數(shù)量顯示于括號中。在圖5.1A組中所示的方案完成后兩周，將所有的小鼠處死。對照組(未處理組，n＝101)的平均數(shù)為30.8/動物。兩種檢查結(jié)果一致顯示，與單獨接受化療的組(n＝7)相比，接受5FU+CPT11與DRIL32-PEG(n＝8)相結(jié)合的組的腫瘤數(shù)量顯著減少(＞30％)(圖5.2)。值得注意的是，對照組(未處理組，n＝101)的平均數(shù)為30.8/動物。通過免疫熒光染色法分析由用熒光素標記的DRIL分子(DRIL32-FITC)和5FU+CPT11處理的動物制備的腫瘤樣品。在回顧體外發(fā)現(xiàn)(比較實施例3.3和4)中，H2AX標記的灶與熒光DRIL分子共染色。圖6.3顯示一個補充的分析，其中18周齡的K-RasV12G×Apc1638N轉(zhuǎn)基因小鼠由化療(5FU+CPT11)和DRIL32-FITC連續(xù)治療3天，在完成最后一次治療2小時后被處死，如A組所示。取出腸，用PBS洗滌。然后對腫瘤組織取樣并凍在-80℃。通過低溫恒溫器制備來自冷凍腫瘤組織的5μm的組織學樣品，用于分析。用以1/500稀釋在PBS中的多克隆兔抗-γ-H2AX抗體(Trevigen)，然后用以1/200稀釋在PBS中以花菁3(Jackson)標記的山羊抗-兔抗體免疫螢光檢測DNA修復灶。樣品也以DAPI(Sigma)復染。通過表面熒光顯微術(shù)觀察樣品。發(fā)現(xiàn)DRIL32-FITC的熒光異質(zhì)地散布于腫瘤組織(腺結(jié)構(gòu)之間的上皮細胞和基質(zhì))，并有優(yōu)選的核定位(圖6.3，B組，左圖)。γ-H2AX位點發(fā)現(xiàn)相似的圖譜(圖6.3，B組，右圖)。觀察到的共定位的DRIL32-FITC和γ-H2AX信號幾乎差不多?？傊?，存活率的提高和每只動物腫瘤數(shù)量的減少，一致性地顯示了攜帶K-RasV12G×Apc1638N突變的轉(zhuǎn)基因小鼠的消化道腫瘤的治療被DRIL分子(DRIL32-PEG)引起化學致敏化作用的證據(jù)。對被處理動物的腫瘤組織的深入分析為DRIL分子參與DNA修復過程提供了證據(jù)。應(yīng)該指出的是，本研究中DRIL32-PEG分子的口服施用不包括任何轉(zhuǎn)染劑。總而言之，生物化學和體外的數(shù)據(jù)明顯符合DRIL分子的作用機制，即通過參與經(jīng)NHEJ途徑的DSB修復和由直接或間接DNA損傷(電離輻射和化療劑)引起的修復信號轉(zhuǎn)導途徑起作用。由于NHEJ途徑的性質(zhì)(不依賴序列的途徑)，對DRIL分子的序列和長度沒有限制(Jackson，2002；Barnes，2001，Downs&Jackon，2004)。體內(nèi)的研究證實了小鼠的腫瘤被DRIL分子引起有效的放射和化學致敏化作用?？傊?，所有的數(shù)據(jù)一致性提供了證據(jù)支持DNA誘餌方法的概念，描繪了DRIL分子的分子特征。參考文獻Barnes，D.E.Non-homologousendjoiningasamechanismofDNArepair.Curr.Biol.(2001)11，R455-7.BelenkovAI，PaiementJP，PanasciLC，MoniaBP，ChowTY.AnantisenseoligonucleotidetargetedtohumanKu80messengerRNAsensitizesM059Kmalignantgliomacellstoionizingradiation，bleomycin，andetoposidebutnotDNAcross-linkingagents.CancerRes.(2002)，62，5888-96.BoultonS；KvleS；Drkacz，R.W.Mechanismsofenhancementofcytotoxicityinetoposideandionisingradiation-treatedcellsbytheproteinkinaseinhibitorwortmannin.Eur.JCancer(2000)，36，535-41.Cantor，C.R.；Warshaw，M.M.；Shapiro，H.Oligonucleotideinteractions.III.Conformationaldifferencesbetweendeoxy-andribodinucleosidephosphatesBiopolymers(1970)，9，1059-77.Cary，R.B.；Peterson，S.R.；Wang，J.T.；Bear，D.G.；Bradbury，E.M.&Chen，D.J.DNAloopingbyKuandtheDNA-dependentproteinkinase.Proc.Natl.AcadSci.USA(1997)94，4267-4272.Downs，J.A.；Jackson，S.PAmeanstoaDNAendThemanyrolesofKu.Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.(2004)，5，367-78.Durant，S.；Karran，P.Vanillins--anovelfamilyofDNA-PKinhibitors.NucleicAcidsRes.(2003)，31，5501-12.Fodde，R.；Edelmann，W.；Yang，K.；vanLeeuwen，C.；Carlson，C.；Renault，B.；Breukel，C.；Alt，E.；Lipkin，M.；Khan，P.M.Atargetedchain-terminationmutationinthemouseApcgeneresultsinmultipleintestinaltumors.ProcNatlAcadSciUSA.(1994)，91，8969-73.Jackson，S.P.SensingandrepairingDNAdouble-strandbreaks.Carcinogenesis(2002)，23，687-96.Janssen，K.P.；el-Marjou，F(xiàn).；Pinto，D.；Sastre，X.；Rouillard，D.；Fouquet，C.；Soussi，T.；Louvard，D.；Robine，S.TargetedexpressionofoncogenicK-rasinintestinalepitheliumcausesspontaneoustumorigenesisinmice.Gastroenterology(2002)，123，492-504.Kim，C.H.；Park，S.J.；Lee，S.H.；AtargetedinhibitionofDNA-dependentproteinkinasesensitizesbreastcancercellsfollowingionizingradiation.J.Pharmacol.Exp.Ther.(2002)，303，753-9.Lee，H.；Sun，D.；Larner，J.M.；Wu，F(xiàn).S.Thetumorsuppressorp53canreducestabletransfectioninthepresenceofirradiation.J.Biomed.Sci.(1999)，6，285-92.Li，S.；Takeda，Y.；Wragg，S.；Barrett，J.；Phillips，A.；Dynan，W.S.ModificationoftheionizingradiationresponseinlivingcellsbyanscFvagainsttheDNA-dependentproteinkinase.NucleicAcidRes.(2003)31，5848-57.Li，G.C.；He，F(xiàn).；Shao，X.；Urano，M.；Shen，L.；Kim，D.；Borrelli，M.；Leibel，S.A.；Gutin，P.H.；Ling，C.C.Adenovirus-mediatedheat-activatedantisenseKu70expressionradiosensitizestumorcellsinvitroandinvivo.CancerRes.(2003b)，63，3268-74.Maacke，H.；Jost，K.；Opitz，S.；Miska，S.；Yuan，Y.；Hasselbach，L.；Luttges，J.；Kalthoff，H.；Sturzbecher，H.W.DNArepairandrecombinationfactorRad51isover-expressedinhumanpancreaticadenocarcinoma.Oncogene(2000).19，2791-5.Mallya，S.M.；Sikpi，M.O.Evidenceoftheinvolvementofp53ingamma-radiation-inducedDNArepairinhumanlymphoblasts.Int.J.Radiat.Biol.(1998)，74，231-8.Marangoni，E.；Bay，J.O.；Verrelle，P.；Bourhis，J.Tranfertdegènepourmodifierlaréponseàlaradithérapie？CancerRadiother.(2000)，4，175-80.Marangoni，E.；LeRomancer，M.；Foray，N.；Muller，C.；Douc-Rasy，S.；Vaganay，S.；Abdulkarim，B.；Barrois，M.；Calsou，P.；Bernier，J.；Salles，B.；Bourhis，J.TransferofKu80RNAantisensedecreasestheradioresistanceofhumanfibroblasts.CancerGeneTher.(2000b)，7，339-46.Marangoni，E.；Foray，N.；O′Driscoll，M.；Douc-Rasy，S.；Bernier，J.；Bourhis，J.；Jeggo，P.AKu80fragmentwithdominantnegativeactivityimpartsaradiosensitivephenotypetoCHO-K1cells.NucleicAcidRes.(2000a)，28，4778-82.Marangoni，E.；LeRomancer，M.；Foray，N.；Muller，C.；Douc-Rasy，S.；Vaganay，S.；Abdulkarim，B.；Barrois，M.；Calsou，P.；Bernier，J.；Salles，B.；BourhisJ.TransferofKu80RNAantisensedecreasestheradioresistanceofhumanfibroblasts.CancerGeneTher.(2000b)，7，339-46.Martensson，S.；Hammarsten，O.DNA-dependentproteinkinasecatalyticsubunitstructuralrequirementsforkinaseactivitybyDNAends.J.Biol.Chem.(2002)，277，3020-29.Mimori，T.；Hardin，J.A.MechanismofinteractionbetweenKuproteinandDNA.J.Biol.Chem.(1986)，261，10375-10379.Nimura，Y.；Ismail，S.M.；Kurimas，A.；Chen，D.J.；Stevens，C.W.DNA-PKandATMarerequiredforradiation-enhancedintegration.RadiatRes.(2002)，157，562-7.O′Driscoll，M.；Jeggo，P.ImmunologicaldisordersandDNArepair.MutatRes.(2002)，509，109-26.Ohnishi，T.；Taki，T.；Hiraga，S.；Arita，N.；Morita，T.InvitroandinvivopotentiationofradiosensitivityofmalignantgliomasbyantisenseinhibitionoftheRAD51gene.BiochemBiophysResCommun.(1998)，245，319-24.Pang，D.L.；Yoo，S.H.；Dynan，W.S.；Jung，M.；Dritschilo，A.KuproteinsjoinDNAfragmentsasshownbyatomicforcemicroscopy.CancerRes.(1997)，57，1412-5.Peng，Y.；Zhang，Q.；Nagasawa，H.；Okayasu，R.；Libe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